Artykuł metodologiczny

Różnice płci w astrocytach hipokampa myszy po niedokrwieniu in vitro

13.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53695

⸱

25 października 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Waisman Center, University of Wisconsin, 2Department of Neurological Surgery, University of Wisconsin, 3Department of Pediatrics, University of Wisconsin

W tym artykule

Podsumowanie

Astrocyty są jednymi z najważniejszych kluczowych graczy w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN). W tym miejscu przedstawiamy praktyczną metodę protokołu hodowli astrocytów w hipokampie płciowym w celu zbadania mechanizmów leżących u podstaw funkcji astrocytów u młodych noworodków płci męskiej i żeńskiej po niedokrwieniu in vitro.

Streszczenie

Astroglejoza po urazie mózgu związanym z niedotlenieniem/niedokrwieniem (HI) odgrywa rolę w zwiększonej zachorowalności i śmiertelności u noworodków. Ostatnie badania kliniczne wskazują, że nasilenie uszkodzenia mózgu wydaje się być zależne od płci i że noworodki płci męskiej są bardziej podatne na skutki uszkodzenia mózgu związanego z HI, co skutkuje poważniejsze wyniki neurologiczne w porównaniu do kobiet z porównywalnymi urazami mózgu. Opracowanie wiarygodnych metod izolowania i utrzymywania wysoce wzbogaconych populacji seksowanych astrocytów hipokampa jest niezbędne do zrozumienia komórkowych podstaw różnic płci w patologicznych konsekwencjach hi u noworodków. W tym badaniu opisano metodę tworzenia specyficznych dla płci kultur astrocytów hipokampa, które poddaje się modelowi niedokrwienia in vitro, deprywacji tlenu i glukozy, a następnie reoksygenacji. Późniejszą astroglejozę reaktywną badano za pomocą barwienia immunologicznego dla kwaśnego białka fibrylarnego gleju (GFAP) i S100B. Metoda ta stanowi użyteczne narzędzie do badania roli męskich i żeńskich astrocytów hipokampa po hi noworodków, oddzielnie.

Wprowadzenie

Astrocyty są jednymi z najważniejszych kluczowych graczy w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN). Coraz więcej dowodów wskazuje na to, że rola astrocytów to coś więcej niż tylko zapewnianie wsparcia neuronalnego. W rzeczywistości role astrocytów w warunkach fizjologicznych mogą być bardzo złożone, takie jak kierowanie migracją rozwijających się aksonów1, regulacja przepływu krwi w OUN2, utrzymywanie homeostazy pH synaptycznego płynu śródmiąższowego3 oraz udział w barierze krew-mózg4 i transmisji synaptycznej5. W warunkach patologicznych astrocyty reagują na uraz procesem zwanym astroglejozą reaktywną, w którym morfologia, liczba, lokalizacja, topografia (w odniesieniu do odległości od zniewagi) i funkcja astrocytów mogą zmieniać się w niejednorodny sposób6,7. Astroglejoza obserwowana po encefalopatii niedotlenieniowej niedotlenienia i niedokrwiennej noworodków może przyczyniać się do zachorowalności i śmiertelności noworodków8.

Ostatnie badania kliniczne i eksperymentalne wskazują, że stopień uszkodzenia mózgu wydaje się być zależny od płci i że noworodki płci męskiej są bardziej podatne na skutki uszkodzenia mózgu związanego z niedotlenieniem/niedokrwieniem (HI), co skutkuje poważniejszymi skutkami neurologicznymi w porównaniu do kobiet z porównywalnymi uszkodzeniami mózgu9-11. Chociaż lokalizacja urazu zależy od wieku ciążowego oraz czasu trwania i ciężkości urazu, hipokamp jest jednym z najczęściej dotkniętych regionów w OUN po donozornym HI noworodka, a zwiększona astroglejoza hipokampa została potwierdzona przez regulację w górę kwaśnego białka fibrylarnego gleju (GFAP) 3 d po HI7,10,12,13 u noworodka. Różnice płci w funkcji astrocytów wykazano zarówno u noworodków, jak i dorosłych gryzoni po niedokrwieniu mózgu14,15. Ponadto podatność mężczyzn na niedokrwienie in vitro wykazano poprzez zwiększoną śmierć komórek w porównaniu z żeńskimi astrocytami korowymi w hodowli16.

