Korzystanie z Tomoauto: protokół dla wysokowydajnej zautomatyzowanej tomografii krioelektronowej

Summary

Przedstawiamy protokół, jak wykorzystać wysokoprzepustową tomografię krioelektronową do określenia wysokiej rozdzielczości struktur in situ maszyn molekularnych. Protokół pozwala na przetwarzanie dużych ilości danych, pozwala uniknąć typowych wąskich gardeł i skraca przestoje zasobów, pozwalając użytkownikowi skupić się na ważnych kwestiach biologicznych.

Abstract

Krioelektronowa tomografia (Cryo-ET) to potężna trójwymiarowa (3-D) technika obrazowania do wizualizacji kompleksów makromolekularnych w ich naturalnym kontekście na poziomie molekularnym. Technika ta polega najpierw na zachowaniu próbki w jej naturalnym stanie poprzez szybkie zamrożenie próbki w szklistym lodzie, następnie zebranie serii mikrofotografii pod różnymi kątami przy dużym powiększeniu, a na koniec obliczeniową rekonstrukcję trójwymiarowej mapy gęstości. Zamrożona, uwodniona próbka jest niezwykle wrażliwa na wiązkę elektronów, dlatego mikrofotografie są zbierane przy bardzo niskich dawkach elektronów, aby ograniczyć uszkodzenia spowodowane promieniowaniem. W rezultacie, surowy kriotomogram ma bardzo niski stosunek sygnału do szumu, charakteryzujący się z natury zaszumionym obrazem. Aby lepiej uwidocznić interesujące nas obiekty, stosuje się konwencjonalną analizę obrazową i uśrednianie subtomogramowe, w którym subtomogramy obiektu są ekstrahowane z początkowego tomogramu, a następnie wyrównywane i uśredniane, w celu poprawy zarówno kontrastu, jak i rozdzielczości. Duże zbiory danych szeregów nachylenia są niezbędne do zrozumienia i rozwiązania kompleksów w różnych stanach, warunkach lub mutacjach, a także do uzyskania wystarczająco dużej kolekcji podtomogramów do uśredniania i klasyfikacji. Gromadzenie i przetwarzanie tych danych może być poważną przeszkodą uniemożliwiającą dalszą analizę. W tym miejscu opisujemy wysokoprzepustowy protokół cryo-ET oparty na sterowanym komputerowo mikroskopie krioelektronowym 300 kV, kamerze urządzenia do bezpośredniej detekcji (DDD) oraz wysoce efektywnej, półautomatycznej bibliotece opakowań oprogramowania do przetwarzania obrazów tomoauto. Protokół ten został skutecznie wykorzystany do wizualizacji nienaruszonego systemu wydzielania typu III (T3SS) w minikomórkach Shigella flexneri. Może mieć zastosowanie do każdego projektu odpowiedniego dla cryo-ET.

Introduction

Systemy sekrecji typu III (T3SS) są istotnymi determinantami wirulencji dla wielu patogenów Gram-ujemnych. Iniekcjon, znany również jako kompleks igieł, jest centralną maszyną T3SS wymaganą do bezpośredniej translokacji białek efektorowych z bakterii do eukariotycznych komórek gospodarza^{1, 2}. Iniekcjon składa się z igły zewnątrzkomórkowej, ciała podstawnego i kompleksu cytoplazmatycznego, znanego również jako kompleks sortujący³. Wcześniejsze badania wyjaśniły struktury 3D oczyszczonych iniekcji z Salmonelli i Shigelli, wraz ze strukturami atomowymi głównych białek ciała podstawnego^{4, 5}. Niedawne struktury in situ iniekcji z Salmonelli, Shigelli i Yersinia zostały ujawnione przez cryo-ET^{6, 7}. Jednak kompleks cytoplazmatyczny, niezbędny do selekcji efektorów i składania igieł, nie został uwidoczniony w tych strukturach.

