Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Monitorowanie w czasie rzeczywistym wewnątrzkomórkowej dynamiki kwasów żółciowych za pomocą genetycznie kodowanego czujnika kwasów żółciowych opartego na FRET

9.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53659

⸱

4 stycznia 2016

 ,  , 
1Tytgat Institute for Liver and Intestinal Research, Department of Gastroenterology and Hepatology, Academic Medical Center, 2Laboratory of Chemical Biology, Institute of Complex Molecular Systems (ICMS), 3Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology

W tym artykule

Podsumowanie

Dostarczamy szczegółowy protokół do badania dynamiki kwasów żółciowych w żywych komórkach za pomocą genetycznie kodowanego czujnika BAS FRET. Ten czujnik kwasu żółciowego stanowi unikalne narzędzie do badania (regulacji) transportu kwasów żółciowych i aktywacji FXR w szerokim zakresie typów komórek.

Streszczenie

Förster Resonance Energy Transfer (FRET) stał się potężnym narzędziem do monitorowania fałdowania, interakcji i lokalizacji białek w pojedynczych komórkach. Bioczujniki działające na zasadzie FRET umożliwiły wizualizację w czasie rzeczywistym subkomórkowych zdarzeń sygnalizacyjnych w żywych komórkach z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną. W tym miejscu opisujemy zastosowanie genetycznie kodowanego czujnika kwasu żółciowego (BAS), który składa się z dwóch fluoroforów połączonych z domeną wiążącą ligand receptora farnesoidu X (FXR-LBD), tworząc w ten sposób czujnik kwasów żółciowych, który może być aktywowany przez dużą liczbę gatunków kwasów żółciowych i innych (syntetycznych) ligandów FXR. Czujnik ten może być ukierunkowany na różne przedziały komórkowe, w tym jądro (NucleoBAS) i cytozol (CytoBAS), w celu lokalnego pomiaru stężenia kwasów żółciowych. Umożliwia szybkie i proste ilościowe określenie napływu komórkowych kwasów żółciowych, wypływu i subkomórkowej dystrybucji endogennych kwasów żółciowych bez konieczności znakowania znacznikami fluorescencyjnymi lub jądrami promieniowymi. Ponadto czujniki BAS FRET mogą być przydatne do monitorowania wiązania ligandów FXR. Na koniec pokazujemy, że ten bioczujnik FRET można łączyć z obrazowaniem innych spektralnie odrębnych fluoroforów. Pozwala to na połączoną analizę wewnątrzkomórkowej dynamiki kwasów żółciowych oraz i) lokalizacji i/lub obfitości interesujących białek lub ii) sygnalizacji wewnątrzkomórkowej w pojedynczej komórce.

Wprowadzenie

Förster Resonance Energy Transfer (FRET) jest szeroko stosowany do lepszego zrozumienia funkcji komórkowych w żywych komórkach z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną1. W FRET energia z wzbudzonego fluoroforu donorowego jest przenoszona do fluoroforu akceptorowego. Wydajność FRET jest silnie zależna od odległości między fluoroforem donorowym a akceptorowym oraz ich orientacji, a zatem jest czułym odczytem zmian konformacyjnych, które wpływają na te dwa fluorofory. Zjawisko to jest wykorzystywane do generowania bioczujników opartych na FRET do obrazowania małych cząsteczek. Zmiany ich stężenia mogą być monitorowane jako wzrosty/spadki stosunku intensywności emisji akceptora do donorowego fluoroforu2. Na przykład bioczujniki wapnia oparte na FRET pozwalają na szybkie i stabilne wykrywanie stężeń wolnego wapnia w żywych komórkach3. Inne zalety bioczujników opartych na FRET to obrazowanie w pojedynczych żywych komórkach, ich nieinwazyjność, zdolność do celowania w różne typy komórek i przedziały komórkowe4.

Wiele aspektów wewnątrzkomórkowej dynamiki kwasów żółciowych jest nadal słabo poznanych. Na przykład niewiele wiadomo na temat mechanizmu leżącego u podstaw regulacji sprzężonego i niesprzężonego transportu kwasów żółciowych. Istniejące techniki monitorowania tego transportu wykorzystują przede wszystkim reportery na bazie lucyferazy, znakowane radioaktywnie kwasy żółciowe lub fluorescencyjne analogi kwasów żółciowych. To ostatnie wymaga modyfikacji kwasów żółciowych, co może wpłynąć na ich właściwości. Reporterzy bazujący na lucyferazie mają słabą rozdzielczość czasową. Poza tym techniki te powodują utratę próbki i nie mają zastosowania do obrazowania w pojedynczych komórkach. W związku z tym korzystne byłoby stosowanie metod, które umożliwiają obrazowanie na żywo aktywności transportowej pojedynczych komórek za pomocą biosensorów FRET, zwłaszcza, że ma to zaletę detekcji ratiometrycznej 5,6. Podczas gdy warianty CFP/YFP tworzą najczęściej używane pary FRET, nowe strategie wykorzystujące mutacje indukujące samoasocjację mOrange i mCherry doprowadziły do rozszerzenia zestawu narzędzi FRET o nowatorskie czujniki, w tym czujnik kwasów żółciowych z przesunięciem ku czerwieni7.

