Artykuł metodologiczny

Izolacja i analiza cytometryczna przepływowa jednojądrzastych komórek krwi obwodowej naciekających glejaka

DOI:

10.3791/53676

⸱

28 listopada 2015

 ,  , 
1Department of Neurosurgery, University of Michigan, 2Department of Cell and Developmental Biology, University of Michigan

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiona tutaj jest prosta metoda izolacji i analizy metodą cytometrii przepływowej komórek jednojądrzastych krwi obwodowej naciekającej glejak, która dostarcza zależnych od czasu danych ilościowych na temat liczby i statusu aktywacji komórek odpornościowych wchodzących do wczesnego mikrośrodowiska guza mózgu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nasze laboratorium niedawno wykazało, że komórki NK są zdolne do wyeliminowania złośliwych glejaków złośliwych myszy GL26 i szczurzego CNS-1 wszczepionych ortotopowo wkrótce po wszczepieniu wewnątrzczaszkowym, jeśli komórki rakowe mają niedobór ekspresji lektyny wiążącej β-galaktozyd, galektyny-1 (gal-1). Nowsze badania pokazują, że populacja komórek szpikowych Gr-1+/CD11b+ ma kluczowe znaczenie dla tego efektu. Aby lepiej zrozumieć mechanizmy, za pomocą których NK i komórki szpikowe współpracują w celu odrzucenia guza z niedoborem gal-1, opracowaliśmy kompleksowy protokół izolacji i analizy komórek jednojądrzastych krwi obwodowej naciekających glejaka (PBMC). Metodę zademonstrowano tutaj, porównując naciekanie PBMC do mikrośrodowiska guza glejaków GL26 z ekspresją gal-1 z tymi, u których występuje niedobór gal-1 poprzez knockdown shRNA. Protokół rozpoczyna się od opisu, w jaki sposób hodować i przygotowywać komórki GL26 do inokulacji w syngenicznym mózgu myszy C57BL/6J. Następnie wyjaśniono etapy związane z izolacją i analizą cytometryczną przepływową PBMC naciekających glejaka z wczesnego mikrośrodowiska guza mózgu. Metodę tę można dostosować do wielu projektów eksperymentalnych in vivo, w których wymagane są dane czasowe dotyczące infiltracji immunologicznej do mózgu. Metoda jest czuła i wysoce powtarzalna, ponieważ PBMC naciekające glejaka można wyizolować z guzów wewnątrzczaszkowych już po 24 godzinach od wszczepienia guza z podobną liczbą komórek obserwowaną na podstawie guzów dopasowanych do punktu czasowego w niezależnych eksperymentach. Pojedynczy eksperymentator może wykonać metodę od pobrania mózgu do analizy cytometrycznej przepływowej PBMC naciekających glejaka w ciągu około 4-6 godzin, w zależności od liczby próbek do analizy. Alternatywne modele glejaka i/lub przeciwciała wykrywające specyficzne dla komórki mogą być również stosowane według uznania eksperymentatorów do oceny infiltracji kilku innych typów komórek odpornościowych będących przedmiotem zainteresowania bez potrzeby wprowadzania zmian w całej procedurze.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Glejaki to klasa neuroepitelialnych nowotworów mózgu powstałych w wyniku transformacji gleju w obrębie ośrodkowego układu nerwowego (OUN). Spośród wszystkich glejaków, glejak IV stopnia Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) lub glejak wielopostaciowy (GBM) jest najczęstszy i śmiertelny1. GBM jest wysoce oporny na leczenie w stosunku do obecnego standardu leczenia, który składa się z resekcji guza w miarę możliwości, a następnie radioterapii oraz jednoczesnej i uzupełniającej chemioterapii temozolomidem2. Te śmiertelne nowotwory wiążą się z ponurą prognozą przeżycia wynoszącą zaledwie 15-18 miesięcy od momentu wstępnej diagnozy, przy czym tylko 5% pacjentów przeżywa chorobę po 5 latach3.

Obecność bariery krew-mózg (BBB), brak profesjonalnych komórek prezentujących antygen (APC) oraz wcześniej niezidentyfikowane istnienie bona fide struktur limfatycznychw mózgu4 doprowadziły do uznania GBM za uprzywilejowany immunologicznie. Jednak liczne badania pokazują obecnie, że te nowotwory mózgu rzeczywiście powodują rekrutację obwodowych komórek odpornościowych, które są głównie pochodzenia szpikowego, w tym monocytów, makrofagów i komórek supresorowych pochodzenia mieloidalnego (MDSC)5. GBM wpływa również na aktywność mikrogleju rezydującego w mózgu, stając się pronowotworowym6,7. Komórki limfoidalne, takiejak limfocyty T CD8 + 8 i komórki NK CD56 + 9 są również obecne w mikrośrodowisku guza, ale w znacznie mniejszej liczbie, co uważa się za spowodowane funkcją immunosupresyjną wywołaną przez czynniki pochodzące z glejaka na makrofagach związanych z nowotworem (TAM)10. Limfocyty T CD4 + są również obecne w GBM, ale duża część tej populacji wykazuje również ekspresję CD25 i FoxP3, twórców immunosupresyjnych komórek regulatorowych T (T reg)11. Ogólny stan immunosupresyjny GBM kończy się promowaniem ucieczki immunologicznej i progresji guza12.

Lepsze zrozumienie mechanizmów immunosupresji GBM jest kluczowe dla rozwoju skutecznych strategii immunoterapeutycznych mających na celu stymulację układu odpornościowego przeciwko nowotworowi. W ciągu ostatnich 15 lat nasze laboratorium pracowało nad przezwyciężeniem mechanizmów immunosupresynu guza mózgu w celu opracowania skutecznych nowych immunoterapeutyków anty-GBM13-19. Kulminacja tych prac doprowadziła do przeprowadzenia badania klinicznego mającego na celu ocenę skojarzonego leku cytotoksycznego i immunostymulującego u pacjentów z nowo zdiagnozowanym GBM (ClinicalTrials.gov Identifier: NCT01811992).

Nasza najnowsza praca pokazuje, że mysie komórki GL26 i szczurzego OUN-1 GBM blokują przeciwnowotworowy nadzór immunologiczny komórek NK poprzez wytwarzanie dużych ilości wiążącej β-galaktozydy lektyny galektyny-1 (gal-1)20. Wykazano to poprzez hamowanie ekspresji gal-1 w komórkach glejaka za pomocą knockdownu genu za pośrednictwem shRNA. Eksperymenty in vitro wykazały, że komórki glejaka z niedoborem gal-1 proliferowały normalnie w hodowli, ale uległy szybkiemu odrzuceniu wkrótce po wszczepieniu wewnątrzczaszkowym syngenicznym myszom C57BL / 6J lub RAG1 / /, ustalając w ten sposób niezależność limfocytów T lub B od tej formy odrzucenia guza. Zubożenie odporności komórek NK za pomocą surowicy anty-asialo GM1 lub monoklonalnych przeciwciał NK1.1 doprowadziło do całkowitego przywrócenia wzrostu glejaka z niedoborem gal-1 wewnątrzczaszkowego, ustalając rolę komórek NK w odrzuceniu glejaka z niedoborem gal-1. Pokazujemy teraz, że zubożenie odporności komórek szpikowych Gr-1 + / CD11b + jest wystarczające, aby zapobiec odrzuceniu glejaka z niedoborem gal-1 pomimo obecności komórek NK, ujawniając w ten sposób nieodzowną rolę pomocniczą komórek szpikowych we wspomaganiu lizy guza z niedoborem gal-1 za pośrednictwem NK (dane niepublikowane). Ten nieoczekiwany wynik skłonił nas do opracowania kompleksowego protokołu izolacji i analizy komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC), które infiltrują mikrośrodowisko guza mózgu wkrótce po wszczepieniu wewnątrzczaszkowym, abyśmy mogli lepiej scharakteryzować zdarzenia naciekania immunologicznego, które wskazują na odrzucenie glejaka z niedoborem gal-1.

