Artykuł metodologiczny

Pierwotna endodermalna hodowla komórek nabłonkowych z błony woreczka żółtkowego zarodków przepiórki japońskiej

8.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53624

⸱

10 marca 2016

 ,  ,  , 
1Department of Animal Science and Technology, National Taiwan University

W tym artykule

Podsumowanie

Aby zbadać mechanizm wykorzystania lipidów w błonach woreczków żółtkowych podczas późnych etapów rozwoju embrionalnego ptaków, stworzyliśmy podstawowy system hodowli komórek nabłonkowych encyklii encyklalnej przepiórek japońskich.

Streszczenie

Stworzyliśmy model hodowli komórek nabłonka endodermalnego (EEC) do badania funkcji niektórych enzymów i białek w pośredniczeniu w wykorzystaniu składników odżywczych przez zarodki ptaków podczas rozwoju. Zapłodnione jaja przepiórki japońskiej inkubowano w temperaturze 37 °C przez 5 dni, a następnie pobrano błony woreczka żółtkowego (YSM) w celu ustanowienia systemu hodowli EWG. Wyizolowaliśmy embrionalną warstwę endodermy z YSM i pokroiliśmy błonę na 2-3 mm kawałki i częściowo strawiliśmy kolagenazą przed wysiewem na 24-dołkowych płytkach hodowlanych. EWG namnażają się z tkanki i są gotowe do badań nad hodowlą komórkową. Stwierdziliśmy, że EEC mają typowe cechy YSM in vivo, na przykład akumulację kropelek lipidów, ekspresję O-acylotransferazy sterolowej i lipazy lipoproteinowej. Częściowe trawienie znacznie zwiększyło wskaźnik powodzenia hodowli EWG. Wykorzystując EEC, wykazaliśmy, że ekspresja SOAT1 była regulowana przez szlak związany z kinazą białkową A zależną od cAMP. Ten pierwotny system hodowli przepiórek japońskich EWG jest użytecznym narzędziem do badania embrionalnego transportu lipidów i wyjaśnienia roli genów zaangażowanych w pośredniczenie w wykorzystaniu składników odżywczych w YSM podczas rozwoju embrionalnego ptaków.

Wprowadzenie

Głównym źródłem odżywczym ptasiego zarodka jest żółtko, składające się z 33% lipidów, 17% białka i 1% popiołu. 1 Podczas rozwoju embrionalnego błona woreczka żółtkowego (YSM) wyrasta z wnętrza embrionalnej jamy brzusznej i stopniowo pokrywa powierzchnię żółtka. Począwszy od 2 dnia embrionalnego, ekspresja genów związana z metabolizmem lipidów i angiogenezą jest stopniowo zwiększana w YSM, a YSM powoli rozwija projekcje podobne do kosmków. 8,9 pkt.Projekcje te zwiększają wchłanianie składników odżywczych żółtka w celu wsparcia rozwoju embrionalnego. YSM to tkanka pozazarodkowa, która zawiera trzy listki zarodkowe: endodermę, mezodermę i ektodermę. 14 Ektoderma woreczka żółtkowego jest skierowana w stronę białka i łączy się z błoną żółtkową, delikatnie pokrywając woreczek żółtkowy. Komórki nabłonka endodermalnego są skierowane bezpośrednio w stronę żółtka jaja kurzego i służą jako portale wykorzystania składników odżywczych. 6 W miarę rozszerzania się YSM, komórki nabłonka endodermalnego (EEC) można podzielić ze względu na kształt i funkcjonalność na dwie grupy, obszar vitelline i obszar vasculosa. 7

Obszar witeliny składa się z komórek endodermalnych i jest oddalony od embrionu; obszar vasculosa składa się z komórek mezodermalnych i obejmuje zróżnicowane EEC z naczyniami krwionośnymi i tkankami łącznymi. Do 5 dnia embrionalnego żółtko jest całkowicie pokryte ektodermą i endodermą YSM, a obszar naczyniowy szybko się powiększa. YSM wchłania, rekomponuje i uwalnia lipidy (jako lipoproteiny o bardzo niskiej gęstości pochodzące z żółtka) i białka do embrionalnego układu krążenia. 9, 2 W związku z tym stworzyliśmy podstawowy system hodowli embrionalnych komórek nabłonkowych przepiórek japońskich, aby zbadać mechanizmy wykorzystania lipidów w YSM podczas rozwoju embrionalnego ptaków.

