Artykuł metodologiczny

Szybka i skuteczna metoda oczyszczania komórek endodermy generowanych z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53655

⸱

3 marca 2016

 ,  , 
1Institute of Clinical Biochemistry, Hannover Medical School

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy metodę oczyszczania zróżnicowanych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, które są zaangażowane w ostateczną endodermę w celu poprawy dalszych zastosowań i dalszego różnicowania.

Streszczenie

Zdolności różnicowania pluripotencjalnych komórek macierzystych, takich jak embrionalne komórki macierzyste (ESC), pozwalają na potencjalne zastosowanie terapeutyczne dla terapii zastępczych komórek. Terminalnie zróżnicowane typy komórek mogą być wykorzystywane w leczeniu różnych chorób zwyrodnieniowych. Różnicowanie in vitro tych komórek w kierunku tkanek płuc, wątroby i trzustki wymaga w pierwszej kolejności wytworzenia ostatecznych komórek endodermy. Ten etap ogranicza szybkość dalszego różnicowania w kierunku terminalnie dojrzałych typów komórek, takich jak komórki beta wytwarzające insulinę, hepatocyty lub inne typy komórek pochodzących z endodermy. Komórki, które są zaangażowane w linię endodermy, wykazują wysoką ekspresję wielu czynników transkrypcyjnych, takich jak FOXA2, SOX17, HNF1B, członkowie rodziny GATA i receptor powierzchniowy CXCR4. Jednak protokoły różnicowania rzadko są w 100% skuteczne. W tym miejscu opisujemy metodę oczyszczania populacji komórek CXCR4+ po różnicowaniu do DE za pomocą mikrokulek magnetycznych. To oczyszczenie dodatkowo usuwa komórki niechcianych linii. Metoda delikatnego oczyszczania jest szybka i niezawodna i może być stosowana w celu poprawy dalszych zastosowań i różnicowania.

Wprowadzenie

Pluripotencjalne komórki macierzyste, takie jak embrionalne komórki macierzyste (ESC), mają zdolność różnicowania się w praktycznie każdy typ komórek ludzkiego ciała. W ten sposób protokoły różnicowania in vitro mogą być wykorzystywane do generowania wielu typów dorosłych komórek, takich jak kardiomiocyty1, hepatocyty2, komórki beta3, nabłonek płuc4 lub komórki neuronalne5. To sprawia, że ESC są cennym narzędziem w potencjalnym leczeniu różnych chorób zwyrodnieniowych3.

Różnicowanie in vitro ESC w kierunku dorosłych tkanek płuc, wątroby i trzustki wymaga pseudo-gastrulacji do komórek przypominających ostateczną endodermę (DE)6. Ponieważ dalsze różnicowanie w kierunku wyżej wymienionych typów komórek somatycznych jest znacznie mniej efektywne, optymalne różnicowanie endodermy uważa się za ograniczające szybkość7. Komórki, które są zaangażowane w linię endodermy, ulegają charakterystycznym zmianom w profilu ekspresji genów. Geny głównego regulatora pluripotencji są regulowane w dół, podczas gdy ekspresja innych czynników transkrypcyjnych, takich jak FOXA2, SOX17, HNF1B, członków rodziny GATA i receptora powierzchniowego CXCR4, jest silnie regulowana w górę6, 8, 9. Wiadomo, że CXCR4 jest transaktywowany przez SMAD2 / 3, za sygnalizacją węzłową/TGF-β i SOX17 ze względu na specyficzne miejsca wiązania w regioniepromotora 10. Jest to więc bardzo odpowiedni marker używany w wielu raportach6, 8, 11-13. Te zmiany ekspresji odzwierciedlają zdarzenie pseudo-gastrulacji, w którym ESC najpierw nabywają cechy prymitywnej populacji komórek przypominających smugi, a następnie angażują się w listek zarodkowy endodermy6.

Jednak protokoły różnicowania rzadko są w 100% skuteczne, ponieważ kilka komórek może opierać się procesowi różnicowania lub różnicować się w kierunku innych niezamierzonych linii14. Komórki te mogą negatywnie wpływać na dalsze różnicowanie. Co więcej, szczątkowe niezróżnicowane komórki niosą ze sobą duże ryzyko dla późniejszych eksperymentów transplantacyjnych i mogą prowadzić do powstawania potworniaków15-17.