Metoda jest tutaj demonstrowana przy użyciu mysich komórek glejaka GL26, które konstytutywnie wyrażają fluorescencyjne białko mCitrine, zwane GL26-Cit, które umożliwiają bezpośrednią wizualizację komórek nowotworowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej21. Komórki te są stereotaktycznie wszczepiane do mózgu syngenicznych myszy C57BL / 6J i mogą rosnąć przez 24, 48 lub 72 godziny przed eutanazją myszy. PBMC naciekające glejaka są następnie izolowane i znakowane immunologicznie za pomocą przeciwciał powierzchniowych anty -CD45, -Gr-1, -CD11b i -NK1.1 wraz z wewnątrzkomórkowym znakowaniem immunologicznym dla granzymu B (GzmB). Ta specyficzna kombinacja przeciwciał pozwala na identyfikację naciekających nowotwór komórek szpikowych Gr-1 + / CD11b + i komórek NK1.1 +, NK, komórek NK, typów komórek, które są zaangażowane w odrzucenie guza z niedoborem gal-1. Profil infiltracji immunologicznej glejaka GL26-Cit z niedoborem gal-1, określanego tutaj jako GL26-Cit-gal1i, jest następnie porównywany z profilem glejaków wyrażających normalne poziomy gal-1 zwane GL26-Cit-NT, które zawierają kontrolną spinkę do włosów shRNA, która nie jest ukierunkowana. Protokół rozpoczyna się od opisu, jak hodować komórki glejaka GL26-Cit in vitro, po którym następuje wyjaśnienie, jak ortotopowo wszczepić te komórki do prążkowia syngenicznych myszy C57BL / 6J. Następnie przechodzi do wyliczenia etapów związanych z izolacją i znakowaniem immunologicznym PBMC naciekających glejaka do analizy cytometrii przepływowej. Protokół kończy się wyjaśnieniem standardowej analizy danych i reprezentacją graficzną.

Demonstracja pokazuje, że zarówno komórki szpikowe Gr-1+/CD11b+, jak i komórki NK NK1.1+ preferencyjnie akumulują się w mikrośrodowisku guza mózgu z niedoborem gal-1 w ciągu 48 godzin od implantacji guza, co pomaga wyjaśnić, dlaczego te guzy szybko przechodzą całkowitą lizę guza około 1 tygodnia po wszczepieniu guza20. Metodę tę można łatwo dostosować do wielu różnych projektów eksperymentalnych in vivo, w których wymagane są dane czasowe dotyczące infiltracji immunologicznej mózgu. Pojedynczy eksperymentator może wykonać protokół od pobrania mózgu do analizy cytometrycznej przepływowej PBMC naciekających glejaka w ciągu około 4-6 godzin, w zależności od liczby próbek do analizy. Metodę można również połączyć z eksperymentami mającymi na celu scharakteryzowanie profilu krążących PBMC u myszy z guzem w celu porównania z tymi, które infiltrują mózg, aby zidentyfikować fenotypy immunosupresji specyficznie indukowane przez mikrośrodowisko guza. Zastosowanie tej i podobnych metod powinno ułatwić lepsze zrozumienie czynników zaangażowanych w transport obwodowych komórek odpornościowych do mikrośrodowiska guza mózgu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uwaga: Proszę zapoznać się z całym protokołem przed przeprowadzeniem eksperymentów. Przed przystąpieniem do postępowania należy uzyskać zgodę na wykorzystanie zwierząt kręgowych od właściwego komitetu instytucjonalnego ds. wykorzystywania i dobrostanu zwierząt.

1. Przygotowanie komórek nowotworowych do wszczepienia wewnątrzczaszkowego

  1. Pracując w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II, zacznij od przygotowania pożywki do hodowli komórkowych GL26-Cit-NT/gal1i, uzupełniając 500 ml butelkę Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 10% sterylnie przefiltrowaną, inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (FBS), 2 mM L-glutaminy, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 600 μg/ml siarczanu G418 (do wyboru wektora ekspresji mCitryny) i 3 μg/ml puromycyny dichlorowodorek (do wyboru shRNA niedocelowych lub specyficznych dla gal-1).
  2. Hodowla komórek GL26-Cit-NT i/lub GL26-Cit-gal1i (ryc. 1A i 1B) w komorze do hodowli tkankowej ustawionej na 37 °C i 5% CO2 przez 1-2 dni przed zabiegiem wszczepienia guza lub do momentu, gdy kolby osiągną 50-80% zbieżności.
  3. W dniu zabiegu należy usunąć pożywkę do hodowli komórkowych z komórek glejaka za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml i pistoletu do pipetowania, a następnie wyrzucić pożywkę do zlewki na odpady.
    1. Odwrócić kolbę od góry do góry do dołu i dodać 10 ml DPBS do górnej części kolby za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml. Powoli odwrócić kolbę, aby przykryć komórki w DPBS, następnie przechylić kolbę pionowo i wyjąć DPBS oraz wyrzucić do zlewki na odpady.
  4. Dodaj 3-4 ml alternatywy trypsyny innej niż ssaki w DPBS z EDTA (szczegóły patrz lista materiałów) do każdej kolby do hodowli tkankowej T75 i umieść z powrotem w komorze do hodowli tkankowej na 2-5 minut. Używając mikroskopu jasnego pola, sprawdź, czy wszystkie komórki oderwały się od dolnej powierzchni przed kontynuowaniem.
  5. Zahamować dalszą aktywność enzymatyczną poprzez rozcieńczenie alternatywy trypsyny 6 ml DPBS. Pipetować w górę i w dół za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml w celu przepłukania dolnej powierzchni kolby i mechanicznej dysocjacji wszelkich agregatów komórkowych. Odessać komórki i umieścić w odpowiednio oznakowanych probówkach wirówkowych o pojemności 15 ml. Wirować ogniwa w dół przy 550 x g (maks. RCF) przez 5 minut w temperaturze 4 °C (Rysunek 1C).
  6. Usunąć supernatant i delikatnie zawiesić komórki za pomocą 1 ml niesuplementowanego DMEM. Upewnij się, że dokładnie pipetujesz komórki w górę i w dół za pomocą mikropipety P-1000, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki.
  7. Zawiesinę komórkową wytworzoną w 1,6 należy rozcieńczyć w stosunku 1:10, umieszczając 18 μl niesuplementowanego DMEM w stożkowej mikroprobówce polipropylenowej o pojemności 0,6 ml, a następnie dodając 2 μl zawiesiny komórek nowotworowych. Pipetować w górę i w dół za pomocą mikropipety P-10, aby dokładnie homogenizować komórki.
  8. Dodać 10 μl rozcieńczenia komórek nowotworowych w stosunku 1:10 powstałego w 1,7 do oddzielnej stożkowej mikroprobówki polipropylenowej o pojemności 0,6 ml, a następnie dodać do probówki 10 μl barwienia błękitem trypanowym. Dokładnie wymieszać z mikropipetą P-10 i dodać 10 μl powstałego roztworu komórek nowotworowych/błękitu trypanowego pod szklanym szkiełkiem nakrywkowym umieszczonym na hemocytometrze, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza (ryc. 1D).
    1. Policz komórki za pomocą mikroskopu jasnego pola przy użyciu obiektywu 10X zgodnie z określonym protokołem powiązanym z danym hemocytometrem. Należy pamiętać, aby wziąć pod uwagę 20-krotne rozcieńczenie oryginalnej zawiesiny komórek nowotworowych wykonane podczas przygotowywania komórek w celu dokładnego oszacowania komórek w oryginalnej podwielokrotności 1 ml. Użyj następującego wzoru, aby obliczyć całkowitą liczbę komórek: całkowita liczba komórek/ml = [((∑komórki zliczone na kwadrat) / # policzonych kwadratów) x 20 (tj. współczynnik rozcieńczenia) x 10 000 komórek/ml].
  9. Po określeniu całkowitej liczby komórek dla każdej linii komórkowej użytej w danym doświadczeniu, należy je wirować w temperaturze 550 x g (maks. RCF) przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant (supernatanty) i ponownie zawiesić komórki odpowiednią objętością nieuzupełnionego DMEM w celu osiągnięcia docelowego stężenia 3 x 104 komórek na 1 μl dla każdej linii komórkowej zgodnie z następującym wzorem: (łącznie # komórek / 30 000).
  10. Umieść równoważną objętość każdej linii komórkowej w odpowiednio oznakowanych stożkowych probówkach polipropylenowych o pojemności 0,6 ml i umieść na lodzie (ryc. 1E). Pamiętaj, aby zapisać kilka komórek, aby kontynuować rozmnażanie każdej linii komórkowej, jeśli oddzielne T75 nie zostały wcześniej wysiane.