Lipidy takie jak triacyloglicerol, lecytyna, fosfolipid i ester cholesterolu (CE) są głównymi źródłami energii dla ptasich zarodków. We wczesnych stadiach rozwoju lipidy żółtka składają się tylko z 1,3% CE i wzrastają do 10-15% w połowie rozwoju embrionalnego ptaków 3, 11. Ester cholesterolu jest syntetyzowany z cholesterolu przez sterolową O-acylotransferazę 1 (SOAT1) w ptasim zarodku YSM. 4

Formą przechowywania cholesterolu jest CE, CE jest przenoszony w lipoproteinach, a lipoproteiny są transportowane przez krążenie do tkanek. 13 Na tydzień przed wykluciem następuje szybki wzrost ptasich zarodków. Około 68% pozostałej zawartości lipidów w żółtku jest wchłanianych na tym etapie. 10 Mechanizm, za pomocą którego wykorzystuje się lipidy żółtka, może być wyjaśniony przez model badawczy EWG. Aby osiągnąć ten cel badawczy, opracowano protokół hodowli kurczaków EWG. 2, 9 Jednak ze względu na niski wskaźnik sukcesu eksplantatów tkankowych, potrzebna jest ulepszona procedura hodowli komórek EWG w celu zbadania funkcji niektórych enzymów i białek w pośredniczeniu w wykorzystaniu składników odżywczych przez zarodki ptaków podczas rozwoju.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Ta procedura jest modyfikacją protokołu hodowli modelu kurczaka opracowanego przez Bauera i in. 2013 oraz Nakazawa i in., 2011. 2,9

1. Przygotuj zdrowe embrionalne zarodki dnia 5 z przepiórki japońskiej

  1. Umieść 1 samca i 3 samice dojrzałej płciowo przepiórki japońskiej razem w tej samej klatce. Dostarczaj paszę i wodę ad libitum. Dostosuj światło w pomieszczeniu dla zwierząt na 14 godzin światła i 10 godzin ciemności.
  2. Codziennie po południu zbieraj zapłodnione jaja do plastikowych torebek i przechowuj je w lodówce o temperaturze 16 °C, aby opóźnić tempo wzrostu zarodków.
  3. Po zebraniu wystarczającej liczby jaj w ciągu dwóch tygodni należy inkubować zapłodnione jaja w inkubatorze o temperaturze 37 °C z dobrą wentylacją przez pięć dni.

2. Przygotuj podłoże podstawowe i roztwory do mycia

  1. Użyj pożywki DMEM/F-12 (dostosowanej do pH 7,2) jako pożywki wzrostowej i uzupełnij ją 10% surowicą nowonarodzonych cieląt (NBCS) i 1% Pen-Strep Ampho. Roztwór (PSA; Penicylina, 105 jednostek/L; Streptomycyna, 100 mg/l; Amfoterycyna B, 0,25 mg/l).
  2. Przygotować roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanami (PBS) o stężeniu 10x do przechowywania; użyć 1x roztwór PBS (zawierający NaCl, 137,93 mM; KCl, 2.667 mM; KH2PO4, 1.471 mM; Na2HPO4-7H 2O, 8,06 mM; dostosować do pH 7,2), aby umyć i zwilżyć błonę woreczka żółtkowego, jednocześnie oddzielając endodermę od żółtka jaja kurzego i albuminy.
  3. Użyj pożywki DMEM (dostosowanej do pH 7,2), aby ponownie zawiesić granulki endodermy.