Poprzednio stworzyliśmy genetycznie kodowany czujnik kwasów żółciowych FRET (BAS), który składa się z donorowego fluoroforu (cerulean) i akceptora fluoroforu (cytryny), które są połączone z domeną wiążącą ligand receptora farnezoidu X (FXR) (FXR-LBD) oraz peptydem zawierającym motywLXXLL 8. Peptyd ten wiąże się z FXR-LBD w sposób zależny od kwasów żółciowych. Po aktywacji FXR odległość między cytrynem a błękitem zmieni się z powodu zmiany konformacyjnej. W liniach komórkowych ssaków aktywacja FXR powoduje wyraźnie wykrywalny wzrost stosunku cytrynu do błękitu, podczas gdy oczyszczony czujnik działa w przeciwnym kierunku i prowadzi do zmniejszenia współczynnika FRET po aktywacji FXR. Czujnik ten (CytoBAS) umożliwia monitorowanie dynamiki cytozolowych kwasów żółciowych. Poprzez dodanie końców karboksylowych subkomórkowych motywów docelowych, konstrukt BAS może być ukierunkowany na jądro (NucleoBAS) i peroksysomy (PeroxiBAS), umożliwiając pomiary stężeń kwasów żółciowych w różnych przedziałach komórkowych. Chociaż dodanie peroksysomalnego motywu celowania nie upośledza jego reakcji na kwasy żółciowe, przepuszczalne dla komórek ligandy FXR nie indukowały żadnych zmian FRET PeroxiBAS wewnątrz peroksysomów8. Ponieważ natura tej rozbieżności jest nieznana, poniższy protokół koncentruje się na CytoBAS i NucleoBAS.

Użycie tego genetycznie kodowanego czujnika FRET zostało niedawno zademonstrowane w komórkach zawierających transportery kwasów żółciowych Na+/taurocholate kotransportujące polipeptyd (NTCP) i transporter organicznych substancji rozpuszczonych alfa/beta (OSTαβ)8. NTCP jest głównym importerem wątrobowych kwasów żółciowych, a OSTαβ jest transporterem kwasów żółciowych w jelicie podstawno-bocznym, który może funkcjonować zarówno jako importer, jak i eksporter, w zależności od elektrochemicznego gradientu stężenia kwasów żółciowych 9,10. Najnowsze dane wykazały, że po transporcie kwasów żółciowych przez NTCP i/lub OSTαβ można zaobserwować silne i szybkie odpowiedzi w stosunku FRET w wyniku interakcji ligand-FXR-LBD.

Tutaj opisujemy szczegółowe protokoły metod pomiaru FRET, takich jak konfokalna analiza mikroskopowa i sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS), podkreślamy kluczowe kroki, rozwiązujemy potencjalne problemy i omawiamy alternatywne metody. Korzystając z tego genetycznie kodowanego czujnika FRET, interakcja kwasów żółciowych z FXR-LBD może być określana ilościowo i monitorowana bezpośrednio w żywych komórkach i zapewnia szybką i prostą metodę wizualizacji transportu i dynamiki kwasów żółciowych w czasie rzeczywistym. Plazmidy ekspresyjne ssaków kodujące CytoBAS i NucleoBAS są dostępne na rynku. W związku z tym ten bioczujnik może jeszcze bardziej przyczynić się do zrozumienia transporterów kwasów żółciowych lub związków, które aktywują FXR i zapewniają głębszy wgląd w biologię i sygnalizację kwasów żółciowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Transfekcja przejściowa

Uwaga: CytoBAS i NucleoBAS (patrz Tabela Materiałów) są z powodzeniem stosowane w kilku typach komórek (U2OS, Huh7, HepG2, H69, MDCK i HEK293T komórkach). Głównym wymogiem korzystania z czujnika jest to, że musi on ulec ekspresji, co wymaga, aby kodujące DNA dostało się do komórki.

