Artykuł metodologiczny

Kwantyfikacja punkcji aktyny nitkowatej (F-aktyny) w neuronach korowych szczurów

DOI:

10.3791/53697

⸱

10 lutego 2016

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory Program in Behavioral, Neuroscience, Department of Psychology, University of South Carolina

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nitkowata aktyna (F-aktyna) odgrywa ważną rolę w spinogenezie, plastyczności synaptycznej i stabilności synaptycznej. Kwantyfikacja F-aktyny puncta jest zatem użytecznym narzędziem do badania integralności struktur synaptycznych. Protokół ten opisuje procedury ilościowego oznaczania F-aktyny puncta znakowanej falloidyną w pierwotnych kulturach neuronów korowych o niskiej gęstości.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nitkowate białko aktyny (F-aktyna) odgrywa główną rolę w spinogenezie, plastyczności synaptycznej i stabilności synaptycznej. Zmiany w dendrytycznych strukturach bogatych w F-aktynę sugerują zmiany w integralności synaptycznej i łączności. Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół hodowli pierwotnych neuronów korowych szczura, barwienia falloidyną dla F-aktyny punktowej i późniejszych technik kwantyfikacji. Najpierw kora czołowa zarodków szczurów E18 jest dysocjowana na hodowlę komórkową o niskiej gęstości, a następnie neurony hodowane in vitro przez co najmniej 12-14 dni. Po eksperymentalnym leczeniu neurony korowe są barwione falloidyną AlexaFluor 488 (w celu znakowania dendrytycznej F-aktyny puncta) i białkiem związanym z mikrotubulami 2 (MAP2; w celu walidacji komórek neuronalnych i integralności dendrytycznej). Wreszcie, specjalistyczne oprogramowanie służy do analizy i ilościowego określania losowo wybranych dendrytów neuronalnych. Struktury bogate w F-aktynę są identyfikowane na gałęziach dendrytycznych drugiego rzędu (zakres długości 25-75 μm) z ciągłą immunofluorescencją MAP2. Przedstawiony tutaj protokół będzie przydatną metodą do badania zmian w strukturach synaps dendrytycznych po leczeniu eksperymentalnym.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Głównym celem tego badania jest opracowanie wiarygodnej metody pomiaru (oszacowania) integralności synaptycznej neuronalnej sieci dendrytycznej. Tutaj opisujemy kwantyfikację F-aktyny puncta w pierwotnych neuronach hodowanych na szczurach za pomocą kombinacji barwienia falloidyną i immunocytochemicznego (ICC) wykrywania dendrytów z późniejszą analizą przy użyciu specjalistycznego oprogramowania (NIS-Elements).

Znakowane phallotoksyny mają podobne powinowactwo zarówno do dużych, jak i małych włókien (F-aktyna), ale nie wiążą się z monomeryczną globularną aktyną (G-aktyną), w przeciwieństwie do niektórych przeciwciał aktynowych 1. Niespecyficzne wiązanie falloidyny jest znikome, zapewniając w ten sposób minimalne tło podczas obrazowania komórkowego. Faloidyna jest znacznie mniejsza niż przeciwciała, które zwykle byłyby używane do znakowania białek komórkowych do mikroskopii fluorescencyjnej, co pozwala na znacznie intensywniejsze znakowanie F-aktyny przez falloidynę. W ten sposób szczegółowe obrazy lokalizacji F-aktyny w neuronach można uzyskać dzięki zastosowaniu znakowanej falloidyny.

Barwienie dendrytów neuronalnych falloidyną (F-aktyną) generuje dyskretne "gorące punkty" lub jasne "puncta", które reprezentują różne struktury dendrytyczne, w tym dojrzałe kolce, synapsy niekolczaste 2 i niedojrzałe kolce. Niedojrzałe kolce obejmują cienkie filopodia i niektóre formy morfologii plam i mogą reprezentować inicjację spinogenezy 3. Niedojrzałe kolce i niekolczaste łaty nie mają PSD95 4. Zmiany w produkcji F-aktyny prowadzą do późniejszych zmian nie tylko w kolcach, ale także w dodatkowych strukturach dendrytycznych, co sprawia, że falloidyna jest ważnym narzędziem do badania integralności synaptodendrytycznej 5-7. Ogólnie rzecz biorąc, liczba punktów falloidyno-dodatnich (F-aktyny) odzwierciedla równowagę między aktywnymi synapsami (pobudzającymi i hamującymi), dynamiką aktyny i stabilnością synaps 8.