3. Zbiór pierwotnych EEC z japońskich przepiórek YSM

  1. Wysiaduj zebrane jaja przez 5 dni (krok 1.3). Zbadaj jaja za pomocą świecy do jaj, aby potwierdzić prawidłowy rozwój embrionalny.
    UWAGA: W 5 dniu embrionalnym granica mezodermy YSM jest bardzo wyraźna, a 3 warstwy embrionalne są mniej ściśle ze sobą połączone, dzięki czemu łatwo jest uzyskać endodermę. Do kolekcji YSM należy używać wyłącznie jaj wykazujących prawidłowy rozwój krążenia kapilarnego.
  2. Dokładnie wyczyść skorupkę jajka świeżą wodą i 75% etanolem. Otwórz skorupkę jajka z pozycji komórki powietrznej za pomocą nożyczek, delikatnie oderwij i zbierz cały YSM za pomocą kleszczy i umieść w 10 cm naczyniu hodowlanym wypełnionym 37°C 1x PBS.
  3. Za pomocą nożyczek usuń zarodek, żółtko i białko jaja, a następnie delikatnie umyj YSM trzykrotnie 1x PBS i umieść YSM w roztworze PBS w naczyniu hodowlanym o średnicy 10 cm.
  4. Użyj kleszczy i nożyczek, aby usunąć ektodermę z YSM. Użyj 2 kleszczyków, jeden do mocnego przytrzymania warstwy komórek endodermy, a drugi do przytrzymania mezodermy kapilarnej.
  5. Pod mikroskopem preparacyjnym rozerwij i oddziel endodermę od krawędzi mezodermy w kierunku zarodka. Zebrać jasnożółtą endodermę do probówek wirówkowych o pojemności 50 ml za pomocą zakraplacza i umieścić w 15 ml pożywki wzrostowej w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, aż wszystkie pobrania tkanek zostaną zakończone.

4. Trawienie plastrów endodermy przez trawienie kolagenazą

  1. Świeżo rozpuścić 6,5 jednostki kolagenazy typu IV w 10 ml DMEM.
  2. Odwirować probówki o pojemności 50 ml (3.4) o sile 130 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Odessać pożywkę i umieścić całą endodermę w naczyniu hodowlanym o średnicy 6 cm za pomocą pipety. Dodaj 1 ml roztworu kolagenazy do tego naczynia hodowlanego.
  3. Pokrój endodermę zebraną z 2 zarodków przepiórczych za pomocą zakrzywionych nożyczek, aż rozmiar każdego plasterka wyniesie około 2 do 3 mm. Za pomocą zakraplacza zbierz wszystkie plastry do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml wraz z 9 ml świeżego roztworu kolagenazy.
  4. Trawić tkankę kolagenazą przez 30 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 175 obr./min. To częściowe trawienie kolagenazą służy do poprawy proliferacji komórek eksplantatu.
  5. Wirować przy 130 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej i delikatnie usunąć frakcję supernatantu za pomocą pipety. Przemyć osad przez zawiesinę w 20 ml DMEM i usunąć frakcję supernatantu po odwirowaniu 130 x g przez 3 minuty.
  6. Ponownie zawiesić osad w 12 ml pożywki wzrostowej (DMEM/F12 z 10% NBCS i 1% PSA) i delikatnie i równomiernie wysiewać na 24-dołkową płytkę (każda studzienka zawiera 500 μl roztworu komórek).
  7. Inkubować eksplantaty tkanek w temperaturze 37 °C w 5% CO2 na powietrzu przez 2 dni, aby umożliwić komórkom namnażanie się z tkanek.
  8. Inkubować komórki przez kolejne 2 dni i scharakteryzować ich żywotność za pomocą protokołu oznaczania żywotności komórek. 15
    UWAGA: Żywe komórki utrzymują środowisko redukujące w cytozolu. Rezazuryna, substancja czynna, jest nietoksycznym, przepuszczalnym dla komórek związkiem, który ma niebieski kolor i praktycznie nie fluorescencyjny. Po dodaniu do kultur komórkowych resazuryna jest redukowana do rezorufiny w cytozolu przez enzymy mitochondrialne. Rezorufina ma czerwony kolor i jest silnie fluorescencyjna. Żywe komórki w sposób ciągły przekształcają resazurynę w rezorufinę, zwiększając ogólną fluorescencję i kolor pożywki hodowlanej otaczającej komórki.
  9. Wykonaj izolację całkowitego RNA komórek nabłonka endodermy, odwrotną transkrypcję i ilościowy PCR w czasie rzeczywistym ekspresji mRNA genu markerowego zgodnie z opisem. Pytania z dnia 16,17 na dzień
    1. Użyj PCR z odwrotną transkryptazą, aby wykryć mRNA SOAT1 (sens: 5'-GAAGGGGCCTATCTGGAACG-3'; antysens: 5'-ATCTGCACGTGACATGACCA-3'; Produkt PCR = 168 pz) jako swoisty marker dla komórek EWG. Użyj mRNA β-aktyny (sens: 5'- TGGTGAAGCTGTAGCCTCTC-3'; antysens: 5'- GTGATGGACTCTGGTGATGG-3'; Produkt PCR = 151 pz) jako gen porządkowy i kontrola wewnętrzna.
    2. Użyj elektroforezy żelowej, aby wykryć rozmiar produktu RT-qPCR. Przygotuj 1% żel agarozowy i wymieszaj 10 μl produktu qPCR z 2 μl barwnika ładującego. Załaduj 10 μl mieszaniny do każdej studzienki w 1% żelu agarozowym i uruchom żel pod napięciem 100 V przez 30 minut.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby zrealizować cel polegający na ustanowieniu spójnego i użytecznego modelu komórkowego, musimy wydłużyć i ustabilizować tempo proliferacji oraz wydajność ptasich EEC. Porównaliśmy bezpośrednią inkubację endodermy bez trawienia enzymatycznego z endodermą częściowo strawioną enzymami proteolitycznymi, takimi jak kolagenaza lub kolagenaza wraz z 0,6 U dispazy. Dispaza jest amino-endopeptydazą, która hydrolizuje wiązania peptydowe N-końca niepolarnych reszt aminokwasowych. Podczas gdy zabie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ponieważ poprzedni system hodowli odniósł ograniczony sukces, potrzebny jest lepszy system hodowli. Endoderma YSM przepiórki japońskiej wymaga leczenia enzymami proteolitycznymi, takimi jak kolagenaza, w celu rozluźnienia połączeń komórka-komórka, aby osiągnąć lepszą wydajność wzrostu w eksplantatach ex-vivo. Nasze dane pokazują, że liczba komórek po częściowym trawieniu była większa niż w przypadku niestrawionej kultury tkankowej po wysiewie przez 2 dni (ryc. 1). Dlatego częściowe trawienie proteolitycz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie ma konkurencyjnych interesów finansowych ani innych konfliktów interesów. Nie dostaliśmy żadnego dofinansowania od żadnej prywatnej firmy.