Cryo-ET jest najbardziej odpowiednią techniką do obrazowania maszynerii molekularnej w rozdzielczości nanometrowej w jej natywnym kontekście komórkowym (in situ). Niemniej jednak rozdzielczość osiągalna przez cryo-ET jest ograniczona przez grubość próbki. Aby przezwyciężyć tę wadę, zobrazowaliśmy nienaruszone inisomy w zjadliwym szczepie Shigella flexneri, który został genetycznie zmodyfikowany w celu wytworzenia minikomórek wystarczająco cienkich dla cryo-ET. Kolejnym ograniczeniem cryo-ET jest wrażliwość próbki na promieniowanie indukowane przez wiązkę elektronów, która bardzo szybko niszczy informacje o wysokiej rozdzielczości w próbce. W związku z tym dla poszczególnych obrazów nachylenia stosuje się bardzo niskie dawki, dzięki czemu odpowiednia dawka może być rozprowadzona między pełnymi seriami pochylenia. To znacznie obniża stosunek sygnału do szumu (SNR) w końcowej rekonstrukcji, co utrudnia odróżnienie cech strukturalnych obiektu od dużej ilości szumu w tomogramie i ogranicza rozdzielczość, którą można osiągnąć za pomocą cryo-ET. Konwencjonalne przetwarzanie obrazu, takie jak filtry Fouriera i filtry w przestrzeni rzeczywistej, a także próbkowanie w dół, mogą być używane do zwiększania kontrastu, ale kosztem odfiltrowywania większości informacji o wysokiej rozdzielczości. Ostatnio uśrednianie subtomogramowe umożliwiło znaczne zwiększenie SNR, a następnie końcowej rozdzielczości w niektórych przypadkach do poziomów subnanometrowych^{8, 9}. Bardziej szczegółowa analiza kompleksów jest możliwa dzięki obliczeniowemu wyodrębnieniu tysięcy podtomogramów zawierających obszary zainteresowania z oryginalnych tomogramów, a następnie wyrównaniu i uśrednieniu podtomogramów w celu określenia in situ złożonych struktur o wyższym SNR i wyższej rozdzielczości. Metody te można zintegrować z podejściami genetycznymi, aby zapewnić jeszcze lepszy wgląd w zespoły makromolekularne i ich dynamiczne konformacje w natywnym kontekście komórkowym.

Ogólnie rzecz biorąc, dziesiątki, a nawet setki tysięcy sub-tomogram muszą być uśrednione, aby określić struktury o wysokiej rozdzielczości in situ. Pozyskanie wystarczającej liczby serii tilt-ów potrzebnych do wyprodukowania tak dużej liczby sub-tomogramów szybko staje się wąskim gardłem. Powstałe w ten sposób serie pochylenia są często narażone na przesunięcie wywołane wiązką, luz stopnia, a także wady powiększenia, obrotu i skośności, które muszą zostać rozwiązane, aby wyrównać serie pochylenia przed rekonstrukcją. Seria przechyłu jest zwykle wyrównywana przez śledzenie złotych znaczników odniesienia, które są tradycyjnie wybierane ręcznie poprzez kontrolę serii przechyłu, co powoduje kolejne wąskie gardło. Opracowano wiele pakietów oprogramowania do automatycznej akwizycji serii nachylenia za pomocą sterowanych komputerowo mikroskopów elektronowych^{10, 11, 12}, wyrównywania i rekonstrukcji serii pochylenia^{13, 14} oraz subtomogramu o średniej^15-18. Ponieważ pakiety te obsługują dyskretne operacje w przepływie pracy cryo-ET, pożądane staje się wbudowanie wyższego poziomu abstrakcji w proces, aby systematycznie usprawniać cały schemat w jednym potoku. W związku z tym opracowaliśmy bibliotekę opakowań oprogramowania "tomoauto" zaprojektowaną w celu zorganizowania wielu z tych pakietów w jedną półautomatyczną jednostkę, co pozwala na prostą obsługę użytkownika przy jednoczesnym zachowaniu pełnej konfiguracji każdego komponentu w sposób scentralizowany. Biblioteka jest open-source, dobrze udokumentowana, stale rozwijana i swobodnie dostępna do użytku, dostosowanego do potrzeb rozwoju lub dalszej integracji za pomocą internetowego zdalnego repozytorium kodu źródłowego (http://github.com/DustinMorado/tomoauto).

