Celem tego protokołu jest opisanie metody funkcji utraty i zysku, która ma zastosowanie do identyfikacji neogeniny jako specyficznego dla etapu receptora, który prowadzi do trofektodermy i różnicowania wewnętrznej masy komórkowej w preimplantacyjnych zarodkach myszy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Podejście oparte na utracie i wzmocnieniu funkcji w celu zbadania determinantów wczesnego losu komórek w preimplantacyjnych zarodkach myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Techniki wyciszania i nadekspresji genów są kluczowe dla identyfikacji genów zaangażowanych w rozwój embrionalny. Bezpośrednia modyfikacja genu docelowego w zarodkach preimplantacyjnych umożliwia badanie mechanizmów leżących u podstaw genów zaangażowanych na przykład w różnicowanie komórek w trofektodermę (TE) i wewnętrzną masę komórkową (ICM). W tym miejscu opisujemy protokół, który bada rolę neogeniny jako autentycznego receptora do wstępnego określania losu komórek w preimplantacyjnych zarodkach myszy. Po pierwsze, omawiamy eksperymentalne manipulacje, które zostały wykorzystane do uzyskania i utraty funkcji neogeniny poprzez mikroiniekcję neogeniny cDNA i shRNA; Skuteczność tego podejścia została potwierdzona przez silną korelację między poziomami ekspresji białka czerwonej fluorescencji (RFP) lub białka zielonej fluorescencji (GFP) a immunocytochemiczną kwantyfikacją ekspresji neogeniny. Po drugie, nadekspresja neogeniny w preimplantacyjnych zarodkach myszy prowadzi do normalnego rozwoju ICM, podczas gdy knockdown neogeniny powoduje nieprawidłowy rozwój ICM, co sugeruje, że neogenina może być receptorem, który przekazuje sygnały zewnątrzkomórkowe, aby napędzać blastomery do wczesnych losów komórek. Biorąc pod uwagę sukces tego szczegółowego protokołu w badaniu funkcji nowego receptora specyficznego dla stadium rozwoju embrionalnego, sugerujemy, że ma on potencjał, aby pomóc w eksploracji i identyfikacji innych genów specyficznych dla danego stadium podczas embriogenezy.
Wprowadzenie
Rozwój embrionalny przed implantacją można podzielić na kilka różnych etapów, od stadium jednokomórkowego do moruli i blastocysty. Wiele dowodów sugeruje, że polaryzacja i wskazówki pozycyjne odgrywają rolę we wczesnym określaniu losu komórek w trofektodermie (TE) i wewnętrznej masie komórkowej (ICM). Jednak natura sygnałów, sposób, w jaki są one przekształcane w sygnały komórkowe, oraz konteksty fizjologiczne, w których takie sygnały są w stanie zainicjować różnicowanie linii komórkowych, nie są znane. Te zróżnicowane komórki ulegają następnie specjalizacji, zaczynając nabierać charakterystycznych struktur i funkcji potrzebnych do prawidłowego powstania zarodka i wzrostu łożyska1-3.
Zarodki przedimplantacyjne są szczególnie podatne na manipulację poprzez bezpośrednie wstrzyknięcie zmodyfikowanych materiałów genetycznych, takich jak siRNA lub docelowe cDNA, a zatem mogą być wykorzystywane do badania konkretnych cząsteczek docelowych. Coraz powszechniejsze staje się przekonanie, że analiza genetyczna zarodków kręgowców ma kluczowe znaczenie dla pogłębienia naszej wiedzy na temat rozwoju embrionalnego4. Precyzyjne wprowadzenie genu typu dzikiego lub zmutowanej formy do zarodka w odpowiednim czasie, aby osiągnąć zysk lub utratę funkcji genu, znacznie ułatwiło badania nad genami regulowanymi rozwojowo. Utrata i wzmocnienie funkcji poprzez mikrowstrzyknięcie materiału genetycznego do poszczególnych wczesnych zarodków zwierząt innych niż ssaki i ssaków jest stosunkowo proste ze względu na ich duże rozmiary i dużą chłonność5. Mikroiniekcja jest zwykle wykonywana przy użyciu wektorów niewirusowych. Szczególną przewagę wykorzystano dzięki łatwości stosowania wektorów niewirusowych w porównaniu z wektorami wirusowymi i transgenami. Opracowano system szybkiej ekspresji utraty lub wzmocnienia funkcji w zarodkach myszy, który pozwala nam na analizę i zrozumienie funkcji genów w embriologii kręgowców6,7.
Fluorescencyjne znakowanie zarodków znacznie ułatwiłoby selekcję mikrowstrzykniętych lub genetycznie modyfikowanych zarodków, a jednocześnie umożliwiłoby pośrednie ilościowe określenie poziomu ekspresji mikroiniekcyjnego siRNA lub cDNA na podstawie intensywności fluorescencji8. Aby osiągnąć to znakowanie, białka fluorescencyjne cDNA, GFP lub RFP, są wstrzykiwane jednocześnie jako konstrukty fuzyjne lub oddzielnie. Intensywność fluorescencji GFP lub RFP ujawnia zakres ekspresji siRNA lub obcego DNA, aby zapewnić, że osiągnięto utratę lub wzmocnienie funkcji.
Tutaj prezentujemy protokół mikromanipulacji dla techniki utraty i wzmocnienia funkcji, który pozwolił nam zidentyfikować neogeninę jako receptor, który przekazuje sygnały zewnątrzkomórkowe ważne we wczesnym różnicowaniu komórek w preimplantacyjnych zarodkach myszy.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
UWAGA: Wszystkie procedury dotyczące hodowli i opieki nad zwierzętami zostały przeprowadzone zgodnie z przepisami IACUC Uniwersytetu Sahmyook, Seul, Korea Południowa.
1. Superowulacja, hodowla i izolacja jajowodu
- Utrzymuj myszy wsobne C57BL/6 w następujących warunkach: 22 ± 3 °C, ~60% wilgotności, 12-godzinny cykl światła/ciemności oraz woda i jedzenie ad libitum.
- Wywołaj superowulację u 3-5 tygodniowych samic myszy przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 5 j.m. gonadotropiny surowicy ciężarnej klaczy (PMSG) w dawce 0,1 ml / sztukę, a następnie 48 godzin później dootrzewnowe wstrzyknięcie 5 IU ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej (hCG) w dawce 0,1 ml / głowę.
- Bezpośrednio po wstrzyknięciu hCG należy kojarzyć samice wywołane superowulacją z dojrzałymi płciowo samcami tego samego szczepu, trzymając je przez noc w tej samej klatce.
- Następnego ranka potwierdź udane krycie przez obecność zatyczki kryjącej lub czopa pochwowego na żeńskich drogach rodnych.
- Uśmierc ciężarne samice myszy przez zatrucie CO2, a następnie zwichnięcie szyjki macicy 18-20 godzin po wstrzyknięciu hCG.
- Otwórz jamę brzuszną, przecinając cienkimi nożyczkami skórę, a następnie warstwę otrzewnej.
- Podnieś rogi macicy cienkimi kleszczami i delikatnie wyciągnij macicę, jajowód, jajnik i poduszeczkę tłuszczową z jamy ciała.
- Wytnij obszar między jajowodem a jajnikiem cienkimi nożyczkami. Zmień położenie kleszczyków i przetnij macicę w pobliżu jajowodu, pozostawiając co najmniej 1 cm przyczepionej górnej części macicy.
- Przenieść bańkę jajowodową na szalkę Petriego o średnicy 35 mm zawierającą pożywkę M16 w temperaturze pokojowej. Połącz jajowody z kilku myszy w tym samym naczyniu.
- Umieść szalki pod mikroskopem stereoskopowym w celu pobrania zarodków.
2. Pobieranie i hodowla zarodków 2-projądrowych (2-PN)
- Odetnij koniec igły podskórnej o gramaturze 30 lub 32 G, zmiel ją na końcówkę i użyj jako igły do płukania.
- Za pomocą cienkich kleszczyków wsunąć koniec jajowodu na igłę do spłukiwania. Delikatnie dociśnij końcówkę igły płuczącej do dna naczynia, aby utrzymać ją na miejscu. Przepłukać jajowód ~0,1 ml pożywki M16, aby uwolnić zarodki 2-PN na szalkę Petriego.
- Odzyskać zarodki 2-PN wraz z otaczającymi masami wzgórków z przepłukanej pożywki M16 pod mikroskopem stereoskopowym za pomocą sterylnej szklanej pipety i przenieść je na nową szalkę Petriego.
- Oddzielić wzgórki od zarodków 2-PN przez trawienie enzymatyczne z 1,0 ml 0,1-0,5% hialuronidazy w buforowanym fosforanem soli fizjologicznej (DPBS) firmy Dulbecco w temperaturze 37 °C przez 5-10 min.
- Ogołocić zarodki poprzez delikatne pipetowanie szklaną pipetą i fizyczne usunięcie komórek wzgórka.
- Pozbawione zarodków należy przemyć trzykrotnie 30-50 ml świeżej soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) na zarodek.
- Inkubować zarodki na plastikowej szalce Petriego o średnicy 35 mm w pożywce M16 uzupełnionej 10 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA, frakcja V) w temperaturze 37 °C w 5% CO2 w wilgotnym inkubatorze do momentu wykonania mikroiniekcji, co zwykle następuje mniej niż 4 godziny później.
3. Odwrotna transkrypcja zarodka (RT) i reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR)
- Zbierz co najmniej 10 zarodków z każdego etapu aż do stadium blastocysty i połącz je w 4,0 μl 5-krotnego roztworu premiksu odwrotnej transkryptazy zawierającego odwrotną transkryptazę, inhibitor RNazy, starter oligo dT, losowe 6mery, mieszaninę dNTP i bufor reakcyjny w probówce do PCR.
- Dodać destylowany H2O bez RNaz do całkowitej objętości 20 μl i sonikować zebrane zarodki przez 30 sekund przy 200 W. Natychmiast rozpocząć reakcję RT w temperaturze 42 °C przez 1 godzinę, a następnie inkubować w temperaturze 95 °C przez 5 minut.
- Na każde 5,0 μl wygenerowanego roztworu cDNA należy przeprowadzić normalną amplifikację PCR ze starterami dla neogeniny, Cdx2, Sox2, Tead4, Nanog, Oct3/4 lub β-aktyny (sekwencje starterów podane w tabeli 1. PCR składa się z 40 cykli 15-sekundowej inkubacji w temperaturze 95 °C, 30 sekund w temperaturze wyżarzania (pokazanej w tabeli 1) i 30 sekund w temperaturze 72 °C.
- Oddziel produkty PCR przez elektroforezę na 2% żelu agarozowym i uwidocznij żel w świetle UV po zabarwieniu bromkiem etydyny.
- Normalizuj ekspresję genu docelowego w stosunku do poziomów β-aktyny.
4. Immunocytochemia zarodków
- Utrwalić zarodki z każdego etapu za pomocą 4% paraformaldehydu w PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie 3 razy krótko przepłukać PBS zawierającym 0,01% BSA.
- Przepuszczalność błon komórkowych poprzez inkubację 10 zarodków w 1,0 ml PBS zawierającego 0,1% Tween 20 i 0,1% TritonX-100 w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
- Aby zablokować niespecyficzne wiązanie, należy inkubować przepuszczalne zarodki w 1,0 ml PBS uzupełnionym 10% normalną surowicą kozią przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
- Inkubować zablokowane zarodki z króliczymi przeciwciałami antyneogenicznymi w rozcieńczeniu 1:100 w PBS zawierającym 0,1% BSA przez noc w temperaturze 4 °C.
- Po trzech płukaniach przez 30 sekund każde w kroplach PBS, inkubować zarodki z anty-króliczą IgG kozią anty-króliczą Alexa 488 lub Alexa 568-sprzężoną kozią anty-króliczą IgG w rozcieńczeniu 1:500 w roztworze PBS/BSA przez noc w temperaturze 4 °C.
- Aby uwidocznić filamenty aktynowe, inkubuj zarodki w 1 μg/ml falloidyny w PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
- Wybarwić jądra, dodając 5 ml PBS zawierającego 1 μg/ml DAPI (dichlorowodorek 4',6-diamidyn-2-fenyloindolu) przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
- Umyj zarodki trzy razy krótko PBS.
- Przenieś zarodki na szkiełko podstawowe i zalej je kroplą oleju mineralnego.
- Wykonuj zdjęcia w powiększeniu 1,000x za pomocą mikroskopu konfokalnego ze wzbudzeniem o odpowiedniej długości fali.
5. Przygotowanie plazmidów Neogenin-RFP i Neogenin-siRNA GFP
- Subklon cDNA kodujący mysią neogeninę do wektora zawierającego białko czerwonej fluorescencji (RFP), co skutkuje RFP z flagą neogeniny.
- Subklonuj małe RNA spinki do włosów ukierunkowane na neogeninę do wektora zawierającego białko szmaragdowozielone fluorescencyjne (EmGFP), w wyniku czego powstaje neogenina pcDNA-EmGFP-miR-(pokazana na rycinie 1).
- Amplifikuj zarówno plazmidy neogenin-flag-RFP, jak i pcDNA-EmGFP-miR-neogenin i oczyść je konwencjonalnymi metodami.
- Dostosuj końcowe stężenia plazmidów do ~1,0 μg/ml w sterylnym buforze Tris-EDTA (TE).
6. Mikroiniekcja plazmidów do zarodków 2-PN
- Pozbawione zarodki 2-PN przemyć raz, krótko, świeżą pożywką M16.
- Odwirować zarodki 2-PN przez 10 minut przy 1 000 x g w wirówce stołowej, aby umożliwić obserwację przedjądrzy.
- Inkubować zarodki w mikrokropli 20-30 μl pożywki M16 na zarodek pod olejem mineralnym w temperaturze 37 °C w 5% CO2 przez dodatkowe 1-2 godziny.
- Wytwarzanie pipet iniekcyjnych i pipet przytrzymujących poprzez ciągnięcie rurki kapilarnej ze szkła borokrzemianowego (Ø = 1,2 mm; ID = 0,94 mm) ze ściągaczem mechanicznym.
- Pipety iniekcyjne z końcówkami i polerowanymi otworami o długości końcówki <500 μm i średnicy wewnętrznej końcówki 1-2 μm należy wykonać za pomocą mikroszlifierki i mikrofałszerza.
- Pipety trzymające należy wytwarzać w taki sposób, aby miały końcówki i polerowane otwory o średnicy wewnętrznej 20 μm i średnicy zewnętrznej 100 μm.
- Do pipet iniekcyjnych należy napełnić odpowiednią ilością (>200 nl) roztworu plazmidu o stężeniu 1,0 μg/μl.
- Mikrowstrzyknąć ~ 10 pl roztworu plazmidu dla każdego zarodka 2-PN do jednego z przedjądrzy za pomocą mikrowstrzykiwacza podłączonego do zmotoryzowanego mikromanipulatora; podczas tego procesu utrzymuj zarodki na miejscu, stosując podciśnienie za pomocą pipety trzymającej.
- Po mikroiniekcji należy przemyć zarodki 2-PN 3 razy świeżą pożywką M16 przez mniej niż 1 minutę za każdym razem.
- Hodować zarodki 2-PN w kropli świeżej pożywki M16 na plastikowym naczyniu hodowlanym pokrytym kroplą oleju mineralnego, aby zapobiec parowaniu pożywki.
- Obserwuj zarodki w odstępach 24-godzinnych pod mikroskopem odwróconym z kontrastem interferencyjnym (DIC) przy 200-krotnym powiększeniu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Odkryliśmy, że neogenina jest przejściowo ekspresjonowana podczas wczesnych etapów rozwoju embrionów myszy przed implantacją, pojawiając się już w stadium 2 komórek i utrzymując się do wczesnej moruli, natomiast staje się niedoborowa w stadium późnej moruli i blastocysty (Ryc. 2A). Ponadto dystrybucja przestrzenna neogeniny była ograniczona głównie do komórek zewnętrznych. Wyniki analizy RT-PCR były zgodne z wczesnym i przejściowym charakterem ekspresji neogeniny, która o...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W niniejszym protokole demonstrujemy nowatorskie metody mikroiniekcji materiałów genetycznych, cDNA lub shRNA, do zarodków myszy 2-PN w celu zbadania roli neogeniny we wczesnym różnicowaniu komórek podczas embriogenezy myszy. Modyfikacja genetyczna zarodków preimplantacyjnych jest potężną techniką pozwalającą na odkrycie kluczowych informacji na temat mechanizmów molekularnych leżących u podstaw np. określenia pierwszej linii komórkowej. Modyfikacja genetyczna jest jedną z najczęściej stosowanych metod ustalania funkcji ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają żadnych konkurencyjnych interesów finansowych do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy chcieliby również podziękować grupie dr Xionga z Georgia Health Sciences University za produkcję i udostępnianie konstruktów dla neogeninowych wektorów cDNA i shRNA. Badanie to było wspierane przez granty z Programu Badań Podstawowych (2013R1A1A4A01012572) finansowane przez Koreańską Fundację Badawczą oraz przez grant badawczy z Uniwersytetu Sahmyook.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| M16 średni, | Gibco BRL (Grand Island, NY) | M7292 LOT # 11A832 | |
| Kozia surowica, | Dako (Glostrup, Dania) | X0907 | |
| PMSG | Folligon, Intervet, Holandia | G4877-1000IU LOT#SLBD0719V | |
| Olej mineralny | Sigma Aldrich | CG5-1VL LOT# SLBC6783V | |
| ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej i surowicy ciężarnej klaczy | (Intervet, Holandia) | (invitrogen , 15596-026) | |
| SuperScript® III Technologie życia z odwrotną transkryptazą | 18080-044 | ||
| Premiks PCR | ( Bioneer, Daejon, Korea Południowa) | GenDEPOT, A0224-050 | |
| Agaroza (klasa molekularna) | BioRad | 161-3101 | |
| Roztwór paraformaldehydu, 4% w PBS | Affymetrix USA | 19943 | |
| poliklonalne królicze przeciwciało anty-neogeniczne | Santa Cruz Biotechnology, US | SC-15337 | |
| Alexa fluor 488 znakowane przeciwciało anty-królicze | Sondy molekularne (Invitrogen, USA) | A-11094 | |
| anty-króliczego znakowane Alexa fluor 555 | (Invitrogen, USA) | A-21428 | |
| Alexa Fluor® 555 | Sondy molekularne falloidyny (Invitrogen, USA) | A34055 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dichlorowodorek) | Invitrogen, USA | D1306 | |
| Rekombinowany ludzki RGM-C/Hemojuvelin | R&;D systemy | 3720-RG | |
| wszystkie konstrukcje plazmidowe | Prof. Wen Cheng Xiong na Uniwersytecie Nauk o Zdrowiu w Gruzji (Agusta, Georgia). | Do niniejszej sprawy badania zostały uprzejmie dostarczone przez | |
| Neon® System transfekcji | lifetech | MPK10096 | |
| Stereo Microscrope | Nikon | SMZ1000 | |
| z mikrowtryskiwaczem Nikon | Nikon | Narishige ONM-1 | |
| Uchwyt | GASTIGHT #1750 | ||
| Nikon | Narishige | IM 16 | |
| Microfuge | Nikon Narishige | Młynek Narishige MF-900 | |
| Ściągacz Narishige | EG400 | ||
| Sutter | Instrumnet firmy | P-97 | |
| Inkubator CO2 | Thermo Scientific Forma | EW-39320-16 | |
| Veriti® 384-Well Thermal Cycler | Technologie życiowe | 4388444 |
Bibliografia
- Yamanaka, Y., Ralston, A., Stephenson, R. O., Rossant, J. Cell and molecular regulation of the mouse blastocyst. Dev. Dyn. 235 (9), 2301-2314 (2006).
- Sasaki, H. Mechanisms of trophectoderm fate specification in preimplantation mouse development. Dev. Growth Differ. 52 (3), 263-273 (2010).
- Nishioka, N., Yamamoto, S., Kiyonari, H., Sato, H., Sawada, A., Ota, M., et al. Tead4 is required for specification of trophectoderm in pre-implantation mouse. Mech. Dev. 125 (3-4), 270-283 (2008).
- Ovitt, C. E., Schöler, H. R. The molecular biology of Oct-4 in the early mouse embryo. Mol. Hum. Reprod. 4 (11), 1021-1031 (1998).
- Stein, P., Schindler, K. Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment. J. Vis. Exp. (53), e2851(2011).
- Shin, M. R., Cui, X. S., Jun, J. H., Jeong, Y. J., Kim, N. H. Identification of mouse blastocyst genes that are down regulated by double-stranded RNA-mediated knockdown of Oct-4 expression. Mol. Reprod. Dev. 70 (4), 390-396 (2005).
- Khang, I., Sonn, S., Park, J. -H., Rhee, K., Park, D., Kim, K. Expression of epithin in mouse preimplantation development: Its role in compaction. Dev. Biol. 281, 134-144 (2005).
- Prieto, D., Aparicio, G., Machado, M., Zolessi, F. R. Application of the DNA-Specific Stain Methyl Green in the Fluorescent Labeling of Embryos. J. Vis. Exp. (99), e52769(2015).
- Lee, J. H., Choi, S. S., Kim, H. W., Xiong, W. C., Min, C. K., Lee, S. J. Neogenin as a receptor for early cell fate determination in preimplantation mouse embryos. PLoS One. 9 (7), e101989(2014).
- Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77 (12), 7380-7384 (1980).
- Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 4438-4442 (1985).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