Podziękowania

Finansowanie rozwoju obecnego protokołu jest szczególnie wspierane przez "Aim for the Top University Plan" Narodowego Uniwersytetu Tajwańskiego, Tajwan (grant ID-104R350144), a także Ministerstwo Nauki i Technologii Tajwanu (ID grantu: MOST 104-2313-B-002-039-MY3). Szczególnie dziękujemy Centrum Biotechnologii Narodowego Uniwersytetu Tajwańskiego za udostępnienie pomieszczenia dla zwierząt i przestrzeni laboratoryjnej na potrzeby obecnego badania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Dulbecco's Modified Eagle MediumGibco by Life technologies12800-017 10 X 1 LDo mycia granulek EEC
D-MEM/F-12Gibco by Life technologies12400-024 10 X 1 LJako podłoże podstawowe w hodowli EEC
NBCSGibco by Life technologies16010-159Jako surowica zasilająca w hodowli EEC
Pen-Strep Ampho. RoztwórBI (Biological Industries)03-033-1B 100 mlDo łagodzenia ewentualnej infekcji 
Kolagenaza Typ IVGibco firmy Life technologies17104-019 1 g  Kolagenaza jest proteazą specyficzną dla wiązania między obojętnym aminokwasem (X) a glicyną w sekwencji Pro-XGly-Pro. Jako proteaza do dysocjacji komórek od tkanki pierwotnej.
Płytka 24-dołkowaFALCON® REF-353047 DlaEWG do zakładania i przedłużania
probówek wirówkowych PP o pojemności 50 mlCorning® CentriStarTM430829Do transportu błon i trawienia enzymatycznego
50 ml Probówka ze stożkowym dnem i nakrętkąPRO TECHCT-50-PL-TWDo transportu błon i trawienia enzymatycznego
Wzajemna kąpiel wytrząsającaDEAGLESB302Dla lepszego trawienia enzymatycznego na błonach

