Wykorzystanie wielokompartmentowego dynamicznego fantomu pojedynczego enzymu do badań hiperspolaryzowanych czynników rezonansu magnetycznego

Podsumowanie

Wielokompartmentowy dynamiczny fantom jest używany do symulacji niektórych interesujących biologicznych badań metabolicznych przy użyciu hiperspolaryzowanych czynników rezonansu magnetycznego.

Streszczenie

Obrazowanie hiperspolaryzowanych substratów za pomocą rezonansu magnetycznego jest bardzo obiecujące klinicznie dla oceny krytycznych procesów biochemicznych w czasie rzeczywistym. Ze względu na fundamentalne ograniczenia narzucone przez stan hiperpolaryzacyjny, powszechnie stosuje się egzotyczne techniki obrazowania i rekonstrukcji. Niezwykle potrzebny jest praktyczny system do charakteryzowania dynamicznych, wielospektralnych metod obrazowania. Taki system musi w sposób powtarzalny odzwierciedlać odpowiednią dynamikę chemiczną tkanek normalnych i patologicznych. Najczęściej stosowanym do tej pory substratem jest hiperspolaryzowany [^1-13C]-pirogronian do oceny metabolizmu nowotworów. Opisujemy system fantomowy oparty na enzymach, który pośredniczy w przemianie pirogronianu w mleczan. Reakcja jest inicjowana przez wstrzyknięcie czynnika hiperpolaryzowanego do wielu komór wewnątrz fantomu, z których każda zawiera różne stężenia odczynników kontrolujących szybkość reakcji. Konieczne jest zastosowanie wielu przedziałów, aby sekwencje obrazowania wiernie oddawały przestrzenną i metaboliczną heterogeniczność tkanki. System ten pomoże w rozwoju i walidacji zaawansowanych strategii obrazowania, zapewniając dynamikę chemiczną, która nie jest dostępna w przypadku konwencjonalnych fantomów, a także kontrolę i odtwarzalność, które nie są możliwe in vivo.

Wprowadzenie

Kliniczny wpływ hiperpolaryzowanego rezonansu magnetycznego (MRI) ¹³związków znakowanych metodą C jest krytycznie zależny od jego zdolności do pomiaru współczynników konwersji chemicznej za pomocą spektroskopii rezonansu magnetycznego w czasie rzeczywistym i obrazowania spektroskopowego^1-5. Podczas opracowywania i weryfikacji sekwencji dynamiczna konwersja chemiczna jest na ogół osiągana za pomocą modeli in vivo lub in vitro ^6-9, które oferują ograniczoną kontrolę i odtwarzalność. W celu zapewnienia solidnych testów i zapewnienia jakości preferowany byłby bardziej kontrolowany system, który zachowuje konwersję chemiczną typową dla tego pomiaru. Przedstawiamy metodę osiągnięcia tej konwersji w powtarzalny sposób przy użyciu dynamicznego fantomu pojedynczego enzymu.

Większość badań z hiperpolaryzowanymi ^{środkami 13}C skupia się na obrazowaniu hiperspolaryzowanych substratów w funkcjonującym środowisku biologicznym. Jest to oczywisty wybór, jeśli celem jest badanie procesów biologicznych lub określenie potencjalnego wpływu na opiekę kliniczną. Jeśli jednak pożądane jest scharakteryzowanie jakiegoś systemu pomiarowego lub algorytmu przetwarzania danych, modele biologiczne mają liczne wady, takie jak nieodłączna zmienność przestrzenna i czasowa¹⁰. Jednak konwencjonalne fantomy statyczne nie mają konwersji chemicznej, która napędza główne zainteresowanie kliniczne MRI hiperspolaryzowanych substratów i nie mogą być używane do charakteryzowania wykrywania współczynników konwersji lub innych parametrów dynamicznych¹¹. Korzystając z pojedynczego systemu enzymatycznego, możemy zapewnić kontrolowaną i powtarzalną konwersję chemiczną, umożliwiając rygorystyczne badanie dynamicznych strategii obrazowania.

Ten system jest skierowany do badaczy, którzy opracowują strategie obrazowania dla hiperspolaryzowanych substratów i chcą scharakteryzować wydajność do porównania z alternatywnymi podejściami. Jeśli pomiary statyczne są pożądanym punktem końcowym, wówczas wystarczą statyczne fantomy ^{metabolitów 13}z wykrywaniem C¹¹. Z drugiej strony, jeśli bardziej złożona charakterystyka biologiczna ma kluczowe znaczenie dla metody (dostarczanie, gęstość komórkowa itp.), wówczas potrzebne będą rzeczywiste modele biologiczne^12-14. System ten idealnie nadaje się do oceny strategii obrazowania, które mają na celu zapewnienie ilościowej miary pozornych współczynników konwersji chemicznej.

Protokół

UWAGA: (Phantom Design) Dwie komory o pojemności 3 ml zostały wykonane z Ultema i wyposażone w rurki PEEK (1,5875 mm średnicy zewnętrznej i 0,762 mm średnicy) do wtrysku i wydechu. Komory umieszczono w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml wypełnionej wodą (ryc. 1). Aby uniknąć pustek sygnałowych tworzonych przez pęcherzyki, komory i przewody zostały wstępnie wypełnione wodą dejonizowaną (dH₂O).

1. Przygotowanie roztworu

1. Przygotować 1 l roztworu buforowego (81,3 mM Tris pH 7,6, 203,3 mM NaCl). Odważyć 11,38 g wstępnie ustawionych kryształów Trizma o pH 7,6 i 11,88 g NaCl i rozpuścić w 1 l dH₂O.
2. Przygotuj 50 mM roztwór NADH. Odważyć 17,8 mg dinukleotydu β-nikotynamidoadeninowego (NADH), zredukowanej soli dipotasowej i rozpuścić w 280 μl roztworu buforowego, który został przygotowany w kroku pierwszym.
3. Przygotować roztwór enzymatyczny o stężeniu 250 j./ml. Odważyć 78,75 jednostek aktywności dehydrogenazy mleczanowej (LDH) i rozpuścić w buforze o stężeniu 315 μl z kroku pierwszego.
4. Przygotuj mieszankę kwasu pirogronowego. Odważyć 21,4 mg rodnika trytylowego Ox063 i rozpuścić w 1,26 g (~1 ml) [^1-13C] kwasu pirogronowego.
5. Przygotować pożywkę do usuwania (40 mM Tris pH 7,6, 40 mM NaOH, 0,27 mM EDTA i 50 mM NaCl). Odważyć 5,96 g wstępnie ustawionych kryształów Trizma o pH 7,6, 1,6 g NaOH, 0,1 g odwodnionej soli disodowej kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i 2,9 g NaCl i rozpuścić w 1 l dH₂O.
6. Przygotować roztwór gadoteridolu w stosunku 1:10 (50 mM). Zmieszać 1 μl gadoteridolu z 9 μl dH₂O. Przygotowanie 8 M [¹³C] mocznika. Odważyć 1,465 5 [¹³C] mocznika i rozpuścić w 3 ml dH₂O.

2. Przygotowanie hiperspolaryzowanego pirogronianu

1. W kubku na próbkę do systemu dynamicznej polaryzacji jądrowej (DNP) odpipetować 0,3 μl roztworu gadoteridolu i 13 mg (~10 μl) roztworu kwasu pirogronowego.
2. Krótko wymieszać tę mieszaninę w kubku na próbkę za pomocą końcówki pipety.
3. Wstaw próbkę do systemu DNP.
   1. Upewnij się, że drzwi do systemu DNP są zamknięte. Rozpocznij proces wstawiania próbki, klikając przycisk wstawiania próbki w konsoli systemowej DNP. W kreatorze próbek wybierz normalną próbkę i naciśnij przycisk dalej.
   2. Trzymając kubek na próbkę w pozycji pionowej, delikatnie umieść pręt wprowadzający na górze kubka na próbkę. Po wyświetleniu monitu otwórz system DNP i włóż kubek do wkładki o zmiennej temperaturze (VTI) za pomocą pręta wprowadzającego.
   3. Pociągnąć za tłok znajdujący się na końcu pręta wprowadzającego próbkę, aby uwolnić próbkę o zmiennym wskaźniku temperatury. Wyjmij pręt wprowadzający próbkę z systemu i kliknij przycisk Dalej na konsoli systemowej DNP.
4. Zainicjuj polaryzację.
   1. Kliknij przycisk rozpoczęcia polaryzacji na konsoli systemu DNP. W oprogramowaniu RINMR wpisz . HYPERSENSENMR w celu uruchomienia oprogramowania do monitorowania polaryzacji. Ustaw konfigurację kompilacji na 1 i naciśnij enter. Następnie kliknij solidną budowę.
   2. Ustaw lokalizację i nazwę pliku zapisu. Wybierz profil dla 13-C z rozwijanej zakładki w konsoli systemowej DNP i kliknij Dalej. Zaznacz pole wyboru do pobierania próbek podczas narastania, ustaw czas próbkowania na 300 sekund i kliknij przycisk Zakończ.
5. Odmierzyć 3,85 g (~ 4 ml) roztworu do rozpuszczania objętościowo za pomocą strzykawki o pojemności 5 ml lub wagowo za pomocą wagi.