Różnice płci zaczynają się w łonie matki i trwają aż do śmierci17. W ciągu ostatniej dekady znaczenie włączenia płci do warunków eksperymentalnych w hodowli komórkowej i badaniach in vivo było przedmiotem nacisku Instytutu Medycyny i NIH na poszukiwanie podstawowej wiedzy na temat różnic płci obserwowanych w stanach fizjologicznych i patologicznych17,18. Opracowanie wiarygodnych metod izolowania i utrzymywania populacji seksowanych astrocytów hipokampa jest niezbędne do zrozumienia komórkowych podstaw różnic płci w patologicznych konsekwencjach hi u noworodków. Niniejsze badanie miało na celu dostarczenie technik przygotowania wzbogaconych, specyficznych dla płci kultur astrocytów hipokampa od nowonarodzonych myszy w celu oceny ról astrocytów immunoreaktywnych GFAP po deprywacji tlenu/glukozy (OGD) i reoksygenacji (REOX), indukując HI w środowisku hodowli komórkowej. Technika ta może być wykorzystana do przetestowania dowolnej hipotezy dotyczącej astrocytów hipokampa u noworodków płci męskiej i żeńskiej w warunkach normoksycznych i niedokrwiennych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Badanie to zostało przeprowadzone zgodnie z zaleceniami Przewodnika opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych Narodowego Instytutu Zdrowia. Protokół dotyczący zwierząt został zatwierdzony przez University of Wisconsin-Madison, Institutional Animal Care and Use Committee. Przedstawiony tutaj protokół pierwotnej hodowli astrocytów został przyjęty z protokołów przedstawionych przez Zhang Y19 i wsp. oraz Cengiz P20 i wsp. z pewnymi modyfikacjami.

