Artykuł metodologiczny

Izolacja i analiza cytometrii przepływowej komórek odpornościowych z niedokrwionego mózgu myszy

DOI:

10.3791/53658

⸱

12 lutego 2016

 ,  ,  ,  , 
1Ischemia Research Unit, Fraunhofer Institute for Cell Therapy and Immunology, 2Fraunhofer Research Institution for Marine Biotechnology, University of Lubeck, 3Department of Neurology, University of Leipzig

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stan zapalny odgrywa kluczową rolę w patogenezie udaru niedokrwiennego. Coraz więcej dowodów sugeruje, że działa jak miecz obosieczny, który zaostrza wczesne uszkodzenie mózgu, ale także przyczynia się do późniejszej naprawy. Protokół ten opisuje izolację komórek odpornościowych z niedokrwionego mózgu i ich późniejsze fenotypowanie metodą cytometrii przepływowej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Udar niedokrwienny inicjuje silną reakcję zapalną, która rozpoczyna się w przedziale wewnątrznaczyniowym i obejmuje szybką aktywację komórek rezydujących w mózgu. Kluczowym mechanizmem tej odpowiedzi zapalnej jest migracja krążących komórek odpornościowych do niedokrwionego mózgu, ułatwiona przez uwalnianie chemokiny i zwiększoną ekspresję cząsteczki adhezyjnej śródbłonka. Leukocyty atakujące mózg są dobrze znane z tego, że przyczyniają się do wtórnego uszkodzenia niedokrwiennego we wczesnym stadium, ale dopiero niedawno zauważono ich znaczenie dla zakończenia stanu zapalnego i późniejszej naprawy mózgu.

Tutaj dostępny jest prosty protokół do efektywnej izolacji komórek odpornościowych z niedokrwionego mózgu myszy. Po perfuzji przezsercowej półkule mózgu są preparowane i mechanicznie dysocjowane. Po trawieniu enzymatycznym za pomocą liberazy następuje wirowanie gradientu gęstości (takiego jak Percoll) w celu usunięcia mieliny i resztek komórkowych. Jedną z głównych zalet tego protokołu jest procedura jednowarstwowego gradientu gęstości, która nie wymaga czasochłonnego przygotowania gradientów i może być niezawodnie wykonana. Podejście to pozwala uzyskać wysoce powtarzalną liczbę komórek na półkulę mózgu i pozwala na pomiar kilku paneli cytometrii przepływowej w jednej kontrpróbie biologicznej. Charakterystyka fenotypowa i kwantyfikacja leukocytów atakujących mózg po eksperymentalnym udarze może przyczynić się do lepszego zrozumienia ich wieloaspektowej roli w uszkodzeniu i naprawie niedokrwiennej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Udar mózgu wywołuje długotrwałą reakcję zapalną, która zaczyna się szybko po ustaniu lokalnego przepływu krwi i obejmuje praktycznie wszystkie części układu odpornościowego. Jedną z ważnych cech charakterystycznych tej reakcji zapalnej jest czasowy napływ komórek odpornościowych do mózgu, który jest napędzany przez aktywację komórek śródbłonka mózgu, znaczne wydzielanie chemokiny i zwiększony odpływ współczulny1-3. Naciek komórek zapalnych był wcześniej uważany za szkodliwy w udarze niedokrwiennym, jednak kilka badań terapeutycznych mających na celu masowe blokowanie wyjścia leukocytów do mózgu nie przyniosło wymiernych korzyści klinicznych4. Niedawno stało się oczywiste, że komórki pochodzące z monocytów, początkowo zaangażowane w progresję uszkodzenia niedokrwiennego5, mogą również odgrywać kluczową rolę w ustępowaniu stanu zapalnego i późniejszej naprawie tkanek6.

Dzięki identyfikacji fenotypowej i funkcjonalnej heterogeniczności wśród monocytów i makrofagów, wiedza na temat roli fagocytów jednojądrzastych w rozwoju i rozwiązywaniu stanów zapalnych znacznie się poszerzyła. U myszy krążące monocyty można podzielić na co najmniej dwa funkcjonalnie odrębne podzbiory zgodnie z ich powierzchniową ekspresją kompleksu antygenu limfocytów 6 (Ly-6C)7. Podczas gdy "monocyty zapalne"o wysokiej zawartości Ly-6C wyraźnie wykazały, że są niezbędne do kontroli infekcji bakteryjnych8, ich rola w bezpłodnym uszkodzeniu jest bardziej kontrowersyjna. W udarze niedokrwiennym selektywna ablacja monocytów owysokiej zawartości CCR2 + Ly-6C skutkowała transformacją krwotocznązawału 6. Jednak to samo podejście eksperymentalne poprawiło ostrą niepełnosprawność po krwotoku śródmózgowym9. Podobnie, uważa się, że różne podzbiory limfocytów T wywierają działanie szkodliwe10 lub ochronne11 w niedokrwiennym uszkodzeniu mózgu, jednak dane są kontrowersyjne12,13 i wymagają dalszych badań. Biorąc pod uwagę tę rosnącą złożoność, staje się jasne, że głębsza wiedza na temat roli różnych komórek odpornościowych w urazie niedokrwiennym i naprawie ma kluczowe znaczenie dla przełożenia wyników eksperymentów na terapie ukierunkowane na stan zapalny po udarze.

