Wielkoskalowa skaningowa transmisyjna mikroskopia elektronowa (nanotomia) mózgu zdrowego i uszkodzonego danio pręgowanego

Podsumowanie

Wielkoskalowa mikroskopia elektronowa 2D (EM), czyli nanotomia, to ogólnotkankowe zastosowanie nanoskalowej rozdzielczości EM. W tym miejscu opisujemy uniwersalną metodę nanotomii stosowaną do badania mózgu larw danio pręgowanego w zdrowiu i po nieinwazyjnym uszkodzeniu mózgu.

Streszczenie

Wielkoskalowa mikroskopia elektronowa 2D (EM), czyli nanotomia, to zastosowanie mikroskopii elektronowej o rozdzielczości nanoskalowej w całej tkance. Inni i my wcześniej zastosowaliśmy EM na dużą skalę do ludzkiej skóry wysp trzustkowych, hodowli tkankowych i całych larw danio pręgowanego^1-7. W tym miejscu opisujemy uniwersalną metodę skanowania EM w skali tkankowej w celu bezstronnego wykrywania cech subkomórkowych i molekularnych. Nanotomię zastosowano do zbadania zdrowego i neurodegeneracyjnego mózgu danio pręgowanego. Nasza metoda opiera się na znormalizowanych protokołach przygotowania próbek EM: utrwalanie za pomocą aldehydu glutarowego i osmu, a następnie zatapianie w żywicy epoksydowej, ultracienkie cięcie i montaż ultracienkich przekrojów na siatkach jednootworowych, a następnie barwienie po zakończeniu uranylem i ołowiem. Wielkoskalowe obrazy mozaiki 2D EM są pozyskiwane za pomocą skanującego EM podłączonego do zewnętrznego generatora skanowania dużego obszaru za pomocą skanowania transmisyjnego EM (STEM). Obrazy EM o dużej skali mają zazwyczaj rozmiar ~ 5 - 50 G pikseli i najlepiej oglądać je za pomocą plików HTML z możliwością powiększania, które można otworzyć w dowolnej przeglądarce internetowej, podobnie jak w przypadku geograficznych map HTML online. Metoda ta może być stosowana do tkanek (ludzkich), przekrojów całych zwierząt, a także do hodowli tkankowych^1-5. W tym przypadku mózgi danio pręgowanego analizowano w nieinwazyjnym modelu ablacji neuronów. W ramach jednego zestawu danych wizualizujemy zmiany tkankowe, komórkowe i subkomórkowe, które można określić ilościowo w różnych typach komórek, w tym neuronach i mikrogleju, makrofagach mózgu. Ponadto nanotomia ułatwia korelację EM z mikroskopią świetlną (CLEM)⁸ na tej samej tkance, ponieważ duże powierzchnie wcześniej zobrazowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej mogą być następnie poddane działaniu EM o dużym obszarze, co skutkuje nanoanatomią (nanotomią) tkanek. Podsumowując, nanotomia pozwala na bezstronne wykrywanie cech na poziomie EM w wymierny sposób obejmujący całą tkankę.

Wprowadzenie

Ostatnie osiągnięcia techniczne poprawiły wszechstronność, stosowalność i ilościowy charakter EM, prowadząc do odrodzenia analizy ultrastrukturalnej. Postępy obejmują 3D EM, wielkoskalową 2D EM oraz ulepszone metody i odczynniki do skorelowanej mikroskopii świetlnej i mikroskopii elektronowej (CLEM) w celu porównania innych trybów analizy mikroskopowej bezpośrednio z poziomem EM^8-10. Wielkoskalowa technologia 2D EM jest szczególnie przydatna do ilościowego określania lub identyfikacji (nowych) cech chorobowych patologii człowieka, badania modeli zwierzęcych pod kątem chorób i modeli kultur tkankowych. Ze względu na typowo małe pole widzenia trudno jest skorelować zmiany przy dużym powiększeniu ze skalą obejmującą całą tkankę, a także obiektywnie i ilościowo analizować cechy ultrastrukturalne.