2. Procedura stereotaktycznego wszczepienia komórek glejaka do prążkowia myszy C57BL/6J

  1. Przed zabiegiem należy przygotować roztwory robocze znieczulenia chirurgicznego, analgezji i odwrócenia znieczulenia w następujący sposób:
    1. W przypadku znieczulenia chirurgicznego ketamina/deksmedetomidyna: pobrać 1,4 ml z fiolki o pojemności 10 ml sterylnego 0,9% NaCl do wstrzykiwań i zastąpić 600 μl roztworu podstawowego chlorowodorku ketaminy o stężeniu 100 mg/ml i 800 μl roztworu podstawowego chlorowodorku deksmedetomidyny o stężeniu 0,5 mg/ml w celu uzyskania zmieszanego roztworu roboczego chlorowodorku ketaminy (6 mg/ml) i chlorowodorku deksmedetomidyny (0,04 mg/ml).
    2. W przypadku analgezji buprenorfiny: pobrać 1 ml z 10 ml fiolki z jałowym 0,9% NaCl do wstrzykiwań i zastąpić całą objętością 1 ml pojedynczą ampułkę z 0,3 mg/ml podstawowego chlorowodorku buprenorfiny, aby otrzymać roztwór roboczy o stężeniu 0,03 mg/ml.
    3. W celu odwrócenia znieczulenia chirurgicznego atipamezolem: pobrać 1 ml z 10 ml fiolki ze sterylnym 0,9% NaCl do wstrzykiwań i zastąpić 1 ml roztworu podstawowego chlorowodorku atipamezolu o stężeniu 5 mg/ml w celu uzyskania roztworu roboczego o stężeniu 0,5 mg/ml.
  2. Pracując w zatwierdzonym miejscu do chirurgii przeżycia myszy, rozpocznij od ustawienia autoklawowanych lub sterylizowanych kulkami narzędzi chirurgicznych i innych odczynników, jak pokazano na (Figura 2A), a następnie uzyskaj wystarczającą liczbę 8-10 tygodniowych samic myszy C57BL / 6J (syngenecznych z glejakiem GL26) wymaganych do badania; zapewnij im ciągły dostęp do pożywienia i wody.
  3. Znieczulij pierwszą mysz pojedynczym wstrzyknięciem dootrzewnowym (i.p.) roboczego roztworu znieczulającego, podając dawkę 75 mg/kg ketaminy i 0,5 mg/kg deksmedetomidyny (około 250 μl dla myszy 20 g). Następnie należy podać podskórnie (s.c.) 5 mg/kg mc. karprofenu (około 100 μl dla myszy 20 g). Przed kontynuowaniem upewnij się, że mysz nie reaguje na szczypanie palców u nóg i ogona.
  4. Za pomocą maszynki do strzyżenia chirurgicznego ogol futro z czaszki. Nałóż roztwór antyseptyczny powidonu i jodu na ogolony obszar, wyszoruj wacikiem do przygotowywania 70% alkoholu izopropylowego, a następnie ponownie nałóż roztwór antyseptyczny powidonu jodu. Następnie nałóż niewielką ilość sterylnej maści okulistycznej wazeliny na każde oko, aby zapobiec wysuszeniu.
  5. Zabezpiecz czaszkę w ramie stereotaktycznej zgodnie z następującym protokołem:
    1. Ostrożnie otwórz usta, sięgając do środka parą zakrzywionych kleszczy preparacyjnych, aby delikatnie wyciągnąć język i przesunąć się na jedną stronę ust, aby zapobiec zadławieniu. Pozwól, aby kleszcze cofnęły się, gdy jesteś w jamie ustnej, aby rozłożyć szczękę i wprowadzić dwa górne siekacze do dziurki od klucza w listwie zębowej na ramie stereotaktycznej. Zabezpiecz listwę zębatą przed obracaniem się w poziomie lub w pionie, regulując odpowiednie. Upewnij się, że czaszka myszy znajduje się na poziomie blatu stołu.
    2. Przyłóż nauszniki bezpiecznie do kości zaoczodołowych czaszki, uważając, aby nie wywierać zbyt dużego nacisku wewnętrznego na czaszkę, aby zapobiec zmiażdżeniu.
    3. Umieść nos na pysku i przykręć, aż będzie dobrze dopasowany. Sprawdź, czy w głowie nie ma ruchów pionowych/bocznych, delikatnie uciskając kciukiem i palcem wskazującym. Mysz prawidłowo umieszczoną w ramce stereotaktycznej pokazano na rysunku (Rysunek 2B).
    4. Za pomocą ostrza skalpela wykonaj 1 cm nacięcie w linii środkowej nad czaszką od kości czołowej do kości potylicznej. Cofnąć skórę w miejscu nacięcia za pomocą retraktorów Colibri.
    5. Opuścić strzykawkę o pojemności mikrolitrów wyposażoną w igłę 33 G przymocowaną do pionowego ramienia ramy stereotaktycznej bezpośrednio nad położeniem bregmy (Rysunek 2C). Stamtąd dostosuj położenie igły +0,5 mm AP, +2,5 mm ML, aby dotrzeć do miejsca docelowego do implantacji guza. Za pomocą strzykawki tuberkulinowej o pojemności 1 ml wyposażonej w igłę o sile 26 G należy zaznaczyć to miejsce, delikatnie drażniąc okostną.
    6. Wywierć otwór w czaszce w miejscu docelowym, aż dotrze do leżącej poniżej opony twardej za pomocą akumulatorowej wiertarki precyzyjnej wyposażonej w wiertło 1/32" (0.8 mm). Podczas wiercenia należy stosować przerywany nacisk, a następnie wyjmować wiertło z powierzchni czaszki, aby uniknąć nadmiernego ciepła i siły, które w przeciwnym razie mogą doprowadzić do przebicia leżącej pod spodem tkanki mózgowej.
  6. Przepłukać strzykawkę z mikrolitrem 0,9% NaCl w stożkowej mikroprobówce polipropylenowej o pojemności 1,7 ml, aby upewnić się, że igła nie jest zatkana. Delikatnie strzepnij kilkakrotnie stożkową mikroprobówkę polipropylenową o pojemności 0,6 ml zawierającą komórki nowotworowe, aby ponownie zawiesić komórki.
  7. Pobrać 2 μl komórek do mikrolitrowej strzykawki, upewniając się, że do strzykawki nie zostały wprowadzone pęcherzyki powietrza. Dozuj 1 μl komórek na podkładkę do przygotowywania 70% nasączku nasączonym alkoholem izopropylowym, pozostawiając dokładnie 1 μl komórek nowotworowych pozostających w strzykawce.
  8. Przyłóż igłę w dół, aż dotknie opony twardej, następnie wprowadź igłę do mózgu -3,5 mm brzusznie i cofnij o +0,5 mm. Powoli i płynnie dostarczaj komórki, naciskając tłok strzykawki w ciągu 1-2 minut.
  9. Pozwól komórkom osiąść w miejscu wstrzyknięcia przez 5 minut, zanim powoli wycofasz igłę. Wytrzyj zakrzepłą krew lub materię mózgową z końcówki igły czystą podkładką do przygotowywania 70% alkoholu izopropylowego. Dokładnie przepłukać igłę i strzykawkę 0,9% NaCl z kroku 2.6, aby upewnić się, że igła nie jest zatkana do następnego wstrzyknięcia.
  10. Zdejmij retraktory Colibri i zszyj skórę głowy za pomocą trzech nylonowych szwów monofilamentowych 3-0. Wyjmij mysz z ramy stereotaktycznej i podaj 0,1 mg/kg chlorowodorku buprenorfiny podskórnie (s.c.) (około 67 μl 0,03 mg/ml roztworu roboczego dla myszy 20 g), a następnie 2,5 mg/kg chlorowodorku atipamezolu domięśniowo (domięśniowo) (około 100 μl roztworu roboczego 0,5 mg/ml dla myszy 20 g) w celu złagodzenia bólu pooperacyjnego i odwrócenia znieczulenia. Umieść myszy po operacji z powrotem w klatkach pod lampą grzewczą, aby wyzdrowiały.