Bibliografia

  1. Abeyrathne, E. D., Lee, H. Y., Ahn, D. U. Egg white proteins and their potential use in food processing or as nutraceutical and pharmaceutical agents--a review. Poult Sci. 92 (12), 3292-3299 (2013).
  2. Bauer, R., Plieschnig, J. A., Finkes, T., Riegler, B., Hermann, M., Schneider, W. J. The developing chicken yolk sac acquires nutrient transport competence by an orchestrated differentiation process of its endodermal epithelial cells. J Biol Chem. 288 (2), 1088-1098 (2013).
  3. Ding, S. T., Nestor, K. E., Lilburn, M. S. The concentration of different lipid classes during late embryonic development in a randombred turkey population and a subline selected for increased body weight at sixteen weeks of age. Poult Sci. 74 (2), 374-382 (1995).
  4. Ding, S. T., Lilburn, M. S. The developmental expression of acyl-coenzyme A: cholesterol acyltransferase in the yolk sac membrane, liver, and intestine of developing embryos and posthatch turkeys. Poult Sci. 79 (10), 1460-1464 (2000).
  5. Ding, S. T., Lilburn, M. S. The ontogeny of fatty acid-binding protein in turkey (Meleagridis gallopavo) intestine and yolk sac membrane during embryonic and early posthatch development. Poult Sci. 81 (7), 1065-1070 (2002).
  6. Kanai, M., Soji, T., Sugawara, E., Watari, N., Oguchi, H., Matsubara, M., Herbert, D. C. Participation of endodermal epithelial cells on the synthesis of plasma LDL and HDL in the chick yolk sac. Microsc Res Tech. 35 (4), 340-348 (1996).
  7. Mobbs, I. G., McMillan, D. B. Structure of the endodermal epithelium of the chick yolk sac during early stages of development. Am J Anat. 155 (3), 287-309 (1979).
  8. Mobbs, I. G., McMillan, D. B. Transport across endodermal cells of the chick yolk sac during early stages of development. Am J Anat. 160 (3), 285-308 (1981).
  9. Nakazawa, F., Alev, C., Jakt, L. M., Sheng, G. Yolk sac endoderm is the major source of serum proteins and lipids and is involved in the regulation of vascular integrity in early chick development. Dev Dyn. 240 (8), 2002-2010 (2011).
  10. Noble, R. C., Cocchi, M. Lipid metabolism and the neonatal chicken. Prog Lipid Res. 29 (2), 107-140 (1990).
  11. Shand, J. H., West, D. W., McCartney, R. J., Noble, R. C., Speake, B. K. The esterification of cholesterol in the yolk sac membrane of the chick embryo. Lipids. 28 (7), 621-625 (1993).
  12. Speier, J. S., Yadgary, L., Uni, Z., Wong, E. A. Gene expression of nutrient transporters and digestive enzymes in the yolk sac membrane and small intestine of the developing embryonic chick. Poult Sci. 91 (8), 1941-1949 (2012).
  13. Walzem, R. L., Hansen, R. J., Williams, D. L., Hamilton, R. L. Estrogen Induction of VLDLy Assembly in Egg-Laying Hens. J Nutr. 129 (2), 467S-472S (1999).
  14. Yoshizaki, N., Soga, M., Ito, Y., Mao, K. M., Sultana, F., Yonezawa, S. Two-step consumption of yolk granules during the development of quail embryos. Dev Growth Differ. 46 (3), 229-238 (2004).
  15. alamarBlue Cell Viability Assay Protocol. , Source: https://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/cell-profilteration-assay-protocols/cell-viability-with-alamarblue.html#4 (2008).
  16. Lin, H. Y., Chen, C. C., Chen, Y. J., Lin, Y. Y., Mersmann, H. J., Ding, S. T. Enhanced Amelioration of High-Fat Diet-Induced Fatty Liver by Docosahexaenoic Acid and Lysine Supplementations. Biomed Res Int. 2014 (1), 310981(2014).
  17. Lin, Y. Y., et al. Adiponectin receptor 1 regulates bone formation and osteoblast differentiation by GSK-3β/β-Catenin signaling in mice. Bone. 64, 147-154 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Trawienie kolagenaztest proliferacji kom rekanaliza RT qPCRakumulacja kropli lipidowychekspresja SOAT1regulacja szlaku cAMProzw j embrionalny ptak w

Powiązane artykuły