Chociaż ważne jest badanie konkretnych typów synaps (np. kolców pobudzających), gdy cel leczenia jest nieznany, konieczne jest najpierw oszacowanie ogólnej integralności różnych struktur dendrytycznych. Ponieważ F-aktyna jest głównym składnikiem kolców dendrytycznych i innych struktur, w tym synaps hamujących, zmieniona liczba punktów F-aktyny może wskazywać na synaptopatię. Ta synaptopatia może być następnie dalej badana pod kątem bardziej szczegółowych zmian. Nasza metoda kwantyfikacji do wykrywania wielu typów/struktur synaptycznych daje ogólne oszacowanie dendrytycznych zmian synaptycznych (wzrostów i spadków) po różnych zabiegach eksperymentalnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie protokoły dotyczące zwierząt zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania na Uniwersytecie Południowej Karoliny (numer gwarancji: A3049-01).

1. Hodowla neuronów embrionalnych o niskiej gęstości

  1. Przygotowanie do hodowli pierwotnych neuronów korowych
    1. Rozwiązania:
      1. Przygotować roztwór podstawowy poli-L-lizyny, rozpuszczając 5 mg poli-L-lizyny w 10 ml buforu boranowego.
      2. Przygotować roztwór roboczy, rozcieńczając 1 ml bulionu poli-L-lizyny w 49 ml buforu boranowego.
      3. Przygotować bufor boranowy o pH 8,4, zaczynając od 395 mldH2O, a następnie dodając wszystkie składniki (1,24 g kwasu borowego + 1,9 g boraksu). Doprowadzić pH do 8,4 na 1 M NaOH. Ustawić na 400 ml i przefiltrować za pomocą nylonowego filtra membranowego 0,2 μm pod maską.
      4. Przygotuj roztwór HBSS o pH 7,2, zaczynając od 445 mldH2O i dodając wszystkie pozostałe składniki (50 ml 10 x HBSS Stock + 1,2 g HEPES). Doprowadzić pH do 7,2 na 1 N HCl, doprowadzić do 500 ml i przefiltrować za pomocą filtra z nylonową membraną 0,2 μm pod maską.
      5. Przygotować pożywkę galwaniczną: DMEM/F12 z 10% płodową surowicą bydlęcą. Filtr z nylonowym filtrem membranowym 0,2 μm pod maską.
      6. Przygotuj kompletną pożywkę wzrostową: Do 50 ml pożywki Neurobasel dodaj suplementy (500 μl GlutaMax (100X) + 500 μl glukozy + 1 ml B-27 (50X) + 500 μl roztworu antybiotykowo-przeciwgrzybiczego (100X) + 100 μl 7,5% wodorowęglanu sodu. Filtr z nylonowym filtrem membranowym 0,2 μm pod maską.
    2. Dwa dni przed posiewem:
      1. Pokryj dwanaście naczyń ze szklanym dnem o średnicy 35 mm 2 ml roztworu roboczego poli-L-lizyny i trzymaj pod pokrywą O/N.
    3. Dzień przed posiewem:
      1. Opróżnij naczynia ze środka powlekającego i spłucz ddH2O. Pozostaw naczynia do wyschnięcia na godzinę pod kapturem.
      2. Przygotować pożywkę posiewową (DMEM/F12 z 10% płodową surowicą bydlęcą (10% całkowitego roztworu). Odpipetować pipetą 2 ml pożywki do każdej pożywki i inkubować O/N w temperaturze 37 oC, 5% CO2,
        nuta: Ważne jest, aby podczas hodowli unikać plastikowych naczyń hodowlanych. Użycie naczyń ze szklanym dnem (w przypadku mikroskopów odwróconych) lub szklanych szkiełek nakrywkowych (w przypadku mikroskopów pionowych) pozwala uzyskać ostre i wyraźne obrazy. W porównaniu z naczyniem z plastikowym dnem, naczynie ze szklanym dnem pozwala uniknąć niepożądanych odcieni lub odblasków podczas mikroskopii fluorescencyjnej.