3. Perfuzja przezsercowa myszy i pobieranie z mózgu

  1. Przygotować heparynizowany roztwór Tyrode'a zgodnie z następującym protokołem:
    1. Umieść mieszadło magnetyczne w szklanej butelce z zakrętką o pojemności 1 l i napełnij do objętości ultraczystą wodą dejonizowaną. Umieść butelkę na talerzu mieszającym.
    2. Zważ i dodaj następujące substancje chemiczne do szklanej butelki, mieszając: 8 g chlorku sodu (NaCl), 0,264 g chlorku wapnia (CaCl2•2H2O), 0,05 g fosforanu sodu jednozasadowego (NaH2PO4•2H2O), 1,0 g D-glukozy (C6H12O6), 1,0 g wodorowęglanu sodu (NaHCO3), 0,2 g chlorku potasu (KCl). Pozwól solom się rozpuścić, a następnie dodaj 100 μl 100 j./ml roztworu podstawowego heparyny sodowej do roztworu Tyrode.
    3. Wyjmij pojemnik z płytki mieszającej i wyjmij pręt mieszający za pomocą różdżki magnetycznej. Roztwór Tyrode'a powinien być przechowywany w heparyniźnie w temperaturze 4 °C.
  2. Przygotuj roztwór roboczy do znieczulenia końcowego w następujący sposób:
    1. W przypadku znieczulenia końcowego ketamina/ksylazyna: usunąć 1,360 μl z 10 ml fiolki sterylnego 0,9% NaCl do wstrzykiwań i zastąpić 1,200 μl 100 mg/ml roztworu podstawowego chlorowodorku ketaminy i 160 μl 100 mg/ml roztworu podstawowego chlorowodorku ksylazyny, aby otrzymać zmieszany roztwór roboczy chlorowodorku ketaminy (12 mg/ml) i chlorowodorku ksylazyny (1,6 mg/ml).
  3. Przygotować roztwór mieszaniny pożywki do wirowania o dużej gęstości, umieszczając 90 ml 10x PBS w 264 ml ultraczystej wody dejonizowanej (3,93x) w sterylnym plastikowym pojemniku. Miareczkować do pH 7,0-7,2 za pomocą HCl i sterylizować przez filtr 0,22 μm. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  4. Przygotować pożywkę wirówkową o gęstości 70%, łącząc 18 ml roztworu mieszaniny pożywki wirowej o gęstości z 30 ml pożywki wirówkowej o gęstości (szczegółowe informacje znajdują się w wykazie materiałów) w probówce wirówkowej z polipropylenu o pojemności 50 ml. Przechowywać w temperaturze 4 °C, ale przed użyciem doprowadzić do temperatury regulowanej.
  5. Przygotuj pożywkę wirówkową o gęstości 37%, łącząc 9,6 ml DPBS z 10,4 ml pożywki wirówkowej o gęstości 70% w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. Przechowywać w temperaturze 4 °C, ale przed użyciem doprowadzić do temperatury regulowanej.
  6. Przygotować bufor przepływowy, umieszczając 500 μl FBS w 50 ml DPBS (~1% FBS) w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. Przechowywać w sklepie w temperaturze 4 °C
  7. Napełnij poliuretanowe wiaderko na lód o pojemności 4,5 l do pełna wiórkami lodu.
  8. Przygotować połączony roztwór 1 mg/ml kolagenazy i 1 mg/ml DNazy-I w ilości wystarczającej na 1 ml na próbkę mózgu w badaniu, rozcieńczając roztwór podstawowy 10 mg/ml DNazy-I w stosunku 1:10 i roztwór podstawowy kolagenazy 50 mg/ml w stosunku 1:50 ze sterylnym DPBS w pojedynczej probówce wirówkowej z polipropylenu o pojemności 15 ml. Delikatnie wymieszać roztwór, pipetując w górę i w dół za pomocą mikropipety P-1000. Przechowywać na lodzie w wiaderku z poliuretanu od kroku 3.7.
  9. Zaopatrz się w dwa szklane młynki do tkanek o pojemności 7 ml. Oznacz jeden "NT", a drugi "gal1i". Umieść młynki do chusteczek higienicznych w pojemniku na lód i dodaj do każdego z nich 1 ml DPBS.
  10. Zdobądź wystarczającą ilość 15 ml probówek wirówkowych, aby zebrać materię mózgową od każdej myszy w badaniu i umieścić w wiadrze z lodem.
  11. Umieść ~150 ml DPBS wśród trzech probówek wirówkowych o pojemności 50 ml w wiadrze na lód.
  12. Uzyskać wystarczającą ilość sześciokątnych naczyń wagowych z polistyrenu (górna średnica wewnętrzna (ID) 115 mm, średnica wewnętrzna podstawy 85 mm, objętość 203 ml) dla każdej myszy w badaniu. Kompletny zestaw do sekcji i rozwarstwiania mózgów myszy pokazano na (Rysunek 3A)
  13. W wybranych punktach czasowych znieczulij pierwszą mysz z nowotworem w badaniu, używając pojedynczego wstrzyknięcia dożylnego 150 mg/kg chlorowodorku ketaminy i 20 mg/kg chlorowodorku ksylazyny (około 250 μl połączonego roztworu roboczego 12 mg/ml ketaminy/1,6 mg/ml ksylazyny na 20 g myszy) w celu wywołania głębokiego znieczulenia. Przed kontynuowaniem upewnij się, że mysz nie reaguje na szczypanie palców u nóg i ogona.
  14. Pobrać wcześniej przygotowany roztwór Tyrode'a i umieścić go w okapie z przepływem laminarnym przeznaczonym do terminalnych zabiegów chirurgicznych na zwierzętach. Umieść nieprzepuszczalne dla gazu rurki polimerowe przymocowane do zbiornika karbogenu w roztworze Tyrode. Otwórz zawór zbiornika, aby 95% O2/5% CO2 karbogen mógł w sposób ciągły przenikać do roztworu.
  15. Przymocuj igłę piasty aluminiowej o wadze 20 G do końca dodatkowej nieprzepuszczalnej dla gazu rurki polimerowej podłączonej do pompy perystaltycznej. Umieść rurkę na drugim końcu pompy perystaltycznej w roztworze Tyrode'a i włącz pompę, aby umożliwić napełnienie rurki natlenizowanym i heparynizowanym roztworem Tyrode. Konfiguracja perfuzji przezsercowej myszy pokazano na (ryc. 3B).
  16. Za pomocą czterech igieł 26 G przygwoźdź znieczuloną mysz brzuszną stroną do góry za przednie i tylne łapy na bloku z ekstrudowanej pianki polistyrenowej pokrytym ręcznikiem chłonnym w kapturze z przepływem laminarnym.
  17. Chwyć skórę nad jamą otrzewnej za pomocą kleszczy preparacyjnych i za pomocą dużej pary nożyczek preparacyjnych wykonaj nacięcie w kształcie litery "Y", penetrując ścianę otrzewnej, przecinając głowę w celu przebicia przepony, a następnie rozwidlając się w mostku, aby zakończyć się na lewej i prawej pachy.
  18. Użyj hemostatu, aby zacisnąć mostek i odbić klatkę piersiową nad lewym ramieniem myszy. Usuń osierdzie za pomocą pary kleszczy preparacyjnych.
  19. Włącz pompę perystaltyczną, aby rozpocząć równomierne kroplowanie natlenionego i heparynizowanego roztworu Tyrode'a (około 2,3-2,5 ml/min).
  20. Wbić igłę do lewej komory serca. Użyj małej pary nożyczek do preparacji, aby przeciąć prawy przedsionek, aby umożliwić wykrwawienie (ryc. 3C).
  21. Pozwól, aby roztwór Tyrode'a dokładnie przeniknął do układu krążenia myszy, aż wątroba i płuca całkowicie zbledną z powodu braku krwi. Upewnij się, że żadne duże ilości krwi nie wydostają się z prawego przedsionka przed wyjęciem 20 G aluminiowej igły piasty z lewej komory.
  22. Odepnij mysz od bloku z ekstrudowanej pianki polistyrenowej i obróć mysz brzuszną stroną do dołu. Za pomocą dużej pary nożyczek preparacyjnych oddziel głowę od reszty ciała na poziomie szyi.
  23. Za pomocą małych nożyczek preparacyjnych przetnij skórę głowy na linii środkowej, zaczynając od kości potylicznej, kierując się do przodu w kierunku pyska, aby odsłonić czaszkę.
  24. Cofnij skórę po obu stronach czaszki za pomocą kciuka i palca wskazującego i mocno przytrzymaj czaszkę. Użyj pary kostnych Rongeurs, aby przebić się przez czaszkę, zaczynając od kości potylicznej i pracuj do przodu, aby całkowicie odsłonić grzbietową i boczną powierzchnię mózgu. Uważaj, aby zminimalizować uszkodzenia mózgu.
  25. Po usunięciu kości czaszki odwróć głowę myszy brzuszną stroną do góry i użyj małych nożyczek preparacyjnych, aby przeciąć nerwy czaszkowe u podstawy mózgu, aby uwolnić je od czaszki.

