Celem tego protokołu jest opisanie metody funkcji utraty i zysku, która ma zastosowanie do identyfikacji neogeniny jako specyficznego dla etapu receptora, który prowadzi do trofektodermy i różnicowania wewnętrznej masy komórkowej w preimplantacyjnych zarodkach myszy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Podejście oparte na utracie i wzmocnieniu funkcji w celu zbadania determinantów wczesnego losu komórek w preimplantacyjnych zarodkach myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Techniki wyciszania i nadekspresji genów są kluczowe dla identyfikacji genów zaangażowanych w rozwój embrionalny. Bezpośrednia modyfikacja genu docelowego w zarodkach preimplantacyjnych umożliwia badanie mechanizmów leżących u podstaw genów zaangażowanych na przykład w różnicowanie komórek w trofektodermę (TE) i wewnętrzną masę komórkową (ICM). W tym miejscu opisujemy protokół, który bada rolę neogeniny jako autentycznego receptora do wstępnego określania losu komórek w preimplantacyjnych zarodkach myszy. Po pierwsze, omawiamy eksperymentalne manipulacje, które zostały wykorzystane do uzyskania i utraty funkcji neogeniny poprzez mikroiniekcję neogeniny cDNA i shRNA; Skuteczność tego podejścia została potwierdzona przez silną korelację między poziomami ekspresji białka czerwonej fluorescencji (RFP) lub białka zielonej fluorescencji (GFP) a immunocytochemiczną kwantyfikacją ekspresji neogeniny. Po drugie, nadekspresja neogeniny w preimplantacyjnych zarodkach myszy prowadzi do normalnego rozwoju ICM, podczas gdy knockdown neogeniny powoduje nieprawidłowy rozwój ICM, co sugeruje, że neogenina może być receptorem, który przekazuje sygnały zewnątrzkomórkowe, aby napędzać blastomery do wczesnych losów komórek. Biorąc pod uwagę sukces tego szczegółowego protokołu w badaniu funkcji nowego receptora specyficznego dla stadium rozwoju embrionalnego, sugerujemy, że ma on potencjał, aby pomóc w eksploracji i identyfikacji innych genów specyficznych dla danego stadium podczas embriogenezy.
Wprowadzenie
Rozwój embrionalny przed implantacją można podzielić na kilka różnych etapów, od stadium jednokomórkowego do moruli i blastocysty. Wiele dowodów sugeruje, że polaryzacja i wskazówki pozycyjne odgrywają rolę we wczesnym określaniu losu komórek w trofektodermie (TE) i wewnętrznej masie komórkowej (ICM). Jednak natura sygnałów, sposób, w jaki są one przekształcane w sygnały komórkowe, oraz konteksty fizjologiczne, w których takie sygnały są w stanie zainicjować różnicowanie linii komórkowych, nie są znane. Te zróżnicowane komórki ulegają następnie specjalizacji, zaczynając nabierać charakterystycznych struktur i funkcji potrzebnych do prawidłowego powstania zarodka i wzr....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
UWAGA: Wszystkie procedury dotyczące hodowli i opieki nad zwierzętami zostały przeprowadzone zgodnie z przepisami IACUC Uniwersytetu Sahmyook, Seul, Korea Południowa.
1. Superowulacja, hodowla i izolacja jajowodu
- Utrzymuj myszy wsobne C57BL/6 w następujących warunkach: 22 ± 3 °C, ~60% wilgotności, 12-godzinny cykl światła/ciemności oraz woda i jedzenie ad libitum.
- Wywołaj superowulację u 3-5 tygodniowych samic myszy przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 5 j.m. gonadotropiny surowicy ciężarnej klaczy (PMSG) w dawce 0,1 ml / sztukę, a następnie 48 godzin później dootrzewnowe wstrzyknięcie 5 IU ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej (hCG) w dawce 0,1 ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Odkryliśmy, że neogenina jest przejściowo ekspresjonowana podczas wczesnych etapów rozwoju embrionów myszy przed implantacją, pojawiając się już w stadium 2 komórek i utrzymując się do wczesnej moruli, natomiast staje się niedoborowa w stadium późnej moruli i blastocysty (Ryc. 2A). Ponadto dystrybucja przestrzenna neogeniny była ograniczona głównie do komórek zewnętrznych. Wyniki analizy RT-PCR były zgodne z wczesnym i przejściowym charakterem ekspresji neogeniny, która o.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W niniejszym protokole demonstrujemy nowatorskie metody mikroiniekcji materiałów genetycznych, cDNA lub shRNA, do zarodków myszy 2-PN w celu zbadania roli neogeniny we wczesnym różnicowaniu komórek podczas embriogenezy myszy. Modyfikacja genetyczna zarodków preimplantacyjnych jest potężną techniką pozwalającą na odkrycie kluczowych informacji na temat mechanizmów molekularnych leżących u podstaw np. określenia pierwszej linii komórkowej. Modyfikacja genetyczna jest jedną z najczęściej stosowanych metod ustalania funkcji .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają żadnych konkurencyjnych interesów finansowych do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy chcieliby również podziękować grupie dr Xionga z Georgia Health Sciences University za produkcję i udostępnianie konstruktów dla neogeninowych wektorów cDNA i shRNA. Badanie to było wspierane przez granty z Programu Badań Podstawowych (2013R1A1A4A01012572) finansowane przez Koreańską Fundację Badawczą oraz przez grant badawczy z Uniwersytetu Sahmyook.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| M16 średni, | Gibco BRL (Grand Island, NY) | M7292 LOT # 11A832 | |
| Kozia surowica, | Dako (Glostrup, Dania) | X0907 | |
| PMSG | Folligon, Intervet, Holandia | G4877-1000IU LOT#SLBD0719V | |
| Olej mineralny | Sigma Aldrich | CG5-1VL LOT# SLBC6783V | |
| ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej i surowicy ciężarnej klaczy | (Intervet, Holandia) | (invitrogen , 15596-026) | |
| SuperScript® III Technologie życia z odwrotną transkryptazą | 18080-044 | ||
| Premiks PCR | ( Bioneer, Daejon, Korea Południowa) | GenDEPOT, A0224-050 | |
| Agaroza (klasa molekularna) | BioRad | 161-3101 | |
| Roztwór paraformaldehydu, 4% w PBS | Affymetrix USA | 19943 | |
| poliklonalne królicze przeciwciało anty-neogeniczne | Santa Cruz Biotechnology, US | SC-15337 | |
| Alexa fluor 488 znakowane przeciwciało anty-królicze | Sondy molekularne (Invitrogen, USA) | A-11094 | |
| anty-króliczego znakowane Alexa fluor 555 | (Invitrogen, USA) | A-21428 | |
| Alexa Fluor® 555 | Sondy molekularne falloidyny (Invitrogen, USA) | A34055 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dichlorowodorek) | Invitrogen, USA | D1306 | |
| Rekombinowany ludzki RGM-C/Hemojuvelin | R&;D systemy | 3720-RG | |
| wszystkie konstrukcje plazmidowe | Prof. Wen Cheng Xiong na Uniwersytecie Nauk o Zdrowiu w Gruzji (Agusta, Georgia). | Do niniejszej sprawy badania zostały uprzejmie dostarczone przez | |
| Neon® System transfekcji | lifetech | MPK10096 | |
| Stereo Microscrope | Nikon | SMZ1000 | |
| z mikrowtryskiwaczem Nikon | Nikon | Narishige ONM-1 | |
| Uchwyt | GASTIGHT #1750 | ||
| Nikon | Narishige | IM 16 | |
| Microfuge | Nikon Narishige | Młynek Narishige MF-900 | |
| Ściągacz Narishige | EG400 | ||
| Sutter | Instrumnet firmy | P-97 | |
| Inkubator CO2 | Thermo Scientific Forma | EW-39320-16 | |
| Veriti® 384-Well Thermal Cycler | Technologie życiowe | 4388444 |
Bibliografia
- Yamanaka, Y., Ralston, A., Stephenson, R. O., Rossant, J. Cell and molecular regulation of the mouse blastocyst. Dev. Dyn. 235 (9), 2301-2314 (2006).
- Sasaki, H. Mechanisms of trophectoderm fate specification in preimplantation mouse development. Dev. Growth Differ. ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