Aby usunąć te niechciane komórki na wczesnym etapie, marker powierzchniowy CXCR4 może być użyty do oczyszczania komórek, które są zaangażowane w DE18. W tym miejscu opisujemy metodę pozytywnej selekcji komórek CXCR4+ z kultur różnicujących DE. W tym celu marker powierzchniowy CXCR4 jest wiązany przez przeciwciało, które następnie wiąże się z mikrokulkami magnetycznymi. W przeciwieństwie do trudnych warunków podczas sortowania FACS, magnetycznie znakowane ogniwa DE-podobne mogą być następnie łatwo oczyszczane w formacie stołowym przy użyciu delikatnej metody oczyszczania. Protokół ten zapewnia prostą metodę usuwania populacji komórek, które oparły się procesowi różnicowania DE.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Zróżnicowanie ludzkiego ESC w kierunku ostatecznej endodermy

  1. Hodować ludzkie embrionalne komórki macierzyste (ESC) w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  2. Pokryć nową 6-dołkową płytkę do hodowli komórkowych 1 ml matrycy błony podstawnej i inkubować materiał do hodowli przez co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej. W celu uzyskania szczegółowych informacji należy zapoznać się z instrukcjami odpowiedniego producenta.
  3. Upewnij się, że hodowane ludzkie ESC osiągnęły 80%-90% konfluencji pod mikroskopem, używając małego powiększenia (np. 4X). Odessać pożywkę z jam poprzez odsysanie pożywki za pomocą sterylnej szklanej pipety Pasteura. Raz przemyć komórki roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS). W tym celu dodaj 2 ml PBS do każdej studzienki, delikatnie potrząśnij płytką i odessaj roztwór, aby usunąć martwe komórki i resztki komórek.
  4. Dodać 1 ml odczynnika do pasażowania bez enzymów w celu delikatnej dysocjacji klastrów komórek. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 do momentu, gdy komórki wykażą wyraźne oznaki rozpadu na małe skupiska.
    nuta: Czas inkubacji zależy od użytego odczynnika. W przypadku bezenzymatycznego roztworu pasażowego, o którym mowa w rozdziale dotyczącym materiałów, czas inkubacji wynosi około 7 minut.
  5. Dodać 1 ml pożywki DMEM/F-12 i rozbić pozostałe agregaty komórek na pojedyncze komórki, pipetując w górę i w dół za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 ml. Użyj tego, aby wypłukać komórki z powierzchni i przenieść je do probówki wirówkowej. Aby pobrać wszystkie komórki, przemyj każdą studzienkę 1 ml pożywki DMEM/F-12 i dodaj pożywkę do probówki wirówkowej.
  6. Odwirować komórki przez 5 minut przy 300 x g. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 5 ml pożywki do hodowli komórek ES zawierającej inhibitor 10 μM kinazy Rho (ROCK).
  7. Policz komórki pod mikroskopem za pomocą hemocytometru i zasiej 150 000 - 400 000 komórek na 6 dołków lub w innym układzie płytek, w zależności od użytej linii komórkowej ES. Aby uniknąć apoptozy, należy użyć pożywki hodowlanej zawierającej 10 μM inhibitora ROCK i hodować komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  8. Około 24 godziny po wysiewie odessać pożywkę sterylną szklaną pipetą Pasteura i dodać 2 ml prymitywnej pożywki do indukcji smug.
    nuta: Pożywka ta zawiera końcowe stężenia 1% glutaminy, 0,2% FCS, 5 μM CHIR-99021 i 50 ng/ml aktywiny A w pożywce Advanced RPMI-1640. Zwykle używa się 2 ml podłoża do uprawy na płytkach 6-dołkowych.
  9. 48 godzin po wysiewie wymienić pożywkę na pożywkę indukcyjną endodermy. Hoduj komórki w tym podłożu przez kolejne 48 godzin z codzienną wymianą podłoża.
    nuta: Pożywka ta zawiera 1% glutaminy, 0,2% FCS i 50 ng/ml aktywiny A w pożywce Advanced RPMI-1640. Komórki, które są zaangażowane w ostateczną endodermę, wyrażają marker powierzchniowy CXCR4. Barwienie CXCR4 można wykorzystać do ilościowego określenia liczby komórek DE-zaangażowanych.

2. Barwienie ostatecznych komórek endodermy CXCR4+ do analizy cytometrii przepływowej

  1. Przez ostatnie 24 godziny, ale co najmniej 1 godzinę przed pobraniem, komórki dodać 10 μM inhibitora ROCK do pożywki hodowlanej.
  2. Przygotować do hodowli komórkowych, które będą używane do ponownego wysiewu, za pomocą macierzy błony podstawnej, tj. 12-dołkowych płytek do analizy qPCR lub szkiełek komorowych do barwienia immunofluorescencyjnego. Inkubować płytki lub szkiełka podstawowe przez co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Odessać pożywkę sterylną szklaną pipetą Pasteura z dołków zróżnicowanych komórek używanych do barwienia i/lub sortowania.
  4. Dodać 1 ml odczynnika do pasażowania bez enzymów w celu delikatnej dysocjacji klastrów komórek. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 do momentu, gdy komórki wykażą wyraźne oznaki rozpadu na małe skupiska.
    nuta: Czas inkubacji zależy od użytego odczynnika. W przypadku bezenzymatycznego roztworu pasażowego, o którym mowa w rozdziale dotyczącym materiałów, czas inkubacji wynosi około 7 minut.
  5. Dodać 1 ml pożywki DMEM/F-12 i rozbić pozostałe agregaty komórkowe na pojedyncze komórki, pipetując w górę i w dół za pomocą końcówki o pojemności 1 ml. Użyj tego, aby wypłukać komórki z powierzchni i przenieść je do probówki wirówkowej. Aby pobrać wszystkie komórki, przemyj każdą studzienkę 1 ml pożywki DMEM/F-12 bez FCS i dodaj pożywkę do probówki wirówkowej.
  6. Policz komórki pod mikroskopem za pomocą hemocytometru. Komórki z trzech dołków płytki 6-dołkowej powinny dać 10-15 x 106 komórek po trzech dniach różnicowania. Odwirowywać komórki przez 5 minut przy 300 x g.
    nuta: Dokładna liczba uzyskanych komórek będzie zależeć od pluripotencjalnej linii komórkowej użytej do różnicowania.
  7. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w buforze PEB zawierającym 10 μM inhibitor ROCK. Użyj 100 μl tego buforu na maksymalnie 107 komórek. Dodać 10 μM inhibitora ROCK w dniu barwienia. Użyj tego bufora dla wszystkich aplikacji podrzędnych (określanego jako bufor PEB + RI).
    nuta: Bufor PEB zawiera 0,5% BSA i 2 mM EDTA w PBS. Jeśli ma zostać zabarwionych więcej komórek, odpowiednio dostosuj objętość bufora.
  8. Dodać 10 μl przeciwciała CXCR4-APC na 107 komórek w 100 μl, co w przybliżeniu odpowiada rozcieńczeniu 1:10,
    nuta: Stosowanie przeciwciał sprzężonych z APC nie jest obowiązkowe. Zamiast tego można go zastąpić w zależności od użytych mikrogranulek. Jeśli ma zostać wybarwionych więcej komórek, odpowiednio dostosuj objętość przeciwciała.
  9. Wymieszać, delikatnie obracając probówkę palcami i inkubować w temperaturze 4 °C w lodówce przez 15 minut. Ponownie zawiesić komórki za pomocą 1-2 ml buforu PEB. Odwirowywać komórki przez 5 minut przy 300 x g.
  10. Odessać supernatant sterylnym szklanym pipetem Pasteura i ponownie zawiesić osad komórek w 80 μl PEB na 107 komórek i dodać 20 μl mikrogranulek anty-APC.
    nuta: Jeśli ma zostać wybarwionych więcej komórek, odpowiednio dostosuj objętość mikrokulek.
  11. Wymieszać, delikatnie obracając probówkę palcami i inkubować w temperaturze 4 °C w lodówce przez 15 minut. Ponownie zawiesić komórki za pomocą 1-2 ml buforu PEB + RRI. Odwirowywać komórki przez 5 minut przy 300 x g. Zassać bufor. Zawiesić w 500 μl buforu PEB + RI.

3. Separacja magnetyczna komórek CXCR4+

  1. Umieść średniej wielkości kolumnę magnetyczną w polu magnetycznym zgodnie z instrukcjami producenta. Wstępnie przepłukać kolumnę 500 μl buforu PEB +RI. Nałóż całą zawiesinę komórek na kolumnę. Zbierz przepływ, ponieważ nie wszystkie komórki zostaną powiązane z kolumną. Upewnij się, że nie przeszkadzasz kolumnom, aby uzyskać optymalne pobieranie komórek CXCR4+.
  2. Przemyć kolumnę trzykrotnie 500 μl buforu PEB + RI. Zbierz pierwszy przepływ i połącz go z zebranymi komórkami z kroku 3.1. Usuń kolumnę magnetyczną z pola magnetycznego i umieść ją w odpowiedniej probówce zbiorczej. Dodać 1 ml buforu PEB + RI do kolumny. Aby wymyć komórki, mocno wciśnij tłok do kolumny.
  3. Opcjonalnie: Zebrać wszystkie przepływające próbki oddzielnie i użyć 20 μl każda do analizy liczby komórek CXCR4+ za pomocą cytometrii przepływowej. Ich liczba powinna maleć z każdym krokiem prania.
    nuta: Aby uzyskać wiarygodne wyniki, należy policzyć co najmniej 2 x 104 żywotne, bramkowane komórki.
  4. Powtórzyć kroki 3.1-3.3 z próbką pobraną przez próbkę z kroku 3.1 i pierwszym przepływem przez próbkę z kroku 3.2 przy użyciu nowej kolumny. Nie używaj ponownie poprzedniej kolumny. Za pomocą tłoka powietrze jest wtłaczane do kolumny, która ją blokuje.
  5. Policz komórki pod mikroskopem za pomocą hemocytometru. W zależności od skuteczności różnicowania, początkowo można posortować do 6 x 10 6 komórek, a kolejne 1 x 106 komórek za pomocą drugiej kolumny przy użyciu 10:7 komórek do zabiegu.
  6. Odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut. Odessać supernatant i sterylnym szklanym pipetem Pasteura ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki do indukcji endodermy z kroku 1.9 z dodatkowym inhibitorem 10 μM ROCK.
  7. Policz komórki pod mikroskopem za pomocą hemocytometru. Wysiewać komórki w odpowiedniej gęstości, tj. ~ 4 x 105 komórek na studzienkę płytki 12-dołkowej (ok. 3,6 cm2 powierzchni) lub ~ 1,5 x 105 komórek na studzienkę 8-dołkowego szkiełka podstawowego.

4. Opcjonalnie: Analiza oczyszczonej populacji endodermy

  1. W przypadku barwienia immunofluorescencyjnego utrwalić oczyszczone komórki z kroku 3.7 około 24 godziny po wysianiu za pomocą 4% paraformaldehydu i wybarwienia w celu uzyskania ostatecznej endodermy (DE) i/lub białek markera pluripotencji.
    nuta: Powszechnie stosowane markery DE to FOXA2 i SOX17, powszechnie stosowane markery pluripotencji to OCT3/4, NANOG i SOX26, 8.
  2. W przypadku analizy RT-qPCR należy zebrać oczyszczone komórki bezpośrednio lub 24 godziny po wysianiu, wyekstrahować całkowite RNA i dokonać odwrotnej transkrypcji cDNA z wyekstrahowanych próbek całkowitego RNA. Użyj 10 ng cDNA jako matrycy w reakcji RT-qPCR (trzykrotnie), aby przeanalizować ekspresję DE i genów markerów pluripotencji6, 8,
    nuta: Powszechnie stosowane geny markerowe są wymienione w kroku 4.1. Warunki cyklu to 5 minut w temperaturze 95 °C i 40 cykli po 15 sekund w temperaturze 95 °C i 1 minuta w temperaturze 60 °C, po których następuje analiza krzywej topnienia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Po zróżnicowaniu Embrionalne komórki macierzyste (ESC) przechodzą drastyczne zmiany w ekspresji genów i białek. Rycina 1 przedstawia typowe geny markerowe, które można wykorzystać do weryfikacji prawidłowej różnicowania w endodermę. Głównymi celami analizy ekspresji genów są GSC, FOXA2, i SOX17. W analizie względnej ekspresji genów, w szczególności FOXA2 i SOX17 zwiększają się poprzez > 2000-krotnie w porówn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Obecnie stosowane protokoły różnicowania rzadko prowadzą do 100% różnicowania komórek. Z powodów, którymi nadal należy się zająć, niektóre komórki opierają się procesowi różnicowania. W zależności od skuteczności zastosowanego protokołu różnicowania i skłonności linii ESC, często obserwuje się pewną liczbę resztkowych komórek pluripotencjalnych nawet po różnicowaniu się do ostatecznej endodermy. Te szczątkowe komórki mogą upośledzać dalsze różnicowanie lub dalszą analizę, taką jak transkryptomika, proteomika i analiza ek...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Z wdzięcznością dziękujemy za umiejętną pomoc techniczną Jasmin Kresse.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Linia ludzkich embrionalnych komórek macierzystych Hues8Harvard Department of stem cell & regenerative biologyOdpowiednia linia komórkowa do generacji
endodermy Linia ludzkich embrionalnych komórek macierzystych Hes3ES Cell InternationalOdpowiednia i wytrzymała linia komórkowa do generowania endodermy
mTeSR1Stemcell Technologies5850Pożywka hodowlana ESC
FCSBiowestS1860
Zaawansowane technologie życia RPMI 164012633012
CD184 (CXCR4)-APC, ludzkiMiltenyi Biotec130-098-357
anty-APC MicroBeadsMiltenyi Biotec130-090-855 
Separator OctoMACSMiltenyi Biotec130-042-109pole magnetyczne
Y-27632Selleck ChemicalsS1049Inhibitor ROCK
CHIR-99021Tocris Bioscience4423
Activin APeprotech120-14
Delikatny odczynnik do dysocjacji komórekStemcell Technologies7174Bez enzymów roztwór do pasażowania, alternatywa: Trypsin/EDTA
Matrigel*Corning354277matryca błony podstawnej
* rozpuścić i przechowywać w podwielokrotnościach w temperaturze -80 &; C zgodnie z instrukcją dla dostawców. Po użyciu rozmrozić na lodzie, rozcieńczyć w 25 ml lodowatego nokautu DMEM/F-12.
Dodać 1 ml do każdego dołka na 6-dołkowej płytce i inkubować przez 45 minut w temperaturze pokojowej.
Usunąć matrycę i natychmiast zużyć.
Kolumny MSMiltenyi Biotec30-042-201
Separator MACSMiltenyi Biotec130-042-302
Człowiek FOXA2 FW
gggagcggtgaagatgga		Life TechnologiesNA
Człowiek FOXA2 REV
tcatgttgctcacggagta		Technologie
Ludzkie GSC FW
gaggagaaagtggaggtggtt		Życie Technologie Człowiek
GSC REV
ctctgatgaggaccgcttctg		Life Technologies
SOX17 Test TaqManBiosystemy stosowaneHs00751752_s1
Człowiek SOX7 FW
gatgctgggaaagtcgtggaagg		Technologie
Człowiek SOX7 REV
tgcggccggggtacttgtag		Technologie
życiaCzłowiek POU5F1 FW
cttgctgcagaagtgggggg		Technologie
Ludzki POU5F1 REV
ctgcagtgtgtgtttcgggca		Technologie
Ludzki nanog FW
ccgagggcagacatcatcc		Technologie
Ludzki nanog REV
ccatccactgccacatcttct		Technologie życia Ludzki
TBP FW
caa cag cct gcc acc tta cgc tc		Life Technologies
Human TBP REV
agg ctg tgg ggt cag tcc agt g		Life Technologies
Human TUBA1A FW
ggc agt gtt tgt aga ctt gga acc c		Life Technologies
Human TUBA1A REV
tgt gat aag ttg ctc agg gtg gaa g		Life Technologies
Human G6PD FW
agg ccg tca cca aga aca a		Life Technologies
Human G6PD REV
cga TGA TG TG GGT TCC AGC CTA t 		Life Technologies
Anti-SOX2Santa Cruz Biotechnologysc-17320
Anti-FOXA2MerckMillipore07-633
Anti-SOX17R& Systemy DAF1924
życioweżycioweżycioweżycioweżyciowe