Dzisiaj najpotężniejszym narzędziem do analizy komórkowych odpowiedzi immunologicznych jest polichromatyczna cytometria przepływowa. Umożliwia identyfikację i kwantyfikację różnych podzbiorów komórek odpornościowych w miejscu zapalenia bez konieczności stronniczości systemu poprzez znakowanie in vivo lub manipulację genetyczną14. Jednoczesne barwienie markerów powierzchniowych komórek przeciwciałami przeciwko cytokinom wewnątrzkomórkowym15 lub czynnikom transkrypcyjnym16 dodatkowo dostarcza informacji o stanie funkcjonalnym pojedynczych, fenotypowo zidentyfikowanych komórek. Jedną z głównych wad jest to, że do testów cytometrii przepływowej wymagane są zawiesiny pojedynczych komórek, a tym samym tracone są informacje o lokalizacji nacieków komórkowych. Jednakże, chociaż histologia jest idealna do uzyskiwania informacji przestrzennych, jest ograniczona przez liczbę przeciwciał, które można użyć jednorazowo do scharakteryzowania podtypów komórek odpornościowych w określonej tkance. Obecnie połączenie obecności i braku różnych markerów powierzchniowych jest potrzebne do jednoznacznej identyfikacji rzadkich podzbiorów komórek odpornościowych, zwłaszcza odrębnych populacji komórek pochodzących z monocytów podczas stanu zapalnego17.

Tutaj opisujemy skuteczny protokół izolowania dużej liczby leukocytów z postniedokrwicznego mózgu myszy za pomocą prostego jednowarstwowego gradientu gęstości. Otrzymane zawiesiny komórkowe mogą być analizowane za pomocą wielowymiarowej cytometrii przepływowej lub dodatkowo wzbogacane przez sortowanie metodą cytometrii przepływowej lub selekcję immunomagnetyczną w celu przeprowadzenia wysoce specyficznych analiz końcowych. Metoda szczegółowo opisuje perfuzję przezsercową, usunięcie półkul mózgowych, dysocjację tkanki mózgowej na zawiesiny pojedynczych komórek, wirowanie w gradiencie gęstości w celu usunięcia mieliny, a także barwienie przeciwciał do analizy cytometrii przepływowej.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach muszą być zgodne z odpowiednimi standardami opieki nad zwierzętami (np. Przewodnik po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych opublikowany przez amerykańskie Narodowe Instytuty Zdrowia, publikacja NIH nr 85-23, poprawiony w 1996 roku) i muszą być zatwierdzone przez odpowiednie władze państwowe.

1. Przygotowanie odczynników

  1. Bufor wytrawiający (1 ml na półkulę): Rozpuść standaryzowaną mieszaninę oczyszczonych enzymów trawiennych, np. Liberazy o niskim stężeniu termolizyny (TL) do stężenia 2U/ml w zrównoważonym roztworze soli Hanksa (HBSS) zawierającym wapń (Ca) i magnez (Mg)
  2. Bufor płuczący z DNAzą: Rozpuścić DNAzę I do stężenia 666U/ml w HBSS (wolne od Ca/Mg) zawierającym 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS)
  3. Bufor płuczący bez DNAzy: HBSS (wolny od Ca/Mg) zawierający 10% FCS
  4. Pożywka o gradiencie gęstości (5 ml na półkulę): przygotować podstawową pożywkę o gradientzie gęstości izotonicznej (SIP; 100%) przez zmieszanie dziewięciu części pożywki o gradionym gradiencie gęstości z jedną częścią 1,5 M chlorku sodu. Rozcieńczyć SIP do 25% gęstości, dodając odpowiednią objętość HBSS (bez Ca/Mg) zawierającego 3% FCS
  5. Bufor do cytometrii przepływowej (FC): Przygotować sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) zawierającą 3% FCS

2. Przejściowa niedrożność tętnicy środkowej mózgu

UWAGA: Przejściowe zamknięcie tętnicy środkowej mózgu (MCAO) za pomocą techniki szwu śródświetlnego zostało przeprowadzone zgodnie z wcześniejszym opisem18 u 12-tygodniowych samców myszy C57BL/6.

  1. Krótko mówiąc, znieczul myszy 2,0% izofluranem w 100% tlenie. Utrzymuj temperaturę ciała na poziomie 36,5 °C ± 0,5 °C za pomocą urządzenia grzewczego sterowanego sprzężeniem zwrotnym.
  2. Po podwiązaniu tętnicy szyjnej wspólnej i tętnicy szyjnej zewnętrznej, wprowadzić standaryzowaną monofilamentkę pokrytą kauczukiem silikonowym do tętnicy szyjnej wspólnej i przesunąć ją do początku tętnicy środkowej mózgu.
  3. Po 45 minutach wyjmij filament, aby umożliwić reperfuzję. U zwierząt operowanych pozorowo należy natychmiast wycofać włókno po zamknięciu tętnicy środkowej mózgu, aby uniknąć niedokrwienia.

