Artykuł metodologiczny

Identyfikacja ładunków kinezyny-1 za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

11.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53632

⸱

14 lutego 2016

1Department of Oncological Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentowany jest protokół identyfikacji ładunków Kinesin-1. Bezsilnikowy mutant ciężkiego łańcucha Kinesin-1 (KIF5B) agreguje się w cytoplazmie i indukuje agregację jej ładunków. Oba agregaty są wykrywane pod mikroskopią fluorescencyjną. Podobną strategię można zastosować do identyfikacji ładunków innych białek motorycznych.

Streszczenie

Mikroskopia fluorescencyjna jest używana do identyfikacji ładunków Kinesin-1. Niedawno wykazano, że ciężki łańcuch Kinesin-1 (KIF5B) transportuje jądrowy czynnik transkrypcyjny c-MYC w celu degradacji proteosomalnej w cytoplazmie. Opisana tutaj metoda polega na badaniu bezsilnikowego mutanta KIF5B do mikroskopii fluorescencyjnej. Białka KIF5B typu dzikiego i bezsilnikowego są znakowane białkiem fluorescencyjnym tdTomato. Dziki tdTomato-KIF5B pojawia się jednorodnie w cytoplazmie, podczas gdy bezsilnikowy mutant tdTomato-KIF5B tworzy agregaty w cytoplazmie. Agregacja bezsilnikowego mutanta KIF5B indukuje agregację jego ładunku c-MYC w cytoplazmie. W związku z tym metoda ta zapewnia wizualne środki do identyfikacji ładunków Kinesin-1. Podobną strategię można zastosować do identyfikacji ładunków innych białek motorycznych.

Wprowadzenie

Kinezyna-1 to białko motoryczne, które pośredniczy w następczym transporcie swoich ładunków1,2. Jest to heterotetramer dwóch podjednostek lekkiego łańcucha kinezyny 1 (KLC1) i dwóch podjednostek ciężkich łańcuchów kinezyny (KHC). KIF5B1, KHC, zawiera domenę motoryczną na swoim N-końcu, która hydrolizuje ATP i przekształca energię chemiczną w energię mechaniczną w celu ruchu wzdłuż mikrotubul. Jego obszar C-końcowy zawiera domenę dimeryzacji, która oddziałuje z KLC1, która wiąże się z ładunkami. Kinezyna-1 transportuje ładunki, takie jak pęcherzyki, organelle i mRNA3,4. Niedawno wykazano, że KIF5B transportuje jądrowy czynnik transkrypcyjny c-MYC w celu degradacji proteosomalnej w cytoplazmie5. Zastosowano trzy metodologie (inhibitor chemiczny, siRNA/shRNA i dominujący mutant ujemny) w celu zahamowania funkcji Kinesin-1. Wszystkie indukowały agregację c-MYC w cytoplazmie. W przypadku ostatniej metodologii, na c-MYC miał wpływ tylko dominujący ujemny mutant KIF5B, ale nie inny pokrewny mutant motoryczny KIF5A, co sugeruje, że mutant nie wywiera ogólnego wpływu na składniki wewnątrzkomórkowe (takie jak rozerwanie mikrotubul) ani na agregację białek. Dominujący ujemny mutant KIF5B również nie wpływał na inny czynnik transkrypcyjny, co sugeruje, że nie wywiera ogólnego wpływu na czynniki transkrypcyjne. Sugeruje raczej, że dominujący negatywny mutant wywiera określony wpływ na swoje ładunki.

Użycie dominujących mutantów ujemnych jest powszechne w dziedzinie białek motorycznych. Podobne bezsilnikowe mutanty kinezyn i miozyn były używane wcześniej. Wykorzystano je głównie do zademonstrowania wpływu mutantów na subkomórkowe lokalizacje ich ładunków lub na funkcje komórkowe6-12. Mniejszy nacisk położono na relacje przestrzenne między mutantami a dotkniętymi nimi ładunkami. Jednak w niektórych przypadkach zaobserwowano, że mutanty kolokują się ze swoimi ładunkami6,10.

Interakcja między KIF5B i powiązanymi z nim białkami została wcześniej potwierdzona przez test in vivo drożdży z dwoma hybrydami i biochemiczne testy pull-down, takie jak coimmunoprecipitation i in vitro pull-downtesty 13-16. W artykule opisano dodatkową metodę wizualną wykorzystującą mikroskopię fluorescencyjną do identyfikacji białek ładunkowych KIF5B. Metoda wykorzystuje bezsilnikowego mutanta KIF5B, który działa jako dominujący mutant ujemny. Agreguje się w cytoplazmie i indukuje agregację jej ładunków.