Ten wysokoprzepustowy potok cryo-ET został wykorzystany do wizualizacji nienaruszonych iniekcji w minikomórkach S. flexneri. Tą metodą wygenerowano łącznie 1917 tomogramów, ujawniając strukturę in situ nienaruszonej maszyny, w tym cytoplazmatyczną platformę sortowania, określoną przez subtomogram wynoszący^{średnio 19}. Wraz z modelowaniem molekularnym maszyn typu dzikiego i zmutowanego, nasza wysokowydajna linia produkcyjna zapewnia nową drogę do zrozumienia struktury i funkcji nienaruszonego iniekcyjnego w natywnym kontekście komórkowym.

Protocol

1. Przygotowanie minikomórki

1. Aby wytworzyć minikomórki S. flexneri, przekształć 1 μl plazmidu pBS58, który konstytutywnie wyraża geny podziału komórek Escherichia coli ftsQ, ftsA i ftsZ z plazmidu opornego na spektynomycynę o niskiej kopii w 5 μl elektrokompetentnych komórek serotypu 5a opornego na streptomycynę (M90T-Sm) przez elektroporację przy 2,5 kV przez 5 ms w kuwetach 1 mm.
2. Przechowuj próbki minikomórek w temperaturze -80 °C w 15% glicerolu w mikroprobówce kriogenicznej o pojemności 1,5 ml. Gdy jest gotowy do użycia, zeskrobać około 5 μl komórek z nierozmrożonej mikroprobówki za pomocą końcówki pipety i zawiesić komórki w 4 ml tryptycznego bulionu sojowego z dodatkiem spektynomycyny o stężeniu 100 μg/ml. Uprawiać O/N w temperaturze 37 °C.
3. Odmierzyć pipetą 2 ml kultury z 1,2 do 200 ml tryptycznego bulionu sojowego z ponownie dodaną spektynomycyną do stężenia 100 μg/ml. Rośnie w temperaturze 37 °C do późnej fazy logarytmicznej.
4. Aby wzbogacić minikomórki, odwirować 200 ml kultury z 1,3 przy 1 000 x g przez 5 minut. Ostrożnie wlać frakcję sklarowanej nad osadem do nowej probówki wirówkowej i wirować przy 20 000 x g przez 10 minut. Ostrożnie odlać i wyrzucić frakcję sklarowanej nad osadem, a następnie delikatnie wymieszać osad z pozostałą cieczą za pomocą końcówki pipety i przenieść około 100 μl mieszaniny osadów do probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.

