Artykuł metodologiczny

Ulepszanie modeli 2D i 3D skóry in vitro za pomocą stłoczenia makromolekularnego

DOI:

10.3791/53642

⸱

22 sierpnia 2016

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 2Epithelial Biology Laboratory, Institute of Medical Biology, A*STAR, 3Department of Biomedical Engineering, Faculty of Engineering, National University of Singapore

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy protokół uzyskiwania matryc pochodzących z komórek bogatych w białka macierzy zewnątrzkomórkowej, przy użyciu makromolekularnych crowderów (MMC). Ponadto przedstawiamy protokół, który włącza MMC do generowania 3D organotypowych kokultur skóry, co skraca czas hodowli przy zachowaniu dojrzałości konstruktu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rodzina glikoprotein kolagenów reprezentuje główne białka strukturalne w ludzkim ciele i są kluczowymi składnikami biomateriałów stosowanych w nowoczesnej inżynierii tkankowej. Technicznym wąskim gardłem jest odkładanie się kolagenu in vitro, ponieważ jest ono notorycznie powolne, co skutkuje nieoptymalnym tworzeniem tkanki łącznej i późniejszą spójnością tkanek, szczególnie w modelach skóry. W tym miejscu opisujemy metodę, która polega na dodawaniu kopolimerów sacharozy o różnej wielkości do kultur skórnych w celu wytworzenia stłoczenia makromolekularnego (MMC), co skutkuje radykalnym zwiększeniem odkładania kolagenu. W szczególności fibroblasty skórne zdeponowały znaczną ilość kolagenu I/IV/VII i fibronektyny pod MMC w porównaniu z grupą kontrolną.

Protokół opisuje również metodę decelularizacji stłoczonych warstw komórek, odsłaniając znaczne ilości macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), które zostały zatrzymane na powierzchni hodowli, czego dowodem jest immunocytochemia. Całkowitą masę i rozkład matrycy badano za pomocą mikroskopii interferencyjnej i refleksyjnej. Co ciekawe, fibroblasty, keratynocyty i kokultury wytwarzały matryce pochodzenia komórkowego (CDM) o różnym składzie i morfologii. CDM może być wykorzystywane jako "bio-rusztowania" do wtórnego wysiewu komórek, gdzie można uniknąć obecnego stosowania powłok lub rusztowań, zazwyczaj pochodzących z ksenogennych źródeł zwierzęcych, przechodząc w ten sposób do bardziej istotnych klinicznie zastosowań.

Ponadto, ten protokół opisuje zastosowanie MMC podczas fazy zanurzonej modelu 3D-organotypowej kokultury skóry, co było wystarczające do zwiększenia odkładania się ECM w połączeniu skórno-naskórkowym (DEJ), w szczególności kolagenu VII, głównego składnika włókienek kotwiczących. Mikroskopia elektronowa potwierdziła obecność włókienek kotwiczących w kulturach opracowanych za pomocą MMC, w porównaniu z kontrolą. Jest to istotne, ponieważ zakotwiczenie włókienek wiąże skórę właściwą z naskórkiem, stąd posiadanie wstępnie uformowanego dojrzałego DEJ może przynieść korzyści biorcom przeszczepu skóry pod względem stabilności przeszczepu i ogólnego gojenia się ran. Co więcej, czas hodowli został skrócony z 5 tygodni do 3 tygodni, aby uzyskać dojrzały konstrukt, przy użyciu MMC, co zmniejszyło koszty.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Skóra tworzy barierę ochronną, zapobiegając utracie wody i przedostawaniu się patogenów. Składa się z trzech głównych elementów; Skóra właściwa bogata w zręb1, warstwowy naskórek2,3,4 na nim i połączenie skórno-naskórkowe pomiędzy5,6. Skóra właściwa składa się głównie z włókien kolagenowych i elastycznych i jest słabo zaludniona fibroblastami7. Natomiast naskórek bogaty w komórki składa się z wielu warstw keratynocytów. Keratynocyty najbardziej wewnętrznej warstwy są proliferacyjne i dostarczają nowych komórek podstawnych, które odnawiają i zastępują końcowo różnicujące się keratynocyty, które stale przemieszczają się do najbardziej zewnętrznej warstwy skóry i utraciły swoje jądra i materiał cytoplazmatyczny, w wyniku czego powstaje zrogowaciała warstwa, która ulega złuszczaniu.

Połączenie skórno-naskórkowe, specyficzny rodzaj błony podstawnej, to złożona struktura złożona z łączących się cząsteczek macierzy, która wiąże naskórek ze skórą właściwą. Włókna kolagenu I skóry właściwej przeplatają się z włókienkami zakotwiczającymi kolagen VII, które są zakotwiczone w blaszce gęstej bogatej w kolagen IV. Włókna kotwiczące (laminina 5, kolagen XVII i integryny) z kolei łączą blaszkę gęstą z hemidesmosomami keratynocytów podstawnych. Keratynocyty podstawne (warstwa podstawna) mają zdolność proliferacji i odnawiania, a także różnicowania i rozwarstwiania w celu utworzenia warstw nadpodstawnych; warstwa kolczasta, warstwa ziarnista i wreszcie warstwa rogowa naskórka, która reprezentuje powierzchnię kontaktu skóry z otoczeniem. W drodze od warstwy podstawowej do warstwy rogowaciałej keratynocyty zmieniają wzorce ekspresji cytokeratyn i ostatecznie ulegają apoptozie i zamykają się w zrogowaciałych otoczkach, kadłubach określonych białek, które są kowalencyjnie usieciowane przez aktywność transglutaminazy.