Do analizy patologicznej tkanek ludzkich lub oceny patologii w modelach zwierzęcych, standardem są kolorowe sekcje hematooksyliny i eozyny (H&E) w tkance zatopionej w formaldehydzie (FFPE). Oprócz prostego barwienia H&E wykonuje się również znakowanie immunologiczne w celu identyfikacji nieprawidłowości patologicznych. Gdyby takie tkanki można było analizować na poziomie EM, można by zidentyfikować określone typy komórek i zmiany subkomórkowe. Bezstronny charakter EM na dużą skalę pozwala na znalezienie nieoczekiwanych i nowych cech choroby. Dzięki dużej skali można wizualizować obszary EM do milimetrów kwadratowych. My i inni wcześniej zastosowaliśmy nanotomię do wysp trzustkowych^{szczura 4}, hodowli komórkowej², mózgu szczura³, skóry i błony śluzowej⁷ oraz całych larw danio pręgowanego^1,5 (www.nanotomy.org). Danio pręgowany doskonale nadaje się do obrazowania in vivo, w szczególności do wizualizacji typów komórek, które są trudno dostępne w tkankach ssaków, w tym w komórkach odpornościowych mózgu¹¹. Tutaj szczegółowo opisano procedurę nanotomii, zastosowaną do przekrojów czołowych głów danio pręgowanego poddawanych warunkowej ablacji neuronalnej poprzez konwersję metronidazolu przez neuronalną ekspresję nitroreduktazy (www.nanotomy.org)^5,12-14. Wszystkie surowe dane są prezentowane jako pliki HTML z możliwością powiększania, wizualizujące zmiany w skali molekularnej do tkankowej. Prezentacja surowych danych pozwala na bezstronną analizę zbiorów danych pod innym kątem przez ekspertów z całego świata.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na larwach danio pręgowanego zostały zatwierdzone przez Komitet Eksperymentów na Zwierzętach Uniwersytetu w Groningen zgodnie z wytycznymi krajowymi i unijnymi.