4. Izolacja PBMC naciekających glejaka

  1. Używając czystej, obosiecznej żyletki, wyizoluj obszar mózgu zawierający guz, wykonując strzałkowy nacięcie środka mózgu, aby przeciąć dwie półkule. Odwróć półkulę ipsilateralną przyśrodkową w dół i wykonaj dwa nacięcia koronalne na poziomie móżdżku i opuszki węchowej, aby wyizolować tkankę docelową zawierającą implant nowotworowy (ryc. 4A). Równoważna część półkuli przeciwległej może być również odizolowana i wykorzystana jako kontrola ujemna.
  2. Umieść tkankę docelową w odpowiednio oznakowanym szklanym młynku do tkanek Dounce zawierającym 1 ml DPBS, wciśnij tłok do końca i przekręć 7 razy, aby początkowo rozbić tkankę. Podnieś tłok, aby płyn opadł z powrotem na dno młynka do chusteczek. Powtórz ten krok trzy razy; Jednak przekręć tłok tylko 4 razy podczas następnych dwóch powtórzeń i 3 razy podczas ostatniego powtórzenia, aby uniknąć nadmiernego roztarcia tkanki.
  3. Za pomocą mikropipety P-1000 nanieść kolejno trzy objętości lodowatego DPBS o objętości 1 ml (przygotowanego w ppkt 3.11) wzdłuż boków tłoka, aby spłukać je do młynka do tkanek.
  4. Ponownie zawiesić rozdrobnioną materię mózgową, pipetując w górę iw dół, a następnie umieścić w oznakowanej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml na lodzie. Opłucz boki młynka do tkanek Dounce dodatkowym 1 ml lodowatego DPBS i dodaj do tej samej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Trzymaj wszystkie probówki zawierające rozdrobnioną materię mózgową na lodzie, dopóki wszystkie próbki nie zostaną przetworzone.
  5. Powtórz kroki 3.13-3.25 i 4.1-4.4 dla każdej myszy w badaniu.
  6. Po przetworzeniu wszystkich próbek, odwirować rozdrobnioną materię mózgową w probówkach wirówkowych o pojemności 15 ml przy 740 x g (maks. RCF) przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
  7. Usunąć supernatant za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml i pistoletu do pipetowania i ponownie zawiesić granulowaną materię mózgową w 1 ml uprzednio przygotowanych enzymów trawiennych kolagenazy/DNazy-I za pomocą P-1000. Umieścić probówki wirówkowe o pojemności 15 ml w stojaku na probówki i umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 15 minut.
  8. Delikatnie mieszać próbki dwukrotnie w okresie inkubacji, przesuwając probówki, aby ułatwić dezagregację tkanek.
  9. Dodać 6 ml lodowatego DPBS za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml do każdej probówki, aby rozcieńczyć enzymy trawienne. Pipetować w górę i w dół, aby ponownie zawiesić, i przefiltrować całkowitą objętość przez sterylne filtry siatkowe nylonowe 70 μm do nowych, oznakowanych probówek wirówkowych o pojemności 15 ml na lodzie.
  10. Obracaj zawiesinę komórek mózgowych w dół przy 740 x g (maks. RCF) przez 20 minut w temperaturze 4 °C, aby uzyskać osad z pojedynczej komórki (ryc. 4B). Po wyjęciu probówek o pojemności 15 ml z wirówki, umieść je na lodzie i zwiększ ustawienie temperatury wirówki do około 21 °C, przygotowując się do następnego kroku.
  11. Całkowicie usunąć supernatant z każdej probówki zawierającej komórki mózgowe i wstępnie ponownie zawiesić granulki w 1 ml pożywki wirówkowej o gęstości 70% za pomocą mikropipety P-1000. Następnie dodać 4 dodatkowe mililitry pożywki wirówkowej o gęstości 70% do każdej probówki za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml. Mocno przykręć nakrętki i homogenizuj zawiesinę komórek, kilkakrotnie delikatnie odwracając do probówek.
  12. Wyjmij z lodu probówki wirówkowe o pojemności 15 ml zawierające komórki mózgowe zawieszone w pożywce wirówkowej o gęstości 70% i umieść w stojaku na probówki w temperaturze pokojowej. Pojedynczo ostrożnie nakładaj 2 ml roztworu pożywki wirowej o gęstości 37% na 5 ml pożywki wirowej o gęstości 70% za pomocą mikropipety P-1000, aby utworzyć czystą granicę między dwiema warstwami pożywki wirówkowej o gęstości (rysunek 4C).
    1. Użyj markera z cienką końcówką, aby wskazać położenie interfejsu, aby można go było łatwo zidentyfikować po odwirowaniu, gdy rozróżnienie staje się mniej widoczne.
  13. Odkręcaj probówki wirówkowe o pojemności 15 ml przy 740 x g (maks. RCF) przez 20 minut w temperaturze pokojowej bez przerwy, aby uniknąć zakłócenia interfejsu.
  14. Po odwirowaniu należy zebrać PBMC, które nagromadziły się na granicy faz między dwiema warstwami pożywki wirówkowej o dużej gęstości (rysunek 4D), wprowadzając mikropipetę P-200 do probówki wzdłuż jej boku, ostrożnie omijając warstwę lipidową.
    1. Gdy znajdziesz się na poziomie pasma PBMC, powoli wyekstrahuj 200 μl z powierzchni warstwy pożywki wirówkowej o gęstości 70% i umieść w odpowiednio oznakowanej probówce FACS z polipropylenu na lodzie. Powtórzyć tę czynność raz dla całkowitej objętości 400 μl na próbkę.
  15. Dodać 3 ml buforu przepływowego do każdej probówki FACS zawierającej 400 μl PBMC w celu wystarczającego rozcieńczenia pożywki wirowej o dużej gęstości, a następnie odwirować komórki w temperaturze 660 x g (maks. RCF) przez 20 minut w temperaturze 4 °C.