Odtworzenie skóry i jej warstw in vitro, w tym złożonych struktur połączenia skórno-naskórkowego i skórnej macierzy zewnątrzkomórkowej, oraz naśladowanie procesu rogowacenia, od dawna intrygowało naukowców i bioinżynierów jako trudne zadanie. Poczyniono znaczne postępy w inżynierii tkanki skórnej, na przykład udało nam się wyodrębnić komórki skóry z biopsji pacjenta i wygenerować kultury organotypowe skóry przy użyciu komórek skóry pochodzących od pacjenta8. Pozostają jednak nierozwiązane problemy związane ze słabym wydzielaniem białek macierzy zewnątrzkomórkowej przez same komórki skóry, co skutkuje nieoptymalnymi modelami skóry. Co więcej, czas potrzebny do wygenerowania organotypowej współkultury skóry 3D przy użyciu obecnych protokołów waha się od czterech do ośmiu tygodni, a ramy czasowe mogą zostać potencjalnie skrócone dzięki włączeniu makromolekularnych tłumów. Skrócenie czasu hodowli pozwala zaoszczędzić koszty odczynników, zmniejsza częstość starzenia się komórek i skraca czas oczekiwania pacjenta w przypadku stosowania produktu w klinice.

Makromolekularne zatłoczenie (MMC) polega na wprowadzeniu określonych makrocząsteczek do pożywki hodowlanej w celu wygenerowania wykluczonych efektów objętościowych. Wpływają one na szybkość reakcji enzymatycznych, w tym na proteolityczne rozszczepienie prokolagenu, który jest spóźniony w standardowych warunkach hodowli wodnej9-13. W MMC reakcje enzymatyczne są przyspieszane bez zwiększania ilości odczynników14,15, co powoduje, w przypadku rozszczepienia prokolagenu, zwiększoną ilość cząsteczek kolagenu I w zatłoczonych kulturach w porównaniu z niezatłoczonymi kontrolami10. Ponieważ konwersja prokolagenu do kolagenu umożliwia tworzenie zespołów kolagenowych, fibroblasty hodowane za pomocą MMC przez 48 godzin dały znacznie więcej kolagenu I w porównaniu z niezatłoczonymi kulturami fibroblastów monitorowanymi przez okres do czterech tygodni11,16,17. Oprócz wpływu na aktywność enzymatyczną, która wpływa na tworzenie, stabilizację i przebudowę ECM, wykazano również, że MMC bezpośrednio wzmacnia i moduluje tworzenie włókien kolagenowych18,19.

Prezentujemy tutaj metodę zwiększania produkcji macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) przez komórki skóry, w szczególności fibroblasty skóry i keratynocyty naskórka. Ponadto wykazaliśmy, że wzbogacony ECM wytwarzany pod MMC w hodowlach jednowarstwowych może być decelularyzowany i stosowany jako czysta matryca pochodzenia komórkowego (CDM).

Używamy niekonwencjonalnego podejścia do wizualizacji i pełnego docenienia ECM zdeponowanego przez komórki skóry hodowane za pomocą MMC. Mikroskopia interferencyjna odbiciowa jest zwykle stosowana do badania interakcji komórka-matryca lub punktów kontaktowych komórka-szkło. Technika ta została wykorzystana w naszym systemie do wyświetlenia całkowitej ilości matrycy osadzonej na powierzchni szkła. Interferencyjną mikroskopię refleksyjną połączono z fluorescencyjnym barwieniem immunologicznym, aby uzyskać jak najwięcej informacji pod względem składu i wzoru macierzy zewnątrzkomórkowej, w obecności i bez MMC.

Organotypowe kokultury skóry to klasyczna metoda modelowania skóry in vitro w kontekście trójwymiarowym. Podczas gdy dwuwymiarowe współkultury mogą dostarczać istotnych informacji, jest to ograniczone w przypadku tłumaczenia tych danych i stosowania ich z powrotem w środowisku in vivo, które jest z natury trójwymiarową strukturą. W szczególności keratynocyty skóry są spolaryzowane i zawierają segmenty wierzchołkowe i podstawne, które są niezbędne do homeostazy i przylegania komórek. Ponadto ekspresja typowych białek nadpodstawnych w keratynocytach powyżej warstwy podstawnej, takich jak keratyna 1, keratyna 10 i filagryna występuje tylko w przebiegu stratyfikacji i końcowego różnicowania keratynocytów. Ponieważ różnicowanie końcowe jest prawie nieobecne w typowych kulturach jednowarstwowych, suprapodstawowa ekspresja białka zwykle nie jest osiągana w tym systemie hodowli. Dlatego kultury organotypowe zaczynają się zanurzać w pożywce hodowlanej, ale następnie są przenoszone do granicy faz powietrze-ciecz, aby napędzać różnicowanie keratynocytów. Powoduje to ekspresję markerów stratyfikacji, a nawet rogowacenie i ogólnie lepsze odzwierciedlenie fizjologii naskórka. Podczas gdy inne grupy wcześniej z powodzeniem generowały organotypowe kokultury skóry, ustanowienie funkcjonalnej strefy połączenia skórno-naskórkowego stanowiło problem. W tym miejscu przedstawiamy nową metodę hodowli organtypowych kokultur skóry ze wzmocnioną błoną podstawną, w skondensowanych ramach czasowych i bez uszczerbku dla dojrzałości tych konstruktów. Pozwoliłoby to na opracowanie mimetyki skóry do modelowania in vitro, badania biologii skóry oraz szeregu testów przesiewowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Makromolekularne stłoczenia w hodowlach komórek skóry 2D

  1. Wysiewaj 50 000 komórek (pierwotne fibroblasty lub pierwotne keratynocyty lub kokultura pierwotnych fibroblastów i keratynocytów) w dołku 24-dołkowej płytki. Komórki nasienne w 1 ml pożywki wzrostowej odpowiedniego typu komórek.
  2. Pozostawić komórki do przylegania przez noc w inkubatorze o temperaturze 37 °C przy 5% CO2 .
  3. Wyrzuć stare podłoża i zastąp je 1 ml świeżej pożywki zawierającej tłumiki makromolekularne i 100 μM kwasu askorbinowego. Użyj koktajlu tłumu składającego się z 37,5 mg/ml Ficoll 70 i 25 mg/ml Ficoll 400. Stosować pożywki fibroblastowe (FM) składające się z DMEM uzupełnionego 10% antybiotykami FBS i 1% penicyliny-streptomycyny. Hoduj keratynocyty w pożywce bez surowicy, KSFM lub CnT-57. Utrzymuj kokultury w mieszaninie 50% FM i 50% pożywki wolnej od surowicy.
  4. Inkubować kultury przez 6 dni w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 , zmieniając pożywkę co 2 dni.

2. Fluorescencyjne barwienie immunologiczne na kulturach komórkowych skóry

  1. Umyj kultury komórkowe dwukrotnie 1x PBS.
  2. Utrwal hodowle komórkowe metanolem lub paraformaldehydem (w zależności od specyfikacji przeciwciał).
    1. Do utrwalania metanolu
      1. Do każdej studzienki podsycić 500 μl zimnego metanolu i inkubować w temperaturze -20 °C przez 10 minut. Odessać utrwalacz i odrzucić odpady metanolu. Suszyć na powietrzu w laminarnym okapie wyciągowym.
    2. Do utrwalania paraformaldehydu
      1. Do każdej studzienki należy dodać 500 μl 2% roztworu paraformaldehydu i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Odessać utrwalacz i wyrzucić odpady paraformaldehydu.
      2. Umyć 1x PBS, na trzy prania, 5 min na pranie.
      3. Podaniec 1 ml 1x PBS do każdej studzienki.
  3. Fluorescencyjne barwienie immunologiczne przy użyciu przeciwciał
    1. Porcję 500 μl 3% albuminy surowicy bydlęcej (rozcieńczonej w 1x PBS) do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Zassać roztwór blokujący i wyrzucić.
    2. Przeciwciało pierwszorzędowe
      1. Do obrazowania bezpośrednio z płytki: Podać 200 μl roztworu przeciwciała pierwszorzędowego (rozcieńczenie 1:100 w 10% surowicy koziej) do każdego dołka i inkubować przez 90 minut w temperaturze pokojowej.
      2. W przypadku szkiełek nakrywkowych: Podać 50 μl roztworu przeciwciała pierwszorzędowego (rozcieńczenie 1:100 w 10% surowicy koziej) na płaski kawałek Parafilmu. Umieścić szkiełko nakrywkowe na Parafilmie, stroną komórkową (część szkiełka nakrywkowego z komórkami) skierowaną w stronę roztworu. Przykryj całą stronę komórki, bez pęcherzyków powietrza. Inkubować przez 90 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Odessać roztwór przeciwciała pierwotnego i wyrzucić.
    4. Umyć 1x PBS, na trzy prania, 5 min na pranie.
    5. Przeciwciało drugorzędowe
      1. Do obrazowania bezpośrednio z płytki: Podwielokrotność 200 μl roztworu przeciwciał drugorzędowych (rozcieńczenie 1:400 w 10% surowicy koziej) do każdej studzienki i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej, przykrywając płytkę folią aluminiową.
      2. W przypadku szkiełek nakrywkowych: Podać 50 μl roztworu przeciwciał drugorzędowych (rozcieńczenie 1:400 w 10% surowicy koziej) na płaski kawałek Parafilmu. Umieścić szkiełko nakrywkowe na Parafilmie, stroną komórkową (część szkiełka nakrywkowego z komórkami) skierowaną w stronę roztworu. Przykryj całą stronę komórki, bez pęcherzyków powietrza. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej, przykrywając Parafilm folią aluminiową.
    6. Odessać roztwór przeciwciał wtórnych i wyrzucić.
    7. Umyć 1x PBS, na trzy prania, 5 min na pranie. Podaniec 1 ml 1x PBS do każdej studzienki.
    8. Montażu
      1. W przypadku obrazowania bezpośrednio z płyty: nie montować. Przejdź do mikroskopu.
      2. Do obrazowania szkiełek nakrywkowych: Zamontuj szkiełka nakrywkowe w nośniku montażowym na szkiełku podstawowym. Suszyć przez noc w pojemniku pokrytym folią aluminiową. Przejdź do mikroskopu.
  4. Uzyskuj obrazy za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego z obiektywem olejowym 40X/1,30.

3. Western Blot kultur komórkowych skóry

  1. Umyj warstwy komórek dwukrotnie za pomocą 1x PBS.
  2. Podaniec 100 μl buforu do lizy (patrz Wykaz materiałów) do każdego dołka (forma płytki 6-dołkowej). Zeskrobać warstwę komórkową za pomocą skrobaka do komórek i przenieść roztwór do probówki mikrowirówkowej.
  3. Odwirować roztwór o stężeniu 15,330 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant do innej probówki do mikrowirówki i wyrzucić osad.
  4. Zmieszać 13 μl każdej próbki z 5 μl buforu próbki i 2 μl środka redukującego (patrz wykaz materiałów). Podgrzewać próbki w temperaturze 95 °C przez 10 minut.
  5. Odwirować próbki o masie 15 330 x g przez 1 minutę w celu zebrania wody kondensacyjnej. Załaduj próbki do wstępnie obsadzonego żelu PAGE i pracuj pod napięciem 100 V przez około 1 godzinę.
  6. Aby przenieść oddzielone białka do membrany nitrocelulozowej, umieść żel i membranę między kawałkami papieru i gąbkami (tego samego rozmiaru). Upewnij się, że między żelem, membraną, papierami i gąbkami nie ma pęcherzyków. Zamknij kasetę kanapkową i uruchom transfer pod napięciem 70 V przez 2 godziny.
  7. Aby sprawdzić, czy transfer został zakończony, inkubuj membranę z 10 ml Ponceau S. Umyj membranę 0,1% PBS-Tween-20, trzy razy, po 10 minut na pranie.
  8. Blok z 10 ml 5% mleka przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Umyj membranę 0,1% PBS-Tween-20, trzy razy po 10 minut na pranie.
  9. Inkubować z 10 ml przeciwciała pierwszorzędowego przez 90 minut (mysi antykolagen VII, LH 7,2, rozcieńczenie 1:1,000 w 5% mleku). Umyj membranę 0,1% PBS-Tween-20, trzy razy po 10 minut na pranie.
  10. Inkubować z 10 ml przeciwciała drugorzędowego przez 30 minut (kozi anty-mysi HRP, rozcieńczenie 1:2 000 w 5% mleku). Umyj membranę 0,1% PBS-Tween-20, trzy razy po 10 minut na pranie.
  11. Przenieść membranę do kasety i dodać 1 ml odczynnika do wykrywania ECL. Umieść przezroczysty, cienki plastikowy arkusz na membranie.
  12. Aby wykryć chemiluminescencję, umieść światłoczułą folię na plastikowym arkuszu i zamknij kasetę. Po 2-5 minutach wyjmij folię z kasety i umieść ją w wywoływaczu.

