Oto protokół do hodowli pluripotencjalnych komórek macierzystych (PSC) i nerwowych komórek macierzystych (NSC) w zamkniętym systemie hodowli komórek, który pozwala na maksymalną sterylność i odtwarzalność, zastępując tradycyjną komorę bezpieczeństwa biologicznego i inkubator. To urządzenie spełnia wytyczne dobrej klinicznej praktyki produkcyjnej (cGMP) i dobrej praktyki klinicznej (cGLP).
Artykuł metodologiczny
Hodowla ludzkich pluripotencjalnych i nerwowych komórek macierzystych w zamkniętym systemie hodowli komórek do badań podstawowych i przedklinicznych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ten artykuł opisuje, jak używać specjalnie wyprodukowanego, dostępnego na rynku zamkniętego systemu hodowli komórkowych do badań podstawowych i przedklinicznych. Komory bezpieczeństwa biologicznego (BSC) i inkubatory od dawna są standardem w hodowli i namnażaniu linii komórkowych do badań podstawowych i przedklinicznych. Jednak w związku z tym, że wiele laboratoriów zajmujących się komórkami macierzystymi przenosi się z badań podstawowych na translację kliniczną, potrzebne są dodatkowe wymagania dotyczące systemu hodowli komórek. Wszystkie procesy muszą być dobrze udokumentowane i spełniać wyjątkowe wymagania dotyczące sterylności i odtwarzalności. W tradycyjnych inkubatorach stężenia gazów i temperatury ulegają znacznym wahaniom za każdym razem, gdy komórki są usuwane w celu karmienia, pasażowania lub innych manipulacji. Takie przerwy przyczyniają się do tworzenia środowiska, które nie jest standardem dla wytycznych cGMP i GLP. Przerwy te muszą być zminimalizowane, zwłaszcza gdy komórki są wykorzystywane do celów terapeutycznych. Motywacją do przejścia ze standardowego systemu BSC i inkubatora na system zamknięty jest to, że takie przerwy mogą być znikome. Systemy zamknięte zapewniają przestrzeń roboczą do karmienia i manipulowania kulturami komórkowymi oraz utrzymywania ich w kontrolowanym środowisku, w którym temperatura i stężenia gazów są stałe. W ten sposób pluripotencjalne i multipotencjalne komórki macierzyste mogą być utrzymywane w optymalnym zdrowiu od momentu ich pozyskania aż do ich ostatecznego wykorzystania w terapii.
Wprowadzenie
Standardowe techniki hodowli komórek macierzystych cierpią z powodu kilku ograniczeń środowiskowych, które nadmiernie obciążają komórki i narażają je na niedopuszczalne ryzyko kontaminacji. Wśród stresów, które komórki mogą wytrzymać w standardowych warunkach hodowli komórkowej, są gwałtowne zmiany poziomu dwutlenku węgla i stężenia tlenu3,4. Dzieje się tak, gdy komórki są przenoszone z inkubatora do komory bezpieczeństwa biologicznego i/lub mikroskopu, co może nie być optymalne dla komórek. Wcześniejsze badania potwierdziły korzyści płynące z hodowli zarówno pluripotencjalnych, jak i nerwowych komórek macierzystych w warunkach niedotlenienia4,11, a aby uzyskać najlepsze wyniki, warunki te muszą być ciągłe. Co więcej, ryzyko skażenia komórek jest wyższe, ponieważ środowisko laboratoryjne i personel wpływają na komórki na prawie każdym etapie ich hodowli i manipulacji. Tradycyjne pomieszczenia czyste stanowią jedną ze skutecznych metod znacznego zmniejszenia ryzyka zanieczyszczenia, ale są drogie, zajmują duży ślad węglowy i nie rozwiązują problemów związanych ze stężeniami dwutlenku węgla i tlenu.
Zakład produkcji komórek, który może zająć się zarówno ryzykiem skażenia, jak i stężeniami gazów, i który może być zakwalifikowany do spełnienia kryteriów cGMP,9 dostarcza wysokiej jakości ogniwa do badań z zakresu nauk podstawowych, jak również do zastosowań klinicznych1,6,7. Taki zakład produkcji komórek składa się co najmniej z następujących elementów: komory procesowej, która działa jak ogrzewane miejsce pracy do karmienia i manipulowania kulturami komórkowymi; okap z przepływem laminarnym do wstępnej sterylizacji odczynników, probówek i narzędzi; dwie komory buforowe śluzy powietrznej pomiędzy okapem a komorą procesową; dwa inkubatory do hodowli komórkowych dostępne z komory procesowej; komora mikroskopowa przylegająca do komory procesowej; i wreszcie oprogramowanie komputerowe do ustawiania i monitorowania warunków w tych modułach. Korzystając z tej podstawowej infrastruktury, można wykonywać wiele różnych zadań, takich jak standardowe karmienie i pasażowanie pluripotencjalnych komórek macierzystych i multipotencjalnych nerwowych komórek macierzystych, a także bardziej specjalistyczne metody, takie jak przeprogramowanie oparte na wirusie Sendai, badania migracji in vitro i różnicowanie nerwowych komórek macierzystych w celu charakterystyki elektrofizjologicznej.
Protokół
1. Wstępna konfiguracja
- Ustawianie stężeń gazu i temperatury
- Korzystając z oprogramowania, kliknij zakładkę "Gość" znajdującą się w lewym górnym rogu interfejsu graficznego. Zaloguj się do systemu za pomocą wyznaczonej nazwy użytkownika i hasła. Upewnij się, że każdy użytkownik ma własną nazwę użytkownika i hasło.
- Kliknij moduł, aby dostosować (Rysunek 1). W nowym oknie wyświetlającym aktualne ustawienia kliknij istniejącą wartość zadanąO2 poniżej "Wartość zadaną" i wprowadź wymagany poziom stężeniaO2 dla tego modułu. Wprowadź 5% O2, jeśli pluripotencjalne komórki macierzyste będą hodowane lub manipulowane w tym module, i 9% O2, jeśli neuronalne komórki macierzyste będą hodowane lub manipulowane. Kliknij zielony znacznik wyboru, aby potwierdzić nastawę.
Uwaga: Dwa moduły nie są regulowane gazem: osłona laminarna i komora mikroskopu. Stężenia gazów w okapie z przepływem laminarnym są atmosferyczne, podczas gdy te w komorze mikroskopu są pasywnie utrzymywane przez stężenia gazów w komorze procesowej. - Powtórz ten krok dla CO2 . Wprowadź nastawę 5% CO2 dla wszystkich modułów z wyjątkiem komór buforowych, które są regulowane tylko dla O2 .