2. Przygotowanie siatki EM

1. Umieść dziurawą folię węglową R2/2 o oczkach miedzianych o oczkach węglowych stroną z węgla do góry na szklanym szkiełku.
   UWAGA: Siatka R2/2 o siatce 200 została wybrana, aby zmaksymalizować liczbę serii pochylenia, które można ustawić tak, aby uzyskać w jednym kwadracie siatki, jednocześnie podtrzymując próbkę i umieszczając krawędź folii węglowej w polu kamery pod żądanym powiększeniem. Do próbek obrazowanych w większym powiększeniu można stosować siatki o mniejszych oczkach i mniejsze, dziurawe folie węglowe, takie jak siatka R1.2/1.3 400; większe dziurawe folie węglowe, takie jak R3.5/1 200-mesh, mogą być używane do próbek obrazowanych w mniejszym powiększeniu lub jeśli mikrofotografia nie powinna zawierać krawędzi węglowej, a dziurawe folie węglowe o większych odstępach, takie jak R1/4 200-mesh, mogą być używane do pomocy w wyrównaniu stolika do obszaru zainteresowania i ochronie obszarów przed nadmierną ekspozycją podczas rutynowych ustawiania ostrości i śledzenia.
2. Umieść szkiełko na platformie w urządzeniu do wyładowywania jarzeniowego.
   UWAGA: Używamy własnego urządzenia, w którym anoda i platforma zostały obrobione w eksykator próżniowy i są zasilane przez generator wysokiej częstotliwości. Po wytworzeniu próżni podłącz sondę generatora wysokiej częstotliwości do anody i włącz sondę na 1 minutę, aby rozładować siatkę. Czas potrzebny do rozładowania żarzenia siatki może wynosić od kilku sekund do minuty. Zmiana czasu wyładowania jarzeniowego może być wykorzystana do zdiagnozowania problemów ze stężeniem próbki i siatkami, które wydają się suche bez szklistego lodu.
3. Usuń siatkę za pomocą zestawu kleszczy i zablokuj kleszcze zamknięte elastyczną opaską.
4. Dodać 100 μl roztworu złota koloidalnego o długości fali 10 nm do probówki mikrowirówki z minikomórkami przygotowanymi w 1.4 i wymieszać, delikatnie przesuwając probówkę palcem. Za pomocą nowej pipety umieścić 4 μl mieszaniny na ruszcie przygotowanym w 2.2.
   UWAGA: Złoto koloidalne jest dostępne w różnych rozmiarach i należy zadbać o to, aby rozmiar złota był większy niż 5 pikseli, biorąc pod uwagę rozmiar pikseli mikrofotografii, które mają być przetwarzane przy uzyskanym powiększeniu, a jednocześnie nie był zbyt duży, aby zasłaniać interesujące go cechy.
5. Przygotować aparat do zamrażania wgłębnego; napełnić zewnętrzny pojemnik do zamrażania ciekłym azotem, a następnie napełnić komorę wewnętrzną ciekłym etanem. Przymocuj kleszczyki z siatką do tłoka i zablokuj tłok w pozycji podniesionej.
   UWAGA: Patrz Iancu i wsp.²⁰ dla protokołu opisującego użycie komercyjnego urządzenia do zamrażania wgłębnego.
6. Osusz siatkę, ostrożnie dotykając kawałka bibuły filtracyjnej do kropli próbki, aż menisk między siatką a bibułą filtracyjną oddzieli się, a odprowadzanie wilgoci na bibule filtracyjnej ustanie, a następnie natychmiast zwolnij tłok, zamrażając siatkę. Ostrożnie wyjmij kleszcze z tłoka i umieść siatkę w uchwycie siatki.
7. Przygotować stację transferową cryo-EM, napełniając obszar załadunku i zbiornik pompy absorpcyjnej ciekłym azotem. Gdy obszar załadunku osiągnie temperaturę ciekłego azotu, umieść w nim uchwyt siatki i wkład z próbką mikroskopu.
8. Ostrożnie zdejmij pierścień blokujący, który jest albo małym gwintowanym pierścieniem blokującym we wcześniejszych mikroskopach Polara, albo pierścieniem zaciskowym typu C w nowszych modelach; umieść siatkę EM we wkładzie za pomocą kleszczyków, a następnie delikatnie przymocuj pierścień blokujący z powrotem do wkładu, zabezpieczając siatkę.
9. Wyjmij uchwyt na wiele próbek z mikroskopu i przymocuj go do stacji transferowej. Umieść wkład z próbką w uchwycie za pomocą kleszczyków do wkładów i wycofaj uchwyt z obszaru załadunku, a następnie przenieś uchwyt na wiele próbek z powrotem do mikroskopu.
   UWAGA: Patrz Chen i wsp.²¹ dla protokołu wizualnego szczegółowo opisanego w pkt 2.1–2.9.

3. Wysokowydajna zautomatyzowana kolekcja serii Tilt

1. Kolekcja map w małym powiększeniu
   1. Otwórz nowe okno Nawigatora, klikając 'Otwórz' w menu 'Nawigator' SerialEM¹⁰ (http://bio3d.colorado.edu/SerialEM)
   2. Znajdź kwadraty siatki, które zawierają akceptowalne warunki obrazowania (tj. cienki lód, brak zanieczyszczeń, przedmiot zainteresowania) za pomocą ekranu fluorescencyjnego przy małym powiększeniu (~2,300X dla próbki minikomórki).
      UWAGA: [Opcjonalnie: Ten krok można zautomatyzować za pomocą SerialEM, montując całą siatkę, jednak szybsze może być po prostu ręczne wybranie kilku obszarów.]
   3. Dostosuj stolik do wysokości eucentrycznej, przechylając uchwyt próbki do 50°, a następnie wyreguluj wysokość z, aż przesunięcie stolika x-y między widokami pochylonymi i niepochylonymi będzie minimalne.
   4. Przejdź do środka kwadratu siatki i kliknij przycisk "Dodaj pozycje etapu" w oknie Nawigatora, aby zapisać aktualną pozycję etapu.
   5. Kontynuuj kroki 3.1.1-4 powyżej, aż wszystkie dopuszczalne pozycje etapu kwadratów siatki zostaną zapisane.
   6. Otwórz nowy plik montażowy MRC, klikając "Nowy montaż" w menu "Plik". W oknie dialogowym Ustawienia montażu, które się otworzy, wybierz liczbę elementów w X i Y, które zajmą cały kwadrat siatki (np. 10 x 10 dla standardowej siatki 200). Użyj wysokiego binowania, takiego jak 8, i wybierz przyciski radiowe "Przesuń scenę zamiast przesuwania obrazu" i "Pomiń korelacje używane do wyrównywania elementów".
   7. W oknie Nawigatora kliknij pozycję pierwszego etapu i ustaw ją do pobrania, zaznaczając pole wyboru 'Pobierz'. Powtórz tę czynność dla każdej pozycji etapu w oknie Nawigatora.
   8. Otwórz okno dialogowe Navigator Acquire, klikając "Acquire at Points" w menu "Navigator". Zaznacz pola wyboru "Pobierz obraz mapy" i "Przybliżona eucentryczność" i upewnij się, że wszystkie inne pola wyboru nie są zaznaczone. Kliknij "Kontynuuj", aby zebrać montaż w każdej pozycji etapu.
2. Akwizycja serii Tilt
   1. W oknie Nawigatora wybierz jedną z pobranych map i kliknij przycisk "Załaduj mapę".
   2. W oknie Nawigatora kliknij przycisk 'Dodaj punkty' i wybierz punkty na mapie, w których chcesz uzyskać serię pochylenia. Następnie kliknij przycisk "Zatrzymaj dodawanie punktów". Powtórz te czynności dla każdej zebranej mapy.
   3. W menu Kamera wybierz "Parametry" i zdefiniuj parametry dla trybów Focus, Trial i Record. [Opcjonalnie: Dane frakcjonowane dawką można określić w parametrach dla trybu nagrywania.]
   4. Wybierz punkt w oknie Nawigatora i zaznacz pole wyboru 'Tilt-Series'. W oknie dialogowym Ustawienia serii pochylenia, które zostanie otwarte, wybierz żądane parametry dla kolekcji serii pochylania. Powtórz te czynności dla pozostałych zaznaczonych punktów w oknie Nawigatora, ale nie wybieraj map.
   5. W menu Nawigatora ponownie wybierz opcję "Zdobądź za punkty". W oknie dialogowym Navigator Acquire wybierz "Wyrównaj do elementu", "Autofokus" i "Szorstka eucentryczność" jako zadania wstępne, a następnie wybierz "Uzyskaj serię przechyłu" jako zadanie główne i wybierz "Zamknij zawory kolumny na końcu", aby zamknąć kolumnę, gdy wszystkie punkty zostaną zebrane. Po kontynuowaniu gry w każdym punkcie na każdej mapie zostanie zebrana seria tiltów.