  2. Protokół hodowli komórkowej:
    1. Umieść schłodzony bufor HBSS (100-150 ml), szalki Petriego 100 mm, kleszcze, nożyczki, probówki 50 ml i probówki 15 ml pod światłem UV w kapturze.
    2. Poddać eutanazji ciężarną szczurkę poprzez śmiertelne wdychanie 5% sewofluranu pod maską poza pomieszczeniem hodowlanym.
    3. Sterylizuj 70% EtOH, nałóż skórę dolnej części brzucha za pomocą kleszczy, jednocześnie tnąc od ogona w górę na środku jamy brzusznej. Otwórz macicę za pomocą nożyczek, aby odsłonić łożysko.
    4. Usuń 8-10 płodów E18. Umieścić 8-10 płodów na szalkach Petriego zawierających roztwór HBSS.
    5. Przytrzymaj tył głowy płodu kleszczami, a następnie użyj nożyczek, aby odciąć głowę od ciała. Umieść go na innej szalce Petriego wypełnionej 5-7 ml HBSS. Przełóż naczynie do okapu.
    6. Napełnij dwie dodatkowe szalki Petriego o średnicy 100 mm zimnym HBSS.
    7. Odłóż czaszkę na bok i zgarnij mózg do nowej szalki Petriego wypełnionej HBSS.
    8. Użyj ostrych, zakrzywionych kleszczy, oddziel móżdżek i pień mózgu od mózgu, a następnie przenieś mózg na nową szalkę Petriego z zimnym HBSS w środku.
    9. Użyj pęsety, aby zabezpieczyć, oddziel półkule zakrzywionymi kleszczami. Usuń opony mózgowe; Wyizolować korę czołową i przenieść jej fragmenty do oznaczonych probówek wirówkowych o pojemności 15 ml.
    10. Napełnij probówkę o pojemności 15 ml świeżym 2 ml HBSS i dodaj 20 μl trypsyny EDTA (10x skoncentrowana mieszanina z 0,5% trypsyny i 5,3 mM EDTA) do każdej probówki o pojemności 15 ml.
    11. Inkubować 10-15 minut w temperaturze pokojowej. Delikatnie obracać rurkę co kilka minut, nie dopuszczając do osiadania.
    12. Po 10-15 minutach użyj szklanej pipety, aby usunąć stary HBSS i dwukrotnie spłucz nowym HBSS.
    13. Zanurzyć w inhibitorze trypsyny (1 mg/ml, 2 mg inhibitora trypsyny w 2 ml HBSS), dobrze wymieszać i odstawić na 5 minut. Umyć dwukrotnie świeżym HBSS.
    14. Za pomocą szklanej pipety z gumową gruszką rozdrabniaj kawałki mózgu 10-15 razy bardzo powoli, aby uniknąć pęcherzyków. Ponownie rozcierać za pomocą skalibrowanej pipety i sterylnej końcówki o zmniejszonej średnicy końcówki bardzo powoli, aż do uzyskania jednorodności.
    15. Przenieś zdysocjowane komórki o pożądanej gęstości do wstępnie przygotowanych powlekanych szalek hodowlanych (50 komórek/mm2). Inkubować O/N w temperaturze 37 oC, 5% CO2.
    16. Po 24 godzinach zastąp pożywkę DMEM/F12 świeżo przygotowaną, kompletną, pozbawioną surowicy wzrostu pożywką Neurobasal.
    17. Utrzymuj komórki przez cały czas w inkubatorze nawilżanym powietrzem o stężeniu 5% CO2/95% powietrza w pomieszczeniu przez co najmniej 12-14 dni przed eksperymentem. Uzupełniaj komórki co 5-6 dni świeżą pożywką Neurobasal, zastępując około 50% starej pożywki.

2. Znakowanie fluorescencyjne i immunocytochemia

Uwaga: Znakowanie immunofluorescencyjne pierwotnych kultur komórek korowych zostało przeprowