Bioprinting Cellularized Constructs przy użyciu specyficznego tkankowo biotuszu hydrożelowego

Summary

Opisujemy zestaw protokołów, które razem dostarczają biotusz naśladujący tkankę, za pomocą którego można biodrukować funkcjonalne i żywotne konstrukcje tkanek 3D do wykorzystania w badaniach przesiewowych in vitro.

Abstract

Bioprinting pojawił się jako wszechstronne podejście do tworzenia konstruktów organów inżynierii tkankowej. Konstrukty te mają potencjalne zastosowanie jako zamienniki narządów do implantacji u pacjentów, a także, gdy są tworzone na mniejszą skalę, jako modelowe "organoidy", które mogą być używane w systemach in vitro do badań przesiewowych leków i toksykologii.

Pomimo rozwoju szerokiej gamy urządzeń do biodruku, zastosowanie technologii biodruku może być ograniczone przez dostępność materiałów, które zarówno przyspieszają procedury bioprintingu, jak i wspierają żywotność i funkcję komórek, dostarczając wskazówek specyficznych dla tkanki. Tutaj opisujemy wszechstronny system hydrożelowy na bazie kwasu hialuronowego (HA) i żelatyny, składający się z wielopunktowego, 2-etapowego protokołu sieciowania, który może dostarczać specyficzne dla tkanek sygnały biochemiczne i naśladować właściwości mechaniczne tkanek in vivo.

Czynniki biochemiczne są dostarczane przez włączenie materiałów macierzy zewnątrzkomórkowej pochodzących z tkanek, które zawierają silne czynniki wzrostu. Właściwości mechaniczne tkanek to kontrolowane kombinacje środków sieciujących na bazie PEG o różnych masach cząsteczkowych, geometriach (liniowych lub wieloramiennych) i grupach funkcyjnych w celu uzyskania wytłaczanych biotuszów i końcowych wartości sztywności na ścinanie w szerokim zakresie (od 100 Pa do 20 kPa). Wykorzystując te parametry, biotusze hydrożelowe wykorzystano do biodruku pierwotnych sferoidów wątroby w biotuszu specyficznym dla wątroby w celu stworzenia in vitro konstruktów wątroby o wysokiej żywotności komórek i mierzalnej funkcjonalnej produkcji albuminy i mocznika. Metodologia ta zapewnia ogólne ramy, które można dostosować do przyszłego dostosowywania hydrożeli do biofabrykacji szerokiej gamy typów konstruktów tkankowych.

Introduction

W ostatnich latach dostępne stały się różne technologie, które zaspokajają zapotrzebowanie na alternatywne źródła funkcjonalnych organów i tkanek poprzez ich produkcję lub biofabrykację. Bioprinting okazał się jedną z najbardziej obiecujących z tych technologii. Bioprinting można traktować jako formę robotycznego wytwarzania przyrostowego części biologicznych, które można wykorzystać do budowy lub modelowania żywotnych struktur przypominających narządy lub tkanki w 3 wymiarach. ¹ W większości przypadków biodruk wykorzystuje trójwymiarowe (3-D) urządzenie drukujące, które jest kierowane przez komputer w celu osadzenia komórek i biomateriałów w precyzyjnych pozycjach, odtwarzając w ten sposób anatomicznie naśladujące architektury fizjologiczne. ² Urządzenia te drukują "biotusz", który może mieć postać agregatów komórkowych, komórek zamkniętych w hydrożelach lub lepkich płynach lub mikronośników wysiewanych przez komórki, a także bezkomórkowych polimerów, które zapewniają strukturę mechaniczną lub działają jako bezkomórkowe symbole zastępcze. ^3,4 Po procesie biodrukowania otrzymana struktura może zostać dojrzała do postaci funkcjonalnych struktur tkankowych lub narządowych i wykorzystana do zamierzonego zastosowania końcowego. ^5,6 Do tej pory nie wydrukowano kompletnego, w pełni funkcjonalnego narządu wielkości człowieka, ale pozostaje on głównym długoterminowym celem badań i rozwoju biodruku. ² Jednak małe "organoidowe" konstrukty tkankowe są obecnie wdrażane w wielu zastosowaniach, w tym w modelowaniu patologii, opracowywaniu leków i badaniach toksykologicznych.