  1. Zebrać komórki z kolby o średnicy 25 cm2 w 80% zlewającej się. Rozcieńczyć komórki w kompletnej pożywce hodowlanej odpowiedniej dla określonej linii komórkowej (10% FBS, 1% L-glutamina, 1% długopis/paciorkowiec dla komórek U2OS i Huh7).
  2. Umieść komórki o pożądanej gęstości w sterylnym 8-dołkowym szkle nakrywkowym (0,8 cm2). Celuj w sub-konfluencyjną (60-80% konfluencji) warstwę komórek w dniu eksperymentu, chociaż nie jest to konieczne.
  3. Dodać kompletną pożywkę hodowlaną do końcowej objętości 400 μl na studzienkę. Pozwól komórkom dołączyć się przez 24 godziny.
  4. Przygotować mieszankę do transfekcji w sterylnej probówce, dodając 0,5 μg DNA NucleoBAS lub CytoBAS do 100 μl pożywki hodowlanej (bez surowicy/antybiotyku). Dobrze wirować. Dodaj odczynnik do transfekcji i wymieszaj przez wirowanie. Odczynniki do transfekcji, które zapewniają optymalną wydajność, są zależne od typu komórki i mogą wymagać wcześniejszych testów.
    1. Na przykład użyj 2,5 μl 1 mg/ml polietyleniminy (PEI) i inkubuj mieszaninę DNA/PEI przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Dodać mieszaninę transfekcji w kropelkach do komórek i wymieszać, delikatnie potrząsając ręcznie płytką dołka. Dodaj 100 μl mieszaniny na studzienkę o powierzchni ~9,6 cm2. Użyć 10 μl mieszaniny transfekcyjnej do indywidualnych komór obrazowania dla komórek transfekowanych przejściowo.
    Uwaga: Po 24-48 godzinach komórki wyrażają czujnik kwasów żółciowych i mogą być używane do eksperymentów.

2. Stabilna transfekcja

  1. Zebrać komórki z kolby o średnicy 25 cm2 w 80% zlewającej się. Rozcieńczyć osad w kompletnej pożywce hodowlanej odpowiedniej dla określonej linii komórkowej (10% płodowej surowicy bydlęcej, 1% L-glutaminy, 1% pióra/paciorkowca dla komórek U2OS i Huh7) do stężenia 150 000 komórek na ml i dodać około 300 000 komórek na basenik do 6-dołkowej płytki hodowlanej (2 ml objętości końcowej).
  2. Pozwól komórkom dołączyć się przez 24 godziny.
  3. Przygotować mieszaninę do transfekcji w sterylnej probówce, dodając 0,5 μg DNA CytoBAS lub NucleoBAS (patrz tabela materiałów) do 100 μl pożywki hodowlanej (bez surowicy/antybiotyku). Dobrze wirować. Dodaj odczynnik do transfekcji i wymieszaj przez wirowanie.
    1. Na przykład użyj 2,5 μl 1 mg/ml polietyleniminy (PEI) i inkubuj mieszaninę DNA/PEI przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Dodać 100 μl mieszaniny transfekcji w kropelkach do komórek i wymieszać, delikatnie potrząsając ręcznie płytką dołka. Zawsze dołączaj nietransfekowaną kontrolę podczas tworzenia stabilnej linii komórkowej.
  5. Hodować komórki O/N w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  6. Trypsynizować komórki zgodnie z protokołem producenta (inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 1,5 ml wstępnie podgrzanej trypsyny na 25 cm2 hodowli komórkowej) i wirować je w temperaturze 250 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 13 ml kompletnej pożywki hodowlanej. Podziel komórki na różnych szalkach hodowlanych o średnicy 10 cm: 0,5 ml (niska gęstość), 1,5 ml (średnia gęstość) i 4,5 ml (wysoka gęstość). Zrób to samo dla pozostałych 6,5 ml.
  7. Dodać pożywkę hodowlaną do końcowej objętości 10 ml. W przypadku komórek U2OS użyj 800 μg / ml G418 dla plazmidów z kasetą oporności na neomycynę, takich jak konstrukty CytoBAS i NucleoBAS, aby wybrać komórki dodatnie. Stężenie to jest zależne od typu komórki i można je określić, wybierając najniższe stężenie antybiotyku (G418), w którym nietransfekowane komórki umierały w ciągu 2 do 10 dni (800 μg/ml G418 dla komórek U2OS).
  8. Odświeżać pożywkę hodowlaną odpowiednim antybiotykiem (G418) co 72 godziny, aż nietransfekowane komórki będą martwe.
  9. Zbadaj płytkę hodowlaną pod mikroskopem z obiektywem 20X dla dodatnich kolonii (fluorescencję można monitorować przy użyciu większości zestawów filtrów używanych do fluorescencji zielonej, cyjanowej lub żółtej).
  10. Zaznacz dodatnie kolonie, które leżą odizolowane od innych kolonii, długopisem na zewnętrznym dnie szalki hodowlanej.
  11. Umyć płytkę dwukrotnie roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i odessać. Weź około 15 sterylnych cylindrów do klonowania i zanurz je w sterylnym silikonie. Zastosuj je wokół wybranych kolonii, lekko dociskając szalkę Petriego i upewnij się, że w pierścieniu klonowania nie znajduje się więcej niż jedna kolonia.
  12. Odmierzyć pipetę 20 μl wstępnie podgrzanej trypsyny (1x, 0,25%) do cylindra klonującego i inkubować w temperaturze 37 °C, aż większość komórek się zaokrągli (obserwować pod mikroskopem).
  13. Dodać 150 μl pożywki hodowlanej z surowicą i odpowiednim antybiotykiem (10% FBS i 800 μg/ml G418 dla komórek U2OS i Huh7) do cylindra klonującego i kilkakrotnie pipetować w górę i w dół w celu ponownego zawieszenia komórek i przeniesienia na płytkę 96-dołkową. Odśwież pożywkę po 4-24 godzinach i pozwól komórkom rosnąć zlewając się w ciągu najbliższych kilku dni (37 °C, 5% CO2dla komórek U2OS i Huh7).
  14. Odświeżaj podłoże antybiotykiem co 3 lub 4 dni. Gdy komórki zaczną się zlewać, przenieś je na większą płytkę dołka. Powtarzaj ten krok, aż kultura będzie wystarczająco duża do eksperymentów. Kriokonserwować niektóre fiolki do tworzenia kopii zapasowych. Pożywka do krioprezerwacji składa się z 20% FBS i 20% DMSO w pożywce (DMEM) bez dodatków.
    Uwaga: Teraz linia komórkowa jest monoklonalna i uważana za stabilną do ekspresji czujnika kwasu żółciowego. Połowa stężenia antybiotyku G418 (400 μg/ml) jest teraz wystarczająca do utrzymania ekspresji w stabilnej linii komórkowej.

3. Transdukcja lentiwirusowa

Uwaga: Niektóre linie komórkowe są uważane za trudne do transfekcji bardziej tradycyjnymi metodami, takimi jak metoda polietyleninowa (PEI). Transdukcja wirusowa komórek jest skutecznym alternatywnym narzędziem do dostarczania genów i stabilnej ekspresji transgenu.

  1. Zebrać komórki z kolby o średnicy 25 cm2 w 80% zlewającej się. Rozcieńczyć komórki w kompletnej pożywce hodowlanej odpowiedniej dla określonej linii komórkowej (10% FBS, 1% L-glutamina, 1% pen/strep dla komórek U2OS i Huh7) i dodać około 200 000 komórek na studzienkę do 6-dołkowej płytki hodowlanej.
  2. Dodać pożywkę do końcowej objętości 2 ml na studzienkę. Pozwól komórkom dołączyć się przez 24 godziny.
  3. Przeprowadzić transdukcje wirusowe poprzez inkubację komórek przez 4-6 godzin z 500 μl pożywki zawierającej lentiwirusa CytoBAS (dostępnej na żądanie) wypełnionej do całkowitej ilości 1 ml kompletną pożywką hodowlaną zawierającą 10 μg/ml dietyloaminoetylu (DEAE)-dekstranu lub innego wzmacniacza transdukcji lentiwirusowej. Nie zapomnij dołączyć studni z nietransdukowanymi komórkami kontrolnymi.
  4. Usunąć pożywkę i dodać 2 ml kompletnej pożywki hodowlanej zawierającej żądany antybiotyk (500 μg/ml higromycyny). Użyj konstruktu lentiwirusowego do transdukcji CytoBAS, który zapewnia komórkom oporność na higromycynę. Hoduj komórki w pożądanych warunkach.
  5. Odświeżaj pożywkę antybiotykiem (500 μg/ml higromycyny) co 3 dni i dziel komórki, gdy zlewają się w 80%, aż wszystkie komórki kontroli ujemnej umrą (trwa to około 1-2 tygodni w przypadku większości linii komórkowych). Linia komórkowa jest teraz uważana za stabilną do ekspresji czujnika kwasu żółciowego.
    1. Alternatywnie, użyj komórek do eksperymentów 1-3 dni po transdukcji wirusa. Ponieważ żywy wirus może być obecny, wymaga to sprzętu do odczytu FRET w pomieszczeniach o odpowiednim poziomie bezpieczeństwa.
  6. Alternatywnie, w celu szybkiej izolacji stabilnych linii komórkowych, należy przeprowadzić sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS).
    1. Zebrać komórki z zlewającej się kolby o średnicy 160 cm2
      2. .
    2. Rozcieńczyć komórki w pożywce Leibovitz (pożywka L-15) w surowicy <5% do stężenia maksymalnie 5 x 106 komórek na ml
    3. W celu pobrania posortowanych komórek należy napełnić probówki FACS 1 ml pożywki zbiorczej (pożywka L-15 + 1,5% wstrzykiwacza/paciorkowca, 1% L-glut i 20% surowicy).
    4. Sortuj komórki pod kątem cytrynu (520-580 nm) lub ceruleanu (450-520 nm), wzbudzane laserem 405.
    5. Po posortowaniu około 500 000 komórek, odwirować komórki (5 min, 250 x g) i ponownie zawiesić je w 5 ml normalnej kompletnej pożywki hodowlanej (10% FBS, 250 μg/ml higromycyny dla komórek CytoBAS U2OS i Huh7) i umieścić je w kolbie hodowlanej T25. Hoduj komórki w pożądanych warunkach (37 °C, 5% CO2 dla komórek U2OS i Huh7).