1. Rozwarstwienie hipokampa i hodowla astrocytów

  1. Przygotuj wszystkie niezbędne odczynniki i materiały, w tym nożyczki chirurgiczne, gładkie kleszcze drobnoziarniste, kleszczyki z płaską końcówką, ręczniki papierowe, worek na odpady, 70% etanolu i 2 naczynia preparacyjne (o średnicy 3,5 cm) na lodzie wypełnionym 2 ml zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS) każda. Przed zabiegiem upewnij się, że sprzęt chirurgiczny jest sterylny (autoklaw) i użyj wszystkich innych materiałów (pożywka do posiewu astrocytów: DMEM + 5% surowicy końskiej + 1% penicyliny-streptomycyny, surowicy końskiej, HBSS, 0,25% trypsyny, szklanych szkiełek nakrywkowych, szalek Petriego, probówek 15/50 ml, kolb T25 itp.) jako wstępnie sterylnych.
  2. Delikatnie przytrzymaj i spryskaj głowę i szyję szczeniaka myszy 70% etanolem i odetnij głowę ostrymi sterylnymi nożyczkami [Rysunek 1 (1)].
  3. Wykonaj nacięcie w linii środkowej od tyłu do przodu czaszki małymi nożyczkami wzdłuż skóry głowy, aby odsłonić mózg [Ryc. 1 (2-3)].
  4. Ostrożnie przeciąć czaszkę od szyi do nosa małymi nożyczkami. Następnie przetnij czaszkę przed opuszkami węchowymi i poniżej móżdżku, aby odłączyć czaszkę od podstawy czaszki.
  5. Wykonaj małe nacięcie u podstawy czaszki i przetnij wzdłuż linii środkowej. Użyj sterylnych kleszczyków z płaską końcówką, aby oderwać czaszkę. Usuń pień mózgu za pomocą zakrzywionych kleszczy. Wyjmij mózg z czaszki i umieść go w pierwszym naczyniu preparacyjnym [Ryc. 1 (4-9)]21.
  6. Za pomocą zakrzywionych kleszczy odwróć mózg tak, aby brzuszna powierzchnia mózgu była skierowana do góry, a następnie oddziel obie półkule ostrym sterylnym ostrzem chirurgicznym [Ryc. 1 (10,11)]
  7. Oderwij półkule mózgowe i ostrożnie usuń wybrzuszone śródmózgowie i tkankę wzgórza za pomocą sterylnych, płaskich, zakrzywionych kleszczy, aby odsłonić hipokamp, małą strukturę w kształcie konika morskiego w przyśrodkowym płacie skroniowym [Ryc. 1 (12-14)].
  8. Usuń oba płaty hipokampa [Ryc. 1 (15,16)] i ostrożnie wypreparuj opony mózgowe z płatów, ciągnąc cienkimi kleszkami. Ten etap pozwala uniknąć zanieczyszczenia końcowej hodowli astrocytów komórkami opon mózgowych i fibroblastami.
  9. Przenieś przygotowane płaty hipokampa do drugiego naczynia wypełnionego HBSS i umieść je z powrotem na lodzie [Ryc. 1 (17,18)]. Zbierz oba płaty hipokampa od jednej myszy (P0 - P2) w celu przygotowania kultur astrocytów hipokampa. Daje to astrocytowi odpowiednią gęstość. Miele płaty hipokampa za pomocą ostrego, sterylnego ostrza chirurgicznego (około 4 razy).
  10. Odessać HBSS z naczynia za pomocą sterylnej końcówki dołączonej do pipety o pojemności 1 ml i dodać 3 ml 0,25% trypsyny, wymieszać, przenieść do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 ml i inkubować tkankę w temperaturze 37 °C przez 20 minut, delikatnie wstrząsając.
  11. Probówka wirówkowa o masie 300 x g przez 5 minut. Ostrożnie odsysać supernatant za pomocą sterylnej szklanej pipety podłączonej do przewodu próżniowego. Dodać 10 ml pożywki do posiewu astrocytów i rozcierać (20 - 30 razy) za pomocą pipety ze szkła polerowanego ogniowo, aż kawałki tkanek ujednolicą się.
  12. Probówkę wirówkową o masie 300 x g przez 5 minut. Odessać supernatant i dodać 2 ml świeżej, wstępnie podgrzanej pożywki do posiewu astrocytów. Przepuść komórki przez filtr siatkowy 70 μm (sitko do komórek) do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
  13. Zawiesinę całych komórek należy umieścić na sterylnej kolbie hodowlanej T25 pokrytej poli-D-lizyną/laminą, zawierającej 3 ml pożywki do posiewu astrocytów, a następnie inkubować kolbę w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 .
  14. Odessać całe pożywki w dniu in-vitro (DIV) 1, DIV 3 i DIV 7 i zastąpić 2 ml świeżej pożywki do posiewu astrocytów. Obserwuj progresję i zbieg astrocytów pod mikroskopem świetlnym za każdym razem podczas wymiany pożywki z pożywki z astrocytów.
    UWAGA: W DIV 1 wszystkie żywotne astrocyty są przyłączone do powierzchni kolby hodowlanej, a martwe lub umierające komórki, które zawierają neurony, unoszą się w supernatancie. W DIV 3 przyłączone komórki zaczynają się dzielić, tworząc warstwę komórek astrocytowych. W przypadku braku warunków wspomagających kultura jest prawie pozbawiona jakiegokolwiek wzrostu neuronów. W DIV 7 warstwa astrocytów składa się w około 80 - 90% ze zlewa, a na wierzchu warstwy astrocytowej znajduje się kilka komórek prekursorowych mikrogleju oraz oligodendrocytów.
  15. Odessać pożywkę galwaniczną z kolby, dodać 2 ml świeżej, wstępnie podgrzanej pożywki do posiewu astrocytów, przepłukać i ponownie usunąć w DIV 11, gdy astrocyty zlewają się i są gotowe do podhodowli.
  16. Dodać 2 ml 0,25% trypsyny, delikatnie obrócić kolbę kilka razy i odessać trypsynę za pomocą sterylnej szklanej pipety.
  17. Dodać 2 ml 0,25% trypsyny i pozostawić kolbę w kapturze do hodowli tkankowej na 4-5 minut w temperaturze pokojowej.
  18. Usunąć trypsynę i utrzymać kolbę w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 przez 10 minut. Dodać 5 ml wstępnie podgrzanej pożywki do posiewu astrocytów i oderwać warstwę astrocytów, stukając kolbą o dłoń (3 - 4 razy), a następnie delikatnie rozcierać, aby uzyskać całkowite oderwanie i zebrać astrocyty w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
  19. Probówkę wirową o sile 300 x g przez 5 minut, odessać supernatant i dodać 1 ml świeżej pożywki do posiewu astrocytów.
  20. Dodać 10 μl zawiesiny komórek do hemocytometru i policzyć komórki w dużym centralnym obszarze siatki (1 mm2) za pomocą mikroskopu z kontrastem z odwróconymi fazami (obiektyw 10X). Pomnóż przez 104, aby oszacować liczbę komórek na ml. Jedna kolba T25 da ~ 1 x 106 całkowitych zdysocjowanych komórek. Nasiona ~ 1 x 105 komórek w 2 ml pożywki do posiewu astrocytów na szkiełku nakrywkowym z poli-D-lizyny o średnicy 12 mm w studzience 24-dołkowej płytki hodowlanej.
  21. Inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 . Wykonać OGD/REOX w DIV 12 - 14 (sekcja 2).
  22. Hodowle astrocytów w DIV 3 należy traktować chlorowodorkiem estru metylowego L-leucyny (LME) o stężeniu 5 mM do DIV 11, jeśli pożądane są hodowle hipokampa pozbawione mikrogleju. Po inkubacji LME poddać hodowle wstrząsaniu (300 obr./min przez 1 godzinę) w celu usunięcia zanieczyszczającego mikrogleju.
    UWAGA: LME jest mikroglejowym środkiem cytotoksycznym, który jest szeroko stosowany jako metoda eliminacji proliferującego mikrogleju22.