1. Przygotowanie próbki

1. Utrwalanie i osadzanie
   1. Utrwalenie
      1. Znieczulić larwy ryb w wodzie danio pręgowanego (0,003%) dodane do E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl₂, 0,33 mM MgSO_4, 10 mM HEPES, pH 7,6) i przetestować głębokość znieczulenia, delikatnie szturchając końcówką pipety o pojemności 200 μl pod mikroskopem preparacyjnym, aż ruch przestanie być wykrywany (ryc. 1A).
      2. Podczas przetwarzania próbek pod kątem korelacyjnego EM po uzyskaniu danych obrazowania in vivo za pomocą obrazowania konfokalnego lub 2 fotonów w 1,8% agarozie, jak opisano,5,15 utrwal larwy w agarozie za pomocą 4% PFA w PBS zawierającym Triton-X-100 (0,05%).
      3. Wytnij larwy z agarozy i przetwórz na dużą skalę EM⁵.
      4. Utrwal larwy w świeżym 4% paraformaldehydzie w PBS zawierającym Triton-X-100 (0,05%) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej w plastikowych probówkach.
         Uwaga: Komórki wyhodowane w hodowli (in vitro) mogą być bezpośrednio utrwalone w aldehydzie glutarowym, jak opisano w następnym kroku (1.1.1.5).
      5. Usunąć roztwór i dodać 100 μl 0,5% PFA, 2% aldehydu glutarowego (GA) i 0,1 M kakodylanu sodu (pH 7,4). Przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C. Próbki należy dwukrotnie płukać w 0,1 M kakodylanu sodu.
      6. Wytnij głowy larw rostralnie do tyłomózgowia, aby ułatwić penetrację osmu. Używaj cienkich strzykawek/kleszczyków.
      7. Larwy postfiksu w 1% tetratlenku osmu (OsO₄)/1,5% żelazocyjanku potasu (K₄[Fe(CN)₆]) w 0,1 M kakodylanu sodu na lodzie przez 2 godziny i płukać 3 x 5 min w podwójnie destylowanym_H2O.
      8. Odwodnić w etanolu przez 20 minut inkubacji w rosnących stężeniach etanolu (50%, 70%, 3 razy 100%).
   2. Osadzanie
      1. Przygotuj żywicę epoksydową zgodnie ze standardowymi recepturami stosowanymi w EM labs.
         Uwaga: Żywicy epoksydowej używamy w następujący sposób: zmieszać 19,8 g eteru glicydowego 100, 9,6 g bezwodnika kwasu 2-dodecenylobursztynowego i 11,4 g bezwodnika metylonadynowego za pomocą mieszadła magnetycznego. Dodać 0,5 g DMP-30 (tris-(dimetyloaminometylo)fenol) i ponownie wymieszać.
      2. Wysiadywać larwy przez noc w 50% żywicy epoksydowej w etanolu (v/v) podczas obracania (RT).
      3. Zastąp rozcieńczoną żywicę epoksydową czystą żywicą. Inkubować przez 30 minut, ponownie dodać świeżą żywicę i inkubować przez kolejne 30 minut. Ponownie odświeżyć żywicę, a następnie inkubować przez 3 godziny w temperaturze pokojowej, następnie przez 15 minut w temperaturze 58 °C i przez kolejną 1 godzinę w temperaturze pokojowej pod niskim ciśnieniem (200 mbar).
      4. Ustaw głowice w dostępnych na rynku silikonowych płaskich formach do zatapiania pod mikroskopem preparacyjnym za pomocą igły lub wykałaczki z przodem skierowanym w stronę formy lub w razie potrzeby (Rysunek 1B).
      5. Polimeryzować żywicę epoksydową przez noc w temperaturze 58 °C. Jeśli żywica epoksydowa jest nadal zbyt miękka, odczekaj kolejny dzień na polimeryzację i stwardnienie w temperaturze 58 °C. Zbadaj sztywność, wywierając nacisk za pomocą kleszczy. Jeśli to łatwo pozostawia wgłębienie, odczekaj kolejny dzień na polimeryzację i stwardnienie w temperaturze 58 °C. Gdy próbka jest w pełni stwardniała, przystąp do przycinania i krojenia.
      6. Odetnij nadmiar żywicy z króćca za pomocą żyletek (Rysunek 1B).
2. Podział na sekcje, kontrasty i montaż
   1. Cięcia
      1. Przeciąć blok żywicy epoksydowej za pomocą ultramikrotomu.
      2. Użyj noża do szkła lub diamentowego noża do histonoża, aby wyciąć półcienkie odcinki (500 nm) w celu barwienia błękitem toluidynowym/zasadową fuksyną (ryc. 1D), aby wykryć właściwe położenie.
      3. Przenieś półcienkie odcinki na szkiełkach mikroskopowych, podnosząc je szklaną pipetą Pasteura, której końcówka została zamknięta przez stopienie w płomieniu. Suszyć na gorącej płycie, aż nie pozostanie woda. Barwieć przez 10 sekund 1% błękitem toluidynowym w wodzie na gorącej płycie i po spłukaniu wodą barwić przez 10 sekund 0,05% fuksyny zasadowej w 1% tetraboranie sodu. Zbadaj za pomocą normalnego mikroskopu świetlnego przy 10X do 40X.
      4. Po osiągnięciu właściwego miejsca/orientacji w mózgu, kontynuuj cięcie bloku żywicy epoksydowej nożem diamentowym, aby wyciąć ultracienkie odcinki (~ 70 nm; Rysunek 1E)
      5. Używaj łatwych do zidentyfikowania struktur anatomicznych w mózgu i wokół niego, w tym wgłębień węchowych, oczu, granic istoty szarej i białej, aby zidentyfikować obszar zainteresowania podczas ultracienkiego przekroju i dostosować kąt cięcia, gdy próbka jest przechylona.
      6. Zamontuj sekcję na miedzianych siatkach L2 x 1 z pojedynczym gniazdem (Rysunek 1F), aby umożliwić akwizycję bez przerywania przez pręty siatki. Użyj siatek powlekanych Formvar do podparcia sekcji.
   2. Kontrastujące
      1. Barwieć ultracienkie skrawki na siatkach przez 2 minuty w 2% octanie uranylu w metanolu, a następnie cytrynianem ołowiu Reynoldsa przez kolejne 2 minuty ¹⁶.