4. Tworzenie i używanie matrycy pochodzącej z komórek

  1. Wysiewaj 50 000 komórek (pierwotne fibroblasty lub pierwotne keratynocyty lub kokultura pierwotnych fibroblastów i keratynocytów) w dołku 24-dołkowej płytki.
  2. Pozostawić komórki do przylegania przez noc w inkubatorze o temperaturze 37 °C przy 5% CO2 .
  3. Wyrzuć stare podłoża i zastąp je świeżymi pożywkami zawierającymi tłumiki makromolekularne i 100 μM kwasu askorbinowego. Koktajl crowder składa się z 37,5 mg/ml Ficoll 70 i 25 mg/ml Ficoll 400. Pożywka fibroblastyczna (FM) składa się z DMEM uzupełnionego 10% FBS i 1% paciorkowcem. Keratynocyty są hodowane w pożywce bez surowicy, KSFM lub CnT-57. Utrzymuj kokultury w mieszaninie 50% FM i 50% KSFM lub CnT-57.
  4. Inkubować kultury przez 6 dni w inkubatorze o temperaturze 37 °C przy 5% CO2 , zmieniając pożywkę co 2 dni.
  5. Decelularyzacja warstw komórkowych w celu uzyskania macierzy pochodzącej z komórki (f-mat = macierz pochodząca z fibroblastów, k-mat = matryca pochodząca z keratynocytów, co-mat = matryca pochodząca ze wspólnej hodowli fibroblastów i keratynocytów).
    1. Umyj warstwy komórek dwukrotnie w 1x PBS.
    2. Dodać 250 μl 0,5% deoksycholanu sodu. Inkubować na lodzie przez 10 minut. Aspirować lizat komórkowy.
    3. Powtórz krok 4.5.2 trzy razy.
    4. Dwukrotnie przemyć matrycę pochodzącą z komórek w destylowanymH2O. Przechowywać matrycę pochodzącą z komórek w 1x PBS. Matryce można przechowywać do 1 tygodnia w temperaturze 4 °C.
  6. Przygotuj wtórną zawiesinę komórek (na przykład wysiewając keratynocyty na wierzchu f-mat).
    1. Odsysać 1x PBS.
    2. Zasiej 50 000 keratynocytów na wierzchu macierzy pochodzącej z komórki (f-mat). Pozostawić komórki do przylegania przez noc w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% CO2,
      Uwaga: Testy można przeprowadzać bezpośrednio na przylegających komórkach.

5. Charakterystyka matrycy pochodzącej z komórki

  1. Barwienie immunologiczne fluorescencyjne: Patrz Protokół 2.
  2. Mikroskopia interferencyjna refleksyjna
    1. Komórki nasienne na szklanych szkiełkach nakrywkowych, zgodnie z protokołem 4.1-4.5.
    2. Po uzyskaniu matrycy pochodzącej z komórek należy ustalić próbki zgodnie z protokołem 2.2.
      Uwaga: Barwienie przeciwciałami jest opcjonalne. W razie potrzeby należy zapoznać się z Protokołem 2.3.
    3. Wykonaj akwizycję obrazu za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego z obiektywem olejowym 40X/1,30. Ustaw otwór na 74 mm.
    4. Użyj LP 505 dla kanału mikroskopii interferencyjnej i refleksyjnego (IRM) dla kanału BP 575-615 IR dla kanału fluorescencji czerwonej dla filtrów. Użyj NT 80/20 dla kanału IRM i HFT 405/488/561, NFT 565, płytki dla czerwonego kanału fluorescencji dla rozdzielaczy wiązki. Należy stosować następujące lasery: DPSS 561-10 (długość fali 561 nm) o mocy 1,1% dla kanału czerwonego fluorescencji oraz HeNe633 (długość fali 633 nm) o mocy 5,0% dla kanału IRM.

6. 3D Współkultura Skóry Organotypowej

  1. Odleć żel kolagenowy z otoczonymi fibroblastami we wkładce do hodowli komórkowej (format płytki 6-dołkowej).
    1. Podaniec 10 ml kolagenu typu I z ogona szczura do zimnej zlewki.
    2. Dodać 1 ml zimnego DMEM. Dodać 0,5 ml 1 M NaOH, aby zneutralizować kwaśny kolagen. Dodać 0,5 ml zawiesiny fibroblastów (zawierającej 1 200 000 fibroblastów).
    3. Przenieść roztwór, w zimnej pipecie, do wkładek do hodowli komórkowych na płytce 6-dołkowej. 12 ml całkowitego roztworu równomiernie podzielić na 6 wkładek do hodowli komórkowych.
    4. Inkubować żel w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 przez 1 godzinę.
    5. Po zestaleniu się żelu zanurz go w FM. Po 24 godzinach wyrzuć stare podłoża i zastąp je świeżymi, zawierającymi tłumiki makromolekularne. Dodać objętość 2 ml do wnętrza wkładki do hodowli komórkowej i 2 ml do zewnętrznej strony wkładki do hodowli komórkowej.
  2. Po 24 godzinach Keratynocyty nasienne na wierzchu żelu kolagenowego.
    1. Trypsynizować keratynocyty za pomocą 0,125% trypsyny/czynnika chelatującego przez 5 minut w temperaturze 37 °C. Delikatnie postukać w boki kolby, aby usunąć komórki i zneutralizować trypinę za pomocą pożywki zawierającej surowicę. Policz komórki i przygotuj zawiesinę keratynocytów (300 000 keratynocytów w żelu i zawieszonych w 200 μl pożywki).
    2. Odessać stare podłoża z wkładki do hodowli komórkowej. Dodaj keratynocyty na wierzch żelu.
    3. Inkubować żel w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 przez 1 godzinę.
    4. Po przyczepieniu się keratynocytów do powierzchni żelu, zanurzyć żel z 2 ml KSFM lub CnT-57 do wnętrza wkładki do hodowli komórkowej i 2 ml FM na zewnątrz wkładki do hodowli komórkowej.
  3. Po 24 godzinach wyrzuć stare podłoża i zastąp je świeżymi, zawierającymi tłumiki makromolekularne.
  4. Po 7 dniach zanurzenia kultury podnieś kulturę do granicy faz powietrze-ciecz.
    1. Przenieść wkładkę do hodowli komórkowej na płytkę z głęboką studzienką. Dodać 10 ml pożywki stratyfikacyjnej na zewnątrz wkładki do hodowli komórkowej. Utrzymuj wnętrze wkładu do hodowli komórkowej w suchym miejscu.
  5. Inkubować kultury w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 i zmieniać pożywki co 3 dni przez następne 14 dni.
    Uwaga: Po 2 tygodniach na granicy powietrzno-płynnej odpowiednik skóry jest dojrzały i można go pobrać (zamrożony na zatrzask lub utrwalony w formalinie).