2. Leczenie OGD/REOX

  1. Odessać pożywkę z szkiełka nakrywkowego zawierającego przylegającą kulturę astrocytów (DIV 12 - 14) i spłukać 3 razy, delikatnie obracając 24-dołkową miskę hodowlaną trzymającą szkiełko nakrywkowe kilka razy z 1 ml izotonicznego roztworu OGD (pH 7,4) zawierającego (w mM): 0 glukozy, 21 NaHCO3, 120 NaCl, 5,36 KCl, 0,33 Na2HPO4, 0,44 KH2PO4, 1,27 CaCl2 i 0,81 MgSO4.
  2. Dodać 0,2 ml roztworu OGD do studzienki, aby przykryć szkiełko nakrywkowe i inkubować przez 2 godziny w inkubatorze hipoksyjnym zawierającym 94% N2, 1% O2 i 5% CO2 . Delikatnie wymieszać z wytrząsarką orbitalną (50 obr./min) przez pierwsze 30 minut hipoksji, aby ułatwić wymianę gazową.
  3. Inkubować normoksyczne komórki kontrolne przez 2 godziny w 5% CO2 i powietrzu atmosferycznym w buforze identycznym z roztworem OGD, z wyjątkiem dodatku 5,5 mM glukozy.
  4. W przypadku REOX odessać roztwór OGD i dodać 2 ml pożywki do posiewu astrocytów. Inkubować w 5% CO2 i powietrzu atmosferycznym w temperaturze 37°C przez 5 godzin.

