Stworzyliśmy fotokonwertowalny system PSmOrange jako potężne, proste i tanie narzędzie do śledzenia komórek in vivo w transgenicznym tle GFP. Protokół ten opisuje jego zastosowanie w systemie modeli danio pręgowanego.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Śledzenie komórek u danio pręgowanego transgenicznego GFP za pomocą fotokonwertowalnego systemu PSmOrange
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Szybki rozwój przezroczystych zarodków danio pręgowanego (Danio rerio) w połączeniu z fluorescencyjnym znakowaniem komórek i tkanek pozwala na wizualizację procesów rozwojowych zachodzących u żywego zwierzęcia. Interesujące komórki można znakować za pomocą specyficznego dla tkanki promotora do sterowania ekspresją białka fluorescencyjnego (FP) w celu wytworzenia linii transgenicznych. Wykorzystanie do tego celu fluorescencyjnych białek fotokonwertowalnych pozwala dodatkowo na precyzyjne śledzenie zdefiniowanych struktur w obrębie domeny ekspresji. Oświetlenie białka w obszarze zainteresowania zmienia jego widmo emisyjne i uwydatnia konkretną komórkę lub klaster komórek, pozostawiając inne komórki transgeniczne w ich pierwotnym kolorze. Głównym ograniczeniem jest brak znanych promotorów dla dużej liczby tkanek danio pręgowanego. Z drugiej strony, badania przesiewowe pułapek genowych i wzmacniających wygenerowały ogromne zasoby transgeniczne, dyskretnie znakując dosłownie wszystkie struktury embrionalne, głównie za pomocą GFP lub w mniejszym stopniu czerwonych lub żółtych FP. Podejście do śledzenia zdefiniowanych struktur w takich transgenicznych tłach polegałoby na dodatkowym wprowadzeniu wszechobecnego białka fotokonwertowalnego, które mogłoby zostać przekształcone w komórkę (komórki) będącą przedmiotem zainteresowania. Jednak dostępne białka fotokonwertowalne obejmują zielony i/lub rzadziej czerwony stan emisji1 i dlatego często nie mogą być wykorzystywane do śledzenia komórek na tle FP istniejących linii transgenicznych. Aby obejść ten problem, stworzyliśmy system PSmOrange dla danio pręgowanego2,3. Prosta mikroiniekcja syntetycznego mRNA kodującego jądrową formę tego białka znakuje wszystkie jądra komórkowe pomarańczowo-czerwoną fluorescencją. Po ukierunkowanej fotokonwersji białka przełącza swoje widmo emisyjne na daleką czerwień. Wydajność kwantowa i stabilność białka sprawia, że PSmOrange jest doskonałym narzędziem do śledzenia komórek dla danio pręgowanego i prawdopodobnie innych gatunków teleostów.
Wprowadzenie
Wykładniczo ulepszające techniki obrazowania pozwalają śledzić procesy rozwojowe w okresach do około czterech kolejnych dni3. U danio pręgowanego i wielu innych modelowych systemów zwierzęcych określone komórki, tkanki, struktury aksonalne lub naczyniowe są oznaczone transgenicznymi zielonymi lub czasami czerwonymi lub żółtymi białkami fluorescencyjnymi, aby ułatwić wizualizację. Jednak w większości linii transgenicznych transgen nie ulega specyficznej ekspresji w komórkach będących przedmiotem zainteresowania, ale także w dodatkowych strukturach, co utrudnia precyzyjne śledzenie na przykład pojedynczych komórek lub grup komórek.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Transkrypcja mRNA H2B-PSmOrange In Vitro i oczyszczanie mRNA
- Linearyzować plazmid H2B-PSmOrange zawierający pCS2+ za pomocą enzymu restrykcyjnego NotI zgodnie z instrukcjami producenta.
