Method Article

Wytwarzanie mikromacierzy przeciwciał z kodami kreskowymi o dużej gęstości pod kontrolą przepływu

DOI:

10.3791/53644

⸱

January 6th, 2016

 , 
1Department of Chemistry, University at Albany, State University of New York, 2Multiplex Biotechnology Laboratory, Cancer Research Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje wytwarzanie wielkoskalowego, multipleksowanego dwuwymiarowego DNA lub matrycy przeciwciał, z potencjalnymi zastosowaniami w badaniach nad sygnalizacją komórkową i wykrywaniem biomarkerów.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikromacierz przeciwciał jako dobrze rozwinięta technologia jest obecnie kwestionowana przez kilka innych uznanych lub powstających technologii o wysokiej przepustowości. W niniejszym raporcie odnawiamy technologię mikromacierzy przeciwciał, stosując nowatorskie podejście do produkcji i wprowadzając nowe funkcje. Wytwarzanie naszej mikromacierzy przeciwciał o dużej gęstości odbywa się poprzez prostopadłie zorientowany wzorzec przepływu jednoniciowych DNA, a następnie konwersję, w której pośredniczą koniugaty DNA-przeciwciało. Protokół ten określa krytyczne etapy wzorca przepływu DNA, produkcji i oczyszczania koniugatów DNA-przeciwciało oraz oceny jakości wytworzonej mikromacierzy. Jednorodność i czułość są porównywalne z konwencjonalnymi mikromacierzami, podczas gdy nasza produkcja mikromacierzy nie wymaga pomocy drukarki matrycowej i może być wykonywana w większości laboratoriów badawczych. Inną ważną zaletą jest to, że rozmiar naszych mikromacierzy jest 10 razy mniejszy niż w przypadku drukowanych tablic, co oferuje unikalną możliwość analizy funkcjonalnych białek z pojedynczych komórek podczas łączenia z ogólnymi projektami mikroprocesorów. Ta technologia kodów kreskowych może być szeroko stosowana w wykrywaniu biomarkerów, badaniach sygnalizacji komórkowej, inżynierii tkankowej i różnych zastosowaniach klinicznych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikromacierze przeciwciał są szeroko stosowane w badaniach proteomicznych od dziesięcioleci w celu zbadania obecności docelowych białek, w tym biomarkerów białkowych1-3. Chociaż dziedzina ta stoi obecnie przed dużymi wyzwaniami związanymi z innymi technologiami wysokoprzepustowymi, takimi jak spektrometria mas (MS), nadal istnieje wiele miejsca na użyteczność mikromacierzy przeciwciał, głównie dlatego, że urządzenia te zapewniają prostą interpretację danych i łatwy interfejs z innymi testami. W ostatnich latach integracja mikromacierzy z rusztowaniami mikroprocesorów zapewniła mikromacierz przeciwciał nową szansę na rozwój4-7. Na przykład mikromacierz kodów kreskowych zintegrowana z jednokomórkowym mikrochipem została wykorzystana w badaniach nad komunikacją komórkową8,9. Technologia ta ma wyraźną przewagę nad innymi dostępnymi technologiami mikromacierzy. Zawiera elementy matrycy o wielkości 10-100 μm, znacznie mniejsze niż typowy rozmiar 150 μm stosowany w konwencjonalnych elementach mikromacierzy. Budowa mniejszych elementów macierzy jest osiągana przy użyciu systematycznych podejść opartych na wzorcach przepływu, co prowadzi do powstania kompaktowych mikromacierzy, które mogą wykrywać białka wydzielane przez pojedyncze komórki i białka wewnątrzkomórkowe. Kolejną zaletą jest zastosowanie prostej, bezinstrumentalnej konfiguracji. Jest to szczególnie ważne, ponieważ większość laboratoriów i małych firm może nie mieć dostępu do podstawowych urządzeń do mikromacierzy. Takie mikromacierze przeciwciał z kodem kreskowym charakteryzują się zwiększoną przepustowością testu i mogą być wykorzystywane do wykonywania wysoce multipleksowanych testów na pojedynczych komórkach, osiągając jednocześnie wysoką czułość i swoistość porównywalną z konwencjonalnym testem immunoenzymatycznym typu kanapkowym (ELISA8). Technologia ta znalazła liczne zastosowania w wykrywaniu białek glejaka9-11, limfocytów T12 i krążących komórek nowotworowych13. Alternatywnie, same mikromacierze DNA z kodami kreskowymi zostały wykorzystane do precyzyjnego pozycjonowania neuronów i astrocytów w celu naśladowania składania in vivo tkanki mózgowej14.