3. Barwienie immunocytochemiczne

  1. Odessać pożywkę hodowlaną za pomocą sterylnej szklanej pipety podłączonej do linii próżniowej i szybko wypłukać szkiełko nakrywkowe, dodając 1 ml 0,1 M buforowanej soli fizjologicznej Tris (TBS) (154 mM NaCl, 16 mM zasady Trizma, 84 mM Tris-HCl, pH 7,4) do dołka. Odessać i dodać 2 ml 4% paraformaldehydu (PFA) do 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  2. Odessać i dodać 1 ml 0,1 M TBS, a następnie umieścić na bujanym shakerze na 2 minuty. Powtórz 3 razy. Dodać 1 ml roztworu blokującego (10% koziej surowicy, 10 mg/ml BSA, 0,025% Triton X-100 w 0,1 M TBS) i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C na wstrząsającym shakerze.
  3. Odessać roztwór blokujący i dodać pierwszorzędowe mysie przeciwciało monoklonalne anty-GFAP (0,2 ml rozcieńczenia w roztworze blokującym w stosunku 1:500) oraz królicze poliklonalne przeciwciało anty-S100B (1:500) lub królicze poliklonalne przeciwciało anty-HIF1α (1:200) przez 60 minut w temperaturze 37 °C.
  4. Alternatywnie, niektóre astrocyty są inkubowane z poliklonalnym anty-IBA1 królika (1:200) i mysim monoklonalnym anty-MAP2 w celu uzyskania czystości hodowli.
  5. Odessać przeciwciało pierwszorzędowe i przepłukać szkiełko nakrywkowe, dodając 1 ml 0,1 M TBS i umieszczając na kołyszącym się wytrząsarce na 2 minuty, a następnie aspirować. Powtórz dwa razy.
  6. Dodać 0,2 ml rozcieńczenia 1:200 drugorzędowych kozich przeciwciał anty-króliczych 488 i anty-mysich 568 sprzężonych w roztworze blokującym przez 60 minut w temperaturze 37 °C na wstrząsającym shakerze.
  7. Odessać przeciwciało wtórne i przepłukać szkiełko nakrywkowe, dodając 1 ml 0,1 M TBS i umieścić na kołyszącym się wytrząsarce na 2 minuty, a następnie aspirować. Powtórz dwa razy.
  8. Wyjmij szkiełko nakrywkowe z dołka i osusz, umieszczając je na szkiełku umieszczonym na suszarce do szkiełek. Zamontuj szkiełko nakrywkowe na nowym szkiełku, odwracając pojedynczą kroplę twardego podłoża mocującego VECTASHIELD za pomocą DAPI (1,5 ng/μL).
  9. Obraz szkiełek nakrywkowych w mikroskopie konfokalnym przy użyciu obiektywu suchego 20X lub 60X olejowego. Uzyskaj obrazy (512 x 512) dla DAPI (405 nm ex / 450 nm em) i przeciwciała GFAP znakowanego fluorochromem 488 (488 nm ex / 515 nm em). Utrzymuj stałe parametry akwizycji w grupach 20X i 60X.

4. Określanie płci za pomocą PCR

  1. Podgrzać ścinki palców u nóg lub palców w temperaturze 95 °C przez 45 minut w 50 mM NaOH i zneutralizować równą objętością 1 M Tris, pH 6,8.
  2. Dodać 1 μl wyekstrahowanego roztworu DNA do 19 μl następującej mieszaniny: 5 pmoli starterów dla genów Myog i Sry, 1x bufor reakcyjny, 0,2 mM każdy deoksynukleotyd i polimeraza 8 U Taq.
  3. Używaj sekwencji starterów; Sry 5'TCATGAGACTGCCAACCACAG3', 5'CATGACCACCACCACCACCAA3' oraz Myog 5'TTACGTCCATCGTGGACAGC3', 5'TGGGCTGGGTGTTAGTCTTA3'23.
  4. Wykonaj następujący protokół PCR: 95 °C przez 3 minuty, następnie 30 cykli denaturacji w temperaturze 95 °C przez 15 s, wyżarzanie w temperaturze 58 °C przez 15 s i wydłużenie w temperaturze 72 °C przez 1 minutę. Po tych 30 cyklach reakcja kończy się końcowym wydłużeniem o 72 °C przez 1 minutę.
  5. Oddziel produkty PCR elektroforetycznie na 2% żelu agarozowym zawierającym bromek etydyny i uwidocznij w świetle UV. (Rysunek 2A.) ostrożność! Bromek etydyny jest potencjalnym czynnikiem rakotwórczym i należy się z nim obchodzić ostrożnie i odpowiednio utylizować zgodnie z przepisami instytucji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zrozumienie roli funkcji astrocytów w zależności od płci w warunkach fizjologicznych lub patofizjologicznych zostało znacznie ułatwione dzięki hodowli tych komórek w warunkach in vitro. Ważnym aspektem prowadzenia hodowli z podziałem na płeć jest określenie płci młodego myszy przed jego wykorzystaniem. Płeć myszy określaliśmy genetycznie za pomocą PCR oraz poprzez ocenę wizualną (Rysunek 2)16. Metodologia określania płci za pomocą PCR została zaadaptow...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W celu zbadania różnic płci we właściwościach i funkcji astrocytów w warunkach fizjologicznych i patologicznych, przygotowanie seksowanych astrocytów pierwotnych w hodowli komórkowej jest ważnym narzędziem do wykorzystania. W niniejszym badaniu przedstawiono wysoce wydajną i powtarzalną metodę hodowli wysoce wzbogaconej, jednorodnej populacji seksowanych astrocytów hipokampa od nowonarodzonych (P0-P2) C57Bl / 6 (typ dziki) lub K19F (GFAP null) szczeniąt myszy in vitro. Ustalenie tej metodologii pomaga badaczom z...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Żaden z autorów nie ma sprzecznych lub sprzecznych interesów.

