Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Indukcja matczynej aktywacji immunologicznej u myszy w połowie ciąży za pomocą wirusowego poli(I:C)

19.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53643

⸱

25 marca 2016

 ,  , 
1Division of Biology and Biological Engineering, California Institute of Technology, 2Harvard Medical School

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Aktywacja immunologiczna matki (MIA) jest modelem środowiskowego czynnika ryzyka autyzmu i schizofrenii. Celem tego artykułu jest przedstawienie krok po kroku procedury, w jaki sposób indukować MIA u ciężarnych myszy w celu zwiększenia odtwarzalności tego modelu.

Streszczenie

Model aktywacji immunologicznej matki (MIA) jest coraz bardziej ceniony jako model gryzoni dla środowiskowego czynnika ryzyka różnych zaburzeń psychicznych. Liczne badania wykazały, że model MIA jest w stanie pokazać twarz, konstrukcję i trafność predykcyjną, które są istotne dla autyzmu i schizofrenii. Aby modelować MIA, badacze często używają wirusowego kwasu poliinozynowego: policytydylowego (poli(I:C)) w celu aktywacji układu odpornościowego u ciężarnych gryzoni. Ogólnie rzecz biorąc, potomstwo matki aktywowanej immunologicznie wykazuje nieprawidłowości behawioralne i zmiany fizjologiczne, które są związane z autyzmem i schizofrenią. Jednak wstrzyknięcie poli(I:C) w różnych dawkach i w różnych punktach czasowych może prowadzić do różnych wyników poprzez zaburzenia rozwoju mózgu na różnych etapach. Tutaj przedstawiamy szczegółową metodę indukcji MIA przez dootrzewnowe (i.p.) wstrzyknięcie 20 mg / kg poli(I:C) w połowie ciąży embrionalnej 12,5 dnia (E12.5). Wykazano, że metoda ta indukuje ostrą reakcję zapalną na osi matczyno-łożyskowo-płodowej, co ostatecznie prowadzi do zaburzeń mózgu i fenotypów behawioralnych związanych z autyzmem i schizofrenią.

Wprowadzenie

Koncepcja aktywacji immunologicznej matki (MIA) wywodzi się z badań epidemiologicznych dotyczących związku infekcji u matki z autyzmem i schizofrenią1. Ze względu na brak wykrywalnych replikujących się patogenów wirusowych w łożysku lub mózgu płodu po zakażeniu wirusowym matki2,3, przypuszcza się, że wpływ infekcji na potomstwo jest spowodowany aktywacją układu odpornościowego matki, a nie samymi patogenami.

Aby wyjaśnić związek przyczynowo-skutkowy między MIA a zaburzeniami psychicznymi, wstrzyknięcie chemicznie syntetyzowanego, wirusowego dwuniciowego dwuniciowego RNA poliinozynowego:kwasu policytydylowego (poli(I:C)) do ciężarnych gryzoni było szeroko stosowane jako model zwierzęcy dla MIA4,5. Poly(I:C) jest rozpoznawany przez toll-like receptor 3 (TLR3), a ogólnoustrojowe podawanie poli(I:C) indukuje wirusopodobną ostrą odpowiedź zapalną. Jednym z mechanizmów, za pomocą których poli(I:C) powoduje nieprawidłowości behawioralne i neuropatologie u potomstwa, jest powodowanie nierównowagi cytokin pro- i przeciwzapalnych w osi matczyno-łożyskowo-płodowej6. Kilka grup przyjęło model MIA, aby zrozumieć etiologię zaburzeń psychicznych7, a ze względu na zróżnicowane zainteresowania grup badawczych, różne punkty czasowe aktywacji immunologicznej zostały wykorzystane do osiągnięcia różnych zaburzeń w rozwoju mózgu i zachowaniach7.

