Pierwszym krokiem w cyklu życia arenawirusa jest dołączenie cząsteczek wirusa do komórek gospodarza. Przedstawiamy ilościowy test oparty na (q)RT-PCR do ultraczułego wykrywania i ilościowego oznaczania zdarzeń związanych z przyłączeniem arenawirusa.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Bardzo czuły test do pomiaru przyłączenia komórki arenawirusa
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Arenawirusy to rodzina wirusów otoczkowych RNA, które powodują poważne choroby u ludzi. Pierwszym krokiem w cyklu życiowym arenawirusa jest przyłączenie cząsteczek wirusa do komórek gospodarza. Podczas gdy przyłączenie wirusa do komórki można zmierzyć za pomocą wirionów znakowanych biotyną, izotopami radioaktywnymi lub barwnikami fluorescencyjnymi, podejścia te zazwyczaj wymagają dużej wielokrotności infekcji (MOI), aby umożliwić wykrycie związanego wirusa. Opisujemy ilościowy test oparty na (q)RT-PCR, który mierzy przyłączenie szczepu wirusa Junin Candid 1 poprzez ilościowe oznaczanie genomowego RNA wirusa upakowanego w wirion. Test ten ma kilka zalet, w tym wyjątkową czułość i zdolność do pomiaru przyłączenia w szerokim zakresie dynamicznym MOI bez konieczności oczyszczania lub znakowania wirusa wejściowego. Co ważne, podejście to można łatwo dostosować do stosowania z innymi wirusami dzięki zastosowaniu specyficznych dla wirusa odczynników qRT-PCR. Co więcej, test ten można zmodyfikować, aby umożliwić pomiar endocytozy cząstek i odsłaniania genomu. Podsumowując, opisujemy prosty, ale solidny test do bardzo czułego pomiaru przyłączenia komórki arenawirusa.
Wprowadzenie
Arenawirusy to rodzina otoczkowych, jednoniciowych wirusów RNA, które występują głównie u gryzoni w naturze1-3. Podczas gdy wirusy te zazwyczaj wywołują bezobjawową, uporczywą infekcję w rezerwuarach gryzoni1,2, mogą powodować ciężką chorobę u ludzi3. Do ważnych gatunków chorobotwórczych należą wirus Junin z Nowego Świata (JUNV)4 i wirus Lassa ze Starego Świata5, które są czynnikami etiologicznymi odpowiednio argentyńskiej gorączki krwotocznej w Ameryce Południowej i gorączki Lassa w Afryce. Wirus limfocytarnego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych (LCMV), prototypowy wirus z rodziny6, występuje na całym ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Uwaga: Niezwykle ważne jest, aby opisany protokół był przeprowadzany przy użyciu ścisłej techniki pre-PCR (patrz 28, aby uzyskać doskonały przegląd tego, jak założyć laboratorium pre-PCR i jak przeprowadzać eksperymenty przy użyciu dobrej techniki pre-PCR). Konieczne jest, aby wszystkie odczynniki i sprzęt były wolne od amplifikowanego DNA zawierającego sekwencję docelową qPCR oraz aby istniały odpowiednie kontrole w celu wykrycia takiego zanieczyszczenia. Przegląd protokołu przedstawiono na rysunku 1.
1. Przygotuj pożywkę i komórki nasienne na płytkach 48-dołkowych
- Przygotować 500 ml kompletnego roztworu buforowego Dulbe....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Aby zademonstrować czułość i zakres dynamiczny testu qPCR, znane ilości plazmidu kodującego gen NP JUNV C#1 (zakres 5-5 x 107 kopii) poddano analizie qPCR zgodnie z opisem w sekcji 4 protokołu. Test jest czuły i pozwala na niezawodne wykrycie nawet 5 kopii docelowego kwasu nukleinowego (Rycina 2). Co więcej, zakres dynamiczny testu jest szeroki i, jak pokazano na Rycynie 2, może obejmować co najmniej 7 rzędów wielkości matrycy. Choć nie przedst.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisany przez nas protokół jest prosty i solidny, pod warunkiem że przestrzegane są następujące krytyczne względy. Po pierwsze, należy zastosować ścisłą technikę pre-PCR (patrz 28 w celu uzyskania doskonałej recenzji). Konieczne jest, aby wszystkie odczynniki i sprzęt były wolne od amplifikowanego DNA zawierającego sekwencję docelową qPCR oraz aby istniały odpowiednie kontrole w celu wykrycia takiego zanieczyszczenia. Po drugie, w przypadku części protokołu dotyczącej przyłączania się wirusa do komórki, wirus,.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Dziękujemy Markusowi Thali, Nathanowi Royowi, Christopherowi Zieglerowi, Emily Bruce i Benjaminowi Kingowi za pomocne dyskusje, a także National Institutes of Health za wsparcie tych badań poprzez granty T32 AI055402 (JK), R21 AI088059 (JB) i P20RR021905 (JB).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| DMEM | Life Technologies | 11965-118 | |
| Penicylina-Streptomycyna | Life Technologies | 15140-163 | 100x |
| Roztwór buforowy HEPES Life | Technologies | 15630-130 | 100x |
| PBS pH 7.4 | Life Technologies | 10010-023 | 1x |
| komórki Vero E6 | Kolekcja kultur typu amerykańskiego | CRL-1586 | |
| Costar 48-dołkowa płytka | Corning | 3548 | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74106 | nie mieszaj RLT lub RW1 z wybielaczem |
| Homogenizator QIAshredder | Qiagen | 79654 | |
| Taqman Universal PCR Master Mix | Life Technologies | 4326614 | |
| Multiscribe Odwrotna transkryptaza (50U/&mikro; l) | Life Technologies | 4311235 | |
| Mieszanina dNTP (10 mM; 2,5 mM każdy dNTP) | Life Technologies | N808-0260 | |
| GeneAmp 10X PCR Buffer II i 25 mM roztwór MgCl2 | Technologies | N808-0010 | |
| Inhibitor RNazy (5000U/100 µ l) | Podkład Life Technologies | N808-0119 | |
| RT 5'-AAGGGTTTAAAAAT GGTAGCAGAC-3' | Integrated DNA Technologies | 250 nmol DNA oligo | standardowe odsalanie |
| Forward qPCR starter 5'-CATGGAGGTCAAACAACTTCCT-3' | Life Technologies | 4304971 | standardowe odsalanie |
| Odwrócony starter qPCR 5'-GCCTCCAGACATGGTTGTGA-3' | Life Technologies | 4304971 | standardowa sonda odsalania |
| TaqMan 5'-6FAM-ATGTCATCGGATCCTT-MGBNFQ-3' | Life Technologies | 4316033 | Oczyszczona |
| HPLC 96-dołkowa płytka reakcyjna MicroAmp Fast Optical (0,1 ml) | Life Technologies | 4346906 | |
| System StepOnePlus do PCR w czasie rzeczywistym | Life Technologies | 4376598 | lub inny instrument qPCR |
Bibliografia
- Childs, J. C., Peters, C. J. The Arenaviridae. Salvato, M. S. , Plenum Press. 331-373 (1993).
- Salazar-Bravo, J., Ruedas, L. A., Yates, T. L. Mammalian reservoirs of arenaviruses. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 262, 25-63 (2002).
- Buchmeier, M. J., de la Torre, J. C., Peters, C. J., et al. Ch. 50.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