3. Perfuzja przezsercowa i rozwarstwienie mózgu

  1. Przygotuj perfuzyjną pompę perfuzyjną perystaltyczną, zanurzając jeden koniec rurki w lodowatym HBSS (bez Ca/Mg). Przymocuj igłę 23 G do drugiego końca rurki perfuzyjnej i włącz pompę, aby całkowicie napełnić rurkę HBSS (bez Ca/Mg).
  2. Głęboko znieczulij mysz 4% izofluranem i poddaj eutanazji przez wdychanie CO2 .
  3. Umieść mysz grzbietowo na desce preparacyjnej umieszczonej w plastikowej tacy. Rozłóż przednie i tylne łapy tak szeroko, jak to możliwe i przymocuj je do deski preparacyjnej za pomocą igieł 20 G.
  4. Chwyć skórę brzucha prostymi kleszczami o wymiarach 1 x 2 zęby i użyj ostrych nożyczek do tęczówki, aby wykonać boczne nacięcie przez powłokę i ścianę brzucha oraz odsłonić wątrobę.
  5. Podnieś mostek i naciąć przeponę ostrzem ostrych/nożyczek do tęczówki. Kontynuuj przecinanie bocznej klatki piersiowej po obu stronach w kierunku ogoniastym. Uważaj, aby nie uszkodzić płuc, serca i tętnic piersiowych.
  6. Podnieś płat skóry kleszczami i przypnij go do deski preparcyjnej. Użyj kleszczy i nożyczek z końcami, aby ostrożnie oddzielić serce od tkanki łącznej.
  7. Przytrzymaj serce kleszczami końcami i włóż końcówkę igły 23 G z dołączoną rurką perfuzyjną do wierzchołka lewej komory. Uwaga: Nie należy wprowadzać igły zbyt głęboko do lewej komory, aby uniknąć uszkodzenia przegrody międzykomorowej. W razie potrzeby przymocuj kaniulę na miejscu za pomocą prostych ostrych kleszczy.
  8. Naciąć prawy przedsionek ostrymi nożyczkami do tęczówki i natychmiast włączyć pompę (przepływ: 8 - 10 ml/min).
  9. Kontynuuj perfuzję, aż wątroba pokaże jasny kolor kawy (~30 ml HBSS). Podczas perfuzji należy ostrożnie unikać tworzenia się pęcherzyków powietrza w rurce.
  10. Odetnij głowę myszy prostymi nożyczkami chirurgicznymi tuż za czaszką. Użyj nożyczek do tęczówki, aby wykonać nacięcie w linii środkowej skóry głowy, aby odsłonić czaszkę.
  11. Umieść jedną końcówkę ostrych nożyczek tęczówki w otworze wielkim i naciąć bocznie w czaszce. Powtórz dla drugiej strony.
  12. Użyj ostrych nożyczek do tęczówki, aby ostrożnie wyciąć od tego samego wgłębienia w górę linii środkowej w kierunku nosa. Staraj się, aby koniec nożyczek był jak najbardziej powierzchowny, aby uniknąć uszkodzenia mózgu.
  13. Użyj cienkich kleszczy, aby delikatnie oderwać kości czaszki z każdej półkuli mózgu. Uwaga: Tkanka po zawale może przylegać do opon mózgowych lub czaszki; Upewnij się, że nie stracisz tkanki mózgowej z powodu nieostrożnego rozwarstwienia
  14. Podnieś mózg szpatułką i użyj ostrych nożyczek do tęczówki, aby ostrożnie wypreparować włókna nerwowe czaszki, które mocują go do czaszki. Umieść mózg w 15 ml probówce wypełnionej 10 ml HBSS (+Ca/Mg) i trzymaj go krótko na lodzie.

4. Dysocjacja tkanki mózgowej na zawiesiny pojedynczych komórek

  1. Ostrożnie usuń pień mózgu i móżdżek czystą żyletką. Użyj czystej żyletki, aby przeprowadzić półsekcję mózgu i przeciąć każdą półkulę wzdłuż płaszczyzny koronalnej na trzy części o mniej więcej równej wielkości.
  2. Zmielić wyciętą tkankę każdej półkuli przez sitko do komórek o wielkości 100 μm za pomocą końcówki tłoka strzykawki o pojemności 5 ml. Sitko do komórek należy w sposób ciągły płukać lodowatym HBSS (+Ca/Mg). Homogenizowane próbki należy przechowywać na lodzie.
  3. Wirować w temperaturze 286 x g i temperaturze 4°C przez 5 minut, ostrożnie wyrzucić supernatant. Zawiesić osad w 1 ml buforu do wytrawiania i przenieść zawiesinę do probówki o pojemności 2 ml. Inkubować zawiesinę przy powolnych, ciągłych obrotach w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
  4. Przesiać zawiesinę komórkową przez sitko o wielkości 70 μm i dokładnie przepłukać 3 ml buforu płuczącego zawierającego DNAzę, a następnie 15 ml buforu płuczącego niezawierającego DNAzy. Wirować w temperaturze 286 x g i temperaturze 18 °C przez 5 minut i odrzucić supernatant. Uwaga: Uwaga: Zastosowanie DNAzy eliminuje śluz DNA spowodowany lizą komórek, co może prowadzić do agregacji komórek zagrażających przeżyciu komórek.

5. Wirowanie w gradimencie gęstości w celu usunięcia mieliny i resztek komórek

  1. Zawiesić osad komórkowy w 5 ml pożywki o nachyleniu gęstości 25% i odpipetować zawiesinę do probówki o pojemności 15 ml. Dokładnie wymieszać, wielokrotnie i delikatnie pipetując, unikając tworzenia się pęcherzyków. Uwaga: w temperaturze pokojowej należy stosować podłoże o gradiencie gęstości, aby zapobiec zbrylaniu się komórek.
  2. Wirować przy 521 x g i temperaturze 18 °C przez 20 minut. Użyć najniższego profilu przyspieszenia wirnika i pozwolić wirnikowi zatrzymać się bez hamowania. Delikatnie wyjmij probówki z wirówki, nie potrząsając. Ostrożnie odessać płaszcz mielinowy i supernatant, zachowując osad komórkowy na dnie probówki. Uwaga: Upewnij się, że usunąłeś cały płaszcz mielinowy, ponieważ wszelkie pozostałości zakłócą analizę cytometrii przepływowej.
  3. Zawiesić osad w 10 ml buforu płuczącego niezawierającego DNAzy i odpipetować zawiesinę do nowej probówki o pojemności 15 ml. Uwaga: Ten etap mycia ma kluczowe znaczenie, ponieważ wystarczające usunięcie medium o gradiencie gęstości znacząco przyczynia się do ilości i jakości końcowej próbki komórek.
  4. Ponownie odwirować w temperaturze 286 x g i temperaturze 10 °C przez 5 minut i odrzucić supernatant. Zawiesić komórki w 100 μl buforu do płukania na zimno i określić liczbę komórek i żywotność przez wykluczenie błękitu trypanowego w hemocytometrze. Próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C i szybko je przetwarzać.