Jedną z głównych przeszkód, które napotkali badacze podczas stosowania technologii biodruku, jest to, że bardzo niewiele materiałów zostało opracowanych z myślą o konkretnym celu biodruku. Aby skutecznie odnieść sukces w biodruku, biomateriał musi spełniać 4 podstawowe wymagania. Biomateriał musi posiadać: 1) odpowiednie właściwości mechaniczne, aby umożliwić osadzanie (czy to wytłaczanie przez dyszę w postaci żelu, czy za pomocą drukarki atramentowej w postaci kropli), 2) zdolność do zachowania swojego kształtu jako składnika struktury 3D po osadzeniu, 3) zdolność do kontrolowania przez użytkownika 2 wcześniejszych cech, oraz 4) przyjazne i wspierające środowisko dla komórek na wszystkich etapach procedury biodruku. ⁷ Historycznie rzecz biorąc, prace biodrukarskie często próbowały wykorzystywać istniejące tradycyjne biomateriały w urządzeniach do biodruku, nie biorąc pod uwagę ich kompatybilności, zamiast zaprojektować biomateriał tak, aby posiadał właściwości niezbędne do biodruku i późniejszych zastosowań po drukowaniu.

Ostatnio opracowano różne rodzaje biotuszów, aby lepiej współpracować ze sprzętem do osadzania i produkcji. Standardowe systemy hydrożelowe stwarzają poważne problemy, ponieważ na ogół występują jako roztwory płynów prekursorowych o niewystarczających właściwościach mechanicznych lub spolimeryzowane hydrożele, które po wydrukowaniu mogą zatkać dysze lub ulec rozpadowi w procesie wytłaczania. Nasz zespół, a także inni, zbadali różne preparaty hydrożelowe w celu rozwiązania tych problemów związanych z biodrukowaniem, w tym drukowanie sferoidów komórkowych w podłożach ^{hydrożelowych,5,8} wytłaczanie komórek i włókien hydrożelowych z probówek mikrokapilarnych,9-11 ekstrudowalne hydrożele z nanocząstek kwasu hialuronowego (HA)-złota o dynamicznych właściwościach sieciowania,12 czasowa kontrola sztywności hydrożelu za pomocą fotopolimeryzowanego metakrylowanu HA i żelatyny, ¹³ sieciowanie na bazie fibrynogenu i trombiny,14,15 żele alginianowo-kolagenowe z jonową wymianą,16 a ostatnio szybkie sieciowanie inicjowane światłem ultrafioletowym (UV),¹⁷

Te przykłady pokazują możliwość generowania materiałów, które można skutecznie drukować biologicznie. Jednak oprócz integracji ze sprzętem, aby z powodzeniem generować żywotne i funkcjonalne konstrukty tkankowe 3D, biomateriały muszą zawierać biochemiczne i mechaniczne wskazówki, które pomagają w utrzymaniu żywotności i funkcji komórek. Te dodatkowe czynniki, profile biochemiczne i mechaniczne, mogą mieć znaczący wpływ na pomyślne funkcjonowanie biodrukowanych konstruktów tkankowych.

Zarówno komórki, jak i natywna macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) są odpowiedzialne za dostarczanie innym komórkom szerokiego zakresu cząsteczek sygnałowych, takich jak czynniki wzrostu i inne cytokiny. Kombinacja tych sygnałów różni się w zależności od tkanki, ale może być niezwykle silna i wpływowa w regulacji zachowania komórek i tkanek. ¹⁸ Z powodzeniem zbadano wykorzystanie specyficznych tkankowo komponentów ECM z różnych narządów i zastosowanie ich jako hydrożelu lub jako części hydrożelu. ^19-21 To podejście, które polega na decelularyzacji danej tkanki, sproszkowaniu jej i rozpuszczeniu, może być wykorzystane do wytwarzania specyficznych dla tkanki sygnałów biochemicznych z dowolnej tkanki i może być włączone do konstruktów hydrożelowych 3D. ^{22 Rozdział 22}

Dodatkowo, jest szeroko udokumentowane, że tkanki w ciele mają szeroki zakres sztywności. ²³ W związku z tym możliwość dostrajania właściwości mechanicznych biomateriałów, takich jak moduł sprężystości E' lub moduł sprężystości przy ścinaniu G', jest użytecznym narzędziem w inżynierii tkankowej. Jak opisano powyżej, kontrola nad właściwościami mechanicznymi biotuszu pozwala na biowytwarzanie oparte na wytłaczaniu przy użyciu miękkiego żelu, który można następnie dalej manipulować poprzez wtórne sieciowanie w późniejszym momencie, przy którym można osiągnąć poziomy modułu sprężystości odpowiadające typowi narządu docelowego. Na przykład, biomateriały można dostosować tak, aby odpowiadały sztywności 5-10 kPa, jak w przypadku natywnej ^wątroby,23 lub odpowiadały sztywności 10-15 kPa, jak w przypadku natywnej tkanki ^serca,24,25 teoretycznie zwiększając zdolność tych organoidów do funkcjonowania w podobny sposób, jak ich natywne odpowiedniki tkankowe. Wpływ sztywności środowiska na fenotyp komórki został zbadany w ostatnich latach, szczególnie w odniesieniu do komórek macierzystych. Engler i in. wykazali, że elastyczność substratu pomogła w kierowaniu mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) w kierunku linii o elastyczności tkanki dopasowanej do elastyczności substratu. ²⁵ Koncepcja ta była dalej badana pod kątem różnicowania w mięśnie, czynność serca, fenotyp wątroby, proliferację hematopoetycznych komórek macierzystych i utrzymanie potencjału terapeutycznego komórek macierzystych. ^24,26-29 Zdolność do dostrojenia hydrożelu do różnych modułów sprężystości jest ważną cechą biomateriału, który będzie używany do biofabrykacji konstruktów tkankowych. ^{Rozdział 30}

Tutaj opisujemy protokół, który reprezentuje wszechstronne podejście stosowane w naszym laboratorium do sformułowania systemu hydrożelowego, który może być biodrukowany przez ekstruzję i dostosowany tak, aby 1) zawierał profil biochemiczny określonego typu tkanki i 2) naśladował moduł sprężystości tego typu tkanki. Wychodząc naprzeciw tym wymaganiom, dążymy do dostarczenia materiału, który może podsumować fizykochemiczne i biologiczne cechy tkanek in vivo. ³¹ Opisany w niniejszym dokumencie modułowy system kompozytów hydrożelowych wykorzystuje podejście polegające na sieciowaniu wielokrotnym w celu uzyskania wytłaczanych biotuszów i umożliwia wtórne sieciowanie w celu stabilizacji i zwiększa sztywność produktów końcowych w celu dopasowania do różnych typów tkanek. Dostosowanie biochemiczne jest spełnione dzięki zastosowaniu specyficznych dla tkanek komponentów ECM. Jako demonstrację wykorzystujemy specyficzną dla wątroby odmianę tego systemu hydrożelowego do biodruku funkcjonalnych konstruktów organoidów wątrobowych. Opisany protokół wykorzystuje niestandardowe urządzenie do biodruku 3D. Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten można dostosować do większości drukarek opartych na wytłaczaniu, konkretne parametry drukowania różnią się znacznie dla każdego typu urządzenia i wymagają przetestowania przez użytkownika.

Protocol

1. Preparaty i przygotowanie hydrożelowego biotuszu

1. W celu uzyskania specyficznych dla tkanek profili biochemicznych należy przygotować specyficzne tkankowo roztwory trawienia ECM, jak opisano wcześniej dla wątroby. ²⁰
   Uwaga: Ogólnie rzecz biorąc, ten ekstrakt ECM będzie zawierał 40% końcowej objętości biotuszu hydrożelowego, która jest stosowana. Można przygotować kilkaset mililitrów roztworu mineralizującego ECM, podzielić go na porcje i zamrozić w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości.
2. Przed preparatem hydrożelowym należy rozpuścić fotoinicjator, 2-hydroksy-4′-(2-hydroksyetoksy)-2-metylopropiofenon, w wodzie o stężeniu 0,1% w/v.
   Uwaga: Objętości w zakresie 50-100 ml można przygotować z wyprzedzeniem i przechowywać w osłonie przed światłem w temperaturze 4 °C przez kilka miesięcy.
3. Aby utworzyć biotusze hydrożelowe, najpierw rozpuść składniki materiału bazowego z zestawów hydrożelowych kwasu hialuronowego (HA) w roztworze wodno-fotoinicjatora.
   1. Tiolowany kwas hialuronowy i tioloowaną żelatynę rozpuścić oddzielnie w roztworze wodno-fotoinicjatora (krok 1.2) do uzyskania 2% w/v roztworów.
   2. Rozpuść dikrylan glikolu polietylenowego (PEGDA), środek sieciujący w zestawach hydrożelowych, w roztworze wodno-fotoinicjatora (krok 1.2), aby uzyskać 8% roztwór w/v.
   3. Rozpuść glikol polietylenowy (PEG) 8-ramienny alkin (10 kDa MW) w roztworze wodno-fotoinicjatora (krok 1.2), aby uzyskać 8% roztwór w/v.
4. Ogólnie rzecz biorąc, formuj hydrożele według poniższego schematu, chociaż możliwe jest dodatkowe dostosowanie.
   1. Połącz 4 części 2% tiolowanego HA, 4 części 2% tiolowanej żelatyny, 1 część środka sieciującego 1, 1 część środka sieciującego 2 z 8 częściami tkankowego roztworu ECM i 2 częściami pożywki do hodowli hepatocytów (HCM) (lub 10 częściami wody jako generyczny hydrożel niespecyficzny dla tkanki).
      Uwaga: Można dodać dodatkowy niemodyfikowany kwas hialuronowy lub żelatynę, aby biotusz wytłaczał się płynniej. Zostało to opisane poniżej.
5. Wiruj powstałą mieszaninę na wysokich obrotach (prędkość 10 z 10) przez 10 sekund, aby wymieszać przed użyciem.
6. Stosowanie biotuszu hydrożelowego
   1. W przypadku testów wytłaczania lub biodruku należy przenieść mieszaninę do strzykawki lub wkładu do drukarki i pozostawić do spontanicznego sieciowania przez 30 minut (etap 1 sieciowanie) w temperaturze 37 °C.
   2. W przypadku pomiarów reologicznych przenieść mieszaninę na szalkę Petriego o średnicy 35 mm i pozostawić do sieciowania przez 30 min.
      Uwaga: Mieszanina natychmiast zaczyna sieciować poprzez tworzenie wiązań tiolowo-akrylowych i zacznie zwiększać lepkość. Mieszaninę należy przenieść do strzykawki, wkładu drukującego lub miejsca docelowego w ciągu 10 minut, aby uniknąć zatkania pipety lub strzykawki podczas przenoszenia.
   3. Gdy pożądane jest wtórne sieciowanie (etap 2), należy napromienić usieciowane żele etapu 1 światłem ultrafioletowym (365 nm, 18 W/cm²) w celu zainicjowania reakcji polimeryzacji tiolowo-alkinowej.
      Uwaga: Czas naświetlania zależy od powierzchni materiału. Ogólnie rzecz biorąc, centymetr kwadratowy materiału wymaga tylko 1-2 sekund ekspozycji na promieniowanie UV przy tej mocy promieniowania UV.

2. Testowanie kompatybilności drukarki

1. Przed testami integracyjnymi z urządzeniami biodrukującymi, przetestuj charakterystykę wytłaczania na stanowisku laboratoryjnym za pomocą prostych testów wytłaczania przy użyciu standardowych strzykawek i końcówek igieł o małej średnicy (rozmiar 20-30).
   1. Przepchnij biotusz przez standardową strzykawkę, aby uzyskać gładko wytłaczane włókna hydrożelu z niewielką liczbą wybrzuszeń lub bez wybrzuszeń. Wyciąganie linii lub prostych wzorów jest wystarczające, aby określić sukces.
2. W celu integracji z biodrukarką należy załadować preparaty biotuszu, pipetując je do wkładów do drukarki i odczekać 30 minut, aż biotusz przejdzie spontaniczne sieciowanie w etapie 1 we wjeździe.
   Uwaga: Objętość biotuszu zależy od konkretnego zastosowania i powinna być określona przez użytkownika. Wkłady do drukarek mogą przypominać lub być strzykawkami, które są kompatybilne z urządzeniem bioprinter.
3. Oceń kompatybilność ekstruzji dla biodruku, drukując prosty wzór przy użyciu biotuszu. Na przykład wydrukuj wzór o wymiarach 7 x 7 mm składający się z równoległych linii. Zastosuj nacisk (np. nacisk pneumatyczny 20 kPa), podczas gdy głowica drukująca porusza się w płaszczyźnie X-Y z prędkością około 300 mm/min.
   Uwaga: Można stosować dysze głowic drukujących o różnych średnicach, ale dysze stożkowe z otworami o średnicy 400-500 μM są optymalne do drukowania sferoid w zakresie 250-350 μm.
   1. Jeśli wytłaczane materiały są grudkowate lub nieregularne, patrz krok 2.4 lub zmniejsz ilość PEGDA, aby zmiękczyć materiał usieciowany etapu 1. Odpowiednio przygotowane receptury biotuszu wytłaczają się płynnie, umożliwiając precyzyjne osadzanie w pożądanych wzorach lub architekturach.
      Uwaga: Opisane procedury biodrukowania wykorzystują niestandardowe urządzenie do biodruku 3D zaprojektowane specjalnie do drukowania konstruktów tkankowych. ³² W związku z tym poszczególne parametry drukowania różnią się znacznie w zależności od typu urządzenia i wymagają testowania przez użytkownika.
4. Aby poprawić właściwości ekstruzji, należy uzupełnić niemodyfikowany kwas hialuronowy i żelatynę do biotuszów (odpowiednio 1,5 mg/ml i 30 mg/ml).

3. Walidacja za pomocą Bioprinting z podstawowymi konstruktami wątroby

1. Przygotuj sferoidy wątroby 3-D z pierwotnymi komórkami za pomocą metod zawieszania kropli jako składnika komórkowego³³
   Uwaga: Bioprinting można wykonać bez sferoid, ale zamiast tego z pojedynczymi komórkami zawieszonymi w hydrożelowych biotuszach. Sferoidy są tutaj wykorzystywane do przyspieszania interakcji komórka-komórka i konstruowania funkcjonalności. Liczba zastosowanych sferoid lub komórek zależy od konkretnego zastosowania i powinna być określona przez użytkownika. Czynności te należy wykonywać w sterylnych warunkach, przy użyciu sterylnych materiałów.
   1. Przygotować HCM, dodając rozmrożoną zawartość zestawu składników suplementu HCM do podłoża podstawowego hepatocytów (HBM) i sterylnie filtrując.
      1. Rozmrozić składniki suplementu do uzyskania płynu.
      2. Dodać składniki suplementu (kwas askorbinowy, 0,5 ml; albumina surowicy bydlęcej [bez kwasów tłuszczowych], 10 ml; siarczan gentamycyny/amfoterycyna B, 0,5 ml; 21-hemibursztynian hydrokortyzonu, 0,5 ml; insulina, 0,5 ml; ludzki rekombinowany naskórkowy czynnik wzrostu, 0,5 ml; przenoszenie, 0,5 ml) do 500 ml HBM.
      3. Sterylny filtr przez filtr 0,45 μm lub 0,22 μm za pomocą filtra butelkowego lub filtra strzykawkowego.
   2. Określ gęstość komórek pierwotnych ludzkich hepatocytów, komórek Kupffera i komórek gwiaździstych, licząc na hemocytometrze po rozmrożeniu każdego typu komórek zgodnie z instrukcjami producenta.
   3. Połącz pierwotne ludzkie hepatocyty, komórki Kupffera i komórki gwiaździste w stosunku 80:10:10 do liczby komórek w pożywce HCM, która została podgrzana do 37 °C w stożkowej probówce.
      Uwaga: Objętość nośnika, który ma być używany, zależy od ogólnej liczby komórek specyficznej dla aplikacji i powinna być określona przez użytkownika.
   4. Odwirować zawiesinę komórkową przez 5 minut w temperaturze 520 x g w temperaturze 20 °C.
   5. Odessać supernatant, pozostawiając osad komórkowy.
   6. Ponownie zawiesić osad komórkowy w pożywce HCM, aby uzyskać zawiesinę komórkową zawierającą 1,000 komórek na 40 μl pożywki. Całkowita objętość zależy od liczby wytwarzanych sferoid.
   7. Przenieś zawiesinę komórek na wiszące płytki kroplowe w formacie 96-dołkowym. Dodaj w sumie około 1000 komórek do każdej studzienki w HCM i utrzymuj w temperaturze 37 °C, w 5% CO₂ przez 3 dni, podczas których tworzą się wielokomórkowe sferoidy.
   8. Zebrać sferoidy wątroby z wiszącej płytki kroplowej za pomocą pipetora. Przenieść do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
2. Sferoidy wątroby Bioprint w biotuszu hydrożelowym specyficznym dla wątroby
   1. Przygotuj preparat biotuszu hydrożelowego zawierającego ECM wątroby, jak opisano w kroku 1, wykorzystując 8% PEGDA i 8% 8% alkinu PEG jako środki sieciujące. Użyj tej kombinacji ze względu na jej zdolność do uzyskania hydrożelu o module sprężystości zbliżonym do natywnej tkanki wątroby.
   2. Niech sferoidy osiądą na dnie stożkowej rurki, w której zostały umieszczone w kroku 3.1.7. Różni się to w zależności od wielkości i gęstości sferoidy, ale zwykle występuje w ciągu 1-2 minut. Usunąć wszystkie podłoża ostrożnie odsysając je lub używając pipetora.
   3. Przenieś żądaną objętość świeżo przygotowanego roztworu hydrożelowego biotuszu do stożkowej rurki zawierającej sferoidy. Ogólnie rzecz biorąc, odpowiednia objętość jest o 10%-25% większa niż objętość konstrukcji 3D, która ma zostać wydrukowana. Ostrożnie pipetować w górę i w dół, aby ponownie zawiesić sferoidy w hydrożelowym roztworze biotuszu. Przenieść do wkładu z biodrukarką za pomocą pipetora lub pipety serologicznej.
   4. Wewnątrz wkładu do biodrukarki pozwól, aby roztwór przeszedł pierwszy etap sieciowania (reakcja tiolowo-akrylowa) przez 30 min.
      Uwaga: W zależności od rozmiaru sferoidy, może być konieczne powolne obracanie wkładu lub może być konieczne wymieszanie zawartości ze sterylną szpatułką, aby utrzymać sferoidy rozprowadzone w całym biotuszu podczas sieciowania na etapie 1. Jest to mniej konieczne w przypadku biotuszów przygotowanych z zawieszonych komórek zamiast sferoidów.
      Uwaga: Po etapie sieciowania 1 użytkownicy mają do dyspozycji kilkugodzinne okno operacyjne. Zaleca się jednak szybkie przeprowadzenie procesu biodrukowania, aby poprawić żywotność komórek.
   5. Po usieciowaniu etapu 1 użyj urządzenia do biodrukowania, aby utworzyć pożądane struktury hydrożelowe zawierające pierwotne sferoidy wątroby (lub inne komórki).
      Uwaga: Ta technologia zapewnia system do biofabrykacji szerokiej gamy konstrukcji. Parametry takie jak objętość całkowita, liczba komórek lub sferoid, geometria drukowanej struktury i podłoże, na którym drukowane są konstrukcje, są w dużym stopniu zależne od celów użytkownika.
   6. Po osadzeniu do żądanej konfiguracji podawaj światło UV przez 2-4 sekundy, aby zainicjować wtórny mechanizm sieciowania, stabilizując konstrukcje i zwiększając sztywność do pożądanego poziomu.
      Uwaga: Stężenie PEG-alkinu, a tym samym ogólna końcowa gęstość usieciowania, przede wszystkim kontroluje końcową sztywność konstrukcji.
   7. Powtórz kroki 3.2.4 i 3.2.5, aby utworzyć konstrukcje wielowarstwowe.

Results

Gdy opisane powyżej procedury są przestrzegane prawidłowo, hydrożele powinny zawierać profil biochemiczny specyficzny dla docelowego typu ^tkanki,20 umożliwiać wysoki stopień kontroli nad biodrukowaniem i końcowym modułem sprężystości,34 oraz wspierać żywotne funkcjonalne komórki w konstruktach tkankowych.

Dostosowywanie hydrożelu
Aby jak najlepiej naśladować natywną wątrobę, hydrożelowy...

Discussion

Istnieje kilka elementów, które należy wziąć pod uwagę podczas próby biofabrykacji konstruktów tkanek 3D, do ewentualnego zastosowania u ludzi lub do zastosowań przesiewowych in vitro . Zastosowanie odpowiednich komponentów komórkowych określa potencjalną funkcjonalność końcową, podczas gdy samo urządzenie do biofabrykacji określa ogólną metodologię osiągnięcia konstruktu końcowego. Trzeci składnik, biomateriał, jest równie ważny, ponieważ pełni podwójną rolę. W szczególności komponent biomateriałowy musi być ko...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kwas hialuronowy	Sigma	53747
Żelatyna	Sigma	G6144
2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone	Sigma	410896
Zestaw hydrożelu kwasu hialuronowego i żelatyny (HyStem-HP)	ESI-BIO	GS315	Zestaw zawiera składniki Heprasil (tiolowany i heparynizowany kwas hialuronowy), Gelin-S (tiolowany żelatyna) oraz Extralink (PEGDA)
PEG 8-Arm Alkyne, 10  kDa	Creative PEGWorks	PSB-887
Pierwotne ludzkie hepatocyty	Triangle Research Labs	HUCPM6
Pierwotne ludzkie komórki gwiaździste wątroby	ScienCell	5300
Pierwotne ludzkie komórki Kupffera	Technologie życia	HUKCCS
Podłoże podstawowe (HBM)	Lonza	CC-3199
Pożywka dla hepatocytów Zestaw suplementów	Lonza	CC-3198	HCM SingleQuot Kit (zawiera kwas askorbinowy, 0,5  Ml; Albumina surowicy bydlęcej [bez kwasów tłuszczowych], 10  Ml; siarczan gentamycyny/amfoterycyna B, 0,5  Ml; hydrokortyzon 21-hemibursztynian, 0,5  Ml; insulina, 0,5  Ml; ludzki rekombinowany naskórkowy czynnik wzrostu, 0,5  Ml; przenoszenie, 0,5  ml)
Triton X-100	Sigma	T9284	Inni producenci są ok.
Wodorotlenek amonu	Fischer Scientific	A669	Inni producenci są w porządku.
Świeże tkanki zwłok świń	n/	a n/d
Liofilizator	dowolny	n/d
Młyn zamrażarczy	dowolny	n/a
Biodrukarka	n/a	n/d	Opisana tutaj biodrukarka została zbudowana na zamówienie we własnym zakresie. Ogólnie rzecz biorąc, inne urządzenia są odpowiednie, pod warunkiem, że obsługują sterowany komputerowo druk materiałów hydrożelowych oparty na wytłaczaniu.
Wisząca płytka do hodowli kropelkowej	InSphero	CS-06-001	Platforma hodowli 3D InSphero GravityPlus