7. Zbiór i charakterystyka organotypowych odpowiedników skóry

  1. Zasysanie pożywki stratyfikacyjne.
  2. Za pomocą pęsety przenieś wkładki hodowlane na ręcznik papierowy i zetrzyj pozostałą pożywkę z podstawy wkładki.
  3. Za pomocą skalpela przeciąć wzdłuż wewnętrznego obwodu wkładu hodowlanego.
  4. Zamocuj organtypową kokulturę skóry (wraz z membraną PET).
    1. Szybkie zamrażanie
      1. Przenieś konstrukt żelowy do krioformy. Przykryj wnętrze kriomoldu związkiem OCT. Umieść kriomold w ciekłym azocie na 10 sekund.
      2. Za pomocą pęsety wyjmij zamrożony kriomold z ciekłego azotu, zawiń w folię aluminiową i przechowuj zamrożone próbki w zamrażarce o temperaturze -80 °C.
      3. Zamrożone próbki należy podzielić na sekcje za pomocą kriostatu o grubości przekroju 7 μm.
    2. Utrwalanie formaliny
      1. Umieść "gąbkę do biopsji" w "kasecie biopsyjnej". Przenieś żelową konstrukcję na podkładkę gąbkową. Delikatnie umieść kolejną gąbkę na wierzchu żelowej konstrukcji. Zamknij kasetę.
      2. Całkowicie zanurz kasetę w 10% neutralnej buforowanej formalinie na 48 godzin w temperaturze pokojowej. Wyjmij kasetę i wyrzuć odpady formaliny.
      3. Utrwaloną próbkę należy osadzić w bloku woskowym, najpierw odwadniając ją serią etanolu, a następnie stopniowo infiltrując próbkę woskiem. Przeciąć blok wosku za pomocą mikrotomu.
  5. Charakterystyka odpowiednika skóry
    1. Barwienie immunologiczne
      1. Dla sekcji zamrożonych:
        1. Inkubować skrawki w 10% surowicy koziej (rozcieńczonej w 1x PBS) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Umyj skrawki w 1x PBS, aby usunąć kozią surowicę.
        2. Inkubować skrawki z pierwszorzędowym przeciwciałem (rozcieńczenie 1:100 w 10% surowicy koziej) przez 90 minut w temperaturze pokojowej. Umyj sekcje w 1x PBS, trzy razy po 5 minut na pranie.
        3. Inkubować skrawki z przeciwciałem drugorzędowym (rozcieńczenie 1:400 w 10% surowicy koziej) przez 30 minut w temperaturze pokojowej, w pojemniku pokrytym folią aluminiową. Umyj sekcje w 1x PBS, trzy razy po 5 minut na pranie.
        4. Zamontuj szkiełka z nośnikami montażowymi na szkle nakrywkowym. Przykryj próbki folią aluminiową i pozostaw do wyschnięcia na noc.
        5. Obraz za pomocą mikroskopu konfokalnego z obiektywem olejowym 40X/1,30.
      2. Dla sekcji zatopionych w parafinie utrwalonej w formalinie:
        1. Odparafinować skrawki (i ponownie uwodnić) w malejących procentach etanolu do wody (ksylen - 100% etanol - 90% etanol - 80% etanol - 70% etanol - woda). Całkowicie zanurz próbki w roztworach. Każdy etap usuwania wosku powinien trwać 3 minuty.
        2. Inkubować sekcje w 1% nadtlenku wodoru przez 30 min. Myć sekcje w 1x PBS przez 5 min.
        3. Inkubować skrawki w roztworze cytrynianu (10 ml roztworu cytrynianu rozpuszcza się w 90 ml wody) w temperaturze 120 °C przez 20 minut. Pozostawić szkiełka do ostygnięcia przez noc, w temperaturze pokojowej. Umyj sekcje w 1x PBS, trzy razy po 5 minut na pranie.
        4. Inkubować skrawki w 10% surowicy koziej (rozcieńczonej w 1x PBS) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Umyj skrawki w 1x PBS, aby usunąć kozią surowicę.
        5. Inkubować skrawki z pierwszorzędowym przeciwciałem (rozcieńczenie 1:100 w 10% surowicy koziej) przez 90 minut w temperaturze pokojowej. Umyj sekcje w 1x PBS, trzy razy po 10 minut na pranie.
        6. Inkubować skrawki z polimerem znakowanym HRP (nierozcieńczonym) przez 30 minut, w temperaturze pokojowej. Umyj sekcje 1x PBS, trzy razy po 10 minut na pranie.
        7. Do probówki do mikrowirówki połączyć 1 ml substratu DAB (3,3'-diaminobenzydyna) z 1 kroplą chromogenu. Inkubuj skrawki tym roztworem przez 15 sekund - 5 minut (kolor brązowy = sygnał dodatni).
        8. Aby zatrzymać reakcję, umyj sekcje pod bieżącą wodą.
        9. Przeciwbarwić jądra hematoksyliną przez 5 min. Płukać skrawki pod bieżącą wodą.
        10. Inkubować skrawki w roztworze kwaśnego alkoholu przez 1 minutę. Opłukać sekcje pod bieżącą wodą.
        11. Inkubuj sekcje w roztworze wody z kranu Scotta przez 2 minuty. Opłucz sekcje pod bieżącą wodą.
        12. Opcjonalnie: Inkubować skrawki w eozynie przez 1 minutę i myć pod bieżącą wodą.
        13. Odwodnić sekcje w rosnących procentach etanolu do ksylenu (70% etanol - 80% etanol - 90% etanol - 100% etanol - ksylen). Upewnij się, że próbki są całkowicie zanurzone na 3 minuty na każdy etap.
        14. Zamontuj szkiełka za pomocą nośnika montażowego do szkła nakrywkowego. Suszyć na powietrzu przez noc.
        15. Obraz za pomocą mikroskopu konfokalnego z obiektywem olejowym 40X/1,30.
    2. Transmisyjna mikroskopia elektronowa (w celu wizualizacji włókien kotwiczących)
      1. Utrwal próbki w 2,5% aldehydzie glutarowym przez 72 godziny.
      2. Umyj próbki w 1x PBS, trzy razy po 10 minut na pranie.
      3. Pokroić na małe kawałki (1 mm3). Próbki po utrwaleniu w 1% tetratlenku osmu, pH 7,4, przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Próbki należy myć w wodzie destylowanej.
        Ostrzeżenie: Tetratlenek osmu jest trujący i toksyczny i należy obchodzić się z nim ostrożnie w okapie.
      4. Próbki należy odwadniać przez rosnącą serię etanolu (25% etanolu - 50% etanolu - 75% etanolu - 95% etanolu - 100% etanolu - acetonu) przez 20 minut na krok.
      5. Naciekać przez moczenie próbek w 100% acetonie: żywica aralditowa (1:1) przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie w stosunku 1:3 przez 1 godzinę, a następnie 1:6 przez noc. Zanurzyć próbkę w świeżej żywicy aralditowej przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, a następnie ponownie zmienić świeżą żywicę aralditową na 1 godzinę w temperaturze 40 °C. Pozostawić trzecią świeżą wymianę żywicy aralditowej na 1 godzinę w temperaturze 45 °C, a czwartą świeżą wymianę żywicy aralditowej pozostawić na 1 godzinę w temperaturze 50 °C.
      6. Próbki inkubować w temperaturze 60 °C przez 24 godziny, aby umożliwić polimeryzację.
      7. Próbki skrawków należy pobrać za pomocą noża do szkła, aby uzyskać półcienkie skrawki o grubości 1 μm. Wycinek bejcowy z błękitem metylenowym w celu obserwacji histologicznej. Podziel próbkę na sekcje, aby uzyskać ultracienkie odcinki o długości fali 70 nm i zbierz każdą sekcję na miedzianej siatce.