6. Barwienie przeciwciał do analizy cytometrycznej przepływowej

  1. Przed znakowaniem przeciwciałami inkubować zawiesinę komórkową w temperaturze 4 °C przez 10 minut z antymysim odczynnikiem blokującym receptor FC CD16/CD32 (końcowe stężenie 2,5 μg/ml, współczynnik rozcieńczenia 1:200), aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu.
  2. Dodać sprzężone z fluoroforem przeciwciała pierwszorzędowe o odpowiednim stężeniu (jak wskazano w tabeli 1) do zawiesiny komórek i inkubować w temperaturze 4 °C przez 20 minut w ciemności. Uwaga: Próbki kontrolne nie są barwione pierwszorzędowymi przeciwciałami, ale poza tym są traktowane tak samo.
  3. Przemyć komórki 2 ml buforu FC i odwirować w temperaturze 350 x g i temperaturze 10 °C przez 7 minut. Ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 200 μl buforu FC. Przechowywać próbki tymczasowo w temperaturze 4 °C w ciemności do czasu analizy metodą cytometrii przepływowej.

7. Bezwzględna kwantyfikacja przez liczenie koralików

  1. Odwróć pipetę 40 μl buforu FC i 10 μl zawiesiny komórek do probówki liczącej zawierającej znaną liczbę kulek fluorescencyjnych. Uwaga: Należy zwrócić uwagę, że pipety są skalibrowane tak, aby dostarczyć dokładnie 10 μl próbki, ponieważ późniejsze obliczenia liczby leukocytów odnoszą się do tej objętości.
  2. Inkubować zawiesinę komórek z przeciwciałem CD45 znakowanym FITC (końcowe stężenie 5 μg/ml, współczynnik rozcieńczenia 1:100) w temperaturze 4 °C przez 20 minut w ciemności.
  3. Odwrotnie napełnić probówkę zliczającą 200 μl buforu FC bez żadnego etapu płukania i bezpośrednio zarejestrować komórki CD45+ w cytometrze przepływowym.

8. Akwizycja cytometrii przepływowej

Uwaga: Aby przeanalizować proponowany panel przeciwciał, odpowiedni cytometr musi być wyposażony w niebieski (488 nm), czerwony (635 nm) i fioletowy (405 nm) laser oraz filtry dla FITC, PE, PerCP Cy5.5, PECy7, APC-Cy7 i AmCyan.

  1. Dostosuj rozproszenie do przodu (FSC) i na boki (SSC), używając niebarwionych komórek z półkuli niedokrwiennej. Rozróżniaj dublety od pojedynczych komórek na wykresie kropkowym pokazującym obszar i wysokość FSC.
  2. Wyświetl wszystkie pojedyncze komórki w histogramach jednoparametrowych dla każdego używanego kanału fluorescencji i dostosuj napięcia lampy fotopowielacza (PMT) tak, aby pojedyncze komórki były wyświetlane po lewej stronie histogramu.
  3. Użyj pojedynczej barwionej próbki CD45-FITC, aby sprawdzić ustawienia rozproszenia i PMT dla interesujących komórek poprzez backgowanie komóreko wysokiej odporności CD45 na każdym histogramie i wykresie punktowym. Uwaga: Dostosuj napięcia PMT FITC tak, aby można było odróżnić od siebie ogniwa ujemne, pośrednie (int) i o wysokiej ekspresji CD45.
  4. Użyj kulek kompensacyjnych wychwyconych przez przeciwciała, aby wykonać kompensację wielokolorową. Ustaw bramki dla mikrogleju (CD45int) i leukocytów (CD45 high), a następnie zdefiniuj subpopulacje leukocytów zgodnie ze strategią bramkowania przedstawioną na rysunku 1.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niedokrwienie mózgu zostało zainicjowane u 12-tygodniowych samców myszy C57BL/6 poprzez przejściowe zamknięcie włókien lewej środkowej tętnicy mózgowej (MCAO). W przypadku operacji pozorowanej włókno zostało wprowadzone w celu zamknięcia lewej tętnicy środkowej mózgu i natychmiast wycofane, aby umożliwić natychmiastową reperfuzję. Co ważne, komórkowe zapalenie nerwów różni się znacznie między powszechnie stosowanymi modelami udaru19. Należy o tym pamiętać zwłaszcza przy ekstrapolacji wyników badań na zwierzętach na niejednorodną patofizjologię udaru mózgu.

Myszy zostały poświęcone 24 godziny po MCAO, aby przeanalizować wczesną inwazję komórek odpornościowych na niedokrwiony mózg. Liczba komórek uzyskana z półkuli niedokrwiennej (MCAO ipsi; 0,95 ± 0,25 x 10E6) po wirowaniu w gradifikacji gęstości była porównywalna z liczbą komórek z półkuli przeciwnej (MCAO contra; 1,09 ± 0,30 x 10E6) i półkuli ipsilateralnej myszy operowanych pozorowo (ipsi; 1,12 ± 0,18 x 10E6, jednokierunkowa ANOVA, p = 0,524). Żywotność izolowanych komórek mierzona wykluczeniem błękitu trypanowego była wysoka i nie różniła się istotnie między grupami (pozorowane 96,85 ± 0,60%, MCAO contra 97,12 ± 1,18%, MCAO ipsi 95,68 ± 2,04%, jednokierunkowe-ANOVA, p = 0,253).