Oznaczanie dzikiego i bezsilnikowego mutanta KIF5B za pomocą białka fluorescencyjnego tdTomato17 umożliwia ich wizualizację za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Oznaczone białka KIF5B mogą ulegać koekspresji z białkiem kandydującym połączonym z innym białkiem fluorescencyjnym o właściwościach widmowych odpowiednio oddzielonych od znacznika KIF5B. Oznaczone białka obserwuje się bezpośrednio w żywych komórkach pod mikroskopią fluorescencyjną. Indukcja agregacji białka kandydującego przez bezsilnikowego mutanta KIF5B potwierdzi, że białko kandydujące jest ładunkiem in vivo KIF5B. Co więcej, białka KIF5B znakowane tdTomato mogą ulegać ekspresji samodzielnie w komórkach w celu zbadania ich wpływu na endogenne białka ładunkowe. Później przeprowadza się mikroskopię immunofluorescencyjną, w której transfekowane komórki są utrwalane i barwione specyficznym przeciwciałem przeciwko endogennemu białku kandydującemu, a następnie odpowiednim przeciwciałem wtórnym sprzężonym z barwnikiem fluorescencyjnym. W tym przypadku badane jest endogenne białko kandydujące na jego poziomie fizjologicznym. Podobne bezsilnikowe mutanty innych białek motorycznych mogą być przygotowane w celu identyfikacji ich ładunków.

Protokół

1. Klonowanie oznaczonych tdTomato dzikich i bezsilnikowych białek KIF5B

  1. Amplifikować cDNA dla ludzkich białek KIF5B typu dzikiego i bezsilnikowego za pomocą starterów w Tabeli 1, polimerazy DNA Taq (5 jednostek na 100 μl), mieszanki dNTP (2 mM dla każdego deoksynukleotydu) i jej 10-krotnego buforu przez 30 cykli. Każdy cykl składa się z etapu denaturacji (95 °C przez 30 sekund), etapu wyżarzania (45 °C przez 30 sekund) i etapu wydłużania (72 °C przez 3 minuty).
  2. Ekstrahować amplifikowany produkt DNA równą objętością fenolu/chloroformu (1:1).
    Uwaga: Fenol jest palny i może powodować oparzenia. Chloroform jest niebezpieczny. Unikaj bezpośredniego kontaktu z nimi i używaj ich pod wyciągiem chemicznym. Alternatywnie, produkty PCR mogą być oczyszczane za pomocą różnych zestawów.
    1. Wirować przy 18 000 x g w mikrowirówce w temperaturze pokojowej przez 1 minutę. Przenieść roztwór wodny do nowej probówki i ekstrahować równą objętością chloroformu.
    2. Wirować przy 18 000 x g w mikrowirówce w temperaturze pokojowej przez 0,5 min. Przenieść roztwór wodny do nowej probówki.
    3. Roztwór wodny zmieszać z jedną dziesiątą objętości 3 M octanu Na-i dwiema objętościami bezwzględnego alkoholu etylowego.
    4. Wirować przy 18 000 x g w mikrowirówce w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Wyrzucić roztwór wodny.
    5. Przemyć osad DNA dwiema objętościami 75% etanolu. Wyrzuć roztwór wodny i wysusz osad DNA na powietrzu w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Zawiesić osad DNA w 34 μl wody.
  3. Roztrawić amplifikowane produkty w końcowej objętości 40 μl za pomocą enzymów restrykcyjnych SalI (10 jednostek) i BamHI (10 jednostek) oraz 4 μl ich 10-krotnego buforu w temperaturze 37 °C przez dwie godziny. Rozpuścić strawione produkty w żelu agarozowym (1,0% przy 100 V) zawierającym bromek etydyny (0,2 μg/ml).
    Uwaga: Bromek etydyny jest silnym mutagenem i może być wchłaniany przez skórę. Dlatego ważne jest, aby unikać bezpośredniego lub pośredniego kontaktu z bromkiem etydyny.
  4. Wytnij odpowiednie pasma do oczyszczenia za pomocą kolumn. Zważyć żel agarozowy zawierający fragment DNA. Następnie rozpuścić go w buforze do rozpuszczania (300 μl na 0,1 g) w temperaturze 37 °C przez około 20 minut.
  5. Dodaj otrzymany roztwór do kolumny i wiruj w mikrowirówce w temperaturze pokojowej przez 5 sekund. Wyrzuć przepływ.
  6. Przemyć kolumnę 0,5 ml buforu do solubilizacji, powtarzając krok 1.5. Ponownie przemyć kolumnę 0,75 ml buforu do przemywania powtarzając krok 1.5. Obracaj kolumnę przez 2 minuty, aby pozbyć się pozostałego buforu do płukania.
  7. Usunąć fragment DNA za pomocą 50 μl wody, powtarzając krok 1.5. Oszacować stężenie fragmentu DNA, porównując jego podwielokrotność z drabinką wielkości DNA w żelu agarozowym (1,0% przy 100 V) zawierającym bromek etydyny (0,2 μg/ml).
  8. Związać oczyszczone produkty (około 100 ng) z wektorem17 (około 100 ng) ptdPomidor-C1 uprzednio strawionym tymi samymi enzymami restrykcyjnymi w 10 μl przy użyciu ligazy DNA T4 (2,000 jednostek) i 1 μl buforu ligacyjnego 10X w temperaturze pokojowej przez 16 godzin.
    Uwaga: Mutant typu dzikiego i bezsilnikowego zawiera aminokwasy odpowiednio od 2 do 963 i od 584 do 963. Wcześniej do zidentyfikowania jego funkcji9 użyto większego, bezsilnikowego mutanta KIF5B. W obecnych badaniach wykorzystano mniejszego, bezsilnikowego mutanta KIF5B w celu zwiększenia jego poziomu ekspresji.