3. Przygotowanie fantomu enzymu

1. Napełnij probówkę do mikrowirówki ~3 ml [¹³C] roztworu mocznika i umieść ją w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. Napełnić probówkę wirówkową o pojemności 50 ml dH₂O.
2. Wstępnie napełnić dwie komory enzymatyczne i przewody_dH2O, wstrzykując ~3 ml_dH2Odo przewodów iniekcyjnych fantomu, uważając, aby wypłukać wszelkie powstałe pęcherzyki.
3. Umieść fantom na środku magnesu z łatwym dostępem do przewodów wtryskowych. Upewnij się, że jest jakiś pojemnik do złapania płynu, który będzie odprowadzał się do przewodu wydechowego.
4. Przygotować mieszaninę enzymów o wysokiej aktywności (17,14 mM NADH, 44,57 U/ml LDH). Zmieszać 240 μl roztworu NADH, 125 μl roztworu LDH i 335 μl buforu i przechowywać w strzykawce o pojemności 3 ml, którą można podłączyć do przewodu iniekcyjnego.
   UWAGA: Po połączeniu z 500 μl 40 mM pirogronianu z systemu DNP, końcowa objętość fantomu wyniesie 1,2 ml przy stężeniach 16,7 mM pirogronianu, 10 mM NADH i 26 U/L LDH w roztworze buforowanym tris o pH ~ 7,5.
5. Przygotować mieszaninę enzymów o niskiej aktywności (17,14 mM NADH 26,79 U/ml LDH) Wymieszać 240 μl roztworu NADH, 75 μl roztworu LDH i 385 μl buforu i przechowywać w oddzielnej strzykawce o pojemności 3 ml, którą można podłączyć do przewodu iniekcyjnego.
   UWAGA: Po połączeniu z 500 μl 40 mM pirogronianu z systemu DNP końcowa objętość fantomu wyniesie 1,2 ml przy stężeniach 16,7 mM pirogronianu, 10 mM NADH i 15,625 U/L LDH w roztworze buforowym tris o pH ~ 7,5.

4. Uruchom dowolne skanowanie kontroli jakości (QA) i pozycjonowania

1. Pozycjonowanie początkowe.
   1. Załaduj nowy skan pozycjonowania lampy błyskowej w trybie pracy [¹H] Tryb głośności TX/RX. Zmień ustawienia wymiarów na 2: Narzędzie do sterowania spektrometrem -> Edytuj GS -> Ustaw wymiary -> 2. Naciśnij GSP na sterowaniu spektrometrem i przesuwaj fantom, aż zostanie wyśrodkowany w magnesie. Naciśnij STOP, a następnie naciśnij GOP na sterowaniu spektrometru.
2. Skanowanie pilotażowe.
   1. Załaduj nowy skan pozycjonowania TriPiolt w trybie pracy [¹H] Tryb głośności TX/RX. Pozycja plasterka: Kontrola skanowania -> narzędzie Slice- > przesuwać plasterki (przytrzymaj M, kliknij i przeciągnij; wybierz plasterek, aby przesunąć za pomocą suwaka pakietu plasterków).
   2. Cewka Wobble ¹H: Narzędzie sterujące spektrometrem - > Acq -> Wobble. Dostrój i dopasuj cewkę ¹H za magnesem i naciśnij STOP. Przytrzymując Shift, naciśnij sygnalizację świetlną w oknie sterowania skanowaniem.

5. Ustawienia skanowania obrazowania spektralnego Radial Echo Planar Spectral

1. Załaduj nowy skan spektroskopii echo radialnego (radEPSI) w trybie pracy [¹³C] Tryb głośności TX/RX. Ustaw plasterek: narzędzie Cięcie na plasterki w kontrolce skanowania i przesuwaj plasterki (przytrzymaj M, kliknij i przeciągnij; wybierz plasterek, aby przesunąć za pomocą suwaka pakietu plasterków).
2. Zawiot cewkę ¹³C, klikając Narzędzie do sterowania spektrometrem - > Acq -> Wobble. Ustaw wzmocnienie odbiornika na 1,000-2,000 na spektrometrze.
3. Wykonaj końcowe sprawdzenie systemu. W zależności od sekwencji, obserwuj sygnał węgla 13 z komory mocznikowej w protokole zwiadowczym.
   UWAGA: Gwarantuje to, że system jest prawidłowo skonfigurowany przed rozpoczęciem procesu nieodwracalnego rozpuszczania.

6. Uruchom rozwiązanie

1. Gdy pirogronian osiągnie polaryzację >90% (~ 1 godz.), roztwory i fantom są gotowe, a skanowanie jest skonfigurowane, kliknij przycisk uruchom rozpuszczanie na konsoli systemowej DNP.
2. Po wyświetleniu monitu przesuń patyczek do rozpuszczania do pozycji roboczej i wstrzyknij pożywkę do rozpuszczania. Zamknij system DNP i kliknij przycisk Gotowe w konsoli systemu DNP. Po wyświetleniu monitu przesuń drążek do rozpuszczania z powrotem do pozycji spoczynkowej, a następnie kliknij przycisk Zakończ.
3. Gdy system DNP dostarczy hiperspolaryzowany pirogronian (~ 2 min po rozpoczęciu ogrzewania), należy pobrać 500 μl roztworu pirogronianu do każdej strzykawki z roztworem o wysokim i niskim stężeniu enzymów. Powoli (~10 sekund) wstrzyknąć każdą strzykawkę do przewodu iniekcyjnego.
   UWAGA: Skanowanie można było rozpocząć przed wstrzyknięciem lub w dowolnym momencie do 3 minut po wstrzyknięciu, w zależności od zastosowanego protokołu skanowania.

7. Przetwarzanie obrazu

UWAGA: Ten fantom został zaprojektowany do użytku z wieloma strategiami obrazowania. Zobacz rysunek 2, jako przykład tego, jak obrazy rad-EPSI zostały przetworzone za pomocą Matlaba.

1. Załaduj nieprzetworzone dane z pliku fid. Przekształć dane, aby dopasować je do liczby projekcji, odczytywać punkty, echa i uwzględniać dane przechowywane jako pary rzeczywiste i wyimaginowane. Oddziel parzyste i nieparzyste punkty echa.
2. Fourier przekształca parzyste lub nieparzyste echa wzdłuż wymiarów echa. Wizualnie zidentyfikuj pasma częstotliwości dla pirogronianu i mleczanu. Dla uproszczenia przyjęto bezwzględną wartość widma.
3. Oddziel każde pasmo metabolitu i przekształć Fouriera wzdłuż kierunku kodowania częstotliwości, aby uzyskać izolowane sinogramy dla każdego metabolitu. Odwrócony radon przekształca oddzielne sinogramy w celu uzyskania obrazu mleczanu lub pirogronianu.

Wyniki

Dwuwymiarowe obrazy selektywne dla warstwy pozyskano przy użyciu sekwencji snapshot radEPSI. Obrazy metabolitów zrekonstruowano metodą filtrowanej projekcji wstecznej. Obrazy metabolitów były dobrze dopasowane do obrazów protonowych, co przedstawiono na Rysunku 2. W tym układzie sygnał hiperpolaryzowanego mleczanu może być generowany wyłącznie w wyniku enzymatycznej konwersji hiperpolaryzowanego pirogronianu. Na Rysunku 4 dolna komora, z wyższym stężeniem...

Dyskusja

Obrazowanie hiperspolaryzowanych metabolitów w czasie rzeczywistym wiąże się z wieloma unikalnymi wyzwaniami związanymi z projektowaniem sekwencji, walidacją i kontrolą jakości. Zdolność do rozwiązania problemu niejednorodności czasoprzestrzennej i spektralnej oferuje znaczny potencjał kliniczny, ale wyklucza metody kontroli jakości i walidacji związane z konwencjonalnym rezonansem magnetycznym. Złożone sekwencje obrazowania lub algorytmy rekonstrukcji mogą mieć subtelne zależności, które utrudniają ich scharakteryzowani...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
BioSpect 7T	Bruker	BioSpec 70/30 USR	7 Tesla Przedkliniczny skaner MRI
HyperSense	Oxford Instruments	Hypersense DNP Polaryzator Dynamiczny	polaryzator jądrowy do agentów MRI
1-13C-Kwas pirogronowy	Sigma Aldrich	677175	Carbon 13 klarowany czysty kwas pirogronowy
Trityl	Radical GE Healthcare	OX063	Wolny rodnik stosowany w dynamicznej polaryzacji jądrowej
NaOH	Sigma Aldrich	S8045
EDTA	Sigma Aldrich	E6758	Kwas etylenodiaminotetraoctowy
LDH	Worthingthon	LS002755	Dehydrogenaza mleczanowa z mięśni królika
NADH	Sigma Aldrich	N4505	β-dinukleotyd nikotynamidoadeninowy, zredukowana sól dipotasowa
Trizma	Sigma Aldrich	T7943	Trizma Wstępnie ustawione kryształy
NaCl	Sigma Aldrich	S7653