Laboratorium Paula H. Pattersona w Kalifornijskim Instytucie Technologicznym przyjmuje strategię wstrzykiwania poli(I:C) ciężarnym myszom w embrionalnym 12,5 dniu (E12,5), co skutecznie wykazało, że MIA jest zdolne do wywoływania zmian behawioralnych, neurologicznych i immunologicznych u potomstwa, które są związane z autyzmem i schizofrenią8-11. Nasze wcześniejsze prace pokazują, że potomstwo MIA wykazuje nieprawidłowości behawioralne (np. upośledzenie społeczne, deficyt komunikacji, powtarzające się zachowanie, zachowanie podobne do lęku i utajony deficyt hamowania8,10,12), dysregulację immunologiczną i brak równowagi cytokin8,13,14, zmianę ekspresji genów mózgu płodu15, utratę komórki Purkinjego w zraziku VII móżdżku11, zmianę właściwości synaptycznych w hipokampie9, interakcja gena x ze środowiskiem13, zmiana przepuszczalności jelit i składu mikrobioty jelitowej16. Ponadto w oparciu o ten model system opracowywane są również strategie terapeutyczne i profilaktyczne13,16,17. Indukując MIA na poziomie E12.5, inni wykazali, że MIA powoduje aktywację mikrogleju płodu i cholinergiczną zmianę rozwojową w podstawie przodomózgowia18, interakcję specyficzną dla szczepu19, nieprawidłowości ultrastrukturalne synaptosomalne mózgu mózgu, nieprawidłowości nadczynności mitochondrialnego łańcucha oddechowego mózgu, regulację w dół cząsteczek synaptosomalnych mózgu17, zachowania podobne do depresji, upośledzenie funkcji poznawczych i długotrwałe wzmocnienie hipokampa (LTP) oraz deficyt neurogenezy hipokampau dorosłych 20.

Tutaj podajemy szczegółową metodę indukowania MIA w E12.5 przez poli(I:C), a także paradygmaty zastosowania tego modelu do badania etiologii autyzmu i schizofrenii. Ważnejest, aby pamiętać, że MIA jest czynnikiem ryzyka różnych zaburzeń4, a jego wyniki są niezwykle wrażliwe na czas i metodę indukcji, a także na rozród ciężarnych matek. W związku z tym nawet niewielkie niespójności między laboratoriami często skutkują niską odtwarzalnością i/lub różnymi fenotypami u potomstwa. Nasza metoda została opracowana specjalnie dla osób zainteresowanych badaniem MIA jako środowiskowego czynnika ryzyka autyzmu i schizofrenii, a szczegółowy opis pomoże naukowcom poprawić odtwarzalność ich danych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie protokoły zostały przeprowadzone za zgodą California Institute of Technology Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Przygotowanie do krycia par na czas

  1. Użyj co najmniej 6 zapór do eksperymentów behawioralnych i 3 do analizy ekspresji genów.
    UWAGA: Użyj podwójnej liczby szacowanych samic myszy, ponieważ tylko około 50% myszy zostanie podłączonych po kryciu w czasie.
  2. Stosować samice myszy bez wcześniejszej ciąży i w wieku 8-16 tygodni.
    UWAGA: Samice myszy, które miały wcześniejszy kontakt seksualny z samcami myszy, ale nie były w ciąży, są dopuszczalne.
  3. Trzymaj samice myszy razem i umieść klatki obok siebie, aby zsynchronizować ich cykl rujowy. Użyj standardowej klatki dla myszy o wysokości ponad 5.5 cala i wewnętrznej podłodze o powierzchni 75 cali kwadratowych, aby umożliwić trzymanie 5 dorosłych myszy. Oznacz każdą samicę myszy za pomocą dziurkacza w ucho.

2. Ustawianie pary matów czasowych

  1. Ustaw krycie czasowe na 0-2 godziny przed rozpoczęciem ciemnego cyklu. Umieść dwie samice myszy w każdej klatce. Wyjmij myszy i zważ je indywidualnie. Zapisz masę ciała każdej samicy myszy.
  2. Umieść jednego samca myszy w każdej klatce z dwiema samicami myszy. Użyj trio krycia, aby zminimalizować efekt mylący ojca.

3. Kontrola korka dopochwowego (E0.5)

  1. Sprawdź samice myszy 0-4 godziny po zakończeniu ciemnego cyklu. Delikatnie podnieś samicę myszy z podstawy ogona i pozwól myszy chwycić drucianą siatkę, górną część klatki lub krawędź klatki.
  2. Szukaj śladów czopa dopochwowego: czop pochwowy to widoczna biaława masa w otworze pochwy. Jeśli zatyczka nie jest widoczna, delikatnie włóż końcówkę pipety o pojemności 200 μl do otworu pochwy. Oporność spowodowana krzepnięciem potwierdza tworzenie się czopa pochwowego. Sprawdzaj korek dopochwowy raz dziennie.
    UWAGA: Zatyczka dopochwowa jest jedynie wskazówką, że doszło do kopulacji, a zatem nie gwarantuje ciąży. Korek dopochwowy może być trudny do zidentyfikowania u niektórych szczepów myszy. Zwróć się o pomoc do doświadczonego opiekuna myszy, aby zwiększyć dokładność identyfikacji wtyczek.
  3. Przenieś podłączone myszy do nowej klatki i umieść je w grupie. Zdefiniuj dzień pojawienia się czopa pochwowego jako embrionalny 0,5 dnia (E0,5).