2. Akwizycja obrazu

1. Duża skala STEM
   Uwaga: Używamy skanowania EM z zewnętrznym generatorem skanowania, który jest w stanie uzyskać wiele dużych pól widzenia w wysokiej rozdzielczości^3,5,7,17 przy użyciu wykrywania STEM. Zazwyczaj jeden obraz wygenerowany w ten sposób odpowiada polom widzenia ~ 100 obrazów z transmisyjnego mikroskopu elektronowego (TEM), co znacznie zmniejsza ilość ściegów.
   1. Montaż próbki w mikroskopie
      1. Umieścić siatkę z sekcją w uchwycie na próbkę z wieloma siatkami i przenieść do komory SEM.
   2. Ustawienie detektora STEM
      1. Umieść siatkę z próbką pod belką i przesuń ją w górę tak, aby znajdowała się ok. 5 mm od bieguna soczewki. Uzyskaj obraz przy napięciu 20 kV za pomocą detektora w obiektywie.
      2. Skoncentruj się na krawędzi siatki i dostosuj odległość roboczą do 4,0 mm.
      3. Przesuń uchwyt próbki do bezpiecznej pozycji i włóż detektor STEM.
      4. Wyśrodkuj otwór detektora STEM w polu obrazu, obracając regulacyjne podczas obrazowania z maksymalną prędkością za pomocą detektora w obiektywie.
      5. Ostrożnie przynieś uchwyt na próbkę, który będzie pasował między słupek obiektywu a detektor.
      6. Uzyskaj obraz za pomocą detektora w obiektywie, aby upewnić się, że znajdujesz się w obszarze przekroju.
      7. Przełącz się na wykrywanie STEM (średnie wzmocnienie i wszystkie ćwiartki ustawione na "minus") i uzyskaj obraz oraz wybierz obszar do skanowania.
      8. Podnieś napięcie przyspieszenia do 21 kV i poczekaj na ustabilizowanie się wiązki (ponownie stabilny obraz), a następnie przejdź do 29 kV w krokach co 2 kV.
   3. Pozyskiwanie obrazów
      1. Wstępnie naświetlić próbkę (aby zapobiec zmianom jasności spowodowanym przez wiązkę elektromagnetyczną), pomniejszając tak, aby cały obszar do skanowania pasował do okna obrazu.
      2. Zmień aperturę na 120 μm (aby zachować odpowiedni zakres dynamiki, wzmocnienia detektora muszą być zmniejszone o jeden stopień).
      3. Rozmycie powoduje, że obraz jest rozmyty.
      4. Spraw, aby skanowany obszar był jak najciaśniejszy, korzystając z opcji skanowania zredukowanego obszaru.
      5. Ustaw szybkość skanowania tak, aby klatka była skanowana w czasie ok. 1 - 2 sek.
         Uwaga: W zależności od rozmiaru i tkanki trwa to zwykle od 1/2 godziny (pole widzenia 100 x 100 μm) do 3 godzin (1 000 x 500 μm).
      6. Powiększ co najmniej 100x i zeskanuj mały obszar przez 10 sek.
         Uwaga: Jeśli obszar ten nie zmienia jasności w porównaniu z otoczeniem, wystarczające jest wstępne naświetlanie.
      7. Przywróć aperturę 30 μm (i wzmocnienie STEM na średnim)
      8. Skoncentruj się na próbce.
      9. Wyrównaj przysłonę za pomocą woblera (przy powiększeniu ~ 40 000X).
      10. Podczas ustawiania ostrości wybierz najjaśniejszy obszar/funkcję, ustaw prędkość skanowania tak, aby szczegóły były widoczne.
      11. W mikroskopie oprogramowanie dostosuj jasność i kontrast, uważnie obserwując histogram, aby utrzymać wszystkie piksele w zakresie dynamicznym. Zrób to samo dla najciemniejszego obszaru/obiektów.
      12. Wróć do jasnego obszaru i sprawdź ponownie. Bądź po bezpiecznej stronie, aby po obu stronach histogramu było trochę miejsca.
      13. Pomniejsz obraz, aby cały obszar do skanowania zmieścił się w oknie obrazowania, a następnie uruchom program akwizycji dużego obszaru.
      14. Użyj opcji kreatora, aby skonfigurować mozaikę, wybierając obszar z ekranu. Użyj rozmiaru piksela 2 - 5 nm w zależności od tego, jakie szczegóły są niezbędne. Użyj czasu przebywania 3 μs dla STEM.
      15. Wybierz opcję "autofokus na poprzednim kafelku", użyj oprogramowania do akwizycji na dużą skalę autofokus z domyślnymi ustawieniami firmy, zaznacz pole "sprawdź ustawienie przed wykonaniem" i określ, gdzie zapisać dane.
      16. Naciśnij "optymalizuj", aby sprawdzić ustawienia mikroskopu.
          Uwaga: Teraz zostanie pokazany potrzebny czas. Może to trwać do 72 godzin w przypadku obszarów o wymiarach 1 x 0,5 mm.
      17. W oknie "maksymalna rozdzielczość kafelków" wpisz 20 000, aby poszczególne kafelki nie były większe niż 20k x 20k, zapobiegając efektom krawędzi. Naciśnij "wykonaj".
      18. Gdy zostaniesz poproszony o sprawdzenie ostrości i jasności/kontrastu (B/C), wyłącz zewnętrzny generator skanowania i ostrożnie dostosuj ostrość i astygmatyzm w oprogramowaniu mikroskopu. Nie zmieniaj B/C.
          Uwaga: Stół montażowy można przesuwać i zmieniać powiększenie, ale powiększenie musi być ustawione z powrotem na żądany rozmiar piksela.
      19. Ponownie włącz zewnętrzny generator skanowania i naciśnij "kontynuuj".