Uwaga: Kolejne kroki należy wykonać, stosując odpowiednie zabezpieczenia, takie jak rękawice i fartuch laboratoryjny, aby zapobiec zanieczyszczeniu i degradacji mRNA. - Oczyść zlinearyzowane DNA za pomocą zestawu do oczyszczania PCR lub metod opartych na fenolu i chloroformie zgodnie z protokołami producentów.
- Użyj 1 μg zlinearyzowanego matrycowego DNA do transkrypcji Sp6-mRNA zgodnie z instrukcjami producenta.
- Usunąć DNA, doda....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Rysunek 1 przedstawia przykład systemu fotokonwersji PSmOrange. Kompleks szyszynkowy jest konserwowaną strukturą w grzbietowej części diencefalonu kręgowców. Podobnie jak u wielu innych kręgowców, kompleks ten składa się z narządu szyszynkowego w centrum diencefalonu oraz komórek parapinealnych po lewej stronie. Precyzyjne, lecz czasochłonne eksperymenty z uwalnianiem klatek (uncaging) wykazały, że komórki parapinealne pochodzą z przedniej części narządu szyszynkowego
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Transgeniczne embriony przenoszące fluorescencyjne reportery zasadniczo pomogły w zrozumieniu rozwoju embrionalnego. Nadal jednak istnieje zasadnicza potrzeba stosowania promotorów, którzy ułatwią specyficzną wizualizację poszczególnych konstrukcji. W przypadku ich braku naukowcy polegają na technikach takich jak fotokonwersja białek fluorescencyjnych, aby dowiedzieć się o pochodzeniu i rozwoju ich interesującej struktury. To z kolei jest kluczowym warunkiem wstępnym do zidentyfikowania mechanizmów molekularnych zaangażo.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Dziękujemy O. Subachowi za dostarczenie oryginalnego plazmidu H2B-PSmOrange oraz naszemu zespołowi ds. hodowli ryb za opiekę nad rybami. Jesteśmy wdzięczni Centrum Obrazowania firmy Nikon na Uniwersytecie w Heidelbergu za dostęp do sprzętu mikroskopowego i oprogramowania analitycznego. Dziękujemy za wsparcie ze strony Core Facility Live Cell Imaging Mannheim w CBTM (DFG INST 91027/10-1 FUGG). Prace te były wspierane przez Excellenzcluster CellNetworks, EcTop Spatio-temporal coordination of signaling processes (EcTop 2), Uniwersytet w Heidelbergu do C.A.B. i Wydziału Medycznego Mannheim Uniwersytetu w Heidelbergu oraz DFG (FOR 1036/2, 298/3-1 i 298/6-1) do M.C.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Zestaw do oczyszczania PCR | Qiagen | 28104 | |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Zestaw do transkrypcji | Ambion | AM1340 | |
| RNeasy MiniElute Zestaw do czyszczenia | Qiagen | 74204 | |
| Plastikowe | laboratoria Pasteura alpha | LW4000 | |
| Oryginalny plazmid H2B-PSmOrange | Addgene | 31920 | Plazmid opisany w artykule to dostępny w |
| mikrowtryskiwaczu Carl lab FemtoJet | Eppendorf | 5247 000.013 | |
| Kleszcze (5 Inox) | NeoLab | 2-1633 | |
| Lab-Tek II Chambered #1.5 Niemiecki system szkła nakrywkowego | Nunc | 155382 | |
| Nikon A1R+ | Nikon GmbH Niemcy | Nr numeru | |
| Nikon PLAN Apo λ Obiektyw pneumatyczny 20X | Nikon GmbH Niemcy | nr numeru | |
| NIS Elements AR Software (wersja 4.30.02) | Nikon GmbH Niemcy/Laboratory Imaging | No Number |
Bibliografia
- Lombardo, V. A., Sporbert, A., Abdelilah-Seyfried, S. Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development. J. Vis. Exp. (4350), (2012).
- Subach, O. M., et al. A photoswitchable orange-to-far-red fluorescent protein, PSmOrange. Nature Methods.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
