Method Article

Szybka i skuteczna metoda oczyszczania komórek endodermy generowanych z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

DOI:

10.3791/53655

⸱

March 3rd, 2016

 ,  , 
1Institute of Clinical Biochemistry, Hannover Medical School

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy metodę oczyszczania zróżnicowanych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, które są zaangażowane w ostateczną endodermę w celu poprawy dalszych zastosowań i dalszego różnicowania.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zdolności różnicowania pluripotencjalnych komórek macierzystych, takich jak embrionalne komórki macierzyste (ESC), pozwalają na potencjalne zastosowanie terapeutyczne dla terapii zastępczych komórek. Terminalnie zróżnicowane typy komórek mogą być wykorzystywane w leczeniu różnych chorób zwyrodnieniowych. Różnicowanie in vitro tych komórek w kierunku tkanek płuc, wątroby i trzustki wymaga w pierwszej kolejności wytworzenia ostatecznych komórek endodermy. Ten etap ogranicza szybkość dalszego różnicowania w kierunku terminalnie dojrzałych typów komórek, takich jak komórki beta wytwarzające insulinę, hepatocyty lub inne typy komórek pochodzących z endodermy. Komórki, które są zaangażowane w linię endodermy, wykazują wysoką ekspresję wielu czynników transkrypcyjnych, takich jak FOXA2, SOX17, HNF1B, członkowie rodziny GATA i receptor powierzchniowy CXCR4. Jednak protokoły różnicowania rzadko są w 100% skuteczne. W tym miejscu opisujemy metodę oczyszczania populacji komórek CXCR4+ po różnicowaniu do DE za pomocą mikrokulek magnetycznych. To oczyszczenie dodatkowo usuwa komórki niechcianych linii. Metoda delikatnego oczyszczania jest szybka i niezawodna i może być stosowana w celu poprawy dalszych zastosowań i różnicowania.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pluripotencjalne komórki macierzyste, takie jak embrionalne komórki macierzyste (ESC), mają zdolność różnicowania się w praktycznie każdy typ komórek ludzkiego ciała. W ten sposób protokoły różnicowania in vitro mogą być wykorzystywane do generowania wielu typów dorosłych komórek, takich jak kardiomiocyty1, hepatocyty2, komórki beta3, nabłonek płuc4 lub komórki neuronalne5. To sprawia, że ESC są cennym narzędziem w potencjalnym leczeniu różnych chorób zwyrodnieniowych3.

Różnicowanie in vitro ESC w kierunku dorosłych tkanek płuc, wątroby i trzustki wymaga pse....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Zróżnicowanie ludzkiego ESC w kierunku ostatecznej endodermy