Bibliografia

  1. Sharma, A., Li, G., Rajarajan, K., Hamaguchi, R., Burridge, P. W., Wu, S. M. Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose Starvation. J Vis Exp. (97), (2015).
  2. Sgodda, M., et al. Improved hepatic differentiation strategies for human induced pluripotent stem cells. Curr Mol Med. 13 (5), 842-855 (2013).
  3. Naujok, O., Burns, C., Jones, P. M., Lenzen, S. Insulin-producing surrogate beta-cells from embryonic stem cells: are we there yet. Mol Ther. 19 (10), 1759-1768 (2011).
  4. Katsirntaki, K., et al. Bronchoalveolar sublineage specification of pluripotent stem cells: effect of dexamethasone plus cAMP-elevating agents and keratinocyte growth factor. Tissue Eng Part A. 21 (3-4), 669-682 (2015).
  5. Abranches, E., et al. Neural differentiation of embryonic stem cells in vitro: a road map to neurogenesis in the embryo. PLoS One. 4 (7), e6286(2009).
  6. Naujok, O., Diekmann, U., Lenzen, S. The generation of definitive endoderm from human embryonic stem cells is initially independent from activin A but requires canonical Wnt-signaling. Stem Cell Rev. 10 (4), 480-493 (2014).
  7. D'Amour, K. A., et al. Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 24 (11), 1392-1401 (2006).
  8. Diekmann, U., Lenzen, S., Naujok, O. A reliable and efficient protocol for human pluripotent stem cell differentiation into the definitive endoderm based on dispersed single cells. Stem Cells Dev. 24 (2), 190-204 (2015).
  9. Kim, P. T., Ong, C. J. Differentiation of definitive endoderm from mouse embryonic stem cells. Results Probl Cell Differ. 55, 303-319 (2012).
  10. Katoh, M., Katoh, M. Integrative genomic analyses of CXCR4: transcriptional regulation of CXCR4 based on TGFbeta, Nodal, Activin signaling and POU5F1, FOXA2, FOXC2, FOXH1, SOX17, and GFI1 transcription factors. Int J Oncol. 36 (2), 415-420 (2010).
  11. Nostro, M. C., et al. Stage-specific signaling through TGFbeta family members and WNT regulates patterning and pancreatic specification of human pluripotent stem cells. Development. 138 (5), 861-871 (2011).
  12. Rezania, A., et al. Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice. Diabetes. 61 (8), 2016-2029 (2012).
  13. Bruin, J. E., et al. Maturation and function of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors in macroencapsulation devices following transplant into mice. Diabetologia. 56 (9), 1987-1998 (2013).
  14. Fu, W., Wang, S. J., Zhou, G. D., Liu, W., Cao, Y., Zhang, W. J. Residual undifferentiated cells during differentiation of induced pluripotent stem cells in vitro and in vivo. Stem Cells Dev. 21 (4), 521-529 (2012).
  15. Hentze, H., Soong, P. L., Wang, S. T., Phillips, B. W., Putti, T. C., Dunn, N. R. Teratoma formation by human embryonic stem cells: evaluation of essential parameters for future safety studies. Stem Cell Res. 2 (3), 198-210 (2009).
  16. Herberts, C. A., Kwa, M. S., Hermsen, H. P. Risk factors in the development of stem cell therapy. J Transl Med. 9, 29(2011).
  17. Naujok, O., Kaldrack, J., Taivankhuu, T., Jörns, A., Lenzen, S. Selective removal of undifferentiated embryonic stem cells from differentiation cultures through HSV1 thymidine kinase and ganciclovir treatment. Stem Cell Rev. 6 (3), 450-461 (2010).
  18. Pan, Y., Ouyang, Z., Wong, W. H., Baker, J. C. A new FACS approach isolates hESC derived endoderm using transcription factors. PLoS One. 6 (3), 17536(2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Oczyszczanie kom rek endodermykom rki CXCR4 dodatnieseparacja za pomoc kulek magnetycznychr nicowanie w kierunku endodermy definitywnejanaliza cytometrycznapowlekanie b on podstawnsuplementacja inhibitorem ROCKmarker powierzchniowy kom rekpod o e do indukcji endodermy

Powiązane artykuły