4. Obrazowanie żywych komórek czujnika kwasów żółciowych

Uwaga: Komórki zawierające transportery kwasów żółciowych mogą być hodowane w pożywce z 1-10% surowicą filtrowaną węglem drzewnym, która usuwa związki lipofilowe. Normalna surowica często zawiera kwasy żółciowe, które mogą prowadzić do wewnątrzkomórkowego gromadzenia się kwasów żółciowych i wysycenia czujnika kwasów żółciowych.

  1. Pomiary FRET za pomocą mikroskopu konfokalnego
    1. Umieść komórki stabilnie lub przejściowo, wyrażając czujnik z pożądaną gęstością, w sterylnym 8-dołkowym szkiełku nakrywkowym z dnem komory (0,8 cm2). Hoduj komórki w kompletnej pożywce hodowlanej (przy użyciu surowicy filtrowanej węglem drzewnym) tak, aby w dniu eksperymentu konfluencja wynosiła około 60-70%.
    2. Umyj przylegające komórki w szkiełku komorowym za pomocą 200 μl 1x PBS lub pożywki L-15 firmy Leibovitz.
    3. Odessać i zastąpić 300 μl pożywki L-15 firmy Leibovitz, tak aby nie była konieczna kontrola CO2.
      Uwaga: Można również stosować DMEM bez czerwieni fenolowej, ale wymaga warunków buforowania CO2. Czujnik kwasów żółciowych wykazuje (pewną) wrażliwość pH, więc staraj się utrzymać stałe pH podczas zbierania danych.
    4. Rozcieńczyć związki, które mają być użyte w doświadczeniu obrazowania konfokalnego, również w pożywce L-15. Należy wziąć pod uwagę, że podczas obrazowania należy dodać stosunkowo duże ilości cieczy w komorach, aby zapewnić szybkie wymieszanie próbki (50-100 μl), dlatego należy wykonać 3-5 razy roztwory.
    5. Uruchom oprogramowanie do obrazowania mikroskopu konfokalnego z komorą inkubacyjną o temperaturze 37 °C i włącz fioletowy laser o długości fali 405 nm. Nałóż kroplę olejku immersyjnego na obiektyw i umieść na nim 8-komorową komorę. Do obrazowania pojedynczych komórek FRET należy użyć obiektywu olejowego 63X. Czujnik został z powodzeniem użyty w RT, ale zachowanie komórki może ulec zmianie.
    6. Ustaw prawidłowo ustawienia mikroskopu konfokalnego.
      1. Ustaw tryb akwizycji: xyt (obrazowanie poklatkowe pojedynczej płaszczyzny ogniskowej).
      2. Pobieraj obrazy w odstępach 20 sekund, aby umożliwić dodawanie związków między akwizycjami bez przerywania eksperymentu.
      3. Ustawiony zakres spektralny dla detekcji emisji: Cerulean: 450-520 nm; Cytryn: 520-580 nm.
    7. Skoncentruj się na warstwie pojedynczej komórki za pomocą światła transilluminacyjnego. Rozpocznij obrazowanie i dokładniej dostosuj pozycję z. Dostosuj wzmocnienie i przesunięcie dla każdego kanału, aby odróżnić sygnał od tła, pozostając znacznie poniżej nasycenia dla wszystkich pikseli w interesujących komórkach.
    8. Narysuj okręgi, aby zdefiniować obszar zainteresowania (ROI). Wybierz komórki, które wykazują podobną intensywność fluorescencji. Unikaj komórek, które w oczywisty sposób różnią się od przeciętnej komórki rozmiarem i kształtem. Wystaw ogniwa na działanie światła przez jak najkrótszy czas, aby zminimalizować fotowybielanie czujnika. Wskazane jest narysowanie ROI niezbyt blisko obwodu komórki. Obszar ten jest najbardziej wrażliwy na zmiany intensywności fluorescencji spowodowane dryftem ogniskowym (komórki poruszające się w kierunku z), co utrudnia monitorowanie zmian współczynnika fluorescencji podczas eksperymentu.
    9. Rozpocznij pomiary za pomocą mikroskopu konfokalnego. Poczekaj, aż fluorescencja błękitu i cytrynu ustabilizuje się.