4. Wysokowydajne zautomatyzowane przetwarzanie i rekonstrukcja serii przechyłów za pomocą Tomoauto

1. Korekcja ruchu wywołanego wiązką w danych frakcjonowanych dawką [opcjonalnie]
   UWAGA: Tomoauto używa MOTIONCORR²² (http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.html) do usuwania ruchu wywołanego wiązką z mikrofotografii frakcjonowanych dawką. W systemie musi być zainstalowany NOTIONCORR¹⁶.
   1. W przypadku oryginalnej serii tilt, dziennika wyjściowego z SerialEM¹⁰ i poszczególnych obrazów frakcjonowanych dawkowo, wszystkie w bieżącym katalogu roboczym, w terminalu wykonaj polecenie:
      dose_fractioned_to_stack
      <filename.st> to nazwa serii przechyłów do obróbki.
2. Wyrównanie i rekonstrukcja serii Tilt
   UWAGA: Tomoauto domyślnie używa IMOD¹³ (http://bio3d.colorado.edu/imod/) do obsługi automatycznego generowania modeli powierniczych serii pochyleń, wyrównania, określania funkcji transferu kontrastu (CTF), korekcji CTF²³ i rekonstrukcji. Alternatywnie, użytkownicy mają w tomoauto możliwość użycia RAPTOR²⁴ (zawartego w IMOD) do automatycznego generowania modeli powierniczych, CTFFIND4²⁵ (http://grigoriefflab.janelia.org/ctf) do określenia CTF i tomo3d²⁶ (https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d) do rekonstrukcji lub w dowolnej kombinacji pakietów oprogramowania według konfiguracji. Ta konfiguracja, jak również parametry dostępne w każdym pakiecie, są obsługiwane przez globalny plik konfiguracyjny Można je edytować w celu dopasowania do wartości najczęściej używanych w laboratorium, podczas gdy lokalne pliki konfiguracyjne mogą być również tworzone w celu wyszczególnienia parametrów używanych dla określonej próbki, zestawu kolekcji lub poszczególnych serii pochylenia. Wszystkie pakiety, które chcą być używane, muszą być zainstalowane w systemie.
   1. Z serią tilt w bieżącym katalogu roboczym, w terminalu wykonaj polecenie
      tomoauto --CTF --mode=wyrównaj
      <filename.st> to seria pochylenia do przetworzenia, a <fid_diam> to średnica znaczników odniesienia w nanometrach. To polecenie automatycznie wyrówna i oszacuje CTF serii pochylenia. Możliwe jest pominięcie przetwarzania CTF poprzez usunięcie opcji --CTF z polecenia.
   2. Sprawdź wizualnie wyrównaną serię pochylenia pod kątem rażących błędów w przetwarzaniu wyrównania i sprawdź szacowany CTF, wykonując polecenia:
      3dmod .ali
      submfg _ctfplotter.com
      odpowiednio, gdzie jest nazwą serii tilt bez sufiksu. Sprawdź również dane wyjściowe polecenia tomoauto, aby zobaczyć średni błąd resztkowy generowany przez wyrównanie, który jest ilościową statystyką jakości wyrównania.
   3. Biorąc pod uwagę akceptowalne wyrównanie, kontynuuj przetwarzanie, wykonując polecenie:
      tomoauto --CTF --mode=zrekonstruować
      z takimi samymi podstawieniami użytkowników, jak w 4.2.1. To polecenie poprawi CTF, usunie znaczniki odniesienia z serii tilt i obliczy rekonstrukcję. Również w tym przypadku przetwarzanie CTF można pominąć, jak w 4.2.1.
   4. [opcjonalnie] Aby pominąć etap oględzin i w pełni zautomatyzować przetwarzanie i rekonstrukcję, wykonaj polecenie
      tomoauto --CTF
   5. [opcjonalnie] Aby użyć określonej konfiguracji lokalnej, zapoznaj się z dokumentacją tomoauto, aby dowiedzieć się, jak wygenerować lokalny plik konfiguracyjny, a następnie wykonaj polecenie
      tomoauto [opcje]-L <local_config> <filename.st> <fid_diam>
      gdzie jest nazwą lokalnego pliku konfiguracyjnego.