Skład nacieku mózgu 24 godziny po MCAO został określony za pomocą analizy cytometrii przepływowej. Rysunek 1 ilustruje strategię bramkowania schematycznie (A) i u reprezentatywnego zwierzęcia z udarem (B). Leukocyty naciekające mózg zdefiniowano jako komórkio wysokiej zawartości CD45, które można odróżnić od mikroglejuwewnętrznego CD45. W populacjio wysokiej zawartości CD45 neutrofile wielojądrzaste (PMN) zostały zidentyfikowane na podstawie ekspresji Ly-6G, podczas gdy limfocyty T zostały wyznaczone jako komórki CD3 +o wysokiej zawartości CD45. Pozostałe komórkio wysokiej zawartości CD45 zostały następnie wyróżnione przez CD19 (limfocyty B) i ekspresję CD11b. Frakcja CD11b+ została dalej podzielona na "monocyty zapalne" owysokiej zawartości Ly-6C i populacjęo niskiej zawartości Ly-6C, która obejmuje monocyty, komórki dendrytyczne (DC) i makrofagi.

W ostrym stadium udaru mieloidalne komórki odpornościowe dominują w mózgu infiltrując3,20. Neutrofile dostają się do mózgu szybko po zamknięciu naczynia i sprzyjają wynaczynieniu zapalnych monocytów21. Rycina 2A przedstawia procentowy wzrost neutrofili Ly6-G+ w półkuli niedokrwiennej 24 godziny po MCAO w porównaniu z półkulą przeciwległą i chirurgią pozorowaną. Natomiast odsetek limfocytów T CD3 + w półkuli niedokrwiennej jest (stosunkowo) niższy niż w zdrowym mózgu. W populacji CD11b + niedokrwienie mózgu przesuwa równowagę w kierunku silnej przewagi monocytów owysokim stanie zapalnym Ly-6C (Figura 2B).

Oprócz rozkładów względnych, do określenia bezwzględnej liczby podzbiorów komórek odpornościowych w próbkach na podstawie pozytywnych zdarzeń CD45 użyto probówek zliczających. Probówki do liczenia zawierają liofilizowany granul, który uwalnia znaną liczbę kulek fluorescencyjnych. Bezwzględną liczbę dodatnich komórek w próbce można określić, odnosząc zdarzenia komórkowe do zdarzeń kulkowych. Aby obliczyć liczbę leukocytówo wysokiej zawartości CD45 na półkulę, zastosowano następujące równanie:Wysokie komórki CD45 na półkulę = (Wysokie zdarzenia CD45 x całkowite zliczanie kulek / zdarzenia kulek próbki) x (całkowita objętość zawiesiny (100 μl)/objętość próbki (10 μl)). 24 godziny po MCAO całkowita liczba leukocytów w półkuli zawału była znacznie zwiększona w porównaniu z półkulą przeciwległą i operacją pozorowaną (ryc. 3D, jednokierunkowa ANOVA, p = 0,0004). Liczbę odrębnych podzbiorów komórek odpornościowych (PMN, limfocyty T, limfocyty B, wysokie monocyty Ly-6C iniskie Ly-6C) można łatwo obliczyć, mnożąc ich względną częstość przez całkowitąwysoką liczbę leukocytów CD45 w odpowiedniej próbce.

figure-results-1
Rysunek 1. Strategia bramkowania dla cytometrii przepływowej. (A) Schematyczna ilustracja strategii bramkowania. (B) pokazuje analizę cytometryczną przepływową leukocytów wyizolowanych z reprezentatywnego mózgu myszy 24 godziny po niedrożności tętnicy środkowej mózgu. FSC rozproszenie do przodu, wielojądrzaste neutrofile PMN, klasyczne komórki dendrytyczne cDC. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2. Różnicowanie podzbiorów komórek odpornościowych. Względna dystrybucja neutrofili Ly-6G+ (A), limfocytów T CD3 + (A) i podzbiorów monocytów zidentyfikowanych przez różnicową ekspresję Ly-6C (B) w półkuli ipsilateralnej (ipsi) i przeciwległej (przeciwnej) 24 godziny po zamknięciu tętnicy środkowej mózgu (MCAO) lub odpowiedniej operacji pozorowanej. Procent każdej populacji jest wskazany w bramie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3. Kwantyfikacja leukocytów mózgu poprzez liczenie koralików. (A) pokazuje wysoce podwójnie dodatnią bramkę koralikową. W populacji pojedynczych komórek (B) mikroglejCD45 int można odróżnić od leukocytówo wysokiej zawartości CD45 (C). W celu kwantyfikacji liczba bramkowanych zdarzeńwysokiego CD45 została znormalizowana do zliczonych zdarzeń koralików. Należy zauważyć, że całkowita liczba leukocytów (wysoka zawartość CD45) jest znacznie zwiększona w półkuli ipsilateralnej (ipsi) w porównaniu z półkulą przeciwległą (przeciwną) i chirurgią pozorowaną 24 godziny po zamknięciu tętnicy środkowej mózgu (MCAO). **p <0,01, ***p <0,001 za pomocą jednoczynnikowej ANOVA i testu wielokrotnych porównań post hoc Tukeya. n = 4 - 6 na grupę. Rozproszenie do przodu FSC. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

pkt. pkt. szt. szt. powiedział:
FluorochromFITCPEKontroler PerCPPC7APC-Cy7V500
(Cy5.5)
antygenCD45.2Płyta CD3Ly-6GPłyta CD19Ly-6CPłyta CD11b
Stężenie końcowe [μg/ml]510,20,211
Współczynnik rozcieńczenia1/1001/2001/1 0001/1 0001/2001/200
klonRozdział 104Zobacz materiał 145-2C11Pozycja 1A86D5AL-21Zobacz materiał M1/70