3. Analiza danych

1. Otwórz przeglądarkę plików EM na dużą skalę i otwórz plik "informacje o mozaice". Spowoduje to otwarcie wszystkich kafelkowych plików tif. Najlepiej jest to zrobić na innej stacji roboczej, aby nie utrudniać nowych przejęć.
2. Wybierz opcję "automatyczne ścieganie całej mozaiki" (parametry trybu nakładania się na pół, próg ściegu 0,90, automatyczna redukcja szumów. W przypadku, gdy kryteria łączenia nie mogą być spełnione, powiększ i ręcznie umieść płytkę w odpowiednim miejscu, a następnie kliknij "kontynuuj tak, jak jest").
3. Eksportuj jako plik html lub jako pojedynczy plik TIF.
   Należy pamiętać, że w przypadku eksportu TIF może być konieczne skalowanie w dół. Uwzględnij ostateczny rozmiar piksela w nazwie pliku, aby umożliwić późniejsze pomiary.
4. Wykonaj adnotacje w pliku TIF, otwierając go w programie do edycji obrazów. Równolegle otwórz plik html z możliwością powiększania w przeglądarce internetowej, aby uzyskać optymalną obserwację rozdzielczości.

Wyniki

Duży zestaw danych EM przekrojów koronalnych głowy 1-tygodniowych larw danio pręgowanego pokazuje wiele cech tkankowych i komórkowych na jednym dużym obrazie (www.nanotomy.org).

Nanotomia kontrolnych odcinków mózgu ujawnia typowe ultrastrukturalne cechy tkanki nerwowej przodomózgowia, w tym wiązki włókien węchowych, jądra neuronalne i podprzedziały neuronalne, w tym synapsy (Rysunek 2A, www.nanotomy.org). Typy komórek w głowie, które można rozróżnić, obejmują chondrocyty z dużymi wakuolami w dolnej szczęce, osmiofilową mielinę węchowych komórek nerwowych, komórki śródbłonka małego naczynia, struktury obejmują meninx (odpowiednik opon mózgowych danio pręgowanego, błoniastą warstwę otaczającą mózg ssaka). Struktury subkomórkowe obejmują glikokaliksy naskórka, różne morfologie jądrowe i ogniska w różnych typach komórek i organelli, w tym aparat Golgiego, retikulum endoplazmatyczne (ER), mitochondria i pęcherzyki synaptyczne oraz gęstości postsynaptyczne.

Nieoczekiwanie jądra komórek wyściełających komorę są bardzo gęste elektronowo w porównaniu z innymi komórkami rozproszonymi bardziej poprzecznie w mózgu. Ponadto te jądra komorowe wykazują ciemne ogniska, które są nieobecne w innych komórkach mózgu i wydają się różnić wielkością i strukturą od heterochromatyny, która znajduje się w jądrach mikrogleju fagocytarnego (ryc. 2). Komórki wyściełające komorę u rozwijającego się danio pręgowanego obejmują głównie promieniste komórki glejowe i neuronalne komórki progenitorowe, które mogą odzwierciedlać zmieniony stan chromatyny niż bardziej zróżnicowane komórki. Ponieważ komórki macierzyste w tkankach są na ogół dość rzadkie, nanotomia do korelacji znakowania tkanek dla markerów komórek macierzystych z EM w skali tkankowej może być wykorzystana do identyfikacji ultrastrukturalnych cech komórek macierzystych.

Wielkoskalowe EM (www.nanotomy.org) przekroju koronalnego u larwy danio pręgowanego poddawanej ablacji neuronalnej ujawnia wiele specyficznych tkanek oraz cech komórkowych i molekularnych, których nie ma u zwierząt kontrolnych. Cechy komórkowe obejmują mikroglej fagocytarny i wakuole wielkości komórek, prawdopodobnie reprezentujące umierające komórki (ryc. 2B, www.nanotomy.org). Poprzednie badania EM zidentyfikowały mikroglej u kręgowców^18,19. Charakterystyczne cechy mikrogleju to wydłużone jądra, grudki niejednolitej chromatyny obok otoczki jądrowej, wydatny aparat Golgiego, wolne polirybosomy, ziarnista retikulum endoplazmatyczne (ER) z długimi, wąskimi cysternami, stosunkowo ciemna/gęsta cytoplazma oraz liczne inkluzje, takie jak fagosomy, kropelki lipidów i lizosomy. Wszystkie te cechy charakterystyczne, przypisywane mikroglejowi w tkankach ssaków, znaleziono również w tych komórkach w mózgach danio pręgowanego (ryc. 2B, www.nanotomy.org).

Rysunek 1: Przebieg pracy wielkoskalowej mikroskopii elektronowej tkanek na mózgach danio pręgowanego. (A) 7-dniowe larwy danio pręgowanego. (B) Głowy larw danio pręgowanego zanurzone obok siebie w żywicy epoksydowej. (C) Nóż szklany do półcienkiego krojenia i orientowania próbki. (D) Reprezentatywny półcienki przekrój zabarwiony na niebiesko toluidyną, przedstawiający dwie osadzone obok siebie larwy danio pręgowanego. (E) Nóż diamentowy do cięcia ultracienkich (70 nm) odcinków. (F) Edytowany obraz w (D) całego przekroju mózgu larw danio pręgowanego na siatce z jednym otworem, aby wskazać położenie. (G) System mikroskopowy używany do wielkoskalowych badań 2D EM w tym badaniu. (H) Przebieg przetwarzania obrazu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ryc. 2: Wyniki nanotomii: od makrocząsteczki do tkanki. (A) Nanotomia mózgów 7 dni po zapłodnieniu kontrola i (B) leczona (ablacja neuronów; Ryc. 1), wykazując cechy charakterystyczne dla neuronalnie ablowanego mózgu zwyrodnieniowego. (B) Należą do nich mikroglej fagocytarny, ciemne komórki ulegające śmierci komórkowej i gąbczasty wygląd tkanki nerwowej ((A) i (B)). Górne panele (dostosowane od⁵ ): 10-krotnie powiększony widok obszaru wskazanego w środkowych panelach. Środkowe panele: 10-krotnie powiększony widok obszaru wskazanego w dolnych panelach. (A, środkowy panel) Widok neuropilu w dużym powiększeniu pokazujący synapsy w (A, dolny panel), pęcherzyki synaptyczne (SVs) i gęstość postsynaptyczną (PD). (B, Panel środkowy) Widok w dużym powiększeniu mikrogleju ameboidalnego lub ewentualnie makrofaga (środkowy panel, M) wykazującego typowe cechy ameboidalnego mikrogleju (dolny panel), w tym wydatny aparat Golgiego (G), inkluzje, w tym lizosomalne wakuole (L). Podziałki: 50 μm (góra), 5 μm (środek) i 0,5 μm (dół). Liczba ta została zmodyfikowana z⁵. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku, lub odwiedź pełną wersję danych online (nanotomy.org).

Dyskusja

EM umożliwia analizę kontekstu komórkowego z obrazowaniem makrocząsteczek w wysokiej rozdzielczości w kontekście biologicznym. Zazwyczaj jednak ogranicza to pole widzenia. Technologia 3D EM na większą skalę jest szczególnie przydatna do mapowania połączeń neuronalnych poprzez tworzenie trójwymiarowych rekonstrukcji w nanoskali, co wymaga złożonego przetwarzania danych¹⁰. W przeciwieństwie do tego, EM 2D na dużą skalę wymaga tylko jednego przekroju i zszywania danych obrazowych, a ocena danych jest możliwa przez każdego, kto ma dostęp do przeglądarki internetowej. My i inni wcześniej używaliśmy EM na dużą skalę do analizy tkanek i całych zwierząt. Podobnie jak w przypadku większości podejść, szwy oparte na TEM i SEM mają swoje zalety. Zastosowano tu transmisję skaningową EM (STEM), która pozwala na generowanie dużego pola widzenia w wysokiej rozdzielczości. Zazwyczaj jeden obraz STEM odpowiada polom widzenia około 100 obrazów TEM, co znacznie zmniejsza ilość szwów podczas obrazowania dużych pól widzenia w wysokiej rozdzielczości. Jeśli potrzebna jest wyższa rozdzielczość, TEM może być korzystny. STEM ma tę przewagę nad TEM, że próbki niekontrastowe mogą być używane z dobrym kontrastem ultrastrukturalnym⁶ .

