Bioprinting Cellularized Constructs przy użyciu specyficznego tkankowo biotuszu hydrożelowego

Summary

Opisujemy zestaw protokołów, które razem dostarczają biotusz naśladujący tkankę, za pomocą którego można biodrukować funkcjonalne i żywotne konstrukcje tkanek 3D do wykorzystania w badaniach przesiewowych in vitro.

Abstract

Bioprinting pojawił się jako wszechstronne podejście do tworzenia konstruktów organów inżynierii tkankowej. Konstrukty te mają potencjalne zastosowanie jako zamienniki narządów do implantacji u pacjentów, a także, gdy są tworzone na mniejszą skalę, jako modelowe "organoidy", które mogą być używane w systemach in vitro do badań przesiewowych leków i toksykologii.

Pomimo rozwoju szerokiej gamy urządzeń do biodruku, zastosowanie technologii biodruku może być ograniczone przez dostępność materiałów, które zarówno przyspieszają procedury bioprintingu, jak i wspierają żywotność i funkcję komórek, dostarczając wskazówek specyficznych dla tkanki. Tutaj opisujemy wszechstronny system hydrożelowy na bazie kwasu hialuronowego (HA) i żelatyny, składający się z wielopunktowego, 2-etapowego protokołu sieciowania, który może dostarczać specyficzne dla tkanek sygnały biochemiczne i naśladować właściwości mechaniczne tkanek in vivo.

Czynniki biochemiczne są dostarczane przez włączenie materiałów macierzy zewnątrzkomórkowej pochodzących z tkanek, które zawierają silne czynniki wzrostu. Właściwości mechaniczne tkanek to kontrolowane kombinacje środków sieciujących na bazie PEG o różnych masach cząsteczkowych, geometriach (liniowych lub wieloramiennych) i grupach funkcyjnych w celu uzyskania wytłaczanych biotuszów i końcowych wartości sztywności na ścinanie w szerokim zakresie (od 100 Pa do 20 kPa). Wykorzystując te parametry, biotusze hydrożelowe wykorzystano do biodruku pierwotnych sferoidów wątroby w biotuszu specyficznym dla wątroby w celu stworzenia in vitro konstruktów wątroby o wysokiej żywotności komórek i mierzalnej funkcjonalnej produkcji albuminy i mocznika. Metodologia ta zapewnia ogólne ramy, które można dostosować do przyszłego dostosowywania hydrożeli do biofabrykacji szerokiej gamy typów konstruktów tkankowych.

Introduction

W ostatnich latach dostępne stały się różne technologie, które zaspokajają zapotrzebowanie na alternatywne źródła funkcjonalnych organów i tkanek poprzez ich produkcję lub biofabrykację. Bioprinting okazał się jedną z najbardziej obiecujących z tych technologii. Bioprinting można traktować jako formę robotycznego wytwarzania przyrostowego części biologicznych, które można wykorzystać do budowy lub modelowania żywotnych struktur przypominających narządy lub tkanki w 3 wymiarach. ¹ W większości przypadków biodruk wykorzystuje trójwymiarowe (3-D) urządzenie drukujące, które jest kierowane przez komputer w celu osadzenia komórek i biomateriałów w precyzyjnych p....

Protocol

1. Preparaty i przygotowanie hydrożelowego biotuszu

1. W celu uzyskania specyficznych dla tkanek profili biochemicznych należy przygotować specyficzne tkankowo roztwory trawienia ECM, jak opisano wcześniej dla wątroby. ²⁰
   Uwaga: Ogólnie rzecz biorąc, ten ekstrakt ECM będzie zawierał 40% końcowej objętości biotuszu hydrożelowego, która jest stosowana. Można przygotować kilkaset mililitrów roztworu mineralizującego ECM, podzielić go na porcje i zamrozić w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości.
2. Przed preparatem hydrożelowym należy rozpuścić fotoinicjator, 2-hydroksy-4′-(2-hydroksyetoksy)-2-metylopropiofenon, w wodzie o st....

Results

Gdy opisane powyżej procedury są przestrzegane prawidłowo, hydrożele powinny zawierać profil biochemiczny specyficzny dla docelowego typu ^tkanki,20 umożliwiać wysoki stopień kontroli nad biodrukowaniem i końcowym modułem sprężystości,34 oraz wspierać żywotne funkcjonalne komórki w konstruktach tkankowych.

Dostosowywanie hydrożelu
Aby jak najlepiej naśladować natywną wątrobę, hydrożelowy.......

Discussion

Istnieje kilka elementów, które należy wziąć pod uwagę podczas próby biofabrykacji konstruktów tkanek 3D, do ewentualnego zastosowania u ludzi lub do zastosowań przesiewowych in vitro . Zastosowanie odpowiednich komponentów komórkowych określa potencjalną funkcjonalność końcową, podczas gdy samo urządzenie do biofabrykacji określa ogólną metodologię osiągnięcia konstruktu końcowego. Trzeci składnik, biomateriał, jest równie ważny, ponieważ pełni podwójną rolę. W szczególności komponent biomateriałowy musi być ko.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kwas hialuronowy	Sigma	53747
Żelatyna	Sigma	G6144
2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone	Sigma	410896
Zestaw hydrożelu kwasu hialuronowego i żelatyny (HyStem-HP)	ESI-BIO	GS315	Zestaw zawiera składniki Heprasil (tiolowany i heparynizowany kwas hialuronowy), Gelin-S (tiolowany żelatyna) oraz Extralink (PEGDA)
PEG 8-Arm Alkyne, 10  kDa	Creative PEGWorks	PSB-887
Pierwotne ludzkie hepatocyty	Triangle Research Labs	HUCPM6
Pierwotne ludzkie komórki gwiaździste wątroby	ScienCell	5300
Pierwotne ludzkie komórki Kupffera	Technologie życia	HUKCCS
Podłoże podstawowe (HBM)	Lonza	CC-3199
Pożywka dla hepatocytów Zestaw suplementów	Lonza	CC-3198	HCM SingleQuot Kit (zawiera kwas askorbinowy, 0,5  Ml; Albumina surowicy bydlęcej [bez kwasów tłuszczowych], 10  Ml; siarczan gentamycyny/amfoterycyna B, 0,5  Ml; hydrokortyzon 21-hemibursztynian, 0,5  Ml; insulina, 0,5  Ml; ludzki rekombinowany naskórkowy czynnik wzrostu, 0,5  Ml; przenoszenie, 0,5  ml)
Triton X-100	Sigma	T9284	Inni producenci są ok.
Wodorotlenek amonu	Fischer Scientific	A669	Inni producenci są w porządku.
Świeże tkanki zwłok świń	n/	a n/d
Liofilizator	dowolny	n/d
Młyn zamrażarczy	dowolny	n/a
Biodrukarka	n/a	n/d	Opisana tutaj biodrukarka została zbudowana na zamówienie we własnym zakresie. Ogólnie rzecz biorąc, inne urządzenia są odpowiednie, pod warunkiem, że obsługują sterowany komputerowo druk materiałów hydrożelowych oparty na wytłaczaniu.
Wisząca płytka do hodowli kropelkowej	InSphero	CS-06-001	Platforma hodowli 3D InSphero GravityPlus