Narażenie na teratogeny może powodować wady wrodzone. Danio pręgowany jest przydatny do określania potencjału teratogennego chemikaliów. Wykazujemy użyteczność danio pręgowanego, wystawiając zarodki na działanie różnych poziomów azotynów, a także w różnych momentach ekspozycji. Pokazujemy, że azotyny mogą być toksyczne i powodować poważne wady rozwojowe.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Danio pręgowany jako model do oceny potencjału teratogennego azotynów
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wysoki poziom azotanów w środowisku może powodować wady wrodzone lub poronienia u ludzi. Przypuszczalnie jest to spowodowane konwersją azotanów do azotynów przez bakterie jelitowe i ślinowe. Jednak w innych badaniach na ssakach wysoki poziom azotynów nie powoduje wad wrodzonych, chociaż może prowadzić do złych wyników reprodukcyjnych. W związku z tym potencjał teratogenny azotynów nie jest jasny. Przydałby się system modelowania kręgowców, aby łatwo ocenić teratogenne działanie azotynów lub innych substancji chemicznych będących przedmiotem zainteresowania. W tym miejscu pokazujemy przydatność danio pręgowanego (Danio rerio) do badań przesiewowych związków pod kątem toksyczności i wad embrionalnych. Zarodki danio pręgowanego są zapładniane zewnętrznie i szybko się rozwijają, co czyni je dobrym modelem do badań teratogennych. Pokazujemy, że wydłużenie czasu ekspozycji na azotyny negatywnie wpływa na przeżycie. Zwiększenie stężenia azotynów również niekorzystnie wpływa na przeżywalność, podczas gdy azotany nie. W przypadku zarodków, które przetrwają ekspozycję na azotyny, mogą wystąpić różne wady, w tym obrzęk osierdzia i woreczka żółtkowego, brak nadęcia pęcherza pławnego i wady rozwojowe twarzoczaszki. Nasze wyniki wskazują, że danio pręgowany jest wygodnym systemem do badania teratogennego potencjału azotynów. Podejście to można łatwo zaadaptować do testowania innych substancji chemicznych pod kątem ich wpływu na wczesny rozwój kręgowców.
Wprowadzenie
Teratogeneza to proces, który zakłóca normalny rozwój zarodka lub płodu, powodując trwałe nieprawidłowości strukturalne i funkcjonalne, opóźnienie wzrostu lub poronienie w ciężkich przypadkach1. Może to być spowodowane przez niektóre czynniki naturalne (teratogeny), które na wiele sposobów zakłócają rozwój zarodka2. Podczas rozwoju płodu doniesiono, że powszechne teratogeny, takie jak promieniowanie, czynniki zakaźne, metale toksyczne i organiczne chemikalia, powodują defekty w fałdach epikantycznych (fałd skórny w górnej powiece) i klinodaktylii (zakrzywiony palec u ręki lub nogi) poprzez błędy morfogenetyczne1.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Procedury opisane w tym protokole zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Indiana w Pensylwanii.
1. Zbieranie zarodków
- Utrzymuj danio pręgowanego w temperaturze 28,5 °C, pH 7, przewodności między 500-1 500 μS i cyklu światło/ciemność trwającego 14 godzin światła i 10 godzin ciemności24. Używaj odmian typu dzikiego, takich jak hybryda Tü, AB lub Tü/AB. Różne szczepy mogą różnie reagować na obróbkę chemiczną25.
- Przygotuj ryby do krycia na noc przed zebraniem jaj, dodając wodę z systemu rybnego do zbiornika godowego. Dodaj samca i samicę r....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Ekspozycja na 300 mM etanolu przez 22 h nie miała wpływu na przeżywalność (dane nie pokazano), co jest zgodne z wcześniejszymi doniesieniami5,23,26. Jest to oczekiwany wynik, ponieważ etanol jest znanym teratogenem i służył jako kontrola pozytywna. Zaobserwowane fenotypy obejmowały obrzęk osierdzia, brak wypełnienia pęcherza pławnego powietrzem (Rysunek 1), wady czaszkowo-twarzowe oraz opóźnienie rozwoju (dane nie pokazano).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisana tu metoda pokazuje przydatność danio pręgowanego w ocenie potencjału teratogennego azotynów i azotanów. W porównaniu z innymi kręgowcami danio pręgowany ma zalety, które obejmują wysoką płodność, nawożenie zewnętrzne, przezroczystość optyczną i szybki rozwój. Dostępne mutanty, które nie mają pigmentacji (takie jak danio pręgowany36) również pomagają zwiększyć widoczność narządów wewnętrznych. Łatwo jest również wygenerować transgenicznego danio pręgowanego z genami reporterowymi, aby ułatwić analizę u .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
VK został ufundowany z grantów z Wydziału Biologii IUP oraz Szkoły Studiów Podyplomowych i Badań (Graduate Student Professional Development). CQD i TWS były wspierane przez IUP School of Graduate Studies and Research (Faculty Publication Costs/Incidental Research Expenses). Dziękujemy również członkom laboratorium Diep za utrzymanie obiektu dla danio pręgowanego.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| DREL/2010 instrument | Hach | 26700-03 | |
| Etanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Szkło KIMAX szalka Petriego | VWR | 89001-244 | |
| MS-222 | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| NitraVer 5 Odczynnik azotanowy | Hach | 14034-46 | |
| NitriVer 3 Odczynnik azotynowy | Hach | 14065-99 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 3-374-10 | |
| Paraformaldehyd | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Mikroskop stereoskopowy S6E | Leica | 10446294 | |
| Azotan sodu | Fisher Scientific | S343 | |
| Azotyn sodu | Fisher Scientific | S347 | |
| Pipety transferowe | Laboratorium Produkty Sprzedaż | L320072 | |
| Fiolki szklane | Fisher Scientific | 03-338B |
Bibliografia
- Gilbert-Barness, E. Teratogenic causes of malformations. Ann Clin Lab Sci. 40 (2), 99-114 (2010).
- Brent, R. L. The cause and prevention of human birth defects: What have we learned in the past 50 years. Con Anom. 41 (1), 3-21 (2001).
- Lin, S., Zhao, Y.....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