- Monitoruj aktualne stężenia gazów, które są oznaczone jako "wartości procesowe", aby upewnić się, że osiągają nowe nastawy.
- Dostosuj nastawy gazu we wszystkich modułach do odpowiednich wartości. Dopasuj poziomy CO2 i O2 komór, które będą narażone na wzajemne działanie. Na przykład należy ustawić komorę procesową na 5% O2 przed otwarciem inkubatora, w którym hoduje się komórki w temperaturze 5%O2. Dostosuj również do 5% O2 dowolną komorę buforową, która jest używana do dodawania przedmiotów do komory procesowej w tym czasie.
- Ustaw temperaturę w komorze procesowej na 37 °C za pomocą tego samego ekranu do regulacji gazu. Ustaw również temperaturę podłogi komory procesowej na 37 °C.
- Kliknij na banki modułów inkubacyjnych pod każdym inkubatorem. Ustaw temperaturę banków na 37 °C.
- Eksploatacja komór buforowych
- Na początku zbierz wszystkie materiały potrzebne do danego zadania (karmienie, dzielenie, barwienie itp.), aby zapobiec opóźnieniu w przepływie pracy. Obficie spryskaj wszystkie materiały 70% etanolem i pozwól im wyschnąć w okapie laminarnym. Nie spryskiwać kolb ani płytek z komórkami - przetrzyj je delikatnie sterylną gąbką z gazy nasączoną 70% etanolem.
- Upewnij się, że zarówno zewnętrzne, jak i wewnętrzne drzwi komory buforowej są dobrze zamknięte. Następnie otwórz drzwi zewnętrzne i umieść przedmioty w środku.
- Zamknij drzwi zewnętrzne. W oprogramowaniu wybierz moduł buforowy i kliknij zakładkę współczynnika rozcieńczenia. Wprowadź wartość 1 w polu logarytmu współczynnika. Kliknij przycisk start.
Uwaga: "Współczynnik rozcieńczenia" jest zdefiniowany w taki sposób, że atmosfera modułu buforowego zostanie opróżniona i zastąpiona 1 raz czystym gazem przefiltrowanym przez HEPA. - Gdy interfejs graficzny przestanie migać "współczynnik rozcieńczenia", otwórz wewnętrzne drzwiczki komory buforowej i wprowadź materiały do komory procesowej.
Ostrzeżenie: Nie pozwól, aby drzwi wewnętrzne i zewnętrzne były otwarte w tym samym czasie i nie otwieraj drzwi wewnętrznych, jeśli komora buforowa nie została poddana współczynnikowi rozcieńczenia. - W celu usunięcia przedmiotów z komory procesowej należy najpierw upewnić się, że komora buforowa została poddana współczynnikowi rozcieńczenia. Następnie otwórz drzwi wewnętrzne, umieść w środku przedmioty, które mają zostać usunięte, i zamknij drzwi wewnętrzne. Następnie otwórz zewnętrzne drzwi i wyjmij przedmioty.
Uwaga: Nie ma potrzeby sprawdzania współczynnika rozcieńczenia przed otwarciem drzwi zewnętrznych.
2. Wprowadzanie i karmienie komórek
- Konfiguracja inkubatora
- Umieść 3 szalki Petriego w misce wodnej u podstawy każdego inkubatora. Napełnij te naczynia sterylną wodą. Nie napełniaj miski na wodę bezpośrednio. Utrzymuj poziom wody w tych naczyniach, ponieważ mają one kluczowe znaczenie dla utrzymania nastawy wilgotności względnej (RH) w inkubatorach.
- W interfejsie graficznym kliknij inkubator. Kliknij istniejącą wartość wilgotności względnej (RH) w polu Nastawa i wprowadź 85%. Kliknij zielony znacznik wyboru, aby zaakceptować tę wartość.
- Przygotowanie zakładu produkcji ogniw do ogniw
- Jeśli jeszcze tego nie zrobiono, dostosuj komory buforowe, komorę procesową i inkubator do nastaw gazu wymaganych dla typu wprowadzanej komórki.
- Oczyść powierzchnię komory procesowej sterylną gazą i niepalnym środkiem dezynfekującym. Nie używaj żadnych środków dezynfekujących na bazie kwasu nadoctowego, ponieważ w systemie zamkniętym silne, utrzymujące się opary są toksyczne dla komórek ssaków. Zamiast tego używaj produktów na bazie chlorku benzalkoniowego.
- Kontynuuj dezynfekcję. Wyczyść rękawice i powierzchnie, które są często dotykane, takie jak klamki drzwi. Używaj środka dezynfekującego dokładnie, ale oszczędnie, ponieważ nadmiar płynu w komorze procesowej przyczyni się do wilgoci, kondensacji i możliwego rozwoju drobnoustrojów.
- Oczyść powierzchnię okapu z przepływem laminarnym i komory buforowej 70% etanolem i pozostaw do wyschnięcia. Umieść kolbę lub płytkę z komórkami (w naszym przypadku PSC lub NSC) w kapturze i krótko przetrzyj jej zewnętrzną powierzchnię sterylną gąbką z gazy nasączonej etanolem.
- Umieścić kolbę lub płytkę w komorze buforowej i uruchomić współczynnik rozcieńczenia (krok 1.2.3).
- Po zakończeniu pomiaru współczynnika rozcieńczania należy natychmiast przenieść kolbę lub płytkę do odpowiedniego inkubatora. Ponieważ inkubatory znajdują się z tyłu komory procesowej, wyciągnij półkę do komory procesowej w celu umieszczenia komórek. Należy unikać niepotrzebnego otwierania drzwi inkubatora lub przez dłuższy czas, ponieważ powietrze w komorze procesowej jest bardzo suche w porównaniu z powietrzem w inkubatorach, co spowoduje znaczną utratę wilgotności w inkubatorze.
- Karmienie kultur komórkowych
- Zebrać składniki pożywki, pipety serologiczne, pipet elektroniczny, gazę i środek dezynfekujący. Zbierz również pojemnik na odpady na zużytą pożywkę do hodowli komórkowych, ale nie napełniaj go wybielaczem. Wprowadzić materiały do komory procesowej przez komorę buforową, jak opisano w sekcji 1.2. Przygotować pożywkę do hodowli komórkowych w komorze procesowej, jak opisano wcześniej9,10 (patrz również tabela materiałów)
- Ułóż materiały w taki sposób, aby umożliwić optymalną przestrzeń roboczą. Unikaj umieszczania przedmiotów, które nie są używane, na środku komory procesowej.
- Pozwolić, aby pożywka zrównoważyła się z poziomami CO2 i O2 obecnymi w systemie, pozostawiając pojemnik na pożywkę lekko niezakorkowany. Niektórzy producenci pożywek PSC zalecają, aby nie podgrzewać pożywek w temperaturze 37 ºC; W takim przypadku należy użyć komory buforowej, aby zrównoważyć pożywkę. Pozwól pożywce zrównoważyć się przez 20 minut.
- Usunąć starą pożywkę ze studzienek za pomocą odpowiedniej pipety stereologicznej i pipetora elektronicznego. W przypadku PSC należy usunąć całą pozostałą ilość starego podłoża z wyjątkiem niewielkiej, wystarczającej do zapobieżenia wysuszeniu podczas procesu karmienia. W przypadku NSC usuń połowę starego podłoża. Odpipetować odpady do pojemnika na odpady.
- Zużytą pipetę należy umieścić z powrotem w oryginalnym opakowaniu i przesunąć ją na bok komory procesowej lub do komory buforowej przeznaczonej do usuwania odpadów. Za pomocą świeżej, sterylnej pipety serologicznej dodać świeżą pożywkę do płytek do kultur komórkowych i umieścić płytki z powrotem w wyznaczonym inkubatorze.
- Pod koniec karmienia spryskaj gazę środkiem dezynfekującym i dokładnie wyczyść podłogę oraz klamki drzwi komory procesowej. Jeśli w systemie hoduje się wiele linii komórkowych, sterylizuj między karmieniami każdej linii komórkowej. Pomaga to zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia krzyżowego.
- Po zakończeniu usuń odpady lub inne niepotrzebne przedmioty przez jedną z komór buforowych.
3. Dzielenie kultur komórkowych
- Pasażowanie enzymatyczne PSC lub NSC
- Zbierz wszystkie przedmioty potrzebne do przejścia. Obejmuje to pożywki, enzymy lub nieenzymatyczne do dysocjacji komórek (ten ostatni jest przeznaczony tylko dla NSC), DPBS, płytki lub kolby, macierz zewnątrzkomórkową (ECM), rurki stożkowe i pipety serologiczne. Wprowadź je do systemu za pomocą komory buforowej.
- Pokryć świeże talerze lub kolby ECM, jak opisano wcześniejw punktach 9,10. Niektóre ECM - takie jak te pochodzące z linii komórkowych mięsaka myszy - są cieczą tylko w temperaturze od 4 do 15 °C, dlatego należy użyć wysterylizowanego zimnego bloku lub żelowego okładu z lodu, aby utrzymać ECM w niskiej temperaturze podczas pracy w ogrzewanej komorze procesowej.
- Odpipetować zużytą pożywkę z kultury i wyrzucić ją do pojemnika na odpady.
- Przepłukać powierzchnię studzienki lub kolby za pomocą 1 ml DPBS/studzienki i usunąć DPBS.
- Dodaj 1-2 ml ciepłego enzymu do każdej studzienki. Tylko bardzo gęste kultury wymagają 2 ml.
- Natychmiast przenieś naczynie lub kolbę hodowlaną do komory mikroskopu i uważnie obserwuj kulturę. Uważaj na oznaki, że poszczególne komórki zaczynają się rozluźniać z naczynia. Nie czekaj, aż komórki uniosą się w zawiesinie, zanim przejdziesz do następnego kroku.
- Wróć komórki do głównej komory procesowej. Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml dodać 4 ml DPBS na każdy 1 ml enzymu, a następnie mocno pipetować w górę i w dół, aby usunąć komórki z powierzchni studzienki. W przypadku przechodzenia przez wiele studzienek w płycie wielościennej, dodaj DPBS do każdej studzienki przed usunięciem komórek z poszczególnych studzienek.
- Przenieść enzym i zawiesinę komórek PBS do stożkowej probówki o odpowiedniej wielkości.
- Jeśli wirówka nie jest dostępna w zakładzie produkcji komórek, szczelnie zamknij stożkową rurkę, umieść ją w komorze buforowej i zamknij drzwiczki.
- Wyjąć rurkę stożkową z komory buforowej od strony przepływu laminarnego i obracać komórki pod ciśnieniem 100 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
- Spryskaj stożkową rurkę 70% etanolem i wprowadź ją do komory procesowej za pomocą komory buforowej i współczynnika rozcieńczenia.
- Odpipetować supernatant i ponownie zawiesić komórki w 2 ml pożywki PSC lub NSC. W przypadku pasażowania PSC należy upewnić się, że inhibitor ROCK znajduje się w pożywce o stężeniu 10 μM, jak opisano wcześniej9,10.
- Policz komórki za pomocą hemocytometru i określ wymaganą liczbę dołków lub płytek. Płytka PSC o wymiarach 5 x 104 - 1 x 105 komórek/cm2. Podziel NSC w stosunku 1:2.
Uwaga: NSC często zbijają się i opierają się dokładnemu liczeniu w hemocytometrze. - Jeśli wymagana jest kriokonserwacja komórek, należy postępować zgodnie z odpowiednim protokołem9,10, ale należy upewnić się, że wszystkie materiały i środki do zamrażania są wcześniej przygotowane i umieszczone w komorze procesowej. DMSO jest bardzo toksyczny dla komórek w temperaturze 37 ºC, więc działa bardzo szybko. Pojemnik do zamrażania z płaszczem izopropanolu należy przechowywać w temperaturze pokojowej w okapie z przepływem laminarnym. Po napełnieniu i zamknięciu fiolek do krioprezerwacji, należy natychmiast wyjąć fiolki z komory procesowej, przepuszczając je przez komorę buforową.
- Ręczne przechodzenie PSC
- Upewnij się, że kultura musi zostać pasażowana, jak opisano wcześniej8. Jeśli tak, przygotuj świeże płytki lub kolby pokryte macierzą zewnątrzkomórkową. Następnie całkowicie zmień nośnik.
- Wyczyść komorę mikroskopu sterylną gazą zwilżoną niewielką ilością niepalnego środka dezynfekującego - zbyt duża ilość spowoduje nadmierne zaparowanie komory. Czyść tylko rękawice, powierzchnię podłogi i scenę. Do komory należy włożyć kilka oddzielnie opakowanych końcówek pipet o pojemności 200 μl lub 1 000 μl.
- Przenieś płytkę PSC do komory mikroskopu, zdejmij pokrywę i połóż ją ekranem do dołu na świeżo umytej podłodze. Pozostawienie pokrywy do góry naraża spód bezpośrednio na prądy powietrza i potencjalne zanieczyszczenie.
- Rozwiń końcówkę pipety i używając mikroskopu do wizualizacji kultury, wybierz kolonie, które mają dobrą morfologię, używając końcówki pipety.
Uwaga: Końcówka pipety może być dołączona do pipety, jeśli indywidualny użytkownik uzna to za wygodniejsze. - Załóż pokrywkę na płytkę i przenieś płytkę z powrotem do komory procesowej.
- Odpipetować nadmiar ECM z nowej płytki i przenieść pożywkę ze starej płytki (zawierającej kawałki kolonii w zawiesinie) na nową płytkę. Jeśli stary talerz nadal zawiera kolonie, które nie są gotowe do zbioru, nakarm go również.
4. Specjalistyczne techniki hodowlane
- Transdukcja fibroblastów z Sendai do PSC
- W zakładzie produkcji komórek rozpręż fibroblasty ludzkiej skóry1 w pożywce fibroblastów zawierającej DMEM/F12, 10% FBS i 20 ng/ml FGF2, przy 5%O2. Używaj 6-dołkowych naczyń do hodowli pokrytych 0,1% żelatyną.
- Przygotuj komórki do transdukcji, dysocjując je 1 ml 0,25% trypsyny na dołek. Dezaktywuj trypsynę za pomocą 1 ml pożywki z fibroblastami. Odwirować w 200 x g, ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki z fibroblastów i policzyć je za pomocą hemocytometru.
- Ponownie zawiesić 2,0 x 105 komórek w 2 ml pożywki z fibroblastów i dodać zawiesinę komórkową do 1 dołka 6-dołkowej płytki pokrytej żelatyną (2,1 x 104 komórki/cm2). Umieść komórki z powrotem w inkubatorze.
- Odczekaj 24 godziny, aż komórki przyczepią się do dolnej części płytki.
- Umieścić świeżą pożywkę fibroblastową w komorze procesowej (1 ml pożywki na studzienkę komórek, która ma być transdukowana) i pozostawić do zrównoważenia z gazami.
- Wysterylizuj wstępnie schłodzony zimny blok z 70% etanolem i umieść go w komorze buforowej. Użyj żelowego okładu z lodu z wyciętymi otworami, jeśli komercyjny zimny blok nie jest dostępny.
Uwaga: Istnieją 3 - 4 oddzielne wirusy Sendai (w zależności od wersji zestawu do transdukcji), które należy szybko rozmrozić, ale po rozmrożeniu przechowywać w zimnym bloku. - Zanurz dolną połowę rurek w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 15 sekund (nie zanurzaj rurek), a następnie natychmiast wyczyść zewnętrzną część rurki 70% etanolem. Umieścić probówki na wysterylizowanym zimnym bloku w komorze buforowej i uruchomić współczynnik rozcieńczenia.
- Pracując szybko, dodaj niezbędną objętość każdego wirusa przeprogramowującego Sendai do zrównoważonego podłoża2. Objętość ta jest określana przez trzy zmienne - liczbę komórek, miano każdego wirusa i pożądaną liczbę infekcji dla każdego wirusa. Zapoznaj się z instrukcją zestawu, aby uzyskać informacje na temat zalecanego MOI. Wzór to:
[(liczba transfekowanych komórek) (mnogość infekcji) (1 000)] / (miano wirusa) = wymagany μl wirusa
- Usunąć supernatant z studzienki (studzienek) komórek, które mają zostać przeprogramowane. Do każdej studzienki dodać 1 ml pożywki zawierającej wirusy. Delikatnie kołysz płytką, uważając, aby nie rozlać pożywki, i umieść płytkę z powrotem w inkubatorze 5%O2.
- Po 2 godzinach ponownie delikatnie kołysz płytką i powtórz ponownie po kolejnych 2 godzinach.
- Po 24 godzinach (1 dzień po transdukcji) nakarmić studzienkę 1 ml pluripotencjalnej pożywki z komórek macierzystych. Powtórz w 2 dniu, ale nie usuwaj podłoża z dołka.
- W dniach 3 i 4 zmień połowę podłoża.
- W dniu 5 i później zmień całe medium.
- Kiedy pojawią się kolonie, wybarwić kulturę za pomocą sterylnych przeciwciał, aby potwierdzić, że kolonie są rzeczywiście pluripotencjalne, jak opisano wcześniej2. Podobnie jak w przypadku komórek karmionych, należy upewnić się, że pożywka PSC zawierająca przeciwciała została zrównoważona z gazami w zakładzie produkcji komórek.
Uwaga: W przypadku udanego przeprogramowania kolonie iPSC powinny być obecne około dwa tygodnie po transdukcji1. - Gdy kolonie urosną wystarczająco duże, należy użyć mikroskopu, aby oznaczyć je i mechanicznie umieścić na płytce pokrytej ECM, jak opisano w sekcji 3.2.
- Namnażać kolonie ręcznie lub enzymatycznie, jak opisano wcześniej9,10.
5. Sprzątanie po codziennym użytkowaniu
- Umieścić wszystkie odpady, w tym kolbę na odpady płynne, w sterylnej komorze buforowej. Przetrzyj powierzchnię komory procesowej i wszystkie obszary, które miały kontakt z materiałami eksploatacyjnymi, sterylną gazą i niepalnym środkiem dezynfekującym.
- Usuń wszystkie odpady stałe z komory buforowej i wyrzuć do odpowiedniego pojemnika na odpady.
- Wyrzuć płynne odpady do odpowiedniego pojemnika na odpady lub po prostu wymieszaj z wybielaczem i slej do odpływu. Wyczyść pojemnik na odpady mydłem i szczotką. Wysterylizuj pojemnik 70% etanolem i przenieś go z powrotem do komory procesowej przez komorę buforową.
Uwaga: Nie zaleca się używania wybielacza w pojemniku na odpady, gdy znajduje się on wewnątrz systemu, ponieważ opary wybielacza mogą recyrkulować i uszkadzać kultury komórkowe. - Ze względów higienicznych przetrzyj przednią plastikową powierzchnię komory przetwarzania systemu 70% etanolem. Pomaga to usunąć pot i oleje skórne z czoła użytkownika.
- Jeśli w komorze procesowej nagromadziła się kondensacja, należy uruchomić współczynnik rozcieńczenia, aby usunąć kondensację. Poczekaj co najmniej 1 godzinę, aby to zakończyć.
6. Rutynowe zadania niecodzienne
- W razie potrzeby uzupełnij naczynia z wodą w inkubatorach do hodowli komórkowych sterylną, destylowaną wodą. Uzupełniaj naczynia przynajmniej raz w tygodniu. Jednak szybkość parowania będzie się wahać w zależności od częstotliwości otwierania drzwi inkubatora, objętości płynu w kulturach i ustawień inkubatora.
- Raz w miesiącu należy ponownie skalibrować ustawieniaO2 i CO2 we wszystkich komorach. Wymaga to użycia gazu SPAN (kalibracyjnego), który zawiera znane poziomy stężeńO2 i CO2 jako wzorzec odniesienia. Przed rozpoczęciem kalibracji upewnij się, że jest odpowiedni dopływ gazu SPAN. System wykorzystuje specjalne czujniki gazu, umieszczone w każdym module, do wykrywania stężeń gazów; w ten sposób zastosowanie wysokiej jakości gazów SPAN zapewnia, że czujniki niezawodnie zapewniają dokładne stężenia gazów.
- Rękawice w komorze procesowej i komorze mikroskopu należy regularnie wymieniać. Rękawice należy wymieniać co 2 miesiące, niezależnie od tego, jak często system jest używany. Przed montażem wysterylizuj nowe rękawice środkiem dezynfekującym. Uruchomić współczynnik rozcieńczenia w komorze procesowej po wymianie rękawic.
Uwaga: Po naciągnięciu na mankiety systemu rękawice nitrylowe mają tendencję do powstawania w miejscach narażonych na obciążenia fizyczne i ciepło. Jest to normalne i nieuniknione zużycie. - Filtry strzykawkowe należy wymieniać we wszystkich komorach co 6 miesięcy.
- Wymień lub umyj filtr wstępny w okapie z przepływem laminarnym, gdy tylko zacznie wydawać się brudny.
- Należy regularnie zapoznać się z dokumentami producenta, aby uzyskać informacje na temat wymiany głównych części.
7. Czyszczenie systemu
- W przypadku poważnego zanieczyszczenia mającego wpływ na większość kultur komórkowych, wszystkie ocalałe hodowle komórkowe należy przenieść z systemu lub (jeśli to możliwe) do nieuszkodzonego inkubatora.
- Wyłączyć kontrolę gazu we wszystkich komorach z wyjątkiem inkubatorów, w których nie ma wpływu naruszeń.
- Zdejmij elastyczny panel przedni aparatu i wyjmij półki ze stali nierdzewnej z inkubatora do hodowli komórkowych dotkniętych chorobą. Wyjmij również miskę na wodę.
- Półki inkubatora i miskę na wodę należy złożyć w autoklawie, a następnie włożyć je z powrotem do inkubatora. Przetrzyj wewnętrzne powierzchnie inkubatora 70% etanolem. Poczekaj, aż etanol odparuje i zamknij drzwi inkubatora.
- Przetrzyj powierzchnie procesu i komory mikroskopu 70% etanolem. Załóż przedni panel urządzenia.
- Przetrzyj wewnętrzne powierzchnie aparatu, w tym powierzchnię dotkniętego inkubatora, niepalnym środkiem dezynfekującym. Pozostaw otwarte drzwi dotkniętego inkubatora i uruchom współczynnik rozcieńczenia w komorze procesowej. Upewnij się, że drzwi komory mikroskopu są również otwarte.
- W celu rutynowego czyszczenia inkubatorów do hodowli komórkowych należy upewnić się, że inkubator i komora procesowa znajdują się w tych samych ustawieniach atmosferycznych. Otwórz drzwi inkubatora i umieść wszystkie szalki z kulturami komórkowymi na powierzchni komory procesowej.
- Przetrzyj półki inkubatora i powierzchnie wewnętrzne niepalnym środkiem dezynfekującym. Poczekaj, aż środek dezynfekujący odparuje, a następnie przenieś kultury komórkowe z powrotem do inkubatora. Pracuj tak szybko, jak to możliwe, aby uniknąć wysuszenia kultur komórkowych.
Wyniki
Niniejszy manuskrypt szczegółowo opisuje instalację do produkcji komórek oraz specyficzne aspekty hodowli komórkowej w systemie zamkniętym. Główną część instalacji do produkcji komórek stanowi wykonane na zamówienie, zamknięte urządzenie do hodowli komórkowej, które zajmuje niewielką powierzchnię i może zostać łatwo umieszczone w pomieszczeniu o wymiarach 6 x 7,5 m2 (Rysunek 2). Komórki znajdujące się w urządzeniu nie mają w żadnym momencie kontaktu z personelem laboratoryjnym ani środowiskiem zewnętrznym. Urządzenie składa się z kilku modułów: komory procesowej, dygestorium z laminarnym przepływem powietrza, dwóch buforowych śluz powietrznych umieszczonych pomiędzy dygestorium a komorą procesową, dwóch inkubatorów do hodowli komórkowej oraz komory mikroskopowej sąsiadującej z komorą procesową (Rysunek 3). System jest sterowany za pomocą oprogramowania pozwalającego na kontrolę i monitorowanie zmiennych środowiskowych (Rysunek 1). Komputer obsługujący to oprogramowanie jest podłączony do zasilacza bezprzerwowego. Gazy są doprowadzane do systemu za pomocą zestawu kolektorów tlenu, azotu i dwutlenku węgla (Rysunek 4). Gazy dla urządzenia są dostarczane przez systemy kolektorowe, z których każdy posiada dwa zestawy butli – zestaw aktywny i zapasowy. Po wyczerpaniu zestawu aktywnego kolektor automatycznie przełącza się na zestaw zapasowy, a personel zamawia butle zamienne. Zasilanie jest wspierane przez system generatorów awaryjnych.