Dodatkowo, opisana tutaj metoda może być łatwo dostosowana do użytku z detekcją elektronów wstecznie rozproszonych (BSD) na sekcjach zamontowanych na płytkach krzemionkowych, rozszerzając zastosowanie na wiele systemów mikroskopowych. Pliki EM tkanek z możliwością powiększania w formacie HTML są bardzo przydatne do kwantyfikacji, udostępniania danych, które mogły nie zostać przeanalizowane do pełnej zawartości, łączenia danych LM i EM (CLEM)⁸, do celów prezentacji w badaniach naukowych, do analizy danych pacjentów oraz do edukacji. Alternatywnie, w wielkoskalowych EM w SEM, ale nie w TEM, można zastosować płytki krzemionkowe, co ma dwie główne zalety: Można zastosować BSD, które jest bardziej ogólnie dostępne w skaningowych mikroskopach elektronowych niż detekcja STEM. Po drugie, montaż dużych odcinków (> 1 mm² obszary zainteresowania) jest prosty. Montaż na pojedynczych rusztach szczelinowych jest pracochłonny i trudny technicznie. Szczegółowe porównanie między TEM, SEM i STEM jest szczegółowo opisane w innym miejscu⁶. Wadą obrazowania BSD jest to, że w porównaniu z STEM obrazy mają zwiększony szum. Można to częściowo zrekompensować poprzez wydłużenie czasu przebywania pikseli, co skutkuje znacznie dłuższym czasem akwizycji.

Chociaż do przygotowania próbki potrzebna jest stosunkowo standardowa obróbka EM (utrwalanie, osadzanie i cięcie)^5-7 , cięcie dużych ultracienkich odcinków całkowicie pozbawionych artefaktów jest technicznie trudne. Sekcje są bardzo delikatne, łatwo się łamią, składają lub ulegają zniszczeniu podczas obrazowania, co zwykle zajmuje wiele godzin na zestaw danych. Jednak ze względu na udostępnianie w internecie nieprzetworzonych, bezstronnych danych, powinno stać się możliwe łatwiejsze porównywanie ich z danymi publikowanymi i wykorzystywanie opublikowanych zbiorów danych w otwartej domenie jako elementów kontrolnych. Obecnie w użyciu jest niewiele urządzeń EM zdolnych do analizy na dużą skalę, a zatem dostęp do tej techniki jest nieco ograniczony, chociaż większość ośrodków obrazowania z zadowoleniem przyjmuje wspólne wysiłki.

W przypadku dużych odcinków tkanka musi być odpowiednio utrwalona w całej próbce. Dlatego stosuje się mieszaninę szybkiego, ale umiarkowanego utrwalacza PFA w połączeniu z powolnym, ale silnym utrwalaczem GA. Cięcie i zbieranie dużych odcinków bez artefaktów jest trudne. Praca z waflami w połączeniu z BSD jest łatwiejsza w porównaniu do zbierania sekcji na siatkach z pojedynczymi otworami. Barwienie po metalach ciężkich jest bardziej krytyczne w porównaniu z klasycznym EM. Ponieważ cała sekcja jest zobrazowana, każdy artefakt będzie widoczny. Użytkownicy TEM zazwyczaj mają trudności z przejściem na SEM ze względu na różnicę w działaniu mikroskopu.