2. Mikroskopia immunofluorescencyjna

  1. Do obrazowania żywych komórek lub fluorescencji pośredniej z powiększeniem 40X lub mniejszym, zasiewaj 0,2-0,3 miliona komórek HeLa w 1 ml kompletnej pożywki [Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS)] w każdym dołku sześciodołkowej płytki. Rosnąć w temperaturze 37 °C z 5 % CO2 .
  2. W przypadku pośrednich badań immunofluorescencyjnych z powiększeniami powyżej 40X, należy krótko umyć szkła nakrywkowe (18 mm x 18 mm; grubość 1,5) w absolutnym etanolu i wysuszyć je na powietrzu w studzienkach sześciodołkowej płytki, w komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby uniknąć zanieczyszczenia.
    1. Zasiać 0,2-0,3 miliona komórek w 1 ml kompletnego podłoża DMEM w każdym dołku sześciodołkowej płytki.
  3. Przygotowanie kompleksu transfekcyjnego
    1. Następnego dnia, w komorze bezpieczeństwa biologicznego, rozcieńczyć 0,6 μg (ogółem) plazmidu ekspresyjnego dla tdPomidor znakowanego typu dzikiego lub bezsilnikowego KIF5B w obecności lub bez plazmidu ekspresyjnego dla białka kandydującego na ładunek (pTagCFP-c-MYC5) za pomocą 0,1 ml pożywki do transfekcji w probówce do mikrowirówki o pojemności 1,6 ml.
      Uwaga: Wektor pTagCFP-c-MYC wyraża c-MYC oznaczony tagiem TagCFP.
    2. Dodać 1,8 μl odczynnika do transfekcji do 0,1 ml pożywki do transfekcji w innej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,6 ml. Zazwyczaj należy przygotować główną mieszankę rozcieńczonego odczynnika do transfekcji wystarczającą na 12 próbek.
    3. Inkubować przez 5 minut, w temperaturze pokojowej.
    4. Dodać rozcieńczony 0,1 ml odczynnika do transfekcji do rozcieńczonych 0,1 ml DNA. Wymieszaj zawartość, odwracając probówki. Wiruj probówki przez 5 sekund w mikrowirówce.
    5. Inkubować przez 45 minut, w temperaturze pokojowej.
  4. Mycie komórek
    1. Przemyć wysiane komórki trzykrotnie solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) w okresie inkubacji w celu utworzenia kompleksu transfekcyjnego.
    2. Zastąp pożywkę z wysianych komórek w każdej studzience 0,8 ml wstępnie podgrzanej pożywki do transfekcji. Umieścić płytki z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C.
  5. Transfekcja komórek
    1. Po 45-minutowej inkubacji dodawać kroplami 0,2 ml kompleksu DNA/odczynnika do transfekcji (przygotowanego w kroku 2.3) do każdego dołka płytki.
    2. Delikatnie kołysać płytkę 6-dołkową przez 5 sekund, zanim zostaną one ponownie umieszczone w inkubatorze w temperaturze 37 °C.
    3. Po 6-8 godzinach wymień pożywkę na kompletną pożywkę DMEM.
  6. Do obrazowania fluorescencyjnego żywych komórek18
    1. Po dodatkowych 16 godzinach inkubacji w temperaturze 37 °C dodać do pożywki barwnik interkalacyjny DNA Hoechst 33342 do końcowego stężenia 1 μM.
      Uwaga: Hoechst 33342 jest przepuszczalnym dla komórek barwnikiem interkalacyjnym DNA, który barwi jądra komórkowe.
    2. Inkubować transfekowane komórki przez 10 minut w inkubatorze w temperaturze 37 °C, a następnie zbadać je pod kątem ekspresji białek fluorescencyjnych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej przy użyciu obiektywu 40X. Zestawy filtrów dla DAPI, CFP, FITC i Cy3 to odpowiednio (Ex350 nm/ Em460 nm), (Ex436 nm/ Em480 nm), (Ex470 nm/ Em525 nm) i (Ex545 nm/ Em605 nm).
      Uwaga: Jeśli tło jest wysokie ze względu na autofluorescencję całego podłoża DMEM, stosuje się podłoże bez czerwieni fenolowej.