Podziękowania

Program Clinical and Translational Science Award NCATS UL1 TR0000427 i KL2 TR000428 (Cengiz P), UL1TR000427 dla UW ICTR od NIH/NCATS oraz fundusze z Waisman Center (Cengiz P), K08 NS088563-01A1 z NINDS (Cengiz P) i NIH P30 HD03352 (Waisman Center), NIH/NINDS 1K08NS078113 (Ferrazzano P). Chcielibyśmy podziękować dr Albee Messingowi za dostarczenie nam myszy z nokautem GFAP.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pożywka do hodowli astrocytów
DMEM, cellgro o wysokim poziomie glukozy10-013-CV
Surowica końskaGibco26050-070Stężenie końcowe: 10%
Penicylina-StreptomycynaCellgro 30-002-CIStężenie końcowe: 1%
chlorowodorek estru metylowego L-leucynyAldrichL1002-25GStężenie końcowe: 5 mM
Roztwór do trawienia tkanki mózgowej
HBSSLife Technologies14170-088
Trypsincellgro25-050-CIStężenie końcowe: 0,25%
Inne
70% (vol/vol) etanolRoth9065.2
Poly-D-Lizyna (PDL) 12 mm okrągłe szkiełka nakrywkowe Corning354087
WaterSigmaW3500Klasa hodowli komórkowej
PBScellgro21-040-CVKlasa hodowli komórkowej
0,05% Trypsyna-EDTA Technologie życiowe25300-062
70 μ m Sterylne sitko do komórek Fisher scientific22363548
3,5 cm szalka PetriegoBD Falcon353001
15 ml Probówka FalconBD Falcon352096
50 ml Probówka FalconBD Falcon352070
Kleszcze, drobne Dumont2-1032; 2-1033# 3c; # 5
Kleszcze, płaska końcówkaKLS Martin12-120-11
Nożyczki chirurgiczne 13 cmAesculapBC-140-R
NikonA1RSi 
WirówkaEppendorf5805000.0175804R
Wytrząsarka orbitalnaThermo ScientificSHKE 4450-1CEMaxQ 4450 
Anti-IBA1Wako019-19741Królik monoklonalny
Anti-MAP2SigmaM2320Mysz monoklonalna
anty-HIF1alphaabcamab179483Królik monoklonalny
Anti-S100BSigmaHPA015768Królik poliklonalny
anty-GFAP (koktajl)Biolegend837602
VECTASTAIN Elite ABC Kit (Królik IgG)Vector LabsPK-6101zawiera 4 odczynniki 
Koza Anty Królik Alexa-Fluor 488InvitrogenA11070
Koza Anty Mysz Alexa-Fluor 568InvitrogenA11004
Mikroskop konfokalny