5. Uśrednianie sub-tomogramu

UWAGA: Używamy pakietu^{i3 15} (http://www.electrontomography.org/) do przetwarzania eksperymentów uśredniania sub-tomogramu, jednak opisany protokół ma ogólne zastosowanie do większości dostępnych pakietów oprogramowania do uśredniania sub-tomogramu16 do przetwarzania eksperymentów uśredniania sub-tomogramu, jednak opisany protokół ma zastosowanie ogólnie do większości dostępnych pakietów oprogramowania do uśredniania sub-tomogramu^16-18.

1. Mając zrekonstruowany tomogram w bieżącym katalogu roboczym, otwórz tomogram do zbierania cząstek, wykonując polecenie:
   tomopick .rec
   gdzie jest jak w 4.2.2. W oknie, które zostanie otwarte, użyj lewego przycisku myszy, aby kliknąć najpierw na korpus podstawowy, a następnie na końcówkę igły, aby wybrać iniekcję i użyj strzałek w górę iw dół, aby przejść przez plasterki tomogramu. W ten sposób należy zaznaczyć wszystkie widoczne inieksomy. Przechowuje on współrzędne w pliku tekstowym definiującym długą oś konstrukcji, a także estymując dwa z trzech kątów Eulera opisujących orientację konstrukcji.
2. Wyodrębnij obliczeniowo 400 3 sześcianów wokseli z tomogramu wyśrodkowanego w środku zdefiniowanej długiej osi, wykonując polecenie:
   clip resize -cx -cy -cz -ix 400 -iy 400 -iz 400 \
   .rec _001.mrc
   gdzie , , są współrzędnymi punktu środkowego struktury, a jest jak w 4.2.2. Rozmiar wyodrębnionego sześcianu powinien różnić się w zależności od struktury i użytego powiększenia oraz powinien być wystarczająco duży, aby odpowiednio objąć interesującą strukturę, która dla tej próbki wynosi 400³ wokseli.
3. Próbkowanie w dół (pojemnik) subtomogramu czterokrotnie, aby skrócić czas obliczeń dla początkowego wyrównania, wykonując polecenie:
   binvol -b 4 _001.mrc _001.bin4.mrc
   gdzie jest jak w 5.2.
4. Zastosuj wyznaczone kąty Eulera do sub-tomogramów i oblicz średnią globalną, aby utworzyć początkowy szablon, wykonując polecenie.
   I3totsum.sh
5. Wyrównaj i sklasyfikuj podtomogramy podpróbkowane w dół za pomocą binarnej maski klasyfikacyjnej obszaru cytoplazmatycznego. Wykonaj uśrednianie subtomogramowe w przestrzeni Fouriera, aby zminimalizować brakujące artefakty klinowe charakterystyczne dla tomografii. Do kategoryzacji 4 danych należy użyć SAMPFACT="4 4 4".
   i3mramsacls.sh
6. Powtórzyć krok 5.5, używając podtomogramów z próbkowaniem dwukrotnie (SAMPFACT="2 2 2") i ponownie z oryginalnymi danymi (SAMPFACT="1 1 1").
   i3mramsacls.sh

Results

Próbki minikomórek S. flexneri zostały zebrane i przetworzone, jak pokazano na schemacie Rysunek 1, przy użyciu tomoauto zgodnie z rurociągiem opisanym na Rysunku 2. Serie pochylenia zostały zebrane przy użyciu SerialEM¹⁰, który pozwala na wysokoprzepustową akwizycję serii pochylenia w punktach wyznaczonych przez użytkownika na mapach montażowych o małym powiększeniu (ilustracja 3). Mikrofotografie ze...