      8. Zabarwić skrawki 5% roztworem octanu uranylu przez 15 minut, a następnie 3% roztworem cytrynianu ołowiu przez 10 minut.
      9. Rejestruj obrazy za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego (100 kV) w powiększeniu 30 000X.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Makromolekularne stłoczenie było w stanie zwiększyć odkładanie ECM, w szczególności fibroblasty odkładały więcej kolagenu I, IV i fibronektyny w porównaniu z kulturami kontrolnymi (Rysunek 1, Warstwa komórkowa; 1A, kolagen I; 1B, kolagen IV; 1C, fibronektyna). Po decelularyzacji okazało się, że fibroblasty były głównymi depozytorami kolagenu I, IV i fibronektyny w porównaniu z keratynocytami (ryc. 1, Maci...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wzmocnioną macierz zewnątrzkomórkową uzyskuje się po wprowadzeniu makromolekularnych crowderów do hodowli komórkowej, dzięki wykluczeniu efektu objętościowego, który zwiększa rozszczepienie propeptydu przez proteinazy. Powoduje to, że macierz zewnątrzkomórkowa, w szczególności kolagen, jest szybciej przetwarzana i osadza się na powierzchni hodowli. Podczas gdy inne grupy uzyskały grube warstwy komórek fibroblastów, wymagało to czasu hodowli wynoszącego kilka tygodni20. W przeciwieństwie do tego, MMC opisany w ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają sprzecznych interesów do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Radę Badań Biomedycznych w Singapurze poprzez podstawowe wsparcie dla Instytutu Biologii Medycznej i grant SPF2013/005. M.R. był wspierany przez Grant Wydziału Badawczego NUS (Inżynieria w Medycynie) (M.R.) R-397-000-081-112 oraz Program Inżynierii Tkankowej NUS (NUSTEP). Autorzy pragną podziękować profesor Irene Leigh za dostarczenie przeciwciała kolagenu VII. Prace nad mikroskopią elektronową przeprowadzono w Zakładzie Mikroskopii Elektronowej Narodowego Uniwersytetu Singapuru.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kwas askorbinowyWako013-12061Dodatek do pożywki do hodowli
komórkowych Wkładki do hodowli komórkowych  (format 6-dołkowy)Greiner Bio-One657610Kultury organotypowe
Roztwór cytrynianuDakoS2369DakoCytomation Docelowy roztwór do pobierania cytrynianu, pH 6 (x10
)Kolagen (ogon szczura)Corning354236Kultury organotypowe
CnT-57CELLnTECCnT-57Pożywka do hodowli komórkowych
Podłoże DAB + zestaw chromogenówDakoK3468Histologia
Płytka głębokodołkowa (format 6-dołkowy)Corning355467Kultury organotypowe Odczynnik
do wykrywania ECLGE Healthcare Life SciencesRPN2106Odczynnik do wykrywania Western Blotting Amersham ECL
Mikroskop elektronowy (TEM)  JEOL   JEM-1010 (100kV)Transmisyjna mikroskopia elektronowa
Pożywka fibroblastów (FM)Wysoka glukoza-DMEM + 10% płodowa surowica bydlęca + 1% penicylina Streptomycyna
Ficoll PM70GE Opieka zdrowotna Nauki przyrodnicze17-0310-05Tłumik makromolekularny
Ficoll PM400GE Healthcare Nauki przyrodnicze17-0300-05Makromolekularny crowder
Pożywki bez surowicy keratynocytów (KSFM)Life Technologies17005-042Pożywka do hodowli komórkowych
Bufor do lizyThermoFisher Scientific89900Bufor do lizy do ekstrakcji białek. Inhibitor proteazy (Roche, #11836170001) został dodany do tego buforu do lizy. 
MikroskopZeissLSM510Czerwone, zielone i niebieskie kanały do wizualizacji fluorescencyjnych barwień immunologicznych AF594, AF488 i DAPI (40X mag).
Nośnik montażowy (Hydromount)National DiagnosticsHS-106Barwienie fluorescencyjne
Media montażowe (Cytoseal)ThermoFisher Scientific8310-16Histologia (HRP)
Związek OCT (Tissue Tek)Sakura4583Osadzanie do kriotomii
Antybiotyki penicylinowo-streptomycynoweSigma AldrichA5955Dodatek do pożywek do hodowli komórkowych
Przeciwciała pierwotne
Przeciwciało anty-Kolagenowe IAbcam#ab6308
Anty-Kolagen typu IVNovocastra#NCL-COLL-IV
Antykolagen VIILH7.2 (we własnym zakresie) 
Przeciwciało anty-fibronektynoweAbcam#ab2413
Środek redukujący ThermoFisher ScientificNP0009Western blot
Bufor do próbekThermoFisher ScientificNP0008Western blot
przeciwciała drugorzędowe (barwienie immunologiczne)
4′,6-diamidino-2-fenyloindolu dichlorowodorek (DAPI)Sigma Aldrich#D9542
AlexaFluor 594 kozio-anty-królikThermoFisher Naukowy#A-11037 
AlexaFluor 594 koza przeciw myszomThermoFisher Scientific #A-11005
AlexaFluor 488 kurczak anty-królikThermoFisher Scientific#A-21441
AlexaFluor 488 koza anty-myszThermoFisher Scientific#A-11001
Przeciwciała drugorzędowe (HRP)DakoEnvision+ System - Polimerowy anty-królik i anty-myszy z oznaczeniem HRPnierozcieńczony
deoksycholan soduProdotti Chimicie AlimentariDecelularyzacja
Pożywka warstwowa
Zmodyfikowany Dulbecco's Eagle's Medium Stosowany podczas granicy faz powietrze-ciecz w kulturach organotypowych. Pożywkę tę dodaje się na zewnątrz wkładki do hodowli komórkowej.
Szynka" s F12     Stosowany podczas granicy faz powietrze-ciecz w kulturach organotypowych. Pożywkę tę dodaje się na zewnątrz wkładki do hodowli komórkowej.
10% płodowa surowica bydlęca Stosowany podczas granicy faz powietrze-ciecz w kulturach organotypowych. Pożywkę tę dodaje się na zewnątrz wkładki do hodowli komórkowej.
100 U/ml penicyliny i 100 U/ml streptomycynyStosowany podczas granicy faz powietrze-ciecz w kulturach organotypowych. Pożywkę tę dodaje się na zewnątrz wkładki do hodowli komórkowej.
0,4 mg/ml hydrokortyzonStosowany podczas granicy faz powietrze-ciecz w kulturach organotypowych. Pożywkę tę dodaje się na zewnątrz wkładki do hodowli komórkowej.
5 mg/ml insulinyStosowany na granicy faz powietrze-ciecz w kulturach organotypowych. Pożywkę tę dodaje się na zewnątrz wkładki do hodowli komórkowej.
1,8 i środkowa kropka; 10-4 M adenina   Stosowany podczas granicy faz powietrze-ciecz w kulturach organotypowych. Pożywkę tę dodaje się na zewnątrz wkładki do hodowli komórkowej.
5 mg/ml transferynyStosowany podczas granicy faz powietrze-ciecz w kulturach organotypowych. Pożywkę tę dodaje się na zewnątrz wkładki do hodowli komórkowej.
2· 10- 11 M trójjodotyronina Stosowany podczas granicy faz powietrze-ciecz w kulturach organotypowych. Pożywkę tę dodaje się na zewnątrz wkładki do hodowli komórkowej.
TrypsinBiopolis Udogodnienia Wspólne0,125% Trypsyna/Versene    pH 7,0 + 0,3 Służy do trypsynizacji komórek