    10. Dodaj 50-100 μl kwasów żółciowych lub innych związków w wybranych punktach czasowych podczas pomiaru. Stosunkowo duże ilości płynu (od jednej piątej do jednej trzeciej końcowej objętości) są niezbędne do dobrego wymieszania płynów (w ciągu 10 sekund) bez potrząsania/pipetowania w górę iw dół. Upewnij się, że nie dotykasz końcówką pipety krawędzi komory 8-dołkowej i powoli dodawaj płyn, aby komórki nie straciły ostrości. Nie dodawaj nowych związków przed osiągnięciem fazy plateau. Trwa to około 200 sekund.
    11. Zakończ każdy eksperyment dodaniem 100 μl GW4064, końcowe stężenie 5-10 μM (dawka nasycona czujnikiem) i poczekaj, aż fluorescencja czujnika ustabilizuje się.
    12. Zapisz eksperyment i wyeksportuj dane jako plik .AVI.
    13. Otwórz w ImageJ oba pliki AVI (kanał 00, cerulean; kanał 01, cytryn), wybierając Plugins > Stacks > Stack interleaver. Alternatywnie, zaimportuj plik konfokalny (np. pliki .lsm lub .lif) bezpośrednio do Image J za pomocą odpowiednich wtyczek (dostępnych pod adresem http://www.openmicroscopy.org) i przejdź do kroku 4.1.14.
      1. Dla stosu 1: użyj kanału 01 (cytryn).
      2. Dla stosu 2: użyj kanału 00 (cerulean).
    14. Kliknij Edytuj > Wybór > Dodaj do menedżera, aby otworzyć okno menedżera ROI. Zaznacz pole wyboru "Pokaż wszystko".
    15. Narysuj kilka obszarów zainteresowania (ROI) pokrywających określone komórki za pomocą narzędzia do zaznaczania owalu. Narysuj także jeden okrąg w obszarze poza komórkami lub wewnątrz komórki, która nie wyraża czujnika, aby określić sygnał tła. Wskazane jest rysowanie ROI niezbyt blisko obwodu komórki w eksperymentach, gdy zmiany intensywności fluorescencji spowodowane dryftem ogniskowym (komórki poruszające się w kierunku z) lub migracją komórek były oczywiste.
    16. Zaznacz jedną komórkę. Kliknij Plugins > Ratio Profiler. Spowoduje to powstanie 3 ekranów: RAW, ratio i Ratio_Profile. Okno RAW pokazuje wzrost intensywności cytrynu (niebieska linia) i spadek błękitu (czerwona linia), jeśli występuje FRET. Okno Stosunek zawiera informacje o stosunku cytryn/cerulean, który będzie wzrastał wraz ze wzrostem FRET. Okienko Ratio_Profile podaje rzeczywiste liczby intensywności fluorescencji zmierzone w obu kanałach. Jeśli używane są pliki specyficzne dla konfiguracji mikroskopu (np. .lsm lub .lif zamiast .avi), kolejność kanałów może być odwrócona.
    17. Skopiuj dane z okna Ratio_Profile w dołączonym arkuszu kalkulacyjnym jako dane uzupełniające. Zrób to samo dla wszystkich innych komórek (i ROI w tle).
      Uwaga: W arkuszu kalkulacyjnym online wszystkie dane są znormalizowane do stanu, przy którym oczekiwana jest maksymalna aktywacja BAS. Biorąc pod uwagę, że GW4064 jest najsilniejszym aktywatorem FXR, współczynnik fluorescencji po inkubacji z nadwyżką GW4064 jest ustawiony na 1. Dlatego ważne jest, aby zakończyć wszystkie eksperymenty dodaniem GW4064. Zaletą tego rozwiązania jest to, że dane nie są już zależne od intensywności lasera lub wzmocnienia detektora, a eksperymenty z różnych dni można łatwiej porównywać. Ponadto na dolnym wykresie arkusza kalkulacyjnego można użyć średniej bieżącej do wygładzenia krzywych dla szumu eksperymentalnego. Nie należy jednak używać tego wykresu podczas analizowania danych kinetycznych, ponieważ średnia bieżąca wygładzi również szybkie odpowiedzi kinetyczne.
  2. Pomiary FRET przy użyciu sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS)
    1. Rozcieńczyć wszystkie związki do eksperymentu FACS w sterylnym buforze wychwytowym FACS (0,3 mM EDTA, 0,5% BSA, 0,01% NaN3i 10 mM D-glukozy).