Ten protokół skupia się tylko na etapach eksperymentalnych i blokach budowania dwuwymiarowej (2-D) mikromacierzy przeciwciał z kodem kreskowym, która ma potencjalne zastosowania w wykrywaniu biomarkerów w próbkach płynów i w pojedynczych komórkach. Technologia opiera się na adresowalnej, jednoniciowej, jednowymiarowej (1-D) mikromacierzy DNA zbudowanej przy użyciu ortogonalnych oligonukleotydów, które są wzorowane przestrzennie na podłożach szklanych. Wzór 1-D powstaje, gdy w kroku wzorca przepływu używane są równoległe kanały przepływu, a taki wzór pojawia się jako dyskretne pasma wizualnie podobne do kodów kreskowych 1-D Universal Product Code (UPC). Konstrukcja dwukierunkowej matrycy przeciwciał (n x m) – przypominająca kod matrycy 2-D Quick Response (QR) – wymaga bardziej złożonych strategii modelowania, ale pozwala na immobilizację przeciwciał przy większej gęstości8,15. Produkcja wymaga dwóch etapów modelowania DNA, z których pierwszy jest prostopadły do drugiego. Punkty przecięcia tych dwóch wzorców stanowią elementy n x m tablicy. Dzięki strategicznemu doborowi sekwencji jednoniciowego DNA (ssDNA) wykorzystywanego we wzorcu przepływu, każdemu elementowi w danej tablicy przypisuje się określony adres. To odniesienie przestrzenne jest niezbędne do rozróżnienia sygnałów fluorescencyjnych na szkiełku mikromatrycy. Macierz ssDNA jest przekształcana w macierz przeciwciał poprzez włączenie komplementarnych koniugatów DNA-przeciwciało, tworząc platformę zwaną biblioteką przeciwciał kodowanych przez DNA (DEAL16).

Ten protokół wideo opisuje kluczowe kroki w tworzeniu układów przeciwciał n x m, które obejmują przygotowanie form kodów kreskowych z polidimetylosiloksanu (PDMS), modelowanie przepływu ssDNA w dwóch orientacjach, przygotowanie koniugatów przeciwciało-oligonukleotyd DEAL i przekształcenie matrycy DNA 3 x 3 w matrycę przeciwciał 3 x 3.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uwaga: Kilka substancji chemicznych używanych w tym protokole jest drażniących i jest niebezpiecznych w przypadku kontaktu ze skórą. Przed wykonaniem tego protokołu należy zapoznać się z kartami charakterystyki substancji niebezpiecznej (MSDS) i nosić odpowiednie środki ochrony osobistej. Roztwór piranii użyty w Kroku (1.1.1) jest silnie i powinien być przygotowany przez powolne dodawanie nadtlenku do kwasu z mieszaniem. Z tym roztworem należy obchodzić się ze szczególną ostrożnością w dygestorium. Stosować odpowiednią ochronę oczu i rękawice kwasoodporne. trimetylochlorosilan (TMCS) jest, łatwopalną substancją chemiczną stosowaną w opcjonalnym kroku po (1.1.6). Z tą substancją chemiczną należy obchodzić się pod wyciągiem.

Uwaga: Wykonaj produkcję szkiełek z kodami kreskowymi i krytyczne procedury wzorcowania przepływu w czystym pomieszczeniu, aby zminimalizować zanieczyszczenie cząstkami stałymi. Cząsteczki kurzu mogą blokować porty i mikrokanały form PDMS i zakłócać wzorzec przepływu.

1. Budowa jednowymiarowego slajdu z kodem kreskowym DNA

  1. Przygotowanie wzorca SU-8 do wzorców przepływu kodów kreskowych
    Uwaga: Rysunki dla schematów przepływu prostopadłego (rysunek 1A-B) są tworzone przy użyciu oprogramowania do projektowania wspomaganego komputerowo (CAD). Te wzory są renderowane na chromowanej fotomasce. Przezroczyste obszary maski odpowiadają cechom mistrza SU-8.
    1. Płytkę krzemową (o średnicy 100 mm) należy dokładnie oczyścić w mieszaninie 3H2SO4: 1 30% H2O2 (roztwór piranii) podgrzanej do temperatury 96 °C. Płytkę umyć wodą dejonizowaną i alkoholem izopropylowym, a następnie wysuszyć pistoletem do przedmuchiwania azotem.
    2. Na wafel wlać około 4 ml fotorezystu SU-8 2025. Użyj programowalnej powlekarki wirowej, aby równomiernie rozprowadzić fotorezystor na płytce przez 10 sekund przy 500 obr./min, a następnie 30 sekund przy 3,000 obr./min. W ten sposób powstaje warstwa fotorezystu o grubości ~25 μm. Stopniowo pozwól, aby wirowanie zwolniło przed zatrzymaniem — ma to na celu utrzymanie równomiernej powłoki na powierzchni wafla.
    3. Powlekany wafel pieczemy na płycie grzejnej przez 1 minutę w temperaturze 65 °C, a następnie przez 5 minut w temperaturze 95 °C. Ten krok pozwala na zestalenie się powłoki. Schłodzić do RT przez 5 min.
    4. Umieść chromowaną maskę (Rysunek 1C) na powłoce fotorezystu. Wystaw maskę na działanie światła bliskiego UV (350-400 nm, energia ekspozycji 150-160 mJ/cm2) przez 20 sek.
      Uwaga: Wzór na chromowanej masce zawiera 20 kanałów, z których każdy ma szerokość 20 μm i rozstaw 50 μm. Kanały wiją się od jednego końca wzoru do przeciwległego końca. W sumie 20 kanałów pokrywa prostokątny obszar o długości ~40 mm i szerokości ~20 mm. Każdy kanał jest otoczony dwoma okrągłymi elementami, które odpowiadają wlotowi i wylotowi. Wloty i wyloty są wymienne.
    5. Piecz odsłonięty wafel na płycie grzejnej przez 5 minut w temperaturze 95 °C. Stopniowo schładzaj do temperatury RT.
    6. Zanurz wafel w wywoływaczu SU-8 z mieszaniem na 5 minut. Umyj wafel niewielką porcją świeżego wywoływacza SU-8, a następnie alkoholem izopropylowym. Wysuszyć wafel za pomocą pistoletu do przedmuchiwania azotem. Piecz wafel na twardo na płycie grzejnej o temperaturze 200 °C przez 30 minut i pozwól wafli stopniowo ostygnąć do RT.
      Uwaga: Wywoływanie można prowadzić przez dłuższy czas, jeśli po umyciu na tym etapie zaobserwuje się biały nalot.
      Opcjonalnie: Sylianizować wzorzec SU-8, wystawiając go na działanie oparów trimetylochlorosilanu na zamkniętej szalce Petriego przez 10 minut.
  2. Przygotowanie formy do kodów kreskowych PDMS
    1. Połącz 40,0 g bazy z elastomeru silikonowego z 4,0 g utwardzacza. Mieszaninę prepolimerów energicznie mieszać przez 10 minut. Odgazowuje przez 20 minut pod próżnią.
      Uwaga: Z reguły należy stosować stosunek masy 10:1 (baza: utwardzacz).
    2. Wlej prepolimer na szalkę Petriego zawierającą płytkę krzemową z wzorcem SU-8 wzoru kodu kreskowego. Wysokość mieszaniny PDMS powinna wynosić około 7,5 mm lub więcej. Odgazować mieszaninę na szalce Petriego po raz drugi, aby usunąć wszelkie pozostałe pęcherzyki, a następnie piec mieszaninę przez 1 godzinę w temperaturze 75 °C, aby umożliwić PDMS utwardzenie się.
      Uwaga: Ważne jest, aby utrzymać wystarczającą grubość płyty PDMS na poziomie ~7.5 mm lub większym, aby uniknąć zbyt dużego naprężenia połączenia PDMS ze szkłem po włożeniu kołków/rurek przez otwory w formie PDMS w kroku (1.3.3.1)
    3. Za pomocą skalpela ostrożnie przeciąć obszar płyty PDMS, która zawiera elementy formy z kodem kreskowym, i oderwij płytę od płytki.
    4. Przytnij krawędzie płyty, aby uzyskać pożądany kształt formy kodów kreskowych PDMS. Przebij 20 otworów (o średnicy 1,0 mm) przez formę za pomocą stempla biopsyjnego z tłokiem. Upewnij się, że otwory są wyrównane z okrągłymi elementami wzoru kodu kreskowego. Otwory te służą jako wloty i wyloty.
  3. Jednowymiarowe wzorowanie poli-L-lizyny (PLL)
    1. Usuń kurz z powierzchni szkiełka pokrytego poli-L-lizyną za pomocą pistoletu do przedmuchiwania azotem. Przymocuj formę PDMS do czystego szkiełka podstawowego. Upewnij się, że krawędzie formy i suwaka są wyrównane.
    2. Piecz przez 1,5 godziny w temperaturze 75 °C, aby wzmocnić połączenie między formą PDMS a szkiełkiem pokrytym PLL. W międzyczasie przygotuj 20 sztuk elastycznych rurek polietylenowych (kawałki od 3 do 4 cali, o średnicy wewnętrznej 0,5 mm i średnicy zewnętrznej 1,5 mm).
      Uwaga: Liczba kawałków rurki odpowiada liczbie wlotów w formie kodów kreskowych PDMS. Rurka służy do łączenia kanałów na formie kodów kreskowych PDMS ze zbiornikiem azotu wyposażonym w regulator ciśnienia.
    3. Do jednego końca każdego kawałka rurki przymocuj drążony kołek ze stali nierdzewnej (średnica 1 mm). Zassać sterylnie przefiltrowany roztwór poli-L-lizyny przez szpilkę, aż co najmniej 1 cm rurki zostanie wypełnione roztworem.
      1. Przymocuj kołki (podłączone do rurki wypełnionej roztworem) do wlotów formy kodów kreskowych PDMS (Rysunek 1E). Podłącz drugi koniec rurek do zbiornika azotu o regulowanym ciśnieniu. Pozwól, aby roztwór przepłynął przez formę w zakresie ciśnienia 0,5-1 psi przez co najmniej 6 godzin.
        Uwaga: Patrz krok (1.3.3), aby zapoznać się ze wszystkimi procedurami dotyczącymi wzorca przepływu.
  4. Jednowymiarowe wzorcowanie ssDNA 14
    Uwaga: Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) stosowana w kolejnych etapach jest przygotowywana ze 137 mM NaCl, 10 mM Na2HPO4 i 2 mM KH2PO4. pH buforu wynosi 7,4.
    1. Przygotować 2 mM roztwór suberanu bis(sulfosuccinimidylo)(BS3) w PBS. Przygotować 300 μM roztwory ssDNA A, B i C (modyfikowane 5'-aminami, 80 nukleotydów) w PBS lub wodzie ultraczystej.
      Uwaga: Roztwór BS3 należy zużyć w ciągu około 30 minut po przygotowaniu, ponieważ ester N-hydroksysukcynimidu łatwo ulega hydrolizie.
    2. Połącz 2,5 μl 300 μM A, B lub C ssDNA z 2,5 μl 2 mM suberatu bis(sulfosuccinimidylo) w PBS dla każdego kanału. DNA A, B i C są oznaczone odpowiednio dla kanałów 1, 2 i 3. Kolejność ta jest również stosowana do pozostałych zestawów 3 kanałów (Rysunek 2A).
    3. Wykonaj krok (1.3.3). Tym razem zassaj 5-μl roztwory BS3/DNA przez kołki ze stali nierdzewnej i do rurki polietylenowej, a następnie połącz formę PDMS ze źródłem azotu. Pozwól, aby roztwór BS3/DNA przepływał przez formę kodów kreskowych przez około 40 minut lub do momentu, gdy kanały zostaną wypełnione.
    4. Zatrzymaj przepływ po wypełnieniu wszystkich kanałów, a następnie inkubuj roztwór BS3/DNA w kodzie kreskowym w RT przez 2 godziny. Nie dopuścić do wyschnięcia roztworu. Piecz formę PDMS z dołączonym szkiełkiem z kodami kreskowymi przez 1 godzinę w temperaturze 75 °C.
      Uwaga: Aby ułatwić wyrównanie w kolejnych krokach wzorca przepływu, krawędzie wzoru kanału na slajdzie z kodem kreskowym mogą być obrysowane. Odbywa się to poprzez staranne zarysowanie powierzchni szkła za pomocą rysika diamentowego w celu wygenerowania znaczników wyrównania na spodzie szkiełka. Wyrównanie w późniejszych etapach protokołu może być sprawdzane pod mikroskopem.
    5. Wyjmij formę PDMS ze szkiełka z kodami kreskowymi. Delikatnie umyj szkiełko 0,01% SDS raz i trzy razy ultraczystą wodą.
      1. Wysuszyć szkiełko z kodem kreskowym za pomocą wirnika do szkiełek mikroskopowych. Przechowuj szkiełko z kodem kreskowym w czystej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml do późniejszego użycia.

2. Walidacja jednowymiarowego wzoru na slajdzie z kodem kreskowym

Uwaga: Ten protokół walidacji może być również dostosowany do oceny jakości kolejnych etapów wzorca przepływu.

  1. Blokowanie zjeżdżalni
    1. Przygotować 1% albuminę surowicy bydlęcej (BSA) w PBS. Przed użyciem przefiltrować ten roztwór przez filtr strzykawkowy 0,45 μm. Za pomocą końcówki do nakładania żelu nanieś 50 μl 1% roztworu BSA na jedną krawędź szkiełka z kodami kreskowymi.
    2. Inkubować 1% roztwór BSA przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  2. Inkubacja z komplementarnym DNA sprzężonym z cyjaniną 3 (Cy3)
    1. Przygotuj koktajl oligonukleotydów A', B' i C' sprzężonych z Cy3 na jednym końcu. Sekwencje A', B' i C' są komplementarne do sekwencji odpowiednio A, B i C. Stężenie robocze Cy3-DNA wynosi 0,05 μM w 0,1% BSA.
    2. Usunąć roztwór BSA ze szkiełka za pomocą pipetowania, a następnie nanieść 30 μl roztworu koktajlu DNA na tę samą krawędź szkiełka. Inkubować koktajl Cy3-DNA na szkiełku w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Wykonaj ten etap inkubacji w ciemności, aby chronić ugrupowanie Cy3 przed fotowybielaniem.
  3. Analiza intensywności fluorescencji
    1. Odpipetować koktajl Cy3-DNA i umyć szkiełko w 1% BSA, PBS, a na koniec w rozcieńczonym PBS (1 część PBS z 50 częściami ultraczystej wody). Wysuszyć szkiełko za pomocą wirówki.
    2. Obserwuj fluorescencję (rysunek 2B) za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego lub skanera mikromatrycowego. W przypadku korzystania ze skanera mikromatrycowego należy ustawić długość fali emisji lasera na 532 nm, rozmiar piksela na 5 mikronów, wzmocnienie lampy fotopowielacza (PMT) na 450 i moc na 15%.

3. Produkcja dwuwymiarowej (3x3) matrycy DNA14

  1. Przygotowanie formy do kodów kreskowych PDMS
    1. Wykonaj procedurę (1.1) w celu skonstruowania kolejnego wzorca SU-8, ale tym razem użyj chromowanej maski ze wzorem przepływu prostopadłym do tego z pierwszego projektu. Wykonać procedurę (1.2) w celu skonstruowania nowej formy PDMS z prostopadłym wzorem.
  2. Dwuwymiarowy wzorzec przepływu ssDNA
    1. Dla macierzy 3 x 3 przygotuj 150 μM roztworów podstawowych A'-i, B'-ii, C'-iii, A'-iv, B'-v, C'-vi, A'-vii, B'-viii i C'-ix DNA w 3% BSA/PBS. Te oligonukleotydy służą jako "sekwencje pomostowe" (ryc. 2A). Połączyć roztwory oligonukleotydów (roztwory 1-3) tak, aby stężenie robocze wynosiło 50 μM dla każdego oligonukleotydu. Skorzystaj z przewodnika zamieszczonego w Tabeli 1.
    2. Przepływ 3% roztworu blokującego BSA/PBS do wszystkich 20 kanałów przez 1 godzinę przy 0,5-1 psi.
    3. Przepływaj roztwory 1, 2 i 3 odpowiednio do kanałów 1, 2 i 3. Postępuj zgodnie z tą kolejnością dla kolejnych zestawów 3 kanałów. Przepływ jest zwykle zakończony w około 40 minut. Inkubuj roztwory DNA w RT przez 2 godziny, aby umożliwić hybrydyzację DNA.
    4. Przelej 3% roztwór blokujący BSA/PBS do wszystkich 20 kanałów przez 1 godzinę przy 0,5-1 psi, aby usunąć niezhybrydyzowane DNA. Oderwij płytę PDMS i umyj powstałe szkiełko z mikromacierzy DNA, zanurzając szklane szkiełko w 3% BSA/PBS raz i PBS dwukrotnie, a następnie rozcieńczony PBS (1 część PBS i 50 części ultraczystej wody). Wysuszyć szkiełko za pomocą wirówki mikroskopowej.
    5. Wykonaj drugi krok walidacji (rysunek 2C) podobny do opisanego w sekcji 2. Użyj oligonukleotydów od i' do ix', które są sprzężone z Cy3. Przechowuj szkiełko podstawowe 3 x 3 w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml do późniejszego użycia.
      Uwaga: Mikromacierz DNA może być przechowywana w temperaturze pokojowej w eksykatorze przez wiele miesięcy.

4. Konwersja macierzy DNA 3 x 3 na matrycę przeciwciał

  1. Otrzymywanie koniugatów przeciwciało-oligonukleotyd (DEAL)
    1. Przygotować roztwory 200 mM sukcynimidylo-4-formylobenzoesanu (S-4FB) i 40 mM sukcynimidylo-6-hydrazynonikotynamidu (S-HyNic) w bezwodnym N,N-dimetyloformamidzie (DMF).
    2. Przygotować do 7 oddzielnych roztworów przeciwciał wychwytujących (1 mg/ml) w PBS.
      Uwaga: Jeśli roztwory podstawowe przeciwciał zawierają bakteriostat azydekowy sodu, należy przeprowadzić wymianę buforu z PBS za pomocą wirowych kolumn odsalających z odcięciem masy cząsteczkowej 7 kDa (MWCO).
    3. Przygotować oddzielne roztwory 400 μM DNA i', ii', iii', iv', v', vi' i vii'. Przypisz każde przeciwciało wychwytujące do jednej sekwencji oligonukleotydowej. Połącz 40 μl 400 μM DNA z 12,25 μl DMF w probówkach do mikrowirówek i odwiruj w dół, aby dokładnie wymieszać.
      1. Do każdego roztworu DNA/DMF dodać 2,3 μl 200 mM S-4FB w DMF. Na każde 100 μg wychwytu przeciwciała dodać 2,25 μl 40 mM S-HyNic w DMF.
    4. Inkubować roztwory przeciwciała/S-HyNic i DNA/S-4FB przez 4 godziny w temperaturze pokojowej.
    5. Przygotowując się do reakcji sprzęgania przeciwciało-DNA, należy przygotować nowe kolumny odsalania wirowego (po jednej dla każdego roztworu DNA i jednej dla każdego przeciwciała), przemłukując je buforem cytrynianowym o pH 6.
    6. Po 4 godzinach inkubacji przeprowadzić wymianę buforu dla każdego roztworu przeciwciała/S-HyNic i DNA/S-4FB. Połączyć oligonukleotydy i', ii', iii', iv', v', vi' i vii' sprzężone z S-4FB z koniugatami przeciwciała S-HyNic. Inkubować mieszaniny przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
    7. Inkubować reakcję O/N w temperaturze 4 °C.
  2. Oczyszczanie koniugatów przeciwciało-oligonukleotyd (DEAL)
    Uwaga: Aby oczyścić koniugaty przeciwciało-oligonukleotyd, należy przeprowadzić szybką chromatografię cieczową białek (FPLC) na standardowym systemie FPLC wyposażonym w kolumnę Superose 6 10/300 GL.
    1. Ustaw długość fali detektora UV systemu FPLC na 280 nm. Użyć izokratycznego przepływu PBS (pH 7,4) z prędkością 0,3 ml/min w celu oddzielenia koniugatów przeciwciało-oligonukleotyd od nadmiaru S-4FB-DNA.
    2. Zebrać frakcje zawierające koniugat i zagęścić frakcje do objętości 150 μl za pomocą filtrów wirowych z MWCO 10 kDa.
  3. Dwuwymiarowe wzorcowanie przeciwciał
    1. Przygotować kolejną formę PDMS z mikrokomorami lub mikrostudzienkami, stosując procedury produkcyjne opisane w kroku (1.2). Forma PDMS może zawierać studzienki o pojemności od mikrolitrów do nanolitrów do testów immunologicznych.
      Uwaga: W celu ogólnego wykrywania biomarkerów w próbkach płynnych, forma PDMS z wieloma dołkami jest łączona ze szkiełkiem matrycowym. Cechy formy PDMS zależą od badanego systemu. Na przykład wykrywanie białek z eksperymentów na pojedynczych komórkach można przeprowadzić za pomocą formy PDMS zawierającej mikrokomory o objętości 0,15 NL.
    2. (Opcjonalnie) Poddaj formę PDMS czyszczeniu plazmowemu (18 W) przez 1,5 minuty, aby jej wzorzysta powierzchnia stała się hydrofilowa. Przed czyszczeniem plazmowym należy użyć taśmy klejącej, aby zablokować wszystkie inne powierzchnie, które będą bezpośrednio połączone ze szkiełkiem 3 x 3.
      Uwaga: Krok (4.3.2) jest opcjonalny, ale zwykle jest wykonywany, gdy forma PDMS jest przeznaczona do użytku w eksperymentach z pojedynczymi komórkami.
    3. Połącz formę PDMS ze szkiełkiem z matrycą 3 x 3, a następnie zablokuj szkiełko za pomocą 1% BSA w PBS. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. W międzyczasie przygotuj koktajl (200 μl końcowej objętości) koniugatów przeciwciało-oligonukleotyd. Stężenie robocze każdego koniugatu wynosi 10 μg/ml w 1% BSA/PBS.
    4. Dodać koktajl przeciwciało-oligonukleotyd, a następnie inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, aby umożliwić ugrupowanie oligonukleotydowe koniugatów na hybrydyzację z określonymi plamkami na matrycach 3 x 3, przekształcając w ten sposób macierz DNA w matrycę przeciwciał.
    5. Powtórzyć krok (3.2.4), aby wyczyścić i osuszyć szkiełko. Najwyższą czułość można osiągnąć, jeśli matryca przeciwciał zostanie użyta natychmiast. Długotrwałe przechowywanie może spowodować utratę wrażliwości.
  4. Wykrywanie białek
    1. Rozpuść rekombinowane białka lub przygotuj przefiltrowaną próbkę komórkową.
    2. Połącz mikromacierz ze specjalnie zaprojektowanym chipem i zablokuj powierzchnię za pomocą 3% BSA w PBS przez 1 godzinę. Następnie usunąć roztwór BSA, nałożyć próbki i inkubować przez 2 godziny.
    3. Próbki należy trzykrotnie zmyć za pomocą 3% BSA w PBS, a następnie dodać przeciwciała wykrywające w stężeniu podanym w karcie katalogowej produktu. Inkubować przez 2 godziny.
    4. Zmyć przeciwciała wykrywające trzykrotnie przez 3% BSA w PBS, a następnie dodać 5(Cy5)-streptawidynę cyjaniny w stężeniu 1 μg/ml, a następnie inkubować przez 1 godzinę.
    5. Powtórz krok (3.2.4), aby wyczyścić i osuszyć szkiełko do skanowania.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Projekty form PDMS (Rysunek 1A-1B) zostały narysowane za pomocą programu CAD (AutoCAD). Dwa pokazane projekty mają kanały do wzorca przepływu, jeden poziomy i jeden pionowy. Lewa i prawa część każdego wzoru są symetryczne; Każdy z nich może być wlotem lub wylotem. Każdy z 20 kanałów jest nawinięty od jednego końca aż do drugiego. Każdy wzór jest wydrukowany na chromowanej fotomasce (rysunek 1C). Wyprodukowany wzorzec SU-8 na płytce krzemowej pokazano na <...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Projektowanie wzorca przepływu jest pierwszym krytycznym krokiem w wytwarzaniu mikromacierzy 2D . Aby wygenerować dwa nakładające się na siebie wzory DNA na szklanym podłożu, cechy kanału pierwszego projektu powinny być prostopadłe do tych z drugiego (ryc. 1A-B). Projekty uwzględniają również dalsze zastosowania mikromacierzy. W przypadku analizy pojedynczych komórek, mikromacierz służy do wykrywania białek z pojedynczych komórek zamkniętych w mikrokomorach, dlatego wymiary kanałów są zgodne z m...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych sprzecznych interesów, które mogliby ujawnić.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować funduszowi startowemu z SUNY Albany oraz dostępowi do obiektów w Centrum Badań nad Rakiem Uniwersytetu w Albany.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Sylgard 184 baza z elastomeru silikonowegoDow Corning3097366-1004
Sylgard 184 utwardzacz z elastomeru silikonowegoDow Corning3097358-1004
SU-8 2025 fotorezystorMicroChemY111069
Wafle krzemowe University Wafers452
Szkiełka szklane powlekane poli-L-lizynąThermo ScientificC40-5257-M20
OligonukleotydyZintegrowane technologie*Zamówione na zamówienie w Integrated DNA Technologies, patrz Tabela 2.
Roztwór podstawowy kleju poli-L-lizynowegoDostawa dla nowicjuszy1339
Poderat bis (sulfosukcynimidylu)  (BS3)Thermo Scientific21585
1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami, pH 7,4Jakość Biologiczna114-058-101
Ä kta Explorer 100 System szybkiej chromatografii cieczowej białek (FPLC)GE (Amersham Pharmacia) 18-1112-41
Kolumna Superose 6 10/300 GLGE Healthcare Nauki przyrodnicze17-5172-01
Wychwytuj przeciwciałaróżneróżne*Wybór przeciwciał zależy od zastosowania
Sukcynimidylo-6-hydrazyno-nikotynamid (S-HyNic)SolulinkS-1002
Sukcynimidylo-4-formylobenzamid (S-4FB)SolulinkS-1004
N,N-dimetyloformamidSigma-Aldrich227056
Kwas cytrynowy, bezwodnyAcros42356
Wodorotlenek soduFisher ScientificS318
Amicon Ultra filtr wirowy 10 kDa MWCOEMD MilliporeUFC201024
Powlekarka wirowaLaurell TechnologiesWS-650-MZ
Dziurkacz do biopsji z tłokiem (średnica 1,0 mm)Ted Pella, Inc.15110-10
Rysik diamentowy (Styl 60)SPI dostarcza6004
TrimetylochlorosilanSigma Aldrich92361
DNA

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alhamdani, M. S. S., Schroder, C., Hoheisel, J. D. Oncoproteomic profiling with antibody microarrays. Genome Med. 1 (7), (2009).
  2. Angenendt, P. Progress in protein and antibody microarray technology. Drug Discov Today. 10 (7), 503-511 (2005).
  3. Sun, H. Y., Chen, G. Y. J., Yao, S. Q. Recent advances in microarray technologies for proteomics. Chem Biol. 20 (5), 685-699 (2013).
  4. Fan, R., et al. Integrated barcode chips for rapid, multiplexed analysis of proteins in microliter quantities of blood. Nat Biotechnol. 26 (12), 1373-1378 (2008).
  5. Chattopadhyay, P. K., Gierahn, T. M., Roederer, M., Love, J. C. Single-cell technologies for monitoring immune systems. Nat Immunol. 15 (2), 128-135 (2014).
  6. Varadarajan, N., et al. Rapid, efficient functional characterization and recovery of HIV-specific human CD8(+) T cells using microengraving. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (10), 3885-3890 (2012).
  7. Ma, S., et al. Electroporation-based delivery of cell-penetrating peptide conjugates of peptide nucleic acids for antisense inhibition of intracellular bacteria. Integr Biol-Uk. 6 (10), 973-978 (2014).
  8. Wang, J., et al. Quantitating cell-cell interaction functions with applications to glioblastoma multiforme cancer cells. Nano Lett. 12 (12), 6101-6106 (2012).
  9. Kravchenko-Balasha, N., Wang, J., Remacle, F., Levine, R. D., Heath, J. R. Glioblastoma cellular architectures are predicted through the characterization of two-cell interactions. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (17), 6521-6526 (2014).
  10. Xue, M., et al. Chemical methods for the simultaneous quantitation of metabolites and proteins from single cells. J Am Chem Soc. 137 (12), 4066-4069 (2015).
  11. Shi, Q. H., et al. Single-cell proteomic chip for profiling intracellular signaling pathways in single tumor cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (2), 419-424 (2012).
  12. Ma, C., et al. A clinical microchip for evaluation of single immune cells reveals high functional heterogeneity in phenotypically similar T cells. Nat Med. 17 (6), 738-743 (2011).
  13. Deng, Y., et al. An integrated microfluidic chip system for single-cell secretion profiling of rare circulating tumor cells. Sci Rep. 4, 7499(2014).
  14. Vermesh, U., et al. High-density, multiplexed patterning of cells at single-cell resolution for tissue engineering and other applications. Angew Chem Int Ed. 50 (32), 7378-7380 (2011).
  15. Yu, J., et al. Microfluidics-based single-cell functional proteomics for fundamental and applied biomedical applications. Annu Rev Anal Chem. 7, 275-295 (2014).
  16. Bailey, R. C., Kwong, G. A., Radu, C. G., Witte, O. N., Heath, J. R. DNA-encoded antibody libraries: A unified platform for multiplexed cell sorting and detection of genes and proteins. J Am Chem Soc. 129, 1959-1967 (2007).
  17. Alegria-Schaffer, A. General protein-protein cross-linking. Methods Enzymol. 539, 81-87 (2014).
  18. Ahmad, H., et al. A robotics platform for automated batch fabrication of high density, microfluidics-based DNA microarrays, with applications to single cell, multiplex assays of secreted proteins. Rev Sci Instrum. 82, 094301(2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Flow PatterningAntibody MicroarrayDNA Antibody ConjugatesPDMS Mold FabricationSingle Cell AnalysisSU 8 MasterPerpendicular Flow PatternMicroarray ValidationBiomarker DetectionCell Signaling Studies

Related Articles