Bibliografia

  1. Powell, E. M., Geller, H. M. Dissection of astrocyte-mediated cues in neuronal guidance and process extension. Glia. 26, 73-83 (1999).
  2. Koehler, R. C., Roman, R. J., Harder, D. R. Astrocytes and the regulation of cerebral blood flow. Trends in neurosciences. 32, 160-169 (2009).
  3. Seifert, G., Schilling, K., Steinhauser, C. Astrocyte dysfunction in neurological disorders: a molecular perspective. Nature reviews. Neuroscience. 7, 194-206 (2006).
  4. Ballabh, P., Braun, A., Nedergaard, M. The blood-brain barrier: an overview: structure, regulation, and clinical implications. Neurobiology of disease. 16, 1-13 (2004).
  5. Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. Tripartite synapses: glia, the unacknowledged partner. Trends in neurosciences. 22, 208-215 (1999).
  6. Anderson, M. A., Ao, Y., Sofroniew, M. V. Heterogeneity of reactive astrocytes. Neuroscience letters. 565, 23-29 (2014).
  7. Cengiz, P., et al. Inhibition of Na+/H+ exchanger isoform 1 is neuroprotective in neonatal hypoxic ischemic brain injury. Antioxidants & redox signaling. 14, 1803-1813 (2011).
  8. Ferriero, D. M. Neonatal brain injury. The New England journal of medicine. 351, 1985-1995 (2004).
  9. Hill, C. A., Fitch, R. H. Sex differences in mechanisms and outcome of neonatal hypoxia-ischemia in rodent models: implications for sex-specific neuroprotection in clinical neonatal practice. Neurol Res Int. , 1-9 (2012).
  10. Cikla, U., et al. ERalpha Signaling Is Required for TrkB-Mediated Hippocampal Neuroprotection in Female Neonatal Mice after Hypoxic Ischemic Encephalopathy(1,2,3). eNeuro. 3, (2016).
  11. Uluc, K., et al. TrkB receptor agonist 7, 8 dihydroxyflavone triggers profound gender- dependent neuroprotection in mice after perinatal hypoxia and ischemia. CNS Neurol Disord Drug Targets. 12, 360-370 (2013).
  12. Cikla, U., et al. Suppression of microglia activation after hypoxia-ischemia results in age-dependent improvements in neurologic injury. J Neuroimmunol. 291, 18-27 (2016).
  13. McQuillen, P. S., Ferriero, D. M. Selective vulnerability in the developing central nervous system. Pediatr Neurol. 30, 227-235 (2004).
  14. Morken, T. S., et al. Altered astrocyte-neuronal interactions after hypoxia-ischemia in the neonatal brain in female and male rats. Stroke; a journal of cerebral circulation. 45, 2777-2785 (2014).
  15. Chisholm, N. C., Sohrabji, F. Astrocytic response to cerebral ischemia is influenced by sex differences and impaired by aging. Neurobiology of disease. 85, 245-253 (2016).
  16. Liu, M., Oyarzabal, E. A., Yang, R., Murphy, S. J., Hurn, P. D. A novel method for assessing sex-specific and genotype-specific response to injury in astrocyte culture. Journal of neuroscience methods. 171, 214-217 (2008).
  17. Exploring the biological contributions to human health: does sex matter?. Journal of women's health & gender-based. 10, 433-439 (2001).
  18. Collins, F. S., Tabak, L. A. Policy: NIH plans to enhance reproducibility. Nature. 505, 612-613 (2014).
  19. Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78, 785-798 (2013).
  20. Cengiz, P., et al. Sustained Na+/H+ exchanger activation promotes gliotransmitter release from reactive hippocampal astrocytes following oxygen-glucose deprivation. PloS one. 9, e84294(2014).
  21. Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490, 187-191 (2012).
  22. Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes. J Neurosci Methods. 150, 128-137 (2006).
  23. McClive, P. J., Sinclair, A. H. Rapid DNA extraction and PCR-sexing of mouse embryos. Molecular reproduction and development. 60, 225-226 (2001).
  24. Wolterink-Donselaar, I. G., Meerding, J. M., Fernandes, C. A method for gender determination in newborn dark pigmented mice. Lab Anim (NY). 38, 35-38 (2009).
  25. Uliasz, T. F., Hamby, M. E., Jackman, N. A., Hewett, J. A., Hewett, S. J. Generation of primary astrocyte cultures devoid of contaminating microglia. Methods Mol Biol. 814, 61-79 (2012).
  26. Raponi, E., et al. S100B expression defines a state in which GFAP-expressing cells lose their neural stem cell potential and acquire a more mature developmental stage. Glia. 55, 165-177 (2007).
  27. Souza, D. G., Bellaver, B., Souza, D. O., Quincozes-Santos, A. Characterization of adult rat astrocyte cultures. PloS one. 8, e60282(2013).
  28. Puschmann, T. B., Dixon, K. J., Turnley, A. M. Species differences in reactivity of mouse and rat astrocytes in vitro. Neuro-Signals. 18, 152-163 (2010).
  29. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2013).
  30. Saura, J. Microglial cells in astroglial cultures: a cautionary note. J Neuroinflammation. 4 (26), (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Deprywacja tlenu i glukozyhodowla astrocyt wreaktywna astrogliozaekspresja GFAPekspresja S100Bnoworodkowe uszkodzenie m zgubarwienie immunofluorescencyjne

Powiązane artykuły