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Breitkreutz, D., Mirancea, N., Nischt, R. Basement membranes in skin: unique structures with diverse functions. Histochem Cell Biol. 132 (1), 1-10 (2009).
  2. Lane, E. B., et al. mutation in the conserved helix termination peptide of keratin 5 in hereditary skin blistering. Nature. 356 (6366), 244-246 (1992).
  3. Fuchs, E., Raghavan, S. Getting under the skin of epidermal morphogenesis. Nat Rev Genet. 3 (3), 199-209 (2002).
  4. Niessen, C. M. Tight junctions/adherens junctions: basic structure and function. J Invest Dermatol. 127 (11), 2525-2532 (2007).
  5. Jarvelainen, H., Sainio, A., Koulu, M., Wight, T. N., Penttinen, R. Extracellular matrix molecules: potential targets in pharmacotherapy. Pharmacol Rev. 61 (2), 198-223 (2009).
  6. Schaefer, L., Schaefer, R. M. Proteoglycans: from structural compounds to signaling molecules. Cell Tissue Res. 339 (1), 237-246 (2010).
  7. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. J Cell Sci. 123 (Pt 24), 4195-4200 (2010).
  8. Ghalbzouri, A., Jonkman, M., Dijkman, R., Ponec, M. Basement membrane reconstruction in human skin equivalents is regulated by fibroblasts and/or exogenously activated keratinocytes. J Invest Dermatol. 124 (1), 79-86 (2005).
  9. Lareu, R. R., Arsianti, I., Harve, K. S., Peng, Y. X., Raghunath, M. In Vitro Enhancement of Collagen Matrix Formation and Crosslinking for Applications in Tissue Engineering--a Preliminary Study. Tiss Eng. 13 (2), 385-391 (2007).
  10. Lareu, R. R., et al. Collagen matrix deposition is dramatically enhanced in vitro when crowded with charged macromolecules: the biological relevance of the excluded volume effect. FEBS Lett. 581 (14), 2709-2714 (2007).
  11. Lareu, R. R., Harve, K. S., Raghunath, M. Emulating a crowded intracellular environment in vitro. dramatically improves RT-PCR performance. Biophys Biochem Res Comm. 363 (1), 171-177 (2007).
  12. Harve, K. S., Ramakrishnan, V., Rajagopalan, R., Raghunath, M. Macromolecular crowding in vitro as means of emulating cellular interiors: when less might be more. Proc Natl Acad USA Sci. 105 (51), E119(2008).
  13. Chen, C., et al. The Scar-in-a-Jar: Studying antifibrotic lead compounds from the epigenetic to extracellular level in a single well. Br J Pharmacol. 158 (5), 1196-1209 (2009).
  14. Harve, K. S., Lareu, R., Rajagopalan, R., Raghunath, M. Understanding how the crowded interior of cells stabilizes DNA/DNA and DNA/RNA hybrids-in silico predictions and in vitro evidence. Nucleic Acids Res. 38 (1), 172-181 (2009).
  15. Satyam, A., et al. Macromolecular crowding meets tissue engineering by self-assembly: A paradigm shift in regenerative medicine. Adv Mat. 26 (19), 3024-3034 (2014).
  16. Chen, C. Z. C., Loe, F., Blocki, A., Peng, Y., Raghunath, M. Applying macromolecular crowding to enhance extracellular matrix deposition and its remodeling in vitro for tissue engineering and cell-based therapies. Adv Drug Deliv Rev. 63 (4-5), 277-290 (2011).
  17. Rashid, R., et al. Novel use for Polyvinylpyrrolidone as a Macromolecular Crowder for Enhanced Extracellular Matrix Deposition and Cell Proliferation. Tiss Eng C. , (2014).
  18. Dewavrin, J. Y., Hamzavi, N., Shim, V. P. W., Raghunath, M. Tuning the Architecture of 3D Collagen Hydrogels by Physiological Macromolecular Crowding. Acta Biomaterialia. 10 (10), 4351-4359 (2014).
  19. Dewavrin, J. Y., et al. Synergistic Rate Boosting of Collagen Fibrillogenesis in Heterogeneous Mixtures of Crowding Agents. J Phys Chem B. 119 (12), 4350-4358 (2015).
  20. Auger, F. A., Berthod, F., Moulin, V., Pouliot, R., Germain, L. Tissue engineered skin substitutes: from in vitro constructs to in vivo applications. Biotechnol Appl Biochem. 39, 263(2004).
  21. Chen, B., et al. Macromolecular crowding effect on cartilaginous matrix production: a comparison of two-dimensional and three-dimensional models. Tiss Eng Part C Methods. 19 (8), 586-595 (2013).
  22. Zeiger, A. S., Loe, F. C., Li, R., Raghunath, M., van Vliet, K. J. Macromolecular crowding directs extracellular matrix organization and mesenchymal stem cell behavior. PLOS One. 7 (5), e37904(2012).
  23. Kumar, P., et al. Macromolecularly crowded in vitro microenvironments accelerate the production of extracellular matrix-rich supramolecular assemblies. Scientific Reports. 5, 8729(2015).
  24. Ang, X. M., et al. Macromolecular crowding amplifies adipogenesis of human bone marrow-derived MSCs by enhancing the pro-adipogenic microenvironment. Tiss Eng Part A. 20 (5-6), 966-981 (2014).
  25. Peng, Y. X., et al. Human Fibroblast Matrices Bioassembled Under Macromolecular Crowding Support Stable Propagation Of Human Embryonic Stem Cells. J Tiss Eng Regen Med. 6 (10), e74-e84 (2012).
  26. Benny, P., Badowski, C., Lane, E. B., Raghunath, M. Making More Matrix: Enhancing the deposition of dermal-epidermal junction components in vitro and accelerating organotypic skin culture development, using macromolecular crowding. Tiss Eng A. 21 (1-2), 182-192 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

odk adanie kolagenumacierz pochodzenia kom rkowegomikroskopia interferencyjno odbiciowa3D model sk rypo czenie sk rno nask rkowew kna kotwicz cehodowla organotypowamacierz zewn trzkom rkowakokultura fibroblast w i keratynocyt w

Powiązane artykuły