5. Znakowanie immunologiczne PBMC naciekających glejaka

  1. Przed analizą jakichkolwiek eksperymentalnych próbek PBMC należy przeprowadzić pojedynczy, niezależny eksperyment kontroli izotypu powierzchni komórki w celu ustalenia bramek linii bazowej, które mają być powiązane z zestawem stałych napięć PMT w szablonie analizy danych cytometrii przepływowej przeznaczonym do oceny PBMC naciekających glejaka zgodnie z następującym protokołem:
    1. Zaszczepić jedną mysz C57BL/6J za pomocą GL26-Cit-gal1i, a drugą za pomocą GL26-Cit-NT zgodnie z procedurą opisaną w sekcji 2. Po 72 godzinach wzrostu guza należy poddać eutanazji obie myszy i wyizolować PBMC naciekające guz zgodnie z procedurami opisanymi w sekcjach 3 i 4.
    2. Połączyć dwie próbki PBMC (NT i gal1i) w jedną objętość (tj. 100 μl), a następnie równomiernie podzielić próbkę między trzy probówki FACS (tj. 33,3 μl na probówkę) oznaczone jako "izotyp CD45", "izotyp Gr-1/CD11b" i "izotyp NK1.1". Dodać następujące przeciwciała (każde w rozcieńczeniu 1:100 i rozcieńczone do całkowitej objętości 200 μl w buforze przepływowym) do odpowiednio znakowanych probówek FACS: "Izotyp CD45": Szczurzy IgG2b sprzężony z Alexa Fluor 700, κ (klon: RTK4530); "Izotyp Gr-1/CD11b": szczurzy anty-mysi CD45 sprzężony z Alexa Fluor 700 (klon: 30-F11), szczur IgG2b sprzężony z PE, κ (klon: eB149/10H5) i szczur IgG2b sprzężony z PerCP/Cy5,5, κ (klon: RTK4530); "Izotyp NK1.1": anty-mysi CD45 sprzężony z Alexa Fluor 700 (klon: 30-F11), szczurzy anty-mysi Gr-1 sprzężony z PE (klon: RB6-8C5), szczurzy anty-mysi CD11b sprzężony z PerCP/Cy5.5 (klon: M1/70) i mysz IgG2a, sprzężona z APC, κ (klon: eBM2a).
    3. Pozwól PBMC na znakowanie immunologiczne na lodzie w ciemności przez 20 minut. Przesuń probówki raz w połowie okresu inkubacji, aby delikatnie wymieszać. Przemyć 1 ml buforu przepływowego, odwirować w temperaturze 660 x g (maks. RCF) przez 10 minut w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić każdą probówkę FACS zawierającą PBMC z 200 μl buforu przepływowego.
    4. Używając cytometru przepływowego wyposażonego w zintegrowaną dyszę 85 μm, najpierw przeanalizuj probówkę "izotypu CD45", aby ustalić podstawową bramkę interwałową CD45. Następnie uruchom probówkę "Izolator Gr-1 / CD11b", aby ustalić podstawową bramkę kwadrantową Gr-1 / CD11b, używając tylko prawdziwych komórek CD45 + jako danych wejściowych. Na koniec uruchom probówkę "Isotype NK1.1", aby ustanowić podstawową bramkę interwałową NK1.1, używając tylko prawdziwych komórek CD45 + / Gr-1low / CD11b +/- jako danych wejściowych.
  2. Dla wszystkich przyszłych analiz eksperymentalnych należy stosować następującą procedurę:
    1. Wykonać wystarczającą ilość rozcieńczenia 1:100 przeciwciał powierzchniowych komórek w buforze przepływowym, aby uzyskać objętość 200 μl na próbkę (plus 1 dla izotypu GzmB): Alexa Fluor 700-sprzężony szczurzy anty-mysi CD45 (klon: 30-F11), szczurzo sprzężony z PE anty-mysi Gr-1 (klon: RB6-8C5), szczurzy anty-mysz CD11b sprzężony z PerCP/Cy5.5 (klon: M1/70), anty-mysi anty-mysz NK1.1 sprzężony z APC (klon: PK136).
    2. Ostrożnie usunąć supernatant z odwirowanych PBMC z 4,15, aż menisk znajdzie się tuż nad dnem każdej probówki FACS (~50 μl), aby uniknąć strat komórek. Ponownie zawiesić PBMC w każdej probówce FACS za pomocą bufora przepływu resztkowego za pomocą mikropipety P-200 i usunąć (1/# próbki) objętości z każdej probówki FACS i połączyć w nową probówkę FACS oznaczoną jako "izotyp zbiorczy".
    3. Dodać 200 μl koktajlu przeciwciał na powierzchni komórki przygotowanego w 5.2.1 do każdej próbki PBMC. Pozwól PBMC na znakowanie immunologiczne na lodzie w ciemności przez 20 minut. Przesuń probówki raz w połowie okresu inkubacji, aby delikatnie wymieszać.
    4. Przemyć 1 ml buforu przepływowego; odwirować w temperaturze 660 x g (maks. RCF) x 10 min w temperaturze 4 °C.
    5. Zawiesić wszystkie probówki FACS zawierające PBMC w 200 μl dostępnego w handlu utrwalacza na bazie formaliny (szczegóły w wykazie materiałów) na 15 minut na lodzie w ciemności. Przesuń probówki raz w połowie okresu inkubacji, aby delikatnie wymieszać.
    6. Przemyć 1 ml dostępnego w handlu 1x buforu do przepuszczania/płukania (szczegóły patrz lista materiałów) i odwirowywać przy 660 x g (maks. RCF) przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    7. Podczas gdy PBMC wirują, przygotuj wystarczającą ilość rozcieńczenia 1:100 mysich przeciwciał wewnątrzkomórkowych anty-mysich GzmB (klon: GB11) w 1x buforze do permeabilizacji / płukania, aby uzyskać objętość 200 μl na próbkę.
    8. W oddzielnej probówce przygotować pojedynczą objętość 200 μl rozcieńczenia 1:100 mysiego przeciwciała kontrolnego IgG1 sprzężonego z błękitem pacyfistycznym κ (klon: MOPC-21).
    9. Zawiesić każdą z eksperymentalnych próbek PBMC z 200 μl przeciwciał anty-mysich GzmB w rozcieńczeniu 1:100 i ponownie zawiesić pojedynczą probówkę FACS oznaczoną jako "izotyp zbiorczy" z objętością 200 μl rozcieńczenia przeciwciał izotypu w stosunku 1:100.
    10. Pozostawić wszystkie próbki PBMC do znakowania immunologicznego na lodzie w ciemności przez 20 minut. Przesuń probówki raz w połowie okresu inkubacji, aby delikatnie wymieszać.
    11. Przemyć 1 ml buforu przepływowego; odwirować w temperaturze 660 x g (maks. RCF) przez 10 minut w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić PBMC z 200 μl buforu przepływowego do analizy.
    12. Cytometrycznie analizować PBMC naciekające glejaka za pomocą zintegrowanej dyszy 85 μm oraz bramek i napięć PMT wcześniej ustalonych w sekcji 5.122. Należy upewnić się, że badasz całą objętość każdej próbki na cytometrze przepływowym, aby zapewnić rzetelne porównanie całkowitej liczby PBMC naciekających glejaka w każdej próbce.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Następująca strategia bramkowania jest używana w typowym eksperymencie: FSC-A vs. SSC-A → SSC-H vs. SSC-W → FSC-H vs. FSC-W → CD45 vs. count → Gr-1 vs. CD11b → NK1.1 vs. count. Bramki umieszczone na komórkach szpikowych Gr-1 + / CD11b + i komórkach NK NK1.1 + są następnie stratyfikowane na podstawie ekspresji GzmB (Figura 5A). Backgating tych komórek, które zostały zidentyfikowane jako komórki NK NK1.1 + i komórki szpikowe Gr-1 + / CD11b +...