Discussion

Opisana tutaj metoda wysokoprzepustowa umożliwiła nam przetworzenie 1917 serii krio-tiltów i wyprodukowanie ponad 4500 subtomogram nienaruszonego inieksomu S. flexneri ¹⁹. Zebrane dane pozwoliły na szczegółową charakterystykę iniekcji in situ , w tym cytoplazmatycznego kompleksu sortującego. Metodę wykorzystano również do wizualizacji kilku zmutowanych komórek ze specyficzną delecją przypuszczalnych składników białkowych, co pomogło wyjaśnić skład platformy sortującej wstrzykiwacza. ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glicerol	Sigma-Aldrich	G9012
Tyrptyczny bulion sojowy	Sigma-Aldrich	22092
Spectinomycin	Sigma-Aldrich	S0692
Aparat do elektroporacji	Bio-rad	165-2100
Kuweta 1 mm	BTX	45-0124
1,5 ml Probówka kriogeniczna	Thermoscientific	5000-1020
1,5 ml Probówka do mikrowirówek	Sigma-Aldrich	Z336769
Holey Carbon Grids	Quantifoil (Mikroskopia elektronowa)	Q2100CR2	R2/2 200 Cu
Urządzenie do wyładowywania jarzeniowego	Dostępna		własna komercyjna alternatywa
Eksykator próżniowy	Sigma-Aldrich	Z119016	Używany w wewnętrznym urządzeniu do wyładowywania jarzeniowego
Generator wysokiej częstotliwości	Produkty elektrotechniczne	BD-10A	stosowany w wewnętrznym urządzeniu do wyładowań jarzeniowych.  UWAGA: To urządzenie generuje wysokie napięcia.
Kleszczyki wirówkowe
	Dumont (Nauki o Mikroskopii Elektronowej)	72705-D	Styl 5 Antymagnetyczna
koliodowa złota	Aurion		BSA 10nm
	Whatman		#2
Etan	Matheson Tri-Gas	UN1035
Azot	Matheson Tri-Gas	UN1977
Tłok	Dostępna		wewnętrzna alternatywa komercyjna Skrzynka
do przechowywania siatki kriogenicznej	Mikroskopia elektronowa Sciences	71166-30
Transmisyjny mikroskop elektronowy	FEI		Tecnai Polara F30 (300 KeV)
Urządzenie do bezpośredniego wykrywania Kamera	Gatan		K2 Summit
Tomogram Acquisiton Software	SerialEM		http://bio3d.colorado.eud/SerialEM Alternatywy: UCSF Tomografia, Leginon, FEI Tomografia wsadowa
Oprogramowanie do korekcji ruchu wywołanej wiązką	MOTIONCORR		http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.html wymaga >2 GB
oprogramowania	do wyrównywania procesorów graficznych Nvidia z serii Tilt-Series		Alternatywy dla http://bio3d.colorado.edu/IMOD IMOD: XMIPP, Protomo
Automatyczne oprogramowanie do modelowania markerów referencyjnych	Alternatywy IMOD		: RAPTOR (zawarty w IMOD0 (do użytku w tomoauto)
Oprogramowanie do oznaczania CTF	IMOD		: CTFFIND http://grigoriefflab.janelia.org/ctf (Do użytku w tomoauto)
Oprogramowanie do rekonstrukcji serii Tilt	tomo3d		https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d Alternatywy: IMOD, XMIPP http://xmipp.cnb.csic.es, Protomo
Oprogramowanie do automatycznego przetwarzania serii Tilt		tomoauto
	https://github.com/DustinMorado/tomoauto i3		http://www.electrontomography.org Alternatywy: IMOD
Alternatywy dla oprogramowania do uśredniania objętości	i3		: PEET http://bio3d.colorado.edu/PEET, Dynamo https://dynamo.bioz.unibas.ch, http://.org