Tabela 1. Podstawowy koktajl przeciwciał do identyfikacji komórek odpornościowych w niedokrwionym mózgu.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu opisujemy prostą i skuteczną metodę izolacji leukocytów z mysiego mózgu po eksperymentalnym udarze. Podejście to pozwala na uzyskanie wysoce powtarzalnej liczby komórek na półkulę mózgu, co pozwala na pomiar różnych paneli przepływu w jednej próbie biologicznej.

Najwyraźniej niepełne usunięcie krwi, w tym komórek odpornościowych, spowoduje zniekształcony obraz rzeczywistej ilości komórek zapalnych, które dostały się do niedokrwionego mózgu. Dlatego podczas korzystania z tego protokołu należy zwrócić szczególną uwagę na dokładną perfuzję przezsercową, aby zapobiec zanieczyszczeniu infiltrowanych komórek odpornościowych niezapalnymi krążącymi leukocytami. Z doświadczenia wynika, że stosowanie igieł do nakłuwania lewej komory zmniejsza ryzyko uszkodzenia przegrody międzykomorowej, co ominęłoby perfuzję krążenia ogólnoustrojowego. Pojawienie się płynu perfuzyjnego z nozdrzy jest oznaką, że ciśnienie perfuzyjne jest zbyt wysokie, dlatego należy unikać natężeń przepływu >10 ml/min. Bladobiały do białego kolor tkanki mózgowej wskazuje na dobrą perfuzję, podczas gdy różowawy kolor jest oznaką słabej perfuzji.

Kolejnym krytycznym etapem tego protokołu jest skuteczna dysocjacja tkanki mózgowej, która obejmuje fragmentację mechaniczną, a także trawienie enzymatyczne. Mielenie tkanki przez sitko komórkowe ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia lepszej skuteczności proteaz. Jednak podczas homogenizacji tkanki należy unikać nadmiernego ciśnienia, ponieważ fagocyty jednojądrzaste są bardzo podatne na autolizę22. Do trawienia enzymatycznego zalecana jest Liberaza TL, która jest mieszaniną wysoko oczyszczonych kolagenaz I i II, która zawiera niskie stężenia obojętnej proteazy termolizyny. Bezpośrednie porównanie z poprzednio opisanymi protokołami izolacji14,22,23wykazało istotnie wyższy odzysk żywotnych komórek przez leczenie Liberazą TL (K.M. dane niepublikowane). W porównaniu z kolagenazą, która jest często stosowana do izolacji komórek odpornościowych z mózgu, Liberase TL zawiera znikome poziomy endotoksyn. Ma to szczególne znaczenie, jeśli komórki są sortowane do dalszej analizy, ponieważ wysoki poziom endotoksyny może zmienić stan aktywacji komórek odpornościowych24 i poważnie pogorszyć wyniki hodowli komórkowej25. Kolejną wadą tradycyjnej kolagenazy są znaczne różnice w aktywności enzymów między partiami, co zagraża odtwarzalności wyników i wymaga określenia stężenia roboczego dla każdej partii26.

W dorosłym mózgu usunięcie mieliny przez wirowanie w gradionym spadku gęstości jest niezbędnym krokiem do dalszych zastosowań, takich jak cytometria przepływowa lub dalsze badania nad ekspresją genów lub białek. Jedną z głównych zalet protokołu jest procedura zagęszczenia jednowarstwowej, która nie wymaga czasochłonnego przygotowania gradientów. Co więcej, protokół separacji daje wiarygodne wyniki, nawet jeśli jest wykonywany przez raczej niedoświadczonych eksperymentatorów. Jest pozbawiony warstwowych gradientów o gęstościach zbliżonych do siebie, które są trudne do pipetowania bez naruszania interfejsu pomiędzy nimi.

Opierając się na ekspresji markera powierzchniowego CD45, protokół daje trzy główne kategorie komórek w niedokrwionym mózgu. Zdecydowana większość komórek należy do populacji CD45 ujemnej, która składa się z komórek neuronalnych, astrogleju, komórek wyściółki i śródbłonka. Ich obfitą obecność przypisuje się jednowarstwowemu gradientowi gęstości, który ma na celu przede wszystkim skuteczne usuwanie mieliny i zanieczyszczeń. Ponadto populacjęint CD45 reprezentującą rezydenta mikrogleju27można odróżnić od populacjio wysokiej zawartości CD45, która zawiera głównie naciekające leukocyty hematogenne. Należy jednak zauważyć, że aktywowany mikroglej może przyjmować fenotyp i funkcję komórek szpikowych krwi. Tak więc tylko zastosowanie wyrafinowanych technik, takich jak parabioza28, chimery szpiku kostnego29 lub analiza mapowania losu30 , pozwala na wyraźne rozróżnienie między tymi dwiema populacjami podczas stanu zapalnego.