    2. Zebrać komórki z 80% zlewającej się kolby do hodowli komórek T-160 cm2 przy użyciu 5 mM EDTA w PBS. Odwirować komórki przy 250 x g przez 5 min. Przemyć osad komórkowy 2x w 5 ml buforu wychwytowego FACS w temperaturze pokojowej.
    3. Policz komórki za pomocą licznika redlic lub komory liczącej.
    4. Rozcieńczyć osad w buforze wychwytowym FACS do stężenia 1 x 106 komórek/ml. Pipetować w górę i w dół, aby uzyskać jednorodną zawiesinę pojedynczych komórek. Jeśli komórki są trudne do dezagregacji, przed sortowaniem należy przepuścić próbki przez sitko do komórek, aby zminimalizować zatkanie dysz.
    5. Odpipetuj 200 μl komórek na probówkę FACS i chroń je przed światłem.
    6. Dodać pożądane stężenie związku (np. kwasy żółciowe, syntetyczne ligandy FXR, inhibitory transportera). Wir. Inkubować przez 20-30 minut w temperaturze pokojowej, wstrząsając (w ciemności).
    7. W międzyczasie uruchom FACS (lasery potrzebują czasu na rozgrzanie).
    8. Ustawić parametry bramkowania cytometrii przepływowej dla eksperymentu (patrz rysunek 3):
      1. Załaduj około 100 000-200 000 komórek transfekowanych NucleoBAS lub CytoBAS, aby określić bramki.
      2. Najpierw dostosuj napięcia FSC i SSC, aby wykreślić komórki w środku wykresu.
      3. Za pomocą fioletowego lasera dostosuj wartość napięcia błękitnego (450/40 nm) i napięcia cytrynu (525/20 nm) i upewnij się, że wszystkie dodatnie komórki NucleoBAS lub CytoBAS są wykreślone na wykresie punktowym.
      4. Ustaw odpowiednie bramki (od bramki P1 do bramki P4), patrz rysunek 4.
        1. Użyj bramki P1, aby wykluczyć martwe komórki, zwykle wyświetlane w lewym dolnym rogu, wybierając główną populację w środku wykresu SSC-A/FSC-A.
        2. Użyj bramki P2 w oknie FSC-H/FSC-A, aby usunąć duplikaty z analizy. Pojedyncze komórki są przedstawione w bardziej ukośnej linii niż dublety.
        3. Bramka P3 w oknie cytrynu (525/20 nm)/błękitu (450/40 nm) może być wykorzystana do selekcji komórek dodatnich NucleoBAS/CytoBAS, poprzez bramkowanie cytrynu i cerulean high cells, populacji wyświetlanej po przekątnej w prawym górnym rogu wykresu.
        4. Narysuj bramkę P4 w lewym górnym rogu populacji, jak najbliżej i upewnij się, że nie więcej niż 5% komórek znajduje się w tej bramce.
      5. Załaduj kilka nietransfekowanych komórek (brak ekspresji CytoBAS lub NucleoBAS), aby określić autofluorescencję. Populacja nietransfekowana nie może znajdować się w bramce P3. W razie potrzeby dostosuj bramkę P3, aby wykluczyć komórki autofluorescencyjne.
    9. Zwiruj próbki przed umieszczeniem probówek w FACS. Dla każdej próbki zmierz co najmniej 10 000 komórek w bramce P3.
      Uwaga: Okno Hierarchia populacji zawiera liczbę zdarzeń wyświetlanych dla każdej bramy i % bramy nadrzędnej. W bramce 4 % komórek macierzystych stanów o zwiększonym stosunku cytrynu do błękitu jako procent wszystkich komórek NucleoBAS dodatnich.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przedstawiony sensor FRET-BAS opiera się na domenie wiążącej ligand receptora FXR (LBD-FXR) połączonej z dwoma fluoroforami (cytryną i ceruleanem) oraz motywem LXXLL. Sensor ten umożliwia badanie transportu kwasów żółciowych w żywych komórkach z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową (Rysunek 1A). W celu promowania tworzenia kompleksu wewnątrzmolekularnego zastosowano mutacje w ceruleanie i cytrynie (Rysunek

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół stosowania nowatorskiego, genetycznie kodowanego czujnika kwasów żółciowych, zdolnego do monitorowania czasoprzestrzennej dynamiki transportu kwasów żółciowych w żywych komórkach. Ten bioczujnik składa się z białek fluorescencyjnych ceruleanu i cytrynu, które są połączone z FXR-LBD, tworząc w ten sposób czujnik kwasów żółciowych (BAS) na bazie FRET.

Czujnik kwasu żółciowego jest stosunkowo prosty i wygodny w użyciu, gdy masz podstawowe doświadcz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty startowe ERC (ERC-2011-StG 280255 i ERC-2013-StG 337479) oraz przez Holenderską Organizację Badań i Rozwoju Zdrowia (Vidi 91713319).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
CytoBAS Addgene62860
NucleoBAS Addgene62861
Zmodyfikowana pożywka Eagles firmy Dulbecco (DMEM)LonzaBE12-614FWysoka glukoza bez L-glutaminy
Penicylina-Streptomycyna (długopis/paciorkowiec)Lonza17-602E
L-glutamina (200mM)Lonza17-605E
Surowica bydlęca płodu (FBS)Invitrogen102-70
Trypsyna-EDTA (10x)LonzaCC-5012
Kolba do hodowli komórkowych T-25VWR international392-0253z powłoką lamininową
VWR international392-0238z powłoką lamininową
VWR international734-022910 cm pokryte poli-L-lizyną i laminą
VWR international392-0243Powlekane laminą
Dietyloaminoetylo (DEAE) - DekstranSigma-AldrichD9885
Polietylenimina (PEI) Brunschwig23966-2
G418 (genetycyna) 50 mg/mlInvitrogen10131-027
Hygromycyna B, 50 mg/mlInvitrogen10687-010
Cylinder do klonowania (6 x 8 mm)Bellco2090-00608
L-15 Pożywka hodowlana LeibovitzInvitrogen21083-027Bez czerwieni fenolowej
Polistyren okrągłodenna probówka (5 ml) Probówka FacsFalcon BD352008Bez nakrętki, niesterylne
Falcon 2 063 probówki (5 ml)Falcon BD352063Zakrętka, sterylna
Szkło nakrywkowe Nunc Lab-Tek 8dołków Thermo scientific155409Sterylne
FBS Life filtrowane węglem drzewnym12676011
GW4064Sigma-AldrichG5172
TCDCASigma-AldrichT6260
CDCASigma-AldrichC9377
Inne chemikaliaSigma-Aldrichn.v.t.
Kolba do hodowli komórkowych T-175 Płytka 6-dołkowa Naczynie technologie

Bibliografia

  1. Aoki, K., Kamioka, Y., Matsuda, M. Fluorescence resonance energy transfer imaging of cell signaling from in vitro to in vivo: basis of biosensor construction, live imaging, and image processing. Dev. Growth Differ. 55 (4), 515-522 (2013).
  2. Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. FRET imaging. Nature Biotechnol. 21 (11), 1387-1395 (2003).
  3. Mank, M., et al. A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change. Biophys. J. 90 (5), 1790-1796 (2006).
  4. Li, I. T., Pham, E., Truong, K. Protein biosensors based on the principle of fluorescence resonance energy transfer for monitoring cellular dynamics. J. Biotechnol. Lett. 28 (24), 1971-1982 (2006).
  5. Stephens, D. J., Allan, V. J. Light microscopy techniques for live cell imaging. Science. 300 (5616), 82-86 (2003).
  6. Merkx, M., Golynskiy, M. V., Lindenburg, L. H., Vinkenborg, J. L. Rational design of FRET sensor proteins based on mutually exclusive domain interactions. Biochem. Soc. Trans. 41 (5), 1201-1205 (2013).
  7. Lindenburg, L. H., et al. Quantifying Stickiness: Thermodynamic Characterization of Intramolecular Domain Interactions To Guide the Design of Förster Resonance Energy Transfer Sensors. Biochem. 53 (40), 6370-6381 (2014).
  8. van der Velden, L. M., et al. Monitoring bile acid transport in single living cells using a genetically encoded Förster resonance energy transfer sensor. J. Hepatol. 57 (2), 740-752 (2013).
  9. Dawson, P. A., et al. The heteromeric organic solute transporter α-β, Ostα-Ostβ, is an ileal basolateral bile acid transporter. J. Biol. Chem. 280 (8), 6960-6968 (2005).
  10. Meier, P. J., Stieger, B. Bile salt transporters. Annu. Rev. Physiol. 64 (1), 635-661 (2002).
  11. Klarenbeek, J. B., Goedhart, J., Hink, M. A., Gadella, T. W., Jalink, K. A mTurquoise-based cAMP sensor for both FLIM and ratiometric read-out has improved dynamic range. PLoS One. 6 (4), e19170(2011).
  12. Wallrabe, H., Periasamy, A. Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy. Curr. Opin Biotechnol. 16 (1), 19-27 (2005).
  13. Plass, J. R., et al. Farnesoid X receptor and bile salts are involved in transcriptional regulation of the gene encoding the human bile salt export pump. J. Hepatol. 35 (3), 589-596 (2002).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Obrazowanie FRETsensor kodowany genetyczniewiązanie ligandu do FXRmikroskopia konfokalnaobrazowanie żywych komórekFRET Cerulean Citrinelokalizacja subkomórkowatransport kwasów żółciowych
Monitorowanie w czasie rzeczywistym wewnątrzkomórkowej dynamiki kwasów żółciowych za pomocą genetycznie kodowanego czujnika kwasów żółciowych opartego na FRET
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.