Kwantyfikacja i udostępnianie danych - Kwantyfikacja cech subkomórkowych jest trudna w przypadku pojedynczych obrazów EM. Możliwość powiększania i pomniejszania obrazów wielkoskalowych umożliwia łatwą identyfikację interesujących komórek, po której można przeprowadzić pomiary w skali nano wewnątrz komórek. Te zestawy danych wskazują, że określone typy komórek można szybko zidentyfikować i określić ilościowo w sposób bezstronny w tych dużych odcinkach tkanki, w oparciu o cechy wykrywalne w różnych skalach. Na przykład mikroglej można zidentyfikować na podstawie jego morfologii i gęstej cytoplazmy. Następnie, po powiększeniu poszczególnych komórek, subkomórkowe i molekularne cechy tych komórek w nanoskali można zmierzyć w ramach tego samego zestawu danych, jak wcześniej pokazaliśmy dla szerokości ER w dużym zestawie danych hodowli tkankowej EM². Dodatkową zaletą nanotomii jest to, że hosting dużych zbiorów danych online pozwoli innym na sprawdzenie danych, być może pod kątem innych cech, i wyciągnięcie wniosków na podstawie nowej hipotezy.

CLEM - Oprócz ułatwienia ilościowego EM, EM na dużą skalę ułatwia skorelowanie etykietowania pod mikroskopem świetlnym z poziomem EM⁸. W niniejszym przykładzie pokazano obecność mikrogleju fagocytarnego w modelu ablacji danio pręgowanego. Głównym pytaniem w neurobiologii jest to, jakie są indywidualne funkcje i wkład mikrogleju i potencjalnych innych źródeł komórek fagocytarnych i odpornościowych. Wczesne badania EM wykazały charakterystyczne subkomórkowe cechy mikrogleju w chorobie¹⁸. Niestety, trudno jest selektywnie oznaczać mikroglej, zwłaszcza w warunkach patologicznych, ponieważ wykazują one duże nakładanie się na siebie innych komórek odpornościowych pod względem ekspresji, morfologii i funkcji genów. Dlatego nie jest jasne, czy i kiedy mikroglej na poziomie ultrastrukturalnym różni się od komórek odpornościowych z innych źródeł, w tym makrofagów naciekających pochodzących z monocytów. Zrozumienie, czy istnieją różnice ultrastrukturalne między tymi komórkami, będzie punktem wyjścia do analizy różnic funkcjonalnych. Połączenie selektywnych markerów transgenicznych lub ekspresyjnych i CLEM umożliwia wykrycie cech ultrastrukturalnych selektywnych dla określonych populacji.

Diagnoza, prezentacja i edukacja - Dzięki wizualizacji od nanoskali do mikroskali w ramach jednego zestawu danych, dane EM są znacznie ułatwione dla szerokiego grona odbiorców. Wraz ze zwiększonymi możliwościami i narzędziami do korelacyjnego i wielkoskalowego EM przewidujemy odrodzenie EM w badaniach podstawowych i medycznych. Nasza metoda przedstawiona tutaj jest stosowana do modelu uszkodzenia mózgu danio pręgowanego⁵, ale została zastosowana na tkance ludzkiej⁷, mózgu szczura³, w modelu szczura na cukrzycę⁴ i w hodowli komórkowej², a także może być stosowana w połączeniu z podejściem opartym na TEM¹ , co pokazuje wszechstronność tej metody. Operator mikroskopu nie rejestruje już wysoce wyselekcjonowanych, a tym samym tendencyjnych obrazów, ale wszystkie liczne cechy ultrastrukturalne są rejestrowane i dostępne do analizy na całym świecie.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Chemicals
low topnia agaroza	VWR	444152G
trikaina	Sigma	E10521
triton-X-100	Sigma	X100
aldehyd glutarowy	Polysciences	1909
kakodylan sodu	Sigma	C0250
tetratlenek osmu	Mikroskopia elektronowa Nauki	19114
żelazocyjanek potasu (K4[Fe(CN)]6)	Merck	4984
etanol	VWR	20821.365
octan uranylu	Merck	8473
tetraboran sodu	Merck	1063808
błękit toluidenowy	Merck	1273
zasadowa fuksyna	BDH	340324
cytrynian ołowiu	BDH	wycofane z produkcji
EPON
2-dodecenylsuccinicacid anhydride	Serva	20755
bezwodnik metylonadowy	Serva	29452
eter glicydowy 100	Serva	21045
DMP-30	Polysciences	553
standardowa płaska forma do zatapiania	Mikroskopia elektronowa Sciences	70901
nóż diamentowy	Diatome Inc.
Siatki miedziane	Mikroskopia elektronowa Nauki dwustronna taśma węglowa
	Mikroskopia elektronowa Nauka skaning
EM Zeiss Supra55	Ultramikrotom Zeiss
Leica EM UC7	Zewnętrzny
Atlas	Zasady fibicyjne