Komórki pluripotencjalne oraz neuralne komórki macierzyste mogą być hodowane w warunkach hipoksji w tym ośrodku zgodnie z wcześniej opracowanymi protokołami9, z uwzględnieniem dodatkowych komplikacji wynikających z zastosowania nowego sprzętu. Pluripotencjalne komórki macierzyste można uzyskać za pomocą wirusa Sendai, wykorzystując przeciwciała specyficzne dla pluripotencji do identyfikacji w pełni przetransfekowanych kolonii, które są następnie izolowane i namnażane (Rycina 5A i B). Z tych iPSC można wyprowadzić neuralne komórki macierzyste oraz neurony przy użyciu podwójnej inhibicji SMAD, a ich fenotyp zweryfikować za pomocą przeciwciał specyficznych dla NSC (Rycina 5C i D).
Rysunek 1. Interfejs graficzny zakładu produkcji komórek. (A) Graficzna reprezentacja CPF jest ekranem domyślnym i odpowiada rysunkowi CAD przedstawionemu na Rysunku 3. Kliknięcie myszą w Module Buforowym 1 (2F na Rysunku 1) otwiera jego ekran sterowania (B), na którym wartości O2 są ustawiane zgodnie z parametrami komory procesowej (3 na Rysunku 3). Podobnie, kliknięcie w Komorę Procesową lub Inkubator 1 otwiera ich odpowiednie ekrany sterowania (C i D), gdzie można w razie potrzeby zmieniać lub monitorować wartości. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 2. Zakład produkcji komórek. (A) System widziany z perspektywy przednio-prawej. Zwróć uwagę na przyłącza elektryczne i gazowe w suficie oraz wózek z akcesoriami do mikroskopu i komputerem po prawej stronie. (B) Dygestorium z laminarnym przepływem powietrza z drzwiami dostępowymi do modułów buforowych widocznymi po prawej stronie. (C) Komora procesowa z dwoma inkubatorami (czarne drzwi) widocznymi z tyłu. (D) Widok przez prawą stronę systemu, przedstawiający mikroskop i monitor, z drzwiami do komór buforowych widocznymi w oddali. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 3. Rysunek CAD instalacji do produkcji komórek. Wszystkie elementy wprowadzane do urządzenia są najpierw przecierane alkoholem i suszone powietrzem w dygestorium z laminarnym przepływem powietrza (1). Następnie elementy są przenoszone do odpowiedniej atmosfery w przednim module buforowym (2F), a następnie przekazywane do modułu UCPC, czyli komory procesowej (3). Komórki są hodowane w dwóch inkubatorach (4, 5). Barwienie żywych komórek, wybieranie kolonii, ocena ogólnej morfologii komórkowej oraz analiza migracji odbywają się w module UPC, czyli komorze mikroskopowej (6). Na koniec odpady opuszczają system poprzez tylny moduł buforowy (2R). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Rysunek 4. Źródła gazów i zasilania. (A) Kolektor CO2 to układ 4 x 4, ponieważ zasila wszystkie inkubatory w laboratorium. (B) Kolektor O2 to układ 2 x 2, który zasila wyłącznie instalację do produkcji komórek. Azot do systemu jest wytwarzany w parowniku (C, tuż poniżej znaku wyjścia) podłączonym do kolektora azotu w stanie ciekłym (po prawej stronie), który automatycznie napełnia również zamrażarki kriogeniczne (na dole po lewej). Kolektor to układ 2 x 2 zasilany przez dwie pary zbiorników z ciekłym azotem o pojemności 160 L. CO2, O2 oraz N2 są doprowadzane z sufitu poprzez zawory odcinające (D). W tym miejscu dostępna jest również próżnia instalacyjna. Tuż za zaworami odcinającymi gazu widoczna jest para kabli zasilających, które dostarczają energię do systemu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Rycina 5. Pluripotencjalne komórki macierzyste pochodzące z hipoksji z użyciem wirusa Sendai. (A) iPSC SC187-SF4-2I0-E3 (nazewnictwo według Stover et al.9), kontrast fazowy 10X. (B) iPSC SC88.1-UH1-2I0 barwione na żywo przy użyciu Tra-1-60 znakowanego AF-594, rozcieńczenie 1:100 w pożywce. Wszystkie iPSC zostały przetransdukowane w zakładzie produkcji komórek w 5% O2 za pomocą wirusa Sendai. (C) Kontrast fazowy NSCs pochodzących z iPSC SC68.1-UH0-2I0-M0S13-N2G6, hodowanych w 5% O2 na szkiełkach komorowych. Komórki następnie utrwalono w 4% paraformaldehydzie i zabarwiono przeciwciałem pierwszorzędowym anty-ludzkim Nestin oraz przeciwciałem drugorzędowym Alex-488. Wszystkie paski skali wynoszą 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Dyskusja
Komórki hodowane w CPF nie obserwują zmian w stężeniu tlenu lub dwutlenku węgla, gdy przemieszczają się z inkubatora do komory procesowej, do komory mikroskopowej i z powrotem. Bardzo ważne jest, aby warunki w każdej komorze były dopasowane do konkretnego inkubatora, w którym komórki są trzymane przed wyjęciem komórek z inkubatora. Atmosfera wewnątrz aparatu jest stale filtrowana przez HEPA i można ją dostosować pod względem stężenia tlenu i dwutlenku węgla. Komórki mogą być hodowane w stężeniach standardowych dla PSC lub NSC, odpowiednio 5% i 9%; lub alternatywne stężenia mogą być wybrane dla różnych typów komórek lub dla konkretnych eksperymentów. W ten sposób aparatura jest zasilana stałymi źródłami tlenu klasy medycznej, dwutlenku węgla i azotu (ryc. 4). Wszystkie trzy z tych gazów są dostarczane przez specyficzne dla gazu systemy kolektorów, które zapewniają stałe zasilanie. Aparat jest również dostarczany z mieszaniną gazów kalibracyjnych składającą się z 10% (± 0,01%) dwutlenku węgla w tlenie. Systemy kolektorów są umieszczone na zewnątrz zakładu produkcji ogniw, a gazy są doprowadzane do zakładu przez sufit. Gaz kalibracyjny znajduje się w obiekcie. Urządzenie jest dodatkowo zasilane odkurzaczem domowym, również przez sufit. Za pomocą elektronicznego systemu monitorowania i bezprzewodowych jednostek nadawczych stale monitorowane są ciśnienia wyjściowe wszystkich rozdzielaczy. W przypadku, gdy jakiekolwiek ciśnienie znajdzie się poza zakresem, operatorzy zakładów produkujących ogniwa są automatycznie wzywani do pracy telefonicznej i powiadamiani, aby można było podjąć odpowiednie działania.
Zapotrzebowanie na moc urządzenia jest zaspokajane przez sześć dedykowanych obwodów 120 V schodzących z sufitu i podłączonych do generatorów rezerwowych szpitala w celu zapewnienia stałego zasilania. Sterowanie pracą aparatury odbywa się za pomocą oprogramowania na komputerze PC zasilanym z zasilacza awaryjnego. Te układy zasilania i komputera zapewniają, że system działa w sposób ciągły nawet w przypadku awarii publicznego systemu zasilania. Oprogramowanie sterujące aparaturą posiada przyjazny dla użytkownika interfejs graficzny (rys. 1), który pozwala na kontrolę stężeń tlenu i dwutlenku węgla oraz temperatury, wilgotności i ciśnienia w komorze. Wartości wszystkich tych parametrów są rejestrowane w sposób ciągły, aby zapewnić bieżący zapis wszystkich parametrów aparatury. Kopia zapasowa tych danych jest tworzona na zdalnym serwerze każdej nocy w celu ochrony ich integralności. Użytkownicy administracyjni mogą uzyskać zdalny dostęp do komputera i oprogramowania w celu oceny i/lub zmiany dowolnego parametru. Dodatkowo, dostęp do komputera i oprogramowania jest możliwy zdalnie, co pozwala na interaktywną ocenę parametrów aparatury i rozwiązywanie problemów z lokalnymi użytkownikami. Dodatkowa jednostka wysyłająca alarmy jest podłączona do aparatury w taki sposób, że operatorzy zakładów produkujących komórki są powiadamiani o każdym stanie aparatury poza zakresem. Możliwości zdalnego dostępu umożliwiają logowanie i ocenę specyfiki stanu poza zasięgiem.
Aparatura została zaprojektowana jako system modułowy zarówno w skali makro, jak i mikro. Poszczególne moduły hodowli komórkowych, takie jak inkubatory i komory procesowe, można dostosować do indywidualnych potrzeb pod względem wymiarów i wymagań, a także pod względem siebie układu. Ponadto większość funkcji sterujących poszczególnych modułów jest sama w sobie modułowa, dzięki czemu na przykład poszczególne regulatory gazów atmosferycznych można łatwo wymienić bez znacznych zakłóceń w systemie.
Specjalistyczne komory obróbcze, takie jak jedna do mikroskopowej wizualizacji i manipulacji kulturami komórkowymi, można łatwo dostosować do systemu. Zarówno mikroskop kontrastu fazowego, jak i mikroskop fluorescencyjny znajdują się wewnątrz systemu (ryc. 6), dzięki czemu komórki mogą być barwione na żywo, a kolonie mogą być preparowane w tych samych warunkach atmosferycznych, co wewnątrz inkubatorów. Prowadzenie kabli przez szczelne przepusty w bocznych ścianach komory przetwarzania pozwala na przechowywanie urządzeń, takich jak zasilacze i komputery, na zewnątrz aparatury, zwykle na wózku (ilustracja 6).
Komory obróbcze w zakładzie produkcji ogniw mają inny wzór przepływu powietrza niż konwencjonalne BSC. W konwencjonalnych BSC przepływ powietrza spływa w dół z centralnego otworu wentylacyjnego i rozdziela się na dwa oddzielne strumienie, które są następnie odbierane przez dwa różne otwory wlotowe w przedniej i tylnej części podłogi szafy. Natomiast CPF ma pojedynczy otwór wentylacyjny w przedniej części sufitu. Powietrze przepływa w dół i w kierunku tylnej części komory, skąd jest następnie zasysane w górę do otworu wlotowego. Chociaż CPF jest z natury bardzo czysty, ten unikalny wzór przepływu powietrza oznacza, że technicy muszą nieznacznie dostosować swoją technikę, aby zmniejszyć ryzyko zanieczyszczenia. Podobnie jak w przypadku konwencjonalnego BSC, pracownik laboratorium powinien unikać umieszczania rąk przed płytkami do hodowli komórkowych i butelkami z pożywką. Kierunek, który jest w górę rzeki, został jednak zmieniony w CPF
Samo laboratorium w zakładzie produkcji komórek jest dość standardowe i jest wyposażone w zamrażarkę o temperaturze -20 °C, zamrażarkę o temperaturze -80 °C, lodówkę o temperaturze 4 °C, wirówkę i łaźnię wodną. W laboratorium znajduje się również zlew ze sterownikami nożnymi do wygodnej obsługi bez użycia rąk. Aby jednak laboratorium to stało się funkcjonalnym zakładem klinicznej produkcji komórek, konieczne jest jeszcze wprowadzenie kilku dodatkowych modyfikacji. Po pierwsze, sama aparatura musi zostać zmodernizowana, aby mogła monitorować lotne związki organiczne, cząstki stałe i stężenia dwutlenku chloru, który jest używany do odkażania. Po drugie, komora procesowa zawierająca maszynę FACS może być umieszczona i połączona z resztą aparatury za pomocą modułu buforowego. Pozwoli to na sortowanie komórek i oczyszczanie populacji komórek nadających się do przeszczepu w odpowiednich warunkach środowiskowych. Wreszcie, całe urządzenie musi być umieszczone w czystym pomieszczeniu o miękkich ścianach. Zapewnia to środowisko klasy 8 Międzynarodowej Organizacji Normalizacyjnej (ISO) dla aparatury5.
Wysoka sterylność i sterowany komputerowo charakter CPF sprawiają, że jest to idealny system do przyszłych zastosowań w terapii komórkowej i dobrych procesach produkcyjnych. Ryzyko zanieczyszczenia jest znacznie ograniczone, ale co ważniejsze, warunki ekspansji komórek są automatycznie rejestrowane i archiwizowane przez system komputerowy. Odchylenia w stężeniach gazów, temperaturze, wilgotności i wszystkie zdarzenia związane z dostępem do systemu są rygorystycznie dokumentowane. Może to być bardzo pomocne podczas badania problemów z jakością produktu. Jednak nadal istnieją ograniczenia. Użycie wszelkich odczynników i materiałów eksploatacyjnych (np. składników pożyw, pipet, płytek) musi być udokumentowane oddzielnie. Ponadto istnieje wiele potencjalnych problemów (w tym wiele form błędu ludzkiego), które mogą się pojawić, a które są całkowicie niezwiązane ze zmiennymi udokumentowanymi przez system monitorowania CPF. W związku z tym nadal istnieje zapotrzebowanie na wysoko wykwalifikowany personel i szczegółową ręczną dokumentację zadań.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować personelowi Biospherix za pomoc w nauce korzystania z systemu zamkniętych hodowli komórkowych Xvivo, szczególnie Mattowi Freemanowi; personelowi Miles & Kelley Construction Company, Inc. za ich pracę przy tworzeniu infrastruktury laboratoryjnej, szczególnie Russowi Hughesowi; personelowi Szpitala Dziecięcego Hrabstwa Orange za ich pracę w koordynowaniu przebudowy laboratorium, zwłaszcza Adama Lukharda i Devina Hugie; personelowi Szpitala Dziecięcego Szpitala Dziecięcego Hrabstwa Orange za pomoc w tworzeniu infrastruktury zarządzania danymi i zdalnego dostępu, w szczególności Viet Tran; Zespołowi Zarządzającemu Szpitala Dziecięcego Hrabstwa Orange za wieloletnie wsparcie dla projektu, w szczególności dr Marii Minon i Brentowi Dethlefsowi. Praca ta została sfinansowana przez Szpital Dziecięcy Hrabstwa Orange i Kalifornijski Instytut Medycyny Regeneracyjnej poprzez grant TR3-05476 dla PHS. Wszyscy autorzy przyczynili się do powstania tej pracy w równym stopniu.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Equipment | |||
| Xvivo System | Biospherix | custom made | |
| Xvivo Oprogramowanie | Biospherix | wersja i.o.2.1.2.1 | |
| O2 Kolektor | Amico P-M2H-C3-S-U-OXY | ||
| CO2 | Amico | M2H-C3-D-U-CO2 | |
| N2 Kolektor | Western Innovator | CTM75-7-2-2-BM | |
| Mikroskop z kamerą DP21 i fluorescencją | Olympus Corporation | CKX41 | |
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
| Reodczynniki | |||
| DMEM/F12 Glutamax | Life Technologies | 10565-018 | |
| StemPro hESC Suplement | Life Technologies | A100006-01 | |
| Accutase | Millipore | SCR005 | |
| Buforowany fosforanem | hyklon | 9236 | |
| Czynnik wzrostu fibroblastów 2 | R& D Systems | AFL233 | |
| Protide | dimetylosulfotlenku | PP1130 | |
| dysocjacji komórek Hanksa | 13150-016 | ||
| 2-merkaptoetanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| Naskórkowy czynnik wzrostu | R& D Systems | AFL236 | |
| Oct-3/4 | Przeciwciało Millipore | AB3209 | |
| TRA-1-60 | Przeciwciało Millipore | MAB4260 | |
| Przeciwciało SSEA4 | Millipore | MAB4304 | |
| BIT-9500 Suplement surowicy | Stemcell Technologies | 9500 | |
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Uwagi |
| Materiały eksploatacyjne | |||
| 2 ml Pipeta serologiczna | VWR | 89130-894 | |
| 5 ml Pipeta serologiczna | Olympus Plastics | 12-102 | |
| 10 ml Pipeta serologiczna | Olympus Plastics | 12-104 | |
| Pipeta serologiczna 25 ml | Olympus Plastics | 12-106 | |
| 50 ml Pipeta serologiczna | Olympus Plastics | 12-107 | |
| Płytka 6-dołkowa | Corning | 353046 | |
| Kolba T25 | TPP | 90026 | |
| Kolba T-75 | TPP | 90076 | |
| 20 &mikro; l końcówki do pipet | Eppendorf | 22491130 | |
| 200 µ l końcówki do pipet | Eppendorf | 22491148 | |
| 1 000 końcówek do pipet | Eppendorf | 22491156 | |
| Cryovials | Thermo Scientific | 5000.102 | |
| 70% etanol | BDH | BDH1164-4LP | |
| Sanimaster 4 | Ecolab | 65332960 | |
| Bleach | Clorox | A714239 |
Bibliografia
- Brick, D. J., et al. The Autism Spectrum Disorders Stem Cell Resource at Children's Hospital of Orange County: Implications for Disease Modeling and Drug Discovery. Stem Cells Transl.Med. 3 (11), 1275-1286 (2014).
- Nethercott, H. E., Brick, D. J., Schwartz, P. H. Derivation of induced pluripotent stem cells by lentiviral transduction. Methods Mol.Biol. 767, 67-85 (2011).
- Pistollato, F., et al. Hypoxia and HIF1alpha repress the differentiative effects of BMPs in high-grade glioma. Stem Cells. 27 (1), 7-17 (2009).
- Pistollato, F., Chen, H. L., Schwartz, P. H., Basso, G., Panchision, D. M. Oxygen tension controls the expansion of human CNS precursors and the generation of astrocytes and oligodendrocytes. Mol.Cell Neurosci. 35, 424-435 (2007).
- Raval, J. S., Koch, E., Donnenberg, A. D. Real-time monitoring of non-viable airborne particles correlates with airborne colonies and represents an acceptable surrogate for daily assessment of cell-processing cleanroom performance. Cytotherapy. 14 (9), 1144-1150 (2012).
- Schwartz, P. H. The potential of stem cell therapies for neurological diseases. Expert.Rev.Neurother. 6, 153-161 (2006).
- Schwartz, P. H., Brick, D. J. Stem cell therapies for the lysosomal storage diseases - the quintessential neurodegenerative diseases. Curr.Stem Cell Res.Ther. 3 (2), 88-98 (2008).
- Schwartz, P. H., Brick, D. J., Nethercott, H. E., Stover, A. E. Traditional human embryonic stem cell culture. Methods Mol.Biol. 767, 107-123 (2011).
- Stover, A. E., et al. Process-based expansion and neural differentiation of human pluripotent stem cells for transplantation and disease modeling. J Neurosci.Res. 91 (10), 1247-1262 (2013).
- Stover, A. E., Schwartz, P. H. Adaptation of human pluripotent stem cells to feeder-free conditions in chemically defined medium with enzymatic single-cell passaging. Methods Mol.Biol. 767, 137-146 (2011).
- Yoshida, Y., Takahashi, K., Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Hypoxia enhances the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 5 (3), 237-241 (2009).
Przedruki i uprawnienia