3. Do pośrednich badań immunofluorescencyjnych

  1. Przygotowanie roztworu paraformaldehydu
    1. Odważyć proszek paraformaldehydu (4 g na 100 ml PBS) i dodać do PBS.
      Uwaga: Paraformaldehyd jest łatwopalnym ciałem stałym i stanowi potencjalne zagrożenie rakiem. Działa drażniąco na oczy, drogi oddechowe i skórę. Dlatego ważne jest, aby unikać kontaktu z paraformaldehydem lub jego wdychania.
    2. Dodać NaOH do roztworu (150 μl 10 N NaOH/100 ml).
    3. Roztwór należy utrzymywać w temperaturze od 37 do 42 °C przez 2-3 godziny, od czasu do czasu wstrząsając.
    4. Doprowadzić pH do 7,0, dodając lodowaty kwas octowy do roztworu (około 75 μl/ 100 ml) po rozpuszczeniu proszku paraformaldehydu.
  2. Barwienie białek docelowych
    1. Po dalszej inkubacji przez 16 godzin w temperaturze 37 °C, przemyć transfekowane komórki w temperaturze pokojowej raz za pomocą PBS, obracając sześciodołkową płytką przez 5 sekund.
    2. Utrwal komórki 1 ml świeżo przygotowanego, 4% roztworu paraformaldehydu na studzienkę. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
    3. Umyj komórki PBS raz, obracając przez 5 sekund płytkę sześciodołkową. Wyrzuć roztwór.
    4. Inkubować komórki z 1 ml 0,1% Triton-X 100 (w PBS) w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Detergent Triton-X 100 przenika przez błonę komórkową, aby umożliwić dostęp przeciwciał do ich celów wewnątrzkomórkowych.
    5. Umyj komórki PBS czterokrotnie, obracając płytkę sześciodołkową przez 5 sekund za każdym razem. Wyrzuć roztwór po każdym praniu.
    6. Inkubować komórki z 1 ml przeciwciał pierwszorzędowych (przeciwciało królika c-MYC lub przeciwciało myszy p53; 0,1 μg/ml) w 10% roztworze FBS w PBS w temperaturze pokojowej, kołysząc przez 4 godziny.
    7. Przemyć PBS cztery razy, obracając płytkę sześciodołkową przez 5 sekund za każdym razem. Wyrzuć roztwór po każdym praniu.
    8. Inkubować z 1 ml fluorescencyjnych przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z barwnikiem (przeciwciało anty-królicze lub anty-mysie IgG sprzężone z Alexa Fluor 488; 0,5 μg/ml) w 10% FBS w PBS w temperaturze pokojowej w ciemności, kołysząc przez 2 godziny.
    9. Przemyć PBS cztery razy, obracając płytkę sześciodołkową przez 5 sekund za każdym razem. Wyrzuć roztwór po każdym praniu.
  3. Barwienie jądrowe i montaż
    1. Inkubować komórki z 1 ml barwnika interkalującego DNA 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI; 0,5 μg/ml) w PBS w temperaturze pokojowej, w ciemności przez 10 minut. Przejść do kroku 3.4, gdy nie stosuje się szkieł nakrywkowych.
      Uwaga: DAPI to barwnik interkalacyjny DNA, który barwi jądra komórkowe.
    2. Nanieść 10 μl roztworu montażowego na każde szkiełko mikroskopowe. Zamontuj każdą szklankę pokrywową na roztworze montażowym na szkiełku mikroskopowym.
    3. Inkubować w temperaturze pokojowej w ciemności przez noc.
    4. Uszczelnij krawędzie okularów nakrywkowych lakierem do paznokci. Umieść na noc w ciemności w dygestorium, aby usunąć opary lakieru do paznokci.
  4. Mikroskopia fluorescencyjna19
    1. Następnego dnia zbadaj komórki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej przy użyciu obiektywu 40X. Zestawy filtrów dla DAPI, CFP, FITC i Cy3 to odpowiednio (Ex350 nm/ Em460 nm), (Ex436 nm/ Em480 nm), (Ex470 nm/ Em525 nm) i (Ex545 nm/ Em605 nm).

Wyniki

Egzogennie ekspresowany KIF5B typu dzikiego występował jednorodnie w cytoplazmie, podczas gdy c-MYC występował głównie w jądrze (Rycyna 1A). Jednakże mutant KIF5B pozbawiony domeny motorowej tworzył agregaty w cytoplazmie (Rycyna 1A). Agregacja KIF5B pozbawionego domeny motorowej indukowała agregację c-MYC. Odsetek komórek wykazujących agregację c-MYC znakowanego TagCFP w komórkach ekspresujących KIF5B typu dzikiego był niski. Był on jednak znacznie wyższy w przypadku koekspresji KIF5B pozbawionego domeny motorowej (Rycyna 1A). Obserwowana kolokalizacja mutanta KIF5B z c-MYC (Rycyna 1) sugeruje, że KIF5B reguluje subkomórkową lokalizację c-MYC, a c-MYC jest ładunkiem Kinezyny-1. Kontrole negatywne, w których konstrukty były ekspresowane pojedynczo, przedstawiono w dolnym panelu Ryciny 1A. Wyniki wskazują na brak znaczącego przesączania (bleed-through) emisji fluorescencji. KIF5B pozbawiony domeny motorowej indukował również agregację endogennego c-MYC (Rycyna 1B) oraz czynnika transkrypcyjnego p53 (Rycyna 2), co wskazuje, że zarówno c-MYC, jak i p53 są ładunkami Kinezyny-1, a KIF5B reguluje subkomórkową lokalizację obu tych endogennych białek. W połączeniu z wynikami wskazującymi, że inhibitor Kinezyny-1, lakton bengalskiej róży (RBL)20, indukuje tworzenie form o wysokiej masie cząsteczkowej dla c-MYC i p535, prawdopodobne jest, że p53 jest ładunkiem Kinezyny-1. Warto zauważyć, że jądrowy czynnik transkrypcyjny p53, podobnie jak c-MYC, jest również eksportowany z jądra do cytoplazmy w celu degradacji proteasomalnej21,22. Transport czynników transkrypcyjnych przez KIF5B wydaje się być specyficzny, ponieważ ekspresja mutantu KIF5B pozbawionego domeny motorowej nie wpłynęła na subkomórkową lokalizację c-Fos ani nie spowodowała jego agregacji (Rycyna 3). Powyższe dane wykazują, że metoda zastosowana w niniejszej publikacji pozwala na wysokospecyficzną identyfikację ładunków Kinezyny-1. Podobną strategię można zastosować również do innych białek motorowych.

figure-results-1
Rysunek 1: Ekspresja mutantu KIF5B pozbawionego domeny motorowej indukuje agregację c-MYC w cytoplazmie. (A) Komórki HeLa przetransfekowano dzikim typem (WT) KIF5B z markerem tdTomato (czerwony) oraz c-MYC z markerem TagCFP (niebieski). KIF5B WT z markerem tdTomato występował głównie w cytoplazmie, podczas gdy c-MYC z markerem TagCFP występował głównie w jądrze komórkowym. Jednakże mutant KIF5B pozbawiony domeny motorowej z markerem tdTomato (czerwony) tworzył w cytoplazmie agregaty włókniste lub punktowe. Ekspresja KIF5B pozbawionego domeny motorowej indukowała agregację c-MYC. Mutant KIF5B i c-MYC współlokalizowały się (różowy). Przedstawiono procent komórek (%) wskazujący na obecność agregatów CFP-c-MYC (%). Wyniki przedstawiono jako średnia±SD (N = 3). Kontrole negatywne z ekspresją białek KIF5B z markerem tdTomato lub c-MYC z markerem TagCFP wraz z pustymi wektorami (V) przedstawiono w dolnym panelu. (B) Podobne wyniki uzyskano dla endogennego c-MYC (zielony) podczas ekspresji białek KIF5B WT lub KIF5B pozbawionego domeny motorowej z markerem tdTomato (czerwony). Mutant KIF5B pozbawiony domeny motorowej z markerem tdTomato tworzył agregaty w cytoplazmie i indukował agregację endogennego c-MYC. Oba rodzaje agregatów współlokalizowały się w cytoplazmie (pomarańczowy). Jądra komórkowe barwiono barwnikiem Hoechst 33342 lub DAPI. Pasek skali; 20 μm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rycina 2: Ekspresja mutantu KIF5B pozbawionego domeny motorowej indukuje agregację endogennego p53 w cytoplazmie.W komórkach HeLa egzogenny KIF5B typu dzikiego (WT) z etykietą tdTomato (czerwony) występował głównie w cytoplazmie, podczas gdy endogenne p53 (zielone) występowało głównie w jądrze komórkowym. W przeciwieństwie do tego, mutant KIF5B pozbawiony domeny motorowej z etykietą tdTomato (czerwony) tworzył agregaty w cytoplazmie. Ekspresja KIF5B pozbawionego domeny motorowej indukowała agregację p53, co doprowadziło do kolokalizacji KIF5B i p53 w cytoplazmie (żółty). Eksperyment przeprowadzono trzykrotnie. Jądra komórkowe barwiono barwnikiem DAPI. Pasek skali: 20 μm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-3
Rysunek 3: Ekspresja pozbawionego domeny silnikowej mutanta KIF5B nie indukuje agregacji c-Fos w cytoplazmie. KIF5B typu dzikiego (WT) z znacznikiem tdTomato (czerwony) pojawił się głównie w cytoplazmie komórek HeLa, natomiast EGFP-c-Fos (zielony) wystąpił głównie w jądrze komórkowym. Z kolei pozbawiony domeny silnikowej mutant KIF5B z znacznikiem tdTomato (czerwony) utworzył agregaty w cytoplazmie. Ekspresja pozbawionego domeny silnikowej białka KIF5B nie wywołała agregacji c-Fos. Eksperyment przeprowadzono cztery razy. Jądra komórkowe barwiono barwnikiem DAPI. Pasek skali; 20 μm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

wspólna starter odwrotna5’-AGAGGATCCTTACACTTGTTTGCCTCCTC-3’
starter forward dla KIF5B typu dzikiego5’- AGAGTCGACGCGGACCTGGCCGAGTGCAACATCAAAGT-3’
starter forward do KIF5B bez domeny motorowej5’- AGAGTCGACGATGAAGAGTTCACTGTTGC-3’

Tabela 1: Sekwencje starterów do klonowania białek KIF5B typu dzikiego oraz pozbawionego domeny motorowej.

Dyskusja

Opisana metoda wykorzystuje właściwości bezsilnikowego mutanta KIF5B, który nie ma zdolności do poruszania się wzdłuż mikrotubul, ale zachowuje zdolność do tworzenia dimerów z KIF5B typu dzikiego, a tym samym umożliwia białku tetramerycznemu interakcję z tymi samymi białkami ładunkowymi, co KIF5B typu dzikiego. Bezsilnikowy KIF5B działa zatem jako dominujący mutant ujemny i tworzy ze swoimi ładunkami błędnie zlokalizowane agregaty. Udowodniono, że ta metoda identyfikuje ładunek Kinesin-1 c-MYC (Rysunek 1)5. W tym artykule ten sam bezsilnikowy mutant KIF5B został użyty do zidentyfikowania p53 jako innego potencjalnego ładunku Kinesin-1 (Rysunek 2). Pokazuje to, że metodologia ta jest możliwa do zidentyfikowania innych ładunków Kinesin-1. Ponadto swoistość mutanta wynika z braku wpływu mutanta na ujemne białko kontrolne c-Fos (ryc. 3).

W tym protokole znakowane tdTomato białko KIF5B typu dzikiego lub bezsilnikowego ulega koekspresji z innym białkiem fluorescencyjnym znakowanym białkiem kandydującym na białko cargo. W takim przypadku wykonuje się mikroskopię fluorescencyjną żywych komórek i obrazowanie. Powstawanie agregatów można prześledzić za pomocą obrazowania poklatkowego. Alternatywnie, białko znakowane tdTomato ulega ekspresji samodzielnie, a białko kandydujące na ładunek na jego poziomach fizjologicznych jest wizualizowane za pomocą pośredniej mikroskopii immunofluorescencyjnej przy użyciu specyficznych przeciwciał. Białko fluorescencyjne tdTomato zostało wybrane ze względu na jego jasność i fotostabilność17. Jeśli tło jest wysokie ze względu na autofluorescencję całego podłoża DMEM, stosuje się podłoże bez czerwieni fenolowej.

Bezsilnikowy mutant KIF5B tworzy stechiometrycznie dimery z KIF5B typu dzikiego. Dlatego tak ważne jest, aby wyrazić wystarczającą ilość bezsilnikowego mutanta KIF5B do tworzenia dimerów z odpowiednikiem typu dzikiego, aby zahamować jego funkcję i utworzyć agregaty. Aby rozwiązać ten problem, niezbędna jest optymalizacja ekspresji bezsilnikowego mutanta. Osiąga się to poprzez użycie małego bezsilnikowego mutanta zawierającego domenę dimeryzacji. Ponadto konieczna jest również optymalizacja odpowiedniego odczynnika i protokołu transfekcji. Czas inkubacji komórek HeLa z odczynnikiem DNA/transfekcji został zoptymalizowany w komórkach HeLa pod kątem ekspresji białek egzogennych i żywotności komórek. Może być konieczne zoptymalizowanie czasu inkubacji dla innych linii komórkowych.

W przypadku powiększeń od 4X do 40X nie są wymagane okulary nakrywkowe. Komórki można badać bezpośrednio w studzienkach. Dlatego w tym przypadku protokół jest niedrogi i wygodny. W przypadku powiększeń powyżej 40X komórki są hodowane na szkłach nakrywkowych w studzienkach, a po zabarwieniu są montowane na szkiełkach mikroskopowych w celu zbadania pod obiektywami zanurzonymi w oleju.

Obserwacja agregatów bezsilnikowego białka KIF5B jest ograniczona wielkością cytoplazmy. Łatwo jest wykryć agregaty w wielu komórkach ssaków. Jednak stosunkowo trudno jest zaobserwować agregaty w komórkach neuronalnych, gdy objętość cytoplazmy jest niewielka wokół jąder i w neurytach.

Protokół służy do pokazania związku między KIF5B a jego ładunkami, oprócz testów in vivo dwuhybrydowych drożdży i biochemicznych testów pull-down13-16. Wszystkie te testy określają związek w różnych warunkach fizycznych, a ich wyniki mogą się wzajemnie uzupełniać. Co więcej, przewagą tego testu fluorescencyjnego nad innymi testami jest to, że może on wykazać regulację subkomórkowej lokalizacji ładunków przez KIF5B (ryc. 1 i 2).

Protokół nie ogranicza się do KIF5B i może być stosowany do identyfikacji ładunków innych białek motorycznych, takich jak niektóre inne silniki kinezynowe3 i niektóre silniki miozyny23,24 używane w wewnątrzkomórkowym transporcie ładunków3. Te białka motoryczne zawierają również domeny motoryczne do ruchu wzdłuż mikrotubul dla silników kinezynowych i mikrofilamentów dla silników miozyny oraz segmenty cewki zwijanej do oligomeryzacji. Większość z nich tworzy homodimery3,23. Dlatego podobną strategię można zastosować wobec nich, tworząc ich bezsilnikowe dominujące mutanty negatywne w celu identyfikacji ich ładunków.

Oświadczenia

Publikacja i produkcja tego artykułu w ramach bezpłatnego dostępu jest opłacana przez firmę Roche.

Podziękowania

Grant na publikację Roche pokrył koszty publikacji i produkcji tego artykułu w ramach Free Access. Autor dziękuje również E. Premkumarowi Reddy'emu, Richardowi V. Mettusowi, Stephenowi C. Cosenzie, Sau Ying Yipowi i Sol D. Glorii za ich wsparcie i krytyczną lekturę manuskryptu.

Materiały

etanol mikroskopu Roche Mikroskop fluorescencyjny
Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
absolutny (200 dowodów)Fisher ScientificBP2818
DAPISigma-AldrichD9542
Hoechst 33342Sigma-AldrichB2261
Opti-MEM-I (medium transfekcyjne)Life Technologies51985
ProLong Diamond Antifade MountantLife TechnologiesP36961
formaldehyd, dlaFisher ScientificO4042-500
Triton-X100Fisher ScientificBP151-500
X-tremeGENE 9 Odczynnik do transfekcji DNARoche6365787001
Taq Polimeraza DNALife Technologies10342020
Mieszanka nukleotydów klasy PCR (dNTP Mix)Osłona12111424
szkłoFisher Scientific12-541A
GeneRuler 1 kb Plus Drabinka DNALife TechnologiesSM1333
Zestaw do szybkiej ekstrakcji żelem PureLinkLife TechnologiesK210012
BamHINew England BiolabR0136
SalINew England BiolabR0138
Ligaza DNA T4 New England BiolabM0202T
Bromek etydynyThermo Scientific17898
DMEMLife Technologies11995-065
przeciwciało królika c-MYCSygnalizacja komórkowa5606
p53 mysie przeciwciałoSanta Cruzsc-126
Alexa Fluor 488-sprzężone przeciwciało anty-królicze IgGLife TechnologiesA11008
Alexa Fluor 488-sprzężone przeciwciało anty-mysie IgGLife TechnologiesA11059
 Olympus IX71_Fluoview
oprogramowanie komputerowe do obrazowania  cellSens 

Bibliografia

  1. Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease. Neuron. 68, 610-638 (2010).
  2. Yu, Y., Feng, Y. M. The role of kinesin family proteins in tumorigenesis and progression: potential biomarkers and molecular targets for cancer therapy. Cancer. 116, 5150-5160 (2010).
  3. Verhey, K. J., Hammond, J. W. Traffic control: regulation of kinesin motors. Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 765-777 (2009).
  4. Hirokawa, N., Noda, Y., Tanaka, Y., Niwa, S. Kinesin superfamily motor proteins and intracellular transport. Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 682-696 (2009).
  5. Lee, C. M. Transport of c-MYC by Kinesin-1 for proteasomal degradation in the cytoplasm. Biochim Biophys Acta. 1843, 2027-2036 (2014).
  6. Bittins, C. M., Eichler, T. W., Hammer, J. A., Gerdes, H. H. Dominant-negative myosin Va impairs retrograde but not anterograde axonal transport of large dense core vesicles. Cell Mol Neurobiol. 30, 369-379 (2010).
  7. Kimura, T., Watanabe, H., Iwamatsu, A., Kaibuchi, K. Tubulin and CRMP-2 complex is transported via Kinesin-1. J Neurochem. 93, 1371-1382 (2005).
  8. Lindsay, A. J., McCaffrey, M. W. Myosin Va is required for the transport of fragile X mental retardation protein (FMRP) granules. Biol Cell. 106, 57-71 (2014).
  9. Rivera, J., Chu, P. J., Lewis, T. L., Arnold, D. B. The role of Kif5B in axonal localization of Kv1 K(+) channels. Eur J Neurosci. 25, 136-146 (2007).
  10. Roland, J. T., Kenworthy, A. K., Peranen, J., Caplan, S., Goldenring, J. R. Myosin Vb interacts with Rab8a on a tubular network containing EHD1 and EHD3. Mol Biol Cell. 18, 2828-2837 (2007).
  11. Uchida, A., Alami, N. H., Brown, A. Tight functional coupling of kinesin-1A and dynein motors in the bidirectional transport of neurofilaments. Mol Biol Cell. 20, 4997-5006 (2009).
  12. Zadeh, A. D., et al. Kif5b is an essential forward trafficking motor for the Kv1.5 cardiac potassium channel. J Physiol. 587, 4565-4574 (2009).
  13. Su, Y. Y., et al. KIF5B promotes the forward transport and axonal function of the voltage-gated sodium channel Nav1.8. J Neurosci. 33, 17884-17896 (2013).
  14. Lalioti, V. S., Vergarajauregui, S., Tsuchiya, Y., Hernandez-Tiedra, S., Sandoval, I. V. Daxx functions as a scaffold of a protein assembly constituted by GLUT4, JNK1 and KIF5B. . J Cell Physiol. 218, 416-426 (2009).
  15. Cho, K. I., et al. Association of the kinesin-binding domain of RanBP2 to KIF5B and KIF5C determines mitochondria localization and function. Traffic. 8, 1722-1735 (2007).
  16. Diefenbach, R. J., Diefenbach, E., Douglas, M. W., Cunningham, A. L. The ribosome receptor, p180, interacts with kinesin heavy chain, KIF5B. Biochem Biophys Res Commun. 319, 987-992 (2004).
  17. Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat Biotechnol. 22, 1567-1572 (2004).
  18. Waters, J. C. Live-cell fluorescence imaging. Methods Cell Biol. 114, 125-150 (2013).
  19. Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D. Fluorescence microscopy. Cold Spring Harb Protoc. 2014, (2014).
  20. Hopkins, S. C., Vale, R. D., Kuntz, I. D. Inhibitors of kinesin activity from structure-based computer screening. Biochemistry. 39, 2805-2814 (2000).
  21. Zhang, Y., Xiong, Y. Control of p53 ubiquitination and nuclear export by MDM2 and ARF. Cell Growth Differ. 12, 175-186 (2001).
  22. Michael, D., Oren, M. The p53-Mdm2 module and the ubiquitin system. Semin Cancer Biol. 13, 49-58 (2003).
  23. Kneussel, M., Wagner, W. Myosin motors at neuronal synapses: drivers of membrane transport and actin dynamics. Nat Rev Neurosci. 14, 233-247 (2013).
  24. Maravillas-Montero, J. L., Santos-Argumedo, L. The myosin family: unconventional roles of actin-dependent molecular motors in immune cells. J Leukoc Biol. 91, 35-46 (2012).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mutant KIF5B pozbawiony domeny silnikowejznakowanie tdTomatoobrazowanie ywych kom rekpo rednia immunofluorescencjaagregacja c MYClokalizacja p53mutant dominuj co negatywnymotory molekularne

Powiązane artykuły