Analiza danych w cytometrii przepływowej jest często ograniczona do procentowego rozkładu określonych populacji komórek. Jednak porównując półkulę zawału z tkanką mózgową bez zawału, informacje te mogą być mylące, ponieważ nie uwzględniają całkowitej liczby leukocytów w mózgu, które są zmieniane przez uszkodzenie niedokrwienne. Tak więc, aby narysować pełny obraz wielkości i fenotypu nacieków zapalnych po udarze, względny rozkład podzbiorów komórek odpornościowych powinien być uzupełniony bezwzględną liczbą komórek. W przypadku stosowania mikrogranulek zgodnie z opisem w niniejszym protokole, pipetowanie dokładnej objętości próbki jest absolutnie konieczne w celu uzyskania wiarygodnych wyników. Ponadto zdecydowanie zaleca się pipetowanie odwrotne, aby uniknąć tworzenia się piany w rurce liczącej. Powstające pęcherzyki powietrza zmniejszą oczekiwaną objętość mikrogranulek, a tym samym doprowadzą do przeszacowania bezwzględnej liczby leukocytów owysokiej zawartości CD45 w próbce.

Podsumowując, protokół ten zapewnia łatwe i niezawodne podejście do izolowania komórek odpornościowych z mózgu. Może służyć jako cenne narzędzie do analizy złożoności odpowiedzi zapalnej na udar niedokrwienny. Przyszłe zastosowania obejmują badania nad zależną od czasu rolą podzbiorów monocytów w propagacji i rozwiązywaniu niedokrwiennego zapalenia mózgu. Podobnie, rola adaptacyjnego układu odpornościowego po udarze mózgu jest słabo poznana. Analiza cytometryczna przepływowa subpopulacji limfocytów T zidentyfikowanych na podstawie ekspresji czynników transkrypcyjnych specyficznych dla podzbioru lub cytokin in situ może pomóc w wyjaśnieniu ich wpływu na długoterminową rekonwalescencję po udarze, a tym samym otworzyć obiecujące możliwości rozwoju nowych podejść do leczenia.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Isabell Schulz za doskonałe wsparcie techniczne.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pompa perystaltyczna Peri-Star Pro, 4-kanałowaświatowa inkubatorPERIPRO-4LS
Heracell 240i Thermo Scientific
MACSmix Tube RotatorMiltenyi Biotec GmbH
Heraeus Multifuge 3SR+Thermo Scientific
FACS Canto IIBecton Dickinson
IsofluraneAbbott4831850
Hank's Buffered Sol Solution (HBSS)Gibco/Life Technologies GmbH14175-129
HBSS z wapniem/magnezemGibco/Life Technologies GmbH24020-091
Liberase TLRoche Diagnostics GmbH5401020001
Percoll PlusGE Healthcare Europe GmbH17-5445-01
Surowica bydlęca PAN Biotech3302-P101003
Trypan niebieskiGibco/Life Technologies GmbH15250-061
TrucountBD Biosciences340334
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiBiochrom AGL 182-10
DNAse IRoche Diagnostics GmbH11284932001
CD11b Horizon V500BD Biosciences562128
CD16/CD32eBioscience14-0161
CD45.2 FITCeBioscience11-0454
CD3 PEBiolegend100307
CD19 PE-Cy7Biolegend115519
Ly6C APC-Cy7BD Biosciences560596
Ly6G PerCP-Cy5.5BD Biosciences560602
Rurka silikonowa, 1 mŚwiatowe instrumenty precyzyjne503022
Nożyczki do cienkiej tęczówki Ostrenarzędzia do nauki14094-11
Nożyczki chirurgiczneNarzędzia do nauki14130-17
Nożyczki do cienkiej tęczówki ostre/Narzędzia do nauki14028-10
Kleszcze proste 1 x 2 zębyNarzędzia do nauki o naprawach11021-14
Kleszcze FineScience Tools11008-13
Tłok strzykawki 5 mlCarl Roth GmbH (Braun)EP96.1
Sitko do komórek, 100 &mikro; mDr. I. Schubert, BD2360-00
Omnican Strzykawka do precyzyjnego dozowania 1 mlBraunTBD
Sitko do komórek, 70 &mikro; mGreiner Bio-One GmbH542 070
Probówki FACSBD Bioscience GmbH352052
pipety serologiczne, 10 mlGreiner Bio-One GmbH607180
, 10 mlSarstedt AG& Co861,254,025
pipety serologiczne, 25 mlGreiner Bio-One GmbH760180
pipety serologiczne, 5 mlGreiner Bio-One GmbH606180
pipety serologiczne, 25 mlSarstedt AG& Co861,685,020
pipety serologiczne,5 mlSarstedt AG& Co861,253,025
Końcówki, 0,1 - 10 i mikro; lCorning B.V.Life Sciences4840
Wskazówki, 100 - 1,000 i mikro; lGreiner Bio-One GmbH740290
Wskazówki, 10 - 200 i mikro; lGreiner Bio-One GmbH739296
Probówki reakcyjne 1,5 mlGreiner Bio-One GmbH616201
Probówki reakcyjne 2 mlGreiner Bio-One GmbH623201
Bakteriologiczna szalka Petriego, 94 x 16 mmGreiner Bio-One GmbH633180
Falcon 15 mlGreiner Bio-One GmbH188271
Falcon 50 mlVWR International GmbH (BD)734-0448
Hemocytometr NeubauerBiochrom AGPDHC-N01
żyletkaCarl Roth GmbHCK07.1
CO2 Pipety serologiczne