4. Na E10.5-11.5, sprawdź, czy nie ma ciąży

  1. Delikatnie podnieś podstawę ogona i pozwól myszy chwycić drucianą siatkę, górną część klatki lub krawędź klatki. Obserwuj obszar brzucha, aby sprawdzić, czy nie ma oznak ciąży, np. wybrzuszenia w jamie brzusznej (ryc. 1).
    UWAGA: Objaw ciąży jest zawsze bardziej oczywisty w E11.5 niż w E10.5.
  2. Zważ myszy, aby potwierdzić ciążę. Ciężarna mysz na ogół waży około 20% więcej przy E10,5 i 30% cięższa przy E12,5 w porównaniu z myszą niebędącą w ciąży (ryc. 2). Ciężarne myszy trzymane w jednym miejscu są trzymane w czystych klatkach.

5. 20 mg/kg Preparat poli(I:C)

  1. Użyj co najmniej 6 matek na grupę do eksperymentów behawioralnych i 3 na grupę do analizy ekspresji genów. Przygotować odpowiednią ilość roztworu poli(I:C).
  2. Zważyć proszek poli(I:C) w stożkowej probówce o pojemności 50 ml, aby uzyskać końcowe stężenie 40 mg/ml. W celu zminimalizowania i standaryzacji stresu spowodowanego objętością wstrzyknięcia, należy wstrzyknąć 5 μl roztworu poli(I:C) na każdy gram masy ciała myszy (5 μl/g lub 5 ml/kg). Aby wywołać MIA, wstrzykujemy 20 mg poli(I:C) na kg.
    UWAGA: Wymagane stężenie roztworu poli(I:C) wynosi (20 mg/kg)/(5 ml/kg) = 4 mg/ml. Ponieważ proszek poli(I:C) zawiera 10% poli(I:C), musimy uzyskać końcowe stężenie (4 mg / ml)/0,1 = 40 mg/ml roztworu poli(I:C).
    UWAGA: Proszek poli(I:C) jest bardzo lekki. Uważaj, aby nie stracić proszku podczas przenoszenia ze szpatułki do stożkowej tuby.
  3. Dodać odpowiednią objętość 0,9% chlorku sodu (soli fizjologicznej) do stożkowej probówki i zamknąć nakrętkę. Rozpuść proszek, delikatnie tocząc kroplę soli fizjologicznej po proszku poli(I:C), aż roztwór będzie klarowny. Odwirować stożkową probówkę o masie 800 x g przez 1 minutę (Rysunek 3C). Przefiltrować roztwór poli(I:C) przez filtr 0,22 μm. Przenieść roztwór poli(I:C) do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 lub 2 ml. Opcjonalnie: Użyj spektrofotometru, aby zmierzyć stosunek 260/280 roztworu poli(I:C). Upewnij się, że stosunek wynosi od 1,54 do 1,82 (rysunek 3) zgodnie z opisem producenta. UWAGA: Sól fizjologiczna używana do rozpuszczania proszku poli(I:C) i służąca jako iniekcja kontrolna powinna być sterylna i farmaceutyczna.

6. Wstrzyknięcie soli fizjologicznej lub poli(I:C) na E12.5

  1. Zważ mysz na wadze i włóż ją z powrotem do klatki. Użyj następującego wzoru, aby obliczyć objętość wstrzyknięcia zarówno dla myszy z solą fizjologiczną, jak i myszy z poli(I:C): masa ciała (g) pomnożona przez 5 = pożądana objętość wstrzyknięcia (μl). Za pomocą strzykawki insulinowej o pojemności 0,3 ml pobrać obliczoną objętość roztworu soli fizjologicznej lub roztworu poli(I:C) w stężeniu 20 mg/kg, np. 150 μl dla myszy o wadze 30 g.
  2. Delikatnie podnieś mysz za podstawę ogona i umieść ją na klatce. Z myszą należy obchodzić się delikatnie, aby uniknąć zakłóceń wywołanych stresem. Wbić igłę, skos do góry, pod kątem około 20° w stosunku do myszy do środka jej dwóch górnych sutków (Rysunek 4) i wstrzyknąć roztwór soli fizjologicznej lub poli(I:C). UWAGA: Igła powinna być wymieniana dla każdej myszy po wstrzyknięciu.
  3. Umieść mysz z powrotem w klatce domowej. Umieść klatki w cichym pomieszczeniu o małym natężeniu ruchu, aby uniknąć innych zakłócających efektów.

7. Dzień po wstrzyknięciu poli(I:C) (E13.5)

  1. Sprawdź myszy, którym wstrzyknięto zastrzyk, następnego ranka. Użyj wagi do pomiaru masy ciała.
    UWAGA: Ciężarne myszy, którym wstrzyknięto poli(I:C), zwykle przybierają na wadze mniej niż myszy, którym wstrzyknięto sól fizjologiczną następnego dnia po wstrzyknięciu.
  2. Nie przeszkadzaj myszom, dopóki nie urodzi się potomstwo.

8. Wskaźnik potomstwa MIA

  1. Aby zminimalizować zakłócające skutki indukcji MIA, postępuj zgodnie z poniższymi wskazówkami, aby ocenić wykorzystanie potomstwa MIA.
    1. Wykluczyć mioty z przedwczesnego lub opóźnionego porodu lub jeśli liczba miotu jest mniejsza niż 5.
    2. Poddaj eutanazji nadmierną ilość szczeniąt za pomocą CO2, jeśli wielkość miotu jest większa niż 10.

9. Opcjonalnie: Zbadaj ostrą reakcję zapalną po MIA

  1. Uśmierc ciężarne myszy 3 godziny po wstrzyknięciu soli fizjologicznej lub poli(I:C) metodą opisaną w protokole zatwierdzonym przez komitet ds. opieki nad zwierzętami instytucji.
    UWAGA: Zwichnięcie szyjki macicy jest często preferowane, ponieważ minimalizuje wpływ leków CO2 / eutanazji na matkę i zarodek.
  2. Zbierz śledzionę od dorosłych ciężarnych myszy i wyizoluj łożysko i mózg płodu pod mikroskopem stereoskopowym.
    1. W celu pobrania śledziony połóż mysz na płytce preparacyjnej i spryskaj 70% etanolem okolice brzucha ciężarnych myszy. Użyj sterylnych nożyczek, aby wykonać pionowe cięcie na środku brzucha poniżej klatki piersiowej przez skórę.
    2. Śledziona znajduje się w lewym górnym kwadrancie brzucha. Użyj kleszczy, aby odizolować śledzionę. Zwiń śledzionę na delikatnych wycieraczkach do zadań, aby usunąć tkankę tłuszczową wokół narządu. Zbierz około 50 mg tkanki śledziony i umieść je pojedynczo w probówkach Eppendorfa z 500 μl RNA, buforem stabilizującym lub TRIzolem, aby zapobiec degradacji kwasów nukleinowych. Próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C w zamrażarce do czasu użycia.
    3. W celu pobrania łożyska delikatnie wyciągnij rogi macicy z ciała. Umieść rogi macicy na szalce Petriego wypełnionej autoklawowaną solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i pozostaw naczynie na lodzie. Użyj dwóch kleszczy, aby rozerwać ścianę macicy i odsłonić worek owodniowy.
      1. Ostrożnie użyj kleszczy, aby otworzyć worek owodniowy, nie uszkadzając łożyska i płodu. Oddziel łożysko od płodu i przetnij pępowinę jak najbliżej łożyska. Usuń resztki worka owodniowego z łożyska. Umieść łożysko pojedynczo w probówkach Eppendorfa z 500 μl buforu stabilizującego RNA lub TRIzolu. Przechowywać próbkę w temperaturze -80 °C w zamrażarce do czasu użycia.
    4. W celu pobrania mózgu płodu, przechowuj płód w buforze stabilizującym RNA od kroku 9.2.2 do rozbioru. Oderwij błonę pialną od komory mózgu za pomocą delikatnych kleszczy #5 pod mikroskopem stereoskopowym. Ostrożnie usuń całą błonę z mózgu płodu. Umieść mózgi płodu pojedynczo w probówkach Eppendorfa z buforem stabilizującym 500 μl RNA lub TRIzolem. Przechowywać próbkę w temperaturze -80 °C w zamrażarce do czasu użycia.
  3. Wyodrębnij RNA z tkanki i przekształć RNA w cDNA. Analizuj ekspresję genu Il6 w cDNA za pomocą PCR w czasie rzeczywistym.
  4. Wyodrębnij RNA z tkanek, postępując zgodnie z protokołem wytwarzania TRIzolu. Jeśli tkanki są przechowywane w buforze stabilizującym RNA. Rozmrozić próbkę i odwirować bufor. Przenieść tkankę końcówką do innego eppendorfa z 500 μl TRIzolu i kontynuować ekstrakcję RNA.
  5. Użyj spektrofotometru, aby zmierzyć stężenie, stosunek 260/280 i 260/230 RNA. Upewnij się, że współczynniki są powyżej 2,0.
  6. Wyeliminować zanieczyszczenie DNA poprzez potraktowanie RNA DNazą I. Wymieszać 1 μg RNA, 1 μl buforu reakcyjnego 10X, 1 μl DNazy wolnej od RNaz i wody wolnej od nukleaz do końcowej objętości 10 μl. Inkubować mieszaninę główną w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Dodać 1 μl roztworu zatrzymującego DNazę, aby zakończyć reakcję. Inkubować mieszaninę w temperaturze 65 °C przez 10 minut.
  7. Odwrotna transkrypcja RNA na cDNA. Użyj 20 μl reakcji i do 1 μg całkowitego RNA na reakcję. Wymieszać 4 μl 5x bufor mieszaniny reakcyjnej odwrotnej transkrypcji (RT), 1 μl odwrotnej transkryptazy, 11 μl matrycy RNA po traktowaniu DNazą I i 4 μl H2O bez nukleaz, aby uzyskać końcowy roztwór 20 μl. Zaprogramuj warunki termocyklera dla RT. Warunek ogólny obejmuje: Krok 1: 25 °C przez 5 minut; Krok 2: 42 °C przez 30 min; Krok 3: 85 °C przez 5 min; Krok 4: Przechowywać w temperaturze 4 °C. Rozcieńczyć cDNA 5 razy. W celu krótkotrwałego przechowywania przechowuj cDNA w temperaturze 4°C. W przypadku długotrwałego przechowywania należy zamrozić cDNA w temperaturze -20 °C.
  8. Przeanalizuj ekspresję genu Il6 w cDNA za pomocą PCR w czasie rzeczywistym i znormalizuj ekspresję genu Il6 do ekspresji genu β-aktyny.
    1. Przygotuj mieszankę wzorcową do wykrywania Il6 i β-aktyny. Użyj 25 μl reakcji, główna mieszanka dla każdego genu zawiera 12,5 μl SYBR Green Mix, 0,5 μl 10 μM startera do przodu, 0,5 μl 10 μM startera odwrotnego i 6,5 μl H2O bez nukleaz.
    2. Umieścić 5 μl 5x rozcieńczonego cDNA na dnie dołka optycznej 96-dołkowej płytki reakcyjnej. Odpipetować 20 μl mieszanki wzorcowej do każdego dołka, aby uzyskać końcową mieszaninę PCR o objętości 25 μl. Potroić każdy gen dla każdej próbki. Uszczelnij płytkę za pomocą optycznej folii samoprzylepnej. Obracać płytkę w temperaturze 800 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C Użyj standardowego programu PCR w czasie rzeczywistym: Krok 1: 50 °C przez 2 minuty; Krok 2: 95 °C przez 10 min; Krok 3: 40 cykli po 95 °C przez 15 sekund i temperatura 60 °C przez 1 min. Dodaj dodatkowy krok dla krzywej dysocjacji.

10. Zbadaj nieprawidłowości w zachowaniu u dorosłego potomstwa MIA (opcjonalnie):

  1. Testy zachowania należy wykonywać w wieku 8-12 tygodni. Zmień ściółkę klatki co najmniej 3 dni przed badaniem. Zaaklimatyzuj myszy w pomieszczeniu do testów behawioralnych co najmniej 30 minut przed testem.
  2. W celu zahamowania impulsów wstępnych (PPI) należy unieruchomić myszy w cylindrze z pleksiglasu z czujnikiem piezoelektrycznym pod spodem. Zaaklimatyzować myszy w komorze PPI przez 5 minut. Wystaw myszy za pomocą 6 prób białego szumu 120 dB (przerażenie).
  3. Następnie wystaw myszy za pomocą randomizowanych mieszanin 14 prób szumu tła, 14 prób Startle, 14 prób prepulsu 5 dB (5 dB wyżej niż szum tła) + Strach (PPI5) i 14 prób prepulsu 15 dB (15 dB więcej niż szum tła + Strach (PPI15).
  4. Uśrednij reakcję na zaskoczenie dla pierwszych 6 prób 120 dB. Uśrednij reakcję zaskoczenia dla innych indywidualnych stymulacji. Ukryj wartość hamowania impulsu wstępnego przez (Strach - PPI5 lub PPI15)/Strach.
  5. W przypadku testu na otwartym polu umieść mysz w rogu otwartej kwadratowej areny (50 x 50 x 50 cm3). Nagrywaj trajektorię myszy przez 10 minut za pomocą kamery zamontowanej na suficie. Zdefiniuj środek areny jako strefę środkową (17 x 17 cm2). Określ ilościowo przebytą odległość, wpisy w strefie środkowej i czas spędzony w strefie środkowej ręcznie lub za pomocą oprogramowania do automatycznej analizy opartej na obrazie.
  6. W celu testu zakopania w marmurze zaaklimatyzuj mysz w klatce testowej ze ściśniętą czystą ściółką z sosny osikowej o głębokości 5 cm na 10 minut. Umieść mysz z powrotem w klatce domowej. Delikatnie ułóż 20 granatowych szklanych kulek o średnicy 1,5 cm w układzie 4 x 5. Umieść mysz z powrotem w klatce testowej z kulkami na 10 minut. Policz kulki, które zostały zakopane w ciągu 10 minut trwania testu.

11. Zbadaj neuropatologię móżdżku u dorosłego potomstwa MIA (opcjonalnie):

  1. Poddaj eutanazji dorosłe potomstwo soli fizjologicznej i MIA za pomocą znieczulenia. Przeprowadzić perfuzję myszy z 50 ml PBS, a następnie 50 ml 4% paraformaldehydu przez układ sercowo-naczyniowy.
  2. Ostrożnie usunąć mózg i umieścić mózg w 4% paraformaldehydzie przez noc w temperaturze 4 °C. Przepłukać mózg trzykrotnie PBS i przechowywać mózg w PBS z 0,02% azydkiem sodu w lodówce o temperaturze 4 °C do czasu użycia.
    UWAGA: Mózg z postfiksem może być przechowywany w PBS z 0,02% azydkiem sodu w lodówce przez okres do miesiąca.
  3. Pokrój mózg na cienkie plasterki o grubości 50 μm strzałkowo za pomocą wibratomu. Zbierz skrawki mózgu za pomocą miękkiego pisaka pędzelkowego. Zakończyć aktywność endogennej peroksydazy przez inkubację skrawków w 0,6% nadtlenku wodoru przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Skrawki przeciwciała antykalbindynowego rozcieńczonego w buforze blokującym (10% surowicy koziej z 0,1% Triton X-100 i 0,02% azydkiem sodu w PBS) inkubować przez noc w temperaturze pokojowej. Następnie inkubować skrawki w odpowiednim biotynylowanym przeciwciałie drugorzędowym rozcieńczonym w buforze blokującym przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
  5. Inkubować skrawki w buforze kompleksu awidyny DH - biotynylowanej peroksydazy H, aby wykryć biotynę przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Opracuj sekcje, używając substratu peroksydazy do wizualizacji antygenu. Umyj sekcje PBS trzy razy między etapami. Zamontuj sekcje na szkiełkach mikroskopowych. Zobrazuj skrawki pod mikroskopem.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Iniekcja 20 mg/kg poly(I:C) w dniu E12.5 może wywołać ostrą odpowiedź zapalną w osi matka-łożysko-płód i spowodować chroniczny wpływ na rozwój mózgu oraz fenotypy behawioralne12,13. Podwyższone poziomy cytokiny prozapalnej, interleukiny (IL)-6, są wiarygodnym wskaźnikiem ostrej odpowiedzi zapalnej po MIA. Szczyt ekspresji genu Il6 w łożysku i mózgu płodu przypada na 3 h po iniekcji poly(I:C)12,13. Wykazaliśmy, że poly(I:C) indukuje wyższą ekspresję genu ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Indukcja MIA w różnych oknach czasowych zaburza różne zdarzenia związane z rozwojem mózgu u gryzoni, a w konsekwencji prowadzi do różnych nieprawidłowości behawioralnych i neuropatologii u potomstwa. Tutaj opisaliśmy protokół indukcji MIA u myszy z wstrzyknięciem poli(I:C) w E12.5. Ta metoda indukcji MIA prowadzi do zaburzeń behawioralnych, neurologicznych, immunologicznych i żołądkowo-jelitowych związanych z autyzmem i schizofrenią u potomstwa8,10,11,16. Ważne jest, aby zauważyć, że ponieważ MIA jest środowis...