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje solidną i powtarzalną metodę izolacji i analizy cytometrii przepływowej PBMC, które przeniknęły do wczesnego mikrośrodowiska guza mózgu myszy. Zawiesiny komórek glejaka są generowane w stężeniu określonym przez eksperymentatora, które są stereotaktycznie wszczepiane do prążkowia mózgu myszy. Myszy są następnie poddawane eutanazji w określonych punktach czasowych określonych w projekcie eksperymentalnym, a ich mózgi są zbierane i przetwarzane w celu wyizolowania PBMC naciekających glejaka, które są zn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health/National Institute of Neurological Disorders & Stroke (NIH/NINDS) granty R01-NS074387, R01-NS057711 i R21-NS091555 dla M.G.C.; NIH/NINDS przyznaje PRL R01-NS061107, R01-NS076991, R01-NS082311 i R21-NS084275; granty z Leah's Happy Hearts, University of Michigan Comprehensive Cancer Center przyznane M.G.C. i P.R.L.; Wydział Neurochirurgii Szkoły Medycznej Uniwersytetu Michigan; Michigan Institute for Clinical and Health Research, wspierany przez grant NIH 2UL1-TR000433; University of Michigan Cancer Biology Training Grant wspierany przez NIH/NCI (National Cancer Institute) grant T32-CA009676; Szkolenie Uniwersytetu Michigan w zakresie neuronauki klinicznej i podstawowej wspierane przez grant NIH/NINDS T32-NS007222; oraz University of Michigan Medical Scientist Training Program wspierany przez NIH/NIGMS (National Institute of General Medicine Sciences) grant T32-GM007863. Autorzy są wdzięczni za przywództwo naukowe i wsparcie otrzymane od dr Karin Muraszko i Kliniki Neurochirurgii; M. Dahlgrenowi, D. Tomfordowi i S. Napolitanowi za znakomite wsparcie administracyjne; M. Dzamanowi za wybitną pomoc techniczną; oraz Philowi F. Jenkinsowi za hojne wsparcie w zakupie skaningowego mikroskopu elektronowego 3D firmy Zeiss. Uznajemy również laboratorium Kuchroo w Harvard Medical School, z którego opracowano zmodyfikowaną wersję strategii izolacji komórek jednojądrzastych mózgu za pośrednictwem wirowania gęstości, w której pośredniczy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Dulbecco' Modyfikacja Orłaków MediumGibco12430-054z 4,5g/L D-glukozy, L-glutaminą, 25 mM HEPES i czerwienią fenolową.
Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Gibco14190-144 bez chlorku wapnia lub chlorku magnezu
Surowica bydlęca płoduOmega Scientific Inc.FB-11
Penicylina Streptomycyna Gibco15140-12210 000 j./ml penicyliny; 10 000 μ g/ml Streptomycyny 
L-glutaminaGibco25030-081200 mM
G418 siarczan Omega Scientific Inc.GN-04
Chlorowodorek puromycyny   Sigma-AldrichP8833z Streptomyces alboniger
HyClone HyQTase alternatywa dla trypsyny dla ssaków Thermo ScientificSV30030.01w DPBS z EDTA 
Hemocytometr z kontrastem fazowymSigma-AldrichZ359629głębokości 0,1 mm
Trypanowa niebieska plamaGibco15250-061
Sterylne 0,9% NaCl do wstrzykiwań, USPHospiraNDC: 0409-4888Fiolki 10 ml
0,6 ml stożkowe mikroprobówki polipropylenoweGenesee Scientific22-272
Chlorowodorek atypamezolu do wstrzykiwańOrion PharmaNDC: 52483-6298Roztwór 5 mg/ml
Chlorowodorek ketaminy do wstrzykiwańFort DodgeNDC: 0409-2051100 mg/ml roztwór
Chlorowodorek deksmedetomidyny do wstrzykiwańZoetisNDC: 54771-28050,5 mg/ml roztwór
Chlorowodorek ksylazyny do wstrzykiwańLloydNDC: 61311-481100 mg/ml roztwór
Wstrzyknięcie karprofenuPfizerNDC: 61106-850150 mg/ml roztwór
chlorowodorek buprenorfiny do wstrzykiwańReckitt BenckiserNDC: 12496-07570,3 mg/ml ampułki
1 ml strzykawki tuberkulinowe Covidien8881501400
26G x ½ Igły do strzykawek (0,45 mm x 13 mm) Maszynki
3M9661
Roztwór prowidonu i joduAplicare82-217NDC: 52380-1905
Sterylna wazelina maść okulistyczna DechraNDC: 17033-211
Podkładki przygotowawcze z 70% alkoholem izopropylowymKendall6818
Sterylna gazaCovidien80444" x 4", 4-warstwowa 
1,7 ml stożkowe mikroprobówki polipropylenoweGenesee Scientific22-281
Ramka stereotaktyczna myszyStoelting51730
Lampa chirurgicznaPhilips BurtonCS316WCoolspot II Zmienny reflektor
Zakrzywione kleszcze preparacyjneTed Pella Inc.5431
Retraktory Colibri FST17000-03
Akumulatorowa wiertarka precyzyjnaDremel 1100-01Model rysika; 7,2 V litowo-jonowy ze stacją dokującą
Frez do grawerowaniaDremel1051/32" lub 0,8 mm średnica bitu
Strzykawka mikrolitrowaHamilton75Hamilton Strzykawki mikrolitrowe seria 700; 5 μ l objętość
Igły strzykawkowe mikrolitroweHamilton7762-0633 G, mała piasta RN NDL, 1,5 cala, styl punktowy 3, 6/PK
Ethilon 3-0 czarne monofilamentowe nylonowe nici Ethicon1663
Mieszadło magnetyczneVWR74950-296Średnica 7,9 mm x długość 50 mm (średnica 5/16" x długość 2")
L szklana butelka do przechowywania z nakrętkąCorning1395Typ 1, klasa A szkło borokrzemianowe
Heparyna sodowa SagentNDC: 25021-4001,000 U/ml roztwór
Pompa perystaltycznaCole Parmer Instruments Group77200-60Master Flex Easy Load II napęd konsoli
skompresowany karbogen (95% O2 / 5% CO2)dostępny od lokalnego dostawcyNietypu A, duża butla 
20 G x 1 & frac12; " Aluminiowe igłypiasty Kendall88812023630,9 mm x 38,1 mm
Poliuretanowe wiadro na lódFisherbrand02-591-45Pojemność: 0,152 uncji (4,5 l)
Kolagenaza (typ I-S)Sigma AldrichC1639z Clostridium histolyticum 
Deoksyrybonukleaza IWorthington Biochemical Corp.LS002007>2 000 jednostek Kunitz na mg suchej masy
Antystatyczne sześciokątne naczynia wagowe z polistyrenuTed Pella Inc.20157-3górna średnica wewnętrzna 115 mm, średnica wewnętrzna podstawy 85 mm, objętość 203 ml 
Żyletki jednosieczne ze stali nierdzewnej Garvey40475
Rongeurs kostneFST16001-15
HemostatFST13014-14
Duże nożyczki preparacyjneTed Pella Inc.1316
Małe nożyczki preparacyjneFST14094-11
Kleszcze z końcemTed Pella Inc.13250
7 ml szklany młynek do tkanek KontesKT885300-0007
Pożywka do wirowania gęstości Percoll GE HealthcareGE17-0891-01
Pipety serologiczne 10 mlGenesee Scientific12-104jednorazowego użytku; sterylne
70 μ M Sterylne sitka do komórek z siatki nylonowej Fisherbrand22363548
Alexa Fluor 700-sprzężony szczur anty-mysi CD45 (klon: 30-F11)Biolegend103128
Anty-mysz skoniugowany z APC NK1.1 (klon: PK136)eBiosciences 17-5941-82
Szczur anty-mysi Gr-1 (klon: RB6-8C5) sprzężony z PEPharmigen553128
PerCP/Cy5.5-sprzężony szczur anty-mysi CD11b (klon: M1/70) Biolegend101228
Alexa Fluor 700-sprzężony szczur IgG2b, κ (klon: RTK4530) Kontrola ISOTYPU Biolegend400628
myszy sprzężonej z APC IgG2a, κ (klon: eBM2a) kontrola izotypu eBioscience17-4724
Szczur sprzężony z PE IgG2b, κ (klon: eB149/10H5) kontrola izotypu eBioscience12-4031-82
IgG2b szczura sprzężonego z PerCP/Cy5.5 i kappa; (klon: RTK4530) kontrola izotypuBiolegend400632
Pacific Blue-sprzężony mysz anty-mysz granzyme B (klon: GB11) Biolegend515403
IgG1 myszy sprzężonej z błękitem pacyficznym IgG1, κ (Klon: MOPC-21) kontrola izotypu Biolegend400151
Cytofix/CytopermBD554714
15 ml polipropylenowe probówki wirówkoweGenesee Scientific21-103stożkowe dno 
Probówki wirówkowe z polipropylenu 50 mlGenesee Scientific21-108stożkowe dno
12 mm x 75 mm okrągłe probówki polipropylenowe FACS Fisherbrand14-956-1B
FACSAria Badania na specjalne zamówienie Produkt Cytometr przepływowy/sortownik komórekBD 
Szafa Bezpieczeństwa Biologicznego klasy IIFirma Baker SG603model: SterilGARD III Advance
do strzyżenia chirurgicznego BD 305111 Włóknina , 1 dotyczy BD 650033