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Courties, G., et al. Ischemic stroke activates hematopoietic bone marrow stem cells. Circulation research. 116 (3), 407-417 (2015).
  2. Iadecola, C., Anrather, J. The immunology of stroke: from mechanisms to translation. Nature medicine. 17 (7), 796-808 (2011).
  3. Möller, K., Boltze, J., Pösel, C., Seeger, J., Stahl, T., Wagner, D. -C. Sterile inflammation after permanent distal MCA occlusion in hypertensive rats. Journal of cerebral blood flow and metabolism. 34 (2), 307-315 (2014).
  4. Sughrue, M. E., Mehra, A., Connolly, E. S., D'Ambrosio, A. L., et al. Anti-adhesion molecule strategies as potential neuroprotective agents in cerebral ischemia: a critical review of the literature. Inflammation research. 53 (10), 497-508 (2004).
  5. Dimitrijevic, O. B., Stamatovic, S. M., Keep, R. F., Andjelkovic, A. V. Absence of the chemokine receptor CCR2 protects against cerebral ischemia/reperfusion injury in mice. Stroke. 38 (4), 1345-1353 (2007).
  6. Gliem, M., et al. Macrophages prevent hemorrhagic infarct transformation in murine stroke models. Annals of neurology. 71 (6), 743-752 (2012).
  7. Geissmann, F., et al. Blood monocytes: distinct subsets, how they relate to dendritic cells, and their possible roles in the regulation of T-cell responses. Immunology and cell biology. 86 (5), 398-408 (2008).
  8. Dunay, I. R., Fuchs, A., Sibley, L. D. Inflammatory monocytes but not neutrophils are necessary to control infection with Toxoplasma gondii in mice. Infection and immunity. 78 (4), 1564-1570 (2010).
  9. Hammond, M. D., et al. CCR2+ Ly6C(hi) inflammatory monocyte recruitment exacerbates acute disability following intracerebral hemorrhage. The Journal of neuroscience. 34 (11), 3901-3909 (2014).
  10. Shichita, T., et al. Pivotal role of cerebral interleukin-17-producing gammadeltaT cells in the delayed phase of ischemic brain injury. Nature medicine. 15 (8), 946-950 (2009).
  11. Liesz, A., et al. Regulatory T cells are key cerebroprotective immunomodulators in acute experimental stroke. Nature medicine. 15 (2), 192-199 (2009).
  12. Kleinschnitz, C., Wiendl, H. Con: Regulatory T cells are protective in ischemic stroke. Stroke. 44 (8), 87-88 (2013).
  13. Hu, X., Li, P., Chen, J. Pro: Regulatory T cells are protective in ischemic stroke. Stroke. 44 (8), e85-e86 (2013).
  14. Möller, K., Stahl, T., Boltze, J., Wagner, D. -C. Isolation of inflammatory cells from rat brain tissue after stroke. Experimental & translational stroke medicine. 4 (1), 20(2012).
  15. Foster, B., Prussin, C., Liu, F., Whitmire, J. K., Whitton, J. L., et al. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. Current protocols in immunology. Coligan, J. E., et al. , Chapter 6, Unit 6.24 (2007).
  16. Albu, D. I., Califano, D., Avram, D. Flow cytometry analysis of transcription factors in T lymphocytes. Methods in molecular biology. 647, Clifton, N.J. 377-390 (2010).
  17. Prinz, M., Priller, J., Sisodia, S. S., Ransohoff, R. M. Heterogeneity of CNS myeloid cells and their roles in neurodegeneration. Nature neuroscience. 14 (10), 1227-1235 (2011).
  18. Wagner, D. -C., et al. Allometric dose retranslation unveiled substantial immunological side effects of granulocyte colony-stimulating factor after stroke. Stroke. 45 (2), 623-626 (2014).
  19. Zhou, W., et al. Postischemic brain infiltration of leukocyte subpopulations differs among murine permanent and transient focal cerebral ischemia models. Brain pathology. 23 (1), Zurich, Switzerland. 34-44 (2013).
  20. Gelderblom, M., et al. Temporal and spatial dynamics of cerebral immune cell accumulation in stroke. Stroke. 40 (5), 1849-1857 (2009).
  21. Soehnlein, O., Lindbom, L. Phagocyte partnership during the onset and resolution of inflammation. Nature reviews. Immunology. 10 (6), 427-439 (2010).
  22. Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nature protocols. 1 (4), 1947-1951 (2006).
  23. Arac, A., et al. Systemic augmentation of alphaB-crystallin provides therapeutic benefit twelve hours post-stroke onset via immune modulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (32), 13287-13292 (2011).
  24. Mattern, T., et al. Endotoxin and lipid A stimulate proliferation of human T cells in the presence of autologous monocytes. Journal of immunology. 153 (7), Baltimore, Md. 2996-3004 (1950).
  25. Berney, T., et al. Endotoxin-mediated delayed islet graft function is associated with increased intra-islet cytokine production and islet cell apoptosis. Transplantation. 71 (1), 125-132 (2001).
  26. McShane, P., Sutton, R., Gray, D. W., Morris, P. J. Protease activity in pancreatic islet isolation by enzymatic digestion. Diabetes. 38, s126-s128 (1989).
  27. Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigen presentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared. Journal of immunology. 154 (9), Baltimore, Md. 4309-4321 (1950).
  28. Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., Tetzlaff, W., Rossi, F. abioM. V. Local self-renewal can sustain CNS microglia maintenance and function throughout adult life. Nature neuroscience. 10 (12), 1538-1543 (2007).
  29. Mildner, A., et al. Distinct and non-redundant roles of microglia and myeloid subsets in mouse models of Alzheimer's disease. The Journal of neuroscience. 31 (31), 11159-11171 (2011).
  30. Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), New York, N.Y. 841-845 (2010).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Izolacja kom rek odporno ciowychanaliza cytometrycznawirowanie w gradiencie g sto cidysocjacja mechanicznatrawienie enzymatycznewysoka ekspresja CD45naciek leukocytarnymetoda wykluczania b kitu trypanowegoblokowanie receptor w Fc

Powiązane artykuły