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Chcielibyśmy uhonorować zmarłego dr Paula H. Pattersona za jego wkład w postęp w badaniach nad modelem MIA, autyzmem i schizofrenią. Wyrażamy uznanie dla Sarkisa K. Mazmaniana za jego wielkie poparcie dla tego protokołu; Rubenowi M. Bayonowi, Yvette Garcii-Flores, Karen C. Lencioni i Leslie A. Neumannowi za pomoc administracyjną; Ali Khoshnan i Jan C. Ko za pomoc w realizacji zdjęć; Elaine Y. Hsiao i Natalii Malkovej za ich rady dotyczące indukcji MIA; Jeffrey S. Cochrane, Joaquin Gutierrez, Kwan F. Lee, Jaime Rodriguez, Lorena C. Sandoval i Natalie A. Verduzco za ich ekspercką hodowlę zwierząt. Praca ta była wspierana przez NIH Conte Center Award (NIH 5P50MH086383-04, dla Paula H. Pattersona); Autyzm mówi (#7670, do Paula H. Pattersona); Fundacja Simonsa (#322839, Sarkisowi K. Mazmanianowi); Stypendium szkoleniowe NIH (NIH/NRSA T32GM07616 do K.-H.C.); Letnie stypendium badawcze Caltech Undergraduate Research Fellowship (SURF) (dla Z.Y.); Program stypendialny Amgen w Caltech (do Z.Y.); oraz stypendium podoktorskie od Narodowej Rady Nauki na Tajwanie (NSC 101-2917-I-564-039, do W.-L.W.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Poliinozynowy– sól potasowa kwasu polycytidylowegoSIGMAP9582
0,9% chlorek sodu INJ. USPHOSPIRANDC 0409-4888-10
MONOJECT syrinaż insuliny 3/10 ml 29 G x 1/2"COVIDIEN8881600145
50 ml stożkowe rurki z nakrętkąUSA SCIENTIFIC1500-1211
Spektrofotometr Nanodrop 1000THERMO SCIENTIFIC1000Opcjonalny
mikroskop stereoskopowyWild HeerbruggM5AOpcjonalny
Dumont #5 Kleszcze Inox Rozmiar końcówki .10 X .06 mmRobozRS-5045Opcjonalny
odczynnik stabilizujący RNA RNAlaterQiagen76104Opcjonalny
odczynnik TRIzolLife Technologies15596-026 fakultatywny
RQ1 DNaza bez rnazyPromegaM610AOpcjonalny
zestaw do syntezy cDNA iScriptBio-Rad170-8891Opcjonalny
uniwersalny FastStart SYBR green master mix z ROX Roche4913922001Opcjonalny
PCR w czasie rzeczywistymABI7300Opcjonalnie
Podkład: Il6 forwardLife TechnologiesTAGTCCTTCCTACCCCAATTTCCOpcjonalnie
Starter: Il6 ReverseLife TechnologiesTTGGTCCTTAGCCACTCCTTCOpcjonalnie
Starter: beta-aktyna forwardLife TechnologiesAGAGGGAAATCGTGCGTGACOpcjonalnie
Podstawa: beta-aktyna Technologie odwróconegożyciaCAATAGTGATGACCTGGCCGTOpcjonalna
optyczna 96-dołkowa płytka reakcyjna MicroAmpLife Technologies4306737Opcjonalna
optyczna folia samoprzylepna MicroAmp Life Technologies4311971Optionl
EthoVisionNoldusEthoVisionOptionl
SR-LAB aparat (PPI)San Diego Instruments SR-LABOptionl
MarblesPENN-PLAXNiebieskie kamienie szlachetne MarmuryOptionl
Dulbecco's Suline-Buffered Saline (DPBS)Life Technologies21600-069Optionl
ParaformaldehydMACRON2621-59
Optionl VibratomeLeicaVT1000 SOptionl
Sodium AzideSigmaS2002Optionl
Triton x-100SigmaX100Optionl
Roztwór nadtlenku wodoruSigma18312Optionl
Kozia surowicaVector LaboratoriesS-1000Optionl
Królik przeciwciało anty-kalbindynoweAbcamab11426Optionl
Biotynliowana koza anty-królik IgGantibodyVector LaboratoriesBA-1000Opcjonalny
zestaw ABC VECTASTAINVector LaboratoriesPK-4000Opcja

Bibliografia

  1. Brown, A. S. Epidemiologic studies of exposure to prenatal infection and risk of schizophrenia and autism. Dev Neurobiol. 72 (10), 1272-1276 (2012).
  2. Fatemi, S. H., et al. The viral theory of schizophrenia revisited: abnormal placental gene expression and structural changes with lack of evidence for H1N1 viral presence in placentae of infected mice or brains of exposed offspring. Neuropharmacology. 62 (3), 1290-1298 (2012).
  3. Shi, L., Tu, N., Patterson, P. H. Maternal influenza infection is likely to alter fetal brain development indirectly: the virus is not detected in the fetus. Int J Dev Neurosci. 23 (2-3), 299-305 (2005).
  4. Knuesel, I., et al. Maternal immune activation and abnormal brain development across CNS disorders. Nat Rev Neurol. 10 (11), 643-660 (2014).
  5. Meyer, U. Prenatal poly(i:C) exposure and other developmental immune activation models in rodent systems. Biol Psychiatry. 75 (4), 307-315 (2014).
  6. Meyer, U., Feldon, J., Yee, B. K. A review of the fetal brain cytokine imbalance hypothesis of schizophrenia. Schizophr Bull. 35 (5), 959-972 (2009).
  7. Boksa, P. Effects of prenatal infection on brain development and behavior: a review of findings from animal models. Brain Behav Immun. 24 (6), 881-897 (2010).
  8. Hsiao, E. Y., McBride, S. W., Chow, J., Mazmanian, S. K., Patterson, P. H. Modeling an autism risk factor in mice leads to permanent immune dysregulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (31), 12776-12781 (2012).
  9. Ito, H. T., Smith, S. E., Hsiao, E., Patterson, P. H. Maternal immune activation alters nonspatial information processing in the hippocampus of the adult offspring. Brain Behav Immun. 24 (6), 930-941 (2010).
  10. Smith, S. E., Li, J., Garbett, K., Mirnics, K., Patterson, P. H. Maternal immune activation alters fetal brain development through interleukin-6. J Neurosci. 27 (40), 10695-10702 (2007).
  11. Shi, L., et al. Activation of the maternal immune system alters cerebellar development in the offspring. Brain Behav Immun. 23 (1), 116-123 (2009).
  12. Hsiao, E. Y., Patterson, P. H. Activation of the maternal immune system induces endocrine changes in the placenta via IL-6. Brain Behav Immun. 25 (4), 604-615 (2011).
  13. Wu, W. L., et al. The interaction between maternal immune activation and alpha 7 nicotinic acetylcholine receptor in regulating behaviors in the offspring. Brain Behav Immun. , (2015).
  14. Garay, P. A., Hsiao, E. Y., Patterson, P. H., McAllister, A. K. Maternal immune activation causes age- and region-specific changes in brain cytokines in offspring throughout development. Brain Behav Immun. 31, 54-68 (2013).
  15. Garbett, K. A., Hsiao, E. Y., Kalman, S., Patterson, P. H., Mirnics, K. Effects of maternal immune activation on gene expression patterns in the fetal brain. Transl Psychiatry. 2, e98(2012).
  16. Hsiao, E. Y., et al. Microbiota modulate behavioral and physiological abnormalities associated with neurodevelopmental disorders. Cell. 155 (7), 1451-1463 (2013).
  17. Naviaux, R. K., et al. Antipurinergic therapy corrects the autism-like features in the poly(IC) mouse model. PLoS One. 8 (3), e57380(2013).
  18. Pratt, L., Ni, L., Ponzio, N. M., Jonakait, G. M. Maternal inflammation promotes fetal microglial activation and increased cholinergic expression in the fetal basal forebrain: role of interleukin-6. Pediatr Res. 74 (4), 393-401 (2013).
  19. Schwartzer, J. J., et al. Maternal immune activation and strain specific interactions in the development of autism-like behaviors in mice. Transl Psychiatry. 3, e240(2013).
  20. Khan, D., et al. Long-term effects of maternal immune activation on depression-like behavior in the mouse. Transl Psychiatry. 4, e363(2014).
  21. Workman, A. D., Charvet, C. J., Clancy, B., Darlington, R. B., Finlay, B. L. Modeling transformations of neurodevelopmental sequences across mammalian species. J Neurosci. 33 (17), 7368-7383 (2013).
  22. Abazyan, B., et al. Prenatal interaction of mutant DISC1 and immune activation produces adult psychopathology. Biol Psychiatry. 68 (12), 1172-1181 (2010).
  23. Meyer, U., et al. Adult behavioral and pharmacological dysfunctions following disruption of the fetal brain balance between pro-inflammatory and IL-10-mediated anti-inflammatory signaling. Mol Psychiatry. 13 (2), 208-221 (2008).
  24. Vuillermot, S., et al. Prenatal immune activation interacts with genetic Nurr1 deficiency in the development of attentional impairments. J Neurosci. 32 (2), 436-451 (2012).
  25. Bechard, A., Nicholson, A., Mason, G. Litter size predicts adult stereotypic behavior in female laboratory mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (4), 407-411 (2012).
  26. Harvey, L., Boksa, P. A stereological comparison of GAD67 and reelin expression in the hippocampal stratum oriens of offspring from two mouse models of maternal inflammation during pregnancy. Neuropharmacology. 62 (4), 1767-1776 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Iniekcja Poly I C125 doba embrionalnainiekcja doszpikowawykrywanie czopka pochwowegokontrolowane kryzowaniehamowanie wywo ane wst pnym impulsemtest otwartego polatest zakopywania kulekekspresja genu Il6
Indukcja matczynej aktywacji immunologicznej u myszy w połowie ciąży za pomocą wirusowego poli(I:C)
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.