  1. Hodować ludzkie embrionalne komórki macierzyste (ESC) w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  2. Pokryć nową 6-dołkową płytkę do hodowli komórkowych 1 ml matrycy błony podstawnej i inkubować materiał do hodowli przez co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej. W celu uzyskania szczegółowych informacji należy zapoznać się z instrukcjami odpowiedniego producenta.
  3. Upewnij się, że hodowane ludzkie ESC osiągnęły 80%-90% konfluencji pod mikroskopem, używając małego powiększenia (np. 4X). Odessać pożywkę z jam poprzez odsysanie pożywki za pomocą sterylnej....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Po różnicowaniu ESC ulegają drastycznym zmianom w ekspresji genów i białek. Rycina 1 przedstawia typowe geny markerowe, które można wykorzystać do weryfikacji pomyślnego różnicowania endodermy. Głównymi celami analizy ekspresji genów są GSC, FOXA2 i SOX17. W względnej analizie ekspresji genów, zwłaszcza FOXA2 i SOX17 są zwiększone > 2000 razy w porównaniu z niezróżnicowanymi ESC. GSC ulega ekspresji.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecnie stosowane protokoły różnicowania rzadko prowadzą do 100% różnicowania komórek. Z powodów, którymi nadal należy się zająć, niektóre komórki opierają się procesowi różnicowania. W zależności od skuteczności zastosowanego protokołu różnicowania i skłonności linii ESC, często obserwuje się pewną liczbę resztkowych komórek pluripotencjalnych nawet po różnicowaniu się do ostatecznej endodermy. Te szczątkowe komórki mogą upośledzać dalsze różnicowanie lub dalszą analizę, taką jak transkryptomika, proteomika i analiza ek.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Z wdzięcznością dziękujemy za umiejętną pomoc techniczną Jasmin Kresse.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Linia ludzkich embrionalnych komórek macierzystych Hues8Harvard Department of stem cell & regenerative biologyOdpowiednia linia komórkowa do generacji
endodermy Linia ludzkich embrionalnych komórek macierzystych Hes3ES Cell InternationalOdpowiednia i wytrzymała linia komórkowa do generowania endodermy
mTeSR1Stemcell Technologies5850Pożywka hodowlana ESC
FCSBiowestS1860
Zaawansowane technologie życia RPMI 164012633012
CD184 (CXCR4)-APC, ludzkiMiltenyi Biotec130-098-357
anty-APC MicroBeadsMiltenyi Biotec130-090-855 
Separator OctoMACSMiltenyi Biotec130-042-109pole magnetyczne
Y-27632Selleck ChemicalsS1049Inhibitor ROCK
CHIR-99021Tocris Bioscience4423
Activin APeprotech120-14
Delikatny odczynnik do dysocjacji komórekStemcell Technologies7174Bez enzymów roztwór do pasażowania, alternatywa: Trypsin/EDTA
Matrigel*Corning354277matryca błony podstawnej
* rozpuścić i przechowywać w podwielokrotnościach w temperaturze -80 &; C zgodnie z instrukcją dla dostawców. Po użyciu rozmrozić na lodzie, rozcieńczyć w 25 ml lodowatego nokautu DMEM/F-12.
Dodać 1 ml do każdego dołka na 6-dołkowej płytce i inkubować przez 45 minut w temperaturze pokojowej.
Usunąć matrycę i natychmiast zużyć.
Kolumny MSMiltenyi Biotec30-042-201
Separator MACSMiltenyi Biotec130-042-302
Człowiek FOXA2 FW
gggagcggtgaagatgga		Life TechnologiesNA
Człowiek FOXA2 REV
tcatgttgctcacggagta		Technologie
Ludzkie GSC FW
gaggagaaagtggaggtggtt		Życie Technologie Człowiek
GSC REV
ctctgatgaggaccgcttctg		Life Technologies
SOX17 Test TaqManBiosystemy stosowaneHs00751752_s1
Człowiek SOX7 FW
gatgctgggaaagtcgtggaagg		Technologie
Człowiek SOX7 REV
tgcggccggggtacttgtag		Technologie
życiaCzłowiek POU5F1 FW
cttgctgcagaagtgggggg		Technologie
Ludzki POU5F1 REV
ctgcagtgtgtgtttcgggca		Technologie
Ludzki nanog FW
ccgagggcagacatcatcc		Technologie
Ludzki nanog REV
ccatccactgccacatcttct		Technologie życia Ludzki
TBP FW
caa cag cct gcc acc tta cgc tc		Life Technologies
Human TBP REV
agg ctg tgg ggt cag tcc agt g		Life Technologies
Human TUBA1A FW
ggc agt gtt tgt aga ctt gga acc c		Life Technologies
Human TUBA1A REV
tgt gat aag ttg ctc agg gtg gaa g		Life Technologies
Human G6PD FW
agg ccg tca cca aga aca a		Life Technologies
Human G6PD REV
cga TGA TG TG GGT TCC AGC CTA t 		Life Technologies
Anti-SOX2Santa Cruz Biotechnologysc-17320
Anti-FOXA2MerckMillipore07-633
Anti-SOX17R& Systemy DAF1924
życioweżycioweżycioweżycioweżyciowe

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sharma, A., Li, G., Rajarajan, K., Hamaguchi, R., Burridge, P. W., Wu, S. M. Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose Starvation. J Vis Exp. (97), (2015).
  2. Sgodda, M., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Endoderm Cell PurificationHuman Embryonic Stem CellsCXCR4 Positive CellsMagnetic Bead SeparationDefinitive Endoderm DifferentiationFlow Cytometry AnalysisBasement Membrane CoatingROCK Inhibitor SupplementationCell Surface MarkerEndoderm Induction Medium

Related Articles