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bleeker, F. E., Molenaar, R. J., Leenstra, S. Recent advances in the molecular understanding of glioblastoma. J Neurooncol. 108, 11-27 (2012).
  2. Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N Engl J Med. 352, 987-996 (2005).
  3. Ostrom, Q. T., et al. CBTRUS statistical report: primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2007-2011. Neuro Oncol. 16, Suppl 4. iv1-63 (2014).
  4. Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523, 337-341 (2015).
  5. Kennedy, B. C., et al. Tumor-associated macrophages in glioma: friend or foe? J Oncol.. 2013, 486912(2013).
  6. Markovic, D. S., Glass, R., Synowitz, M., Rooijen, N., Kettenmann, H. Microglia stimulate the invasiveness of glioma cells by increasing the activity of metalloprotease-2. J Neuropathol Exp Neurol. 64, 754-762 (2005).
  7. Zhai, H., Heppner, F. L., Tsirka, S. E. Microglia/macrophages promote glioma progression. Glia. 59, 472-485 (2011).
  8. Kmiecik, J., et al. Elevated CD3+ and CD8+ tumor-infiltrating immune cells correlate with prolonged survival in glioblastoma patients despite integrated immunosuppressive mechanisms in the tumor microenvironment and at the systemic level. J Neuroimmunol. 264, 71-83 (2013).
  9. Yang, I., Han, S. J., Sughrue, M. E., Tihan, T., Parsa, A. T. Immune cell infiltrate differences in pilocytic astrocytoma and glioblastoma: evidence of distinct immunological microenvironments that reflect tumor biology. J Neurosurg. 115, 505-511 (2011).
  10. Wagner, S., et al. Microglial/macrophage expression of interleukin 10 in human glioblastomas. Int J Cancer. 82, 12-16 (1999).
  11. El Andaloussi, A., Lesniak, M. S. An increase in CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells in tumor-infiltrating lymphocytes of human glioblastoma multiforme. Neuro Oncol. 8, 234-243 (2006).
  12. Kostianovsky, A. M., Maier, L. M., Anderson, R. C., Bruce, J. N., Anderson, D. E. Astrocytic regulation of human monocytic/microglial activation. J Immunol. 181, 5425-5432 (2008).
  13. Curtin, J. F., et al. HMGB1 mediates endogenous TLR2 activation and brain tumor regression. PLoS Med. 6, e10(2009).
  14. Curtin, J. F., et al. Fms-like tyrosine kinase 3 ligand recruits plasmacytoid dendritic cells to the brain. J Immunol. 176, 3566-3577 (2006).
  15. Mineharu, Y., et al. Engineering the brain tumor microenvironment enhances the efficacy of dendritic cell vaccination: implications for clinical trial design. Clin Cancer Res. 17, 4705-4718 (2011).
  16. Larocque, D., et al. Exogenous fms-like tyrosine kinase 3 ligand overrides brain immune privilege and facilitates recognition of a neo-antigen without causing autoimmune neuropathology. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 14443-14448 (2010).
  17. Curtin, J. F., et al. Treg depletion inhibits efficacy of cancer immunotherapy: implications for clinical trials. PLoS One. 3, e1983(2008).
  18. Ali, S., et al. Combined immunostimulation and conditional cytotoxic gene therapy provide long-term survival in a large glioma model. Cancer Res. 65, 7194-7204 (2005).
  19. Dewey, R. A., et al. Chronic brain inflammation and persistent herpes simplex virus 1 thymidine kinase expression in survivors of syngeneic glioma treated by adenovirus-mediated gene therapy: implications for clinical trials. Nat Med. 5, 1256-1263 (1999).
  20. Baker, G. J., et al. Natural killer cells eradicate galectin-1-deficient glioma in the absence of adaptive immunity. Cancer Res. 74, 5079-5090 (2014).
  21. Baker, G. J., et al. Mechanisms of glioma formation: iterative perivascular glioma growth and invasion leads to tumor progression, VEGF-independent vascularization, and resistance to antiangiogenic therapy. Neoplasia. 16, 543-561 (2014).
  22. Ormerod, M. G., Novo, D. Flow cytometry : a basic introduction. , (2008).
  23. Stirling, D. P., Yong, V. W. Dynamics of the inflammatory response after murine spinal cord injury revealed by flow cytometry. J Neurosci Res. 86, 1944-1958 (2008).
  24. Hirai, T., et al. The prevalence and phenotype of activated microglia/macrophages within the spinal cord of the hyperostotic mouse (twy/twy) changes in response to chronic progressive spinal cord compression: implications for human cervical compressive myelopathy. PLoS One. 8, e64528(2013).
  25. Fleming, T. J., Fleming, M. L., Malek, T. R. Selective expression of Ly-6G on myeloid lineage cells in mouse bone marrow. RB6-8C5 mAb to granulocyte-differentiation antigen (Gr-1) detects members of the Ly-6 family. J Immunol. 151, 2399-2408 (1993).
  26. Wiesner, S. M., et al. De novo induction of genetically engineered brain tumors in mice using plasmid DNA. Cancer Res. 69, 431-439 (2009).
  27. Holland, E. C., et al. Combined activation of Ras and Akt in neural progenitors induces glioblastoma formation in mice. Nat Genet. 25, 55-57 (2000).
  28. Lynes, J., et al. Lentiviral-induced high-grade gliomas in rats: the effects of PDGFB, HRAS-G12V, AKT, and IDH1-R132H. Neurotherapeutics. 11, 623-635 (2014).
  29. de Vries, N. A., et al. Rapid and robust transgenic high-grade glioma mouse models for therapy intervention studies. Clin Cancer Res. 16, 3431-3441 (2010).
  30. Uhrbom, L., et al. Ink4a-Arf loss cooperates with KRas activation in astrocytes and neural progenitors to generate glioblastomas of various morphologies depending on activated Akt. Cancer Res. 62, 5551-5558 (2002).
  31. Marumoto, T., et al. Development of a novel mouse glioma model using lentiviral vectors. Nat Med. 15, 110-116 (2009).
  32. Assanah, M., et al. Glial progenitors in adult white matter are driven to form malignant gliomas by platelet-derived growth factor-expressing retroviruses. J Neurosci. 26, 6781-6790 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

PBMC infiltruj ce glejakamikro rodowisko guza m zgudysagregacja tkankiwirowanie w gradiencie g sto cianaliza kom rek NKinfiltracja kom rek mieloidalnychstereotaktyczna implantacja guzaperfuzja przezsercowa

Powiązane artykuły