Modelowanie białaczki opornej na chemioterapię in vitro

Podsumowanie

Obecny raport podsumowuje protokół, który może być wykorzystany do modelowania wpływu niszy mikrośrodowiska szpiku kostnego na komórki białaczkowe, kładąc nacisk na wzbogacenie najbardziej chemoodpornej subpopulacji.

Streszczenie

Jest dobrze znane, że mikrośrodowisko szpiku kostnego stanowi unikalne miejsce sanktuarium dla chorób krwiotwórczych, które zarówno inicjują, jak i postępują w tym miejscu. Model przedstawiony w niniejszym raporcie wykorzystuje ludzkie pierwotne komórki zrębu szpiku kostnego i osteoblasty jako dwa reprezentatywne typy komórek z niszy szpikowej, które wpływają na fenotyp komórek nowotworowych. Warunki kohodowli in vitro opisane dla ludzkich komórek białaczkowych z tymi głównymi składnikami niszowymi wspierają generowanie chemoodpornej subpopulacji komórek nowotworowych, które można skutecznie odzyskać z hodowli w celu analizy za pomocą różnych technik. Ścisły harmonogram karmienia, aby zapobiec przepływom składników odżywczych, po których następuje odzyskiwanie cząstek usieciowanego dekstranu (G10) typu 10 w żelu, populacji komórek nowotworowych, które migrowały pod przylegającymi komórkami zrębu szpiku kostnego (BMSC) lub osteoblastami (OB), generując populację komórek nowotworowych "przyciemnionych fazowo" (PD), zapewnia stałe źródło oczyszczonych, opornych na terapię komórek białaczkowych. Ta klinicznie istotna populacja komórek nowotworowych może być oceniana za pomocą standardowych metod w celu zbadania szlaków apoptotycznych, metabolicznych i regulacyjnych cyklu komórkowego, a także zapewnienia bardziej rygorystycznego celu, w którym można przetestować nowe strategie terapeutyczne przed badaniami przedklinicznymi ukierunkowanymi na minimalną chorobę resztkową.

Wprowadzenie

Ogólnym celem opisanej metody jest zapewnienie efektywnego, opłacalnego podejścia in vitro, które wspiera badanie mechanizmów, które leżą u podstaw przeżycia komórek białaczkowych w szpiku kostnym podczas ekspozycji na chemioterapię. Jest dobrze udokumentowane, że ocalałe resztkowe komórki nowotworowe, które utrzymują się po leczeniu, przyczyniają się do nawrotu choroby, która często jest bardziej agresywna niż w momencie diagnozy i często jest mniej skuteczna w leczeniu^1-8. Modele, które obejmują komórki białaczkowe w izolacji, takie jak te ograniczone do hodowli komórek w samych pożywkach, do testowania podejść terapeutycznych, nie uwzględniają tych krytycznych sygnałów ani niejednorodności choroby, która występuje w odpowiedzi na dostępność wskazówek pochodzących z niszy, w których subpopulacje komórek nowotworowych o bardzo specyficznych interakcjach z komórkami niszowymi uzyskują zwiększoną ochronę. Standardowe modele kohodowli 2D, które współhodują komórki zrębu pochodzące ze szpiku kostnego i komórki białaczkowe, w pewnym stopniu zajęły się wkładem niszy szpiku kostnego i wykazały, że interakcja z komórkami mikrośrodowiska szpiku kostnego zwiększa ich odporność na chemioterapię i zmienia ich charakterystykę wzrostu^9-14. Modele te jednak często nie są w stanie podsumować długoterminowego przeżycia komórek nowotworowych i nie informują dokładnie o wynikach związanych z najbardziej opornymi populacjami komórek białaczkowych, które przyczyniają się do MRD. Modele in vivo pozostają kluczowe i definiują "złoty standard" w badaniach nad innowacyjnymi terapiami przed badaniami klinicznymi, ale często są one kwestionowane ze względu na czas i koszty wymagane do przetestowania hipotez związanych z opornymi nowotworami i nawrotami choroby. W związku z tym opracowanie bardziej szczegółowych modeli 2D byłoby korzystne dla badań pilotażowych, aby lepiej informować o projektowaniu kolejnych projektów przedklinicznych opartych na myszach.

Model 2D in vitro przedstawiony w tym raporcie nie jest tak skomplikowany jak prawdziwe mikrośrodowisko in vivo, ale dostarcza opłacalnego i powtarzalnego sposobu badania interakcji guza z mikrośrodowiskiem, które nadaje się specjalnie do wzbogacenia chemoopornej subpopulacji komórek nowotworowych. Rozróżnienie to jest cenne, ponieważ ocena całej populacji komórek nowotworowych może maskować fenotyp niewielkiej grupy opornych na terapię komórek nowotworowych, które stanowią najważniejszy cel. Dodatkowym atutem jest skalowalność modelu w celu dopasowania go do interesującej Cię analizy. Hodowle masowe można ustalić dla analiz wymagających znacznego odzysku komórek nowotworowych, podczas gdy kokultury na małą skalę na płytkach wielodołkowych można wykorzystać do analizy opartej na PCR lub ocen opartych na mikroskopii.

Opierając się na tej potrzebie, opracowaliśmy model in vitro, aby zająć się heterogenicznością choroby, która jest charakterystyczna dla ostrej białaczki limfoblastycznej linii B (ALL). Pokazujemy, że WSZYSTKIE komórki, które mają wiele cech wspólnych ze swoimi zdrowymi odpowiednikami, lokalizują się w różnych przedziałach kohodowli BMSC lub OB. Generowane są trzy populacje komórek nowotworowych, które mają różne fenotypy, które są cenne dla badania odpowiedzi terapeutycznej. W szczególności wykazujemy, że komórki (ALL) odzyskane z populacji "fazy dim" (PD) w kokulturze są konsekwentnie oporne na terapię, a przeżycie jest zbliżone do komórek nowotworowych, które nie były narażone na działanie czynników cytotoksycznych. Te komórki ALL, pochodzące z ustalonych linii komórkowych lub pierwotnych próbek pacjentów, migrują pod przylegającymi komórkami zrębu lub warstwami osteoblastów, ale mogą być wychwycone po trypsynizacji kultur i oddzieleniu typów komórek przez wykorzystanie kolumn cząstek usieciowanego dekstranu (G10) typu¹⁵ w żelu.

Tutaj prezentujemy konfigurację kokultury 2D, która może być wykorzystana do modelowania interakcji między mikrośrodowiskiem komórek zrębu szpiku kostnego (BMSC/OB) a komórkami białaczkowymi. Szczególne znaczenie ma obserwacja, że komórki białaczkowe tworzą trzy subpopulacje przestrzenne względem monowarstwy komórek zrębu i że populacja PD reprezentuje populację nowotworów opornych na chemioterapię ze względu na interakcję z BMSC lub OB. Ponadto pokazujemy, jak skutecznie izolować populacje komórek białaczkowych za pomocą kolumn G10. Warto zauważyć, że odkryliśmy, że izolacja tych subpopulacji pozwala na dalszą analizę najbardziej opornej populacji PD w celu określenia potencjalnych sposobów oporności, które są przekazywane tym komórkom w wyniku ich interakcji z mikrośrodowiskiem szpiku kostnego, komórkami zrębu lub osteoblastami. Techniki, które wykorzystaliśmy poniżej tego modelu kokultury i izolacji, obejmują ocenę cytometrii przepływowej, analizę proteomiczną i ocenę ukierunkowanej ekspresji białek, a także nowsze opracowanie ablacji laserowej, jonizacji elektrorozpylania (LAESI) i analizy konika morskiego w celu oceny profili metabolicznych. Dzięki zastosowaniu tego modelu w połączeniu z powyższymi technikami stwierdziliśmy, że populacja komórek białaczkowych z chorobą Parkinsona ma fenotyp oporny na chemioterapię, który jest unikalny w porównaniu z komórkami białaczkowymi hodowanymi w samych pożywkach lub odzyskanymi z innych subpopulacji w tej samej kokulturze. W związku z tym model ten nadaje się do bardziej rygorystycznej oceny w celu przetestowania strategii ukierunkowanych na najbardziej oporne na chemioterapię komórki białaczkowe, które czerpią swój oporny fenotyp poprzez interakcję z mikrośrodowiskiem szpiku kostnego.

Protokół

1. Zaawansowane przygotowanie

1. Przygotowanie cząsteczek dekstranu G10.
   1. Przygotować gnojowicę G10, dodając 50 ml 1x PBS do 10 g cząstek G10. Wymieszać przez odwrócenie i pozostawić G10 do osiadania z soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w temperaturze 4 °C O/N.
   2. W dniu oddzielenia kolumny G10 odessać PBS z osiadłych cząstek G10 i dodać 50 ml świeżego PBS. Wymieszaj przez odwrócenie. Powtórzyć dwukrotnie, dodając 50 ml świeżego PBS do osiadłych cząstek G10 i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
2. Hodowla BMSC i OB.
   1. Utrzymuj zarówno BMSC, jak i OB w temperaturze 37 °C przy 6% CO₂ i hoduj na 10 cm płytkach do hodowli tkankowej, aż do osiągnięcia 90% zbieżności.
   2. Trypsynizuj komórki BMSC lub OB i podziel 1:2 na nowe płytki o średnicy 10 cm. Komórki są hodowane zgodnie z tymi standardami, dopóki nie będą potrzebne do kohodowli białaczki.

2. Ustanawianie i utrzymywanie wspólnej kultury

1. Dodaj 5-20 x 10⁶ komórek białaczkowych w 10 ml pożywki hodowlanej specyficznej dla nowotworu na 80%-90% zlewającej się płytki BMSC lub OB.
   nuta: Nasze laboratorium utrzymuje kokultury w temperaturze 37 °C w 5%_O2, aby lepiej podsumować mikrośrodowisko szpiku kostnego, które, jak wykazano, mieści się w zakresie od 1% do 7%^16-18. Jednak utrzymanie kokultur przy tym napięciu tlenu nie jest krytyczne dla ustanowienia trzech subpopulacji białaczki i leży w gestii laboratorium.
2. Co 4^dni należy usunąć wszystkie pożywki z wyjątkiem 1 ml (w tym komórki białaczkowe w zawiesinie) i zastąpić 9 ml świeżej pożywki do hodowli białaczkowej. Podczas wyjmowania 9 ml pożywki z płytki należy uważać, aby nie naruszyć warstwy przylegającej BMSC lub OB.
   1. Wyjmij nośnik, przechylając płytkę na bok i zassaj nośnik w rogu płytki. Dodatkowo, dodając świeże podłoże, pamiętaj, aby dodać kroplami w rogu płyty przy ścianie bocznej, aby zapewnić minimalne zakłócenie warstwy przylegającej BMSC lub OB.
3. Po 12 dniu kohodowli wypłucz komórki białaczkowe z warstwy BMSC lub OB, delikatnie pipetując pożywkę hodowlaną z naczynia w górę iw dół na szalce około 5 do 10 razy, a następnie zebrać w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Ponownie wysiewaj się na nową, 80%-90% zlewającą się płytkę BMSC lub OB, jak opisano w kroku 2.1.
   nuta: Delikatne płukanie kokultury, jak opisano w kroku 2.3, usunie komórki białaczkowe S i PB bez naruszania monowarstwy BMSC lub OB. Pozwala to na przeniesienie tylko komórek nowotworowych na następną płytkę kohodowlaną. Ten 12-dniowy cykl można powtarzać tyle razy, ile potrzeba, w zależności od potrzeb użytkownika.

3. Przygotowanie kolumn z koralików G10

UWAGA: Jeśli po oddzieleniu kolumn G10 wymagana jest sterylna dalsza analiza lub hodowla, następujące kroki powinny być przeprowadzone przy użyciu techniki sterylnej, a kolumny G10 powinny być ustawione w sterylnym biologicznym kapturze.

1. Podgrzej pożywkę do hodowli komórkowych do 37°C w łaźni wodnej (~30 ml na kolumnę). Za pomocą jednorazowej strzykawki o pojemności 10 ml wyjąć i wyrzucić tłok. Dodaj watę szklaną do strzykawki.
2. Za pomocą pęsety rozciągnij watę szklaną na cienkie, luźne pasma. Dodaj kilka warstw lekko upakowanej waty szklanej do strzykawki, aż 2/3 strzykawki zostanie wypełniona watą szklaną.
   nuta: Wata szklana ma kluczowe znaczenie dla zanieczyszczenia luźnych cząstek G10 w kolekcji komórek białaczkowych. Upewnij się, że wata szklana jest wystarczająco upakowana, aby utrzymać cząstki G10, ale nie za gęsto, aby zablokować przepływ mediów przez kolumnę.
3. Przymocować 1-kierunkowy kran do końcówki strzykawki w pozycji zamkniętej.
4. Zacisk kolumnę strzykawki do pierścienia stojaka wystarczająco wysoko, aby można było umieścić stożkową rurkę (probówkę zbiorczą) o pojemności 50 ml pod kurkiem. Umieścić probówkę zbiorczą pod kolumną strzykawki.
5. Za pomocą pipety o pojemności 10 ml dodaj, kroplami, cząstki G10 zawieszone w PBS do kolumny na wierzchu waty szklanej. Kontynuuj dodawanie cząstek G10, aż na wierzchu waty szklanej utworzy się ~ 2 ml granulek (mierzonych podziałką na strzykawce) cząstek G10.
6. Zrównoważyć kolumnę G10 wstępnie podgrzanym podłożem.
   1. Dodać 2 ml wstępnie podgrzanej pożywki do kolumny. Powoli otwieraj zawór odcinający, aby media wypływały z kolumny kroplami.
   2. Powtarzać krok 3.6.1 do momentu, gdy w kolumnie zostanie przepuszczonych łącznie 10 ml wstępnie podgrzanej pożywki.
      nuta: Jeśli cząstki G10 są widoczne w przepływie w probówce zbiorczej, albo 1) dodaj więcej cząstek G10, aby utrzymać ~ 2 ml granulki, upewniając się, że żadne dodatkowe cząstki G10 nie wydostają się z kolumny, albo 2) wymień kolumnę na nieużywaną i powtórz kroki 3.4-3.6.1.
   3. Po spuszczeniu wstępnie podgrzanego podłoża z kolumny zamknij kran i wylej rurkę zbiorczą z przepływem. Dodaj nową probówkę zbiorczą pod kolumną. Kolumna jest gotowa do załadowania mieszaniną mediów + komórek.
      nuta: Kolumny należy zużyć natychmiast i nie dopuścić do wyschnięcia.

4. Wyodrębnienie 3 subpopulacji w ramach kokultury

1. Zbiór subpopulacji guza zawiesiny (S).
   1. Odessać pożywkę z płytki do współhodowli za pomocą pipety i delikatnie ponownie nałożyć tę samą pożywkę, aby przepłukać płytkę i zebrać pożywkę zawierającą komórki białaczkowe w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Pobrane komórki białaczkowe to subpopulacja S.
2. Zbiór subpopulacji guza Phase Bright (PB).
   1. Dodaj 10 ml świeżej pożywki z powrotem na płytkę do wspólnej hodowli. Spłucz energicznie, pipetując dodane media w górę iw dół około 5 razy, aby usunąć przylegające komórki białaczkowe, ale nie na tyle mocno, aby usunąć przylegający składnik BMSC / OB.
   2. Odessać pipetą i zebrać pożywkę do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Pobrane komórki stanowią subpopulację PB.
3. Zbiór subpopulacji guza Phase Dim (PD).
   1. Przepłukać płytkę 1 ml PBS w celu usunięcia pozostałego podłoża. Trypsynizować płytkę do jednoczesnej hodowli z 3 ml trypsyny i umieścić w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 5 minut.
   2. Wyjąć płytkę z inkubatora i delikatnie postukać w boki płytki, aby usunąć przylegający BMSC/OB.
   3. Dodaj 1 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i pipetuj w górę i w dół 3-5 razy, aby rozbić duże agregaty komórkowe.
   4. Zebrać pożywkę z komórkami w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Komórki te są również nieoczyszczoną subpopulacją PD z BMSC / OB.
4. Odwirować 3 izolowane subpopulacje przy 400 x g przez 7 minut. Odessać i wyrzucić supernatant, a następnie ponownie zawiesić granulki w 1 ml wstępnie podgrzanego podłoża. Komórki są gotowe do załadowania do kolumny G10.

5. Wczytywanie komórek z kokulturą do kolumny G10

UWAGA: Upewnij się, że zawór jest całkowicie zamknięty przed dodaniem nośnika zawierającego komórki do kolumny G10. Ponadto każda subpopulacja musi być przeprowadzona przez osobną kolumnę G10, aby nie wprowadzać żadnych uprzedzeń między populacjami w dalszej analizie.

1. Za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl dodaj kroplami 1 ml każdej subpopulacji komórek w podgrzanym podłożu do oddzielnej kolumny G10. Upewnij się, że podłoże zawierające ogniwa pozostaje na górze lub w gletach G10. Pozostawić komórki do inkubacji na osadzie G10 przez 20 minut w temperaturze RT.
   nuta: Zawór odcinający pozostaje zamknięty na czas inkubacji.

6. Zbieranie komórek białaczkowych z kolumny G10

1. Dodaj 1-3 ml wstępnie podgrzanego podłoża do każdej kolumny G10. Otwórz zawór odcinający i pozwól, aby media powoli opuszczały kolumnę w kierunku kropli.
   nuta: Bardzo ważne jest utrzymanie powolnego przepływu z kolumny, w przeciwnym razie granulat G10 zawierający BMSC / OB może wypłukać się z kolumny i zanieczyścić izolowane komórki białaczkowe.
2. Kontynuuj dodawanie wstępnie podgrzanej pożywki małymi porcjami (1-2 ml) do kolumny G10, aż łącznie 15 do 20 ml przejdzie przez kolumnę i zostanie zebrane. Zamknij zawór odcinający i rurkę zbiorczą nakrętki.
   nuta: Jeśli na dnie probówki zbiorczej widoczna jest osadka z cząstkami G10, delikatnie usuń pożywkę z probówki, pozostawiając osad cząstek G10 w spokoju i przenieś do nowej probówki.
3. Odwirować zebrane pożywki o stężeniu 400 x g przez 7 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w buforze odpowiednim do dalszego zastosowania.
4. Komórki są teraz czystą populacją komórek białaczkowych wolnych od zanieczyszczenia BMSC lub OB i są gotowe do zastosowania w dalszych zastosowaniach według uznania użytkownika.
   nuta: Żywotność komórek białaczkowych powinna pozostać niezmieniona podczas przechodzenia komórek przez kolumny G10.

Wyniki

Udana konfiguracja i hodowla tego modelu kokultury zaowocuje ustanowieniem 3 subpopulacji komórek białaczkowych w stosunku do przylegającej monowarstwy BMSC lub OB. Rycina 1 pokazuje, w jaki sposób WSZYSTKIE komórki zasiane w monowarstwie BMSC początkowo wydają się być tylko pojedynczą populacją zawieszonych komórek białaczkowych. W ciągu 4 dni komórki białaczkowe oddziałują z BMSC, tworząc 3 przestrzenne subpopulacje komórek białaczkowych (zawieszone (S), jasne fazowo (P...

Dyskusja

Minimalna choroba resztkowa (MRD), która przyczynia się do nawrotu choroby, nadal stanowi poważne wyzwanie kliniczne w leczeniu agresywnych, opornych na leczenie ALL, a także wielu innych nowotworów hematologicznych. Mikrośrodowisko szpiku kostnego jest najczęstszym miejscem nawrotu choroby w ALL^3,8. W związku z tym modele modelujące mikrośrodowisko szpiku kostnego są niezbędnymi narzędziami do testowania hipotez związanych z przeżywalnością komórek białaczkowych i utrzymaniem MRD podczas ekspozycji na chemiot...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Koraliki sephadex G10	Sigma	G10120	Określany w manuskrypcie jako żel typu 10 usieciowane cząstki dekstranu
10 ml sterylna strzykawka	BD	309604
Wełna szklana	Pyrex	3950
1-kierunkowy kran	World Precision Instruments, Inc.	14054-10
Stożkowe probówki wirówkowe o pojemności 50 ml World	Wide Medical Products	41021039	Używane jako probówki zbiorcze
Stożkowe probówki wirówkowe 15 ml	World Wide Medical Products	41021037	Używane do pobierania komórek
Surowica bydlęca	płodu Sigma	F6178
0,05% Trypsyna	Mediatech, Inc.	25-053-CI
100 x 20 mm Naczynia do hodowli komórkowych	Greiner Bio-One	664160
Pożywka hodowlana
Pożywka do hodowli osteoblastów	PromoCell	C-27001	Do pożywek dla ludzkich osteoblastów
RPMI 1640 media	Mediatech, Inc.	15-040	Do przygotowania pożywki nowotworowej
< silne> Linie komórkowe< / silne>
< silne> Komórki adherentne: < / silne>
ludzkie osteoblasty	PromoCell	C-12720	Ludzkie osteoblasty zostały wyhodowane zgodnie z dostawcą " s rekomendacje.
Ludzkie komórki zrębu kości Morrowa	WVU Biospecimen Core		Zdeidentyfikowane pierwotne komórki zrębu ludzkiej białaczki i szpiku kostnego (BMSC) zostały dostarczone przez Mary Babb Randolph Cancer Center (MBRCC) Biospecimen Processing Core i Bank Tkanek Wydziału Patologii Uniwersytetu Zachodniej Wirginii. Hodowle BMSC ustalono zgodnie z wcześniejszym opisem (*)
Komórki białaczkowe:
REH	ATCC	ATCC-CRL-8286	Komórki REH hodowano zgodnie z dostawcą Rekomendacje i polecane media.
SD-1	DSMZ	ACC 366	SD-1 zostały wyhodowane zgodnie z zaleceniami dostawcy Rekomendacje i polecane media.
(*) Gibson LF, Fortney J, Landreth KS, Piktel D, Ericson SG, Lynch JP. Zaburzenie funkcji komórek zrębu szpiku kostnego przez etopozyd. Biol Przeszczep szpiku krwi J Am Soc Przeszczep szpiku krwi. 1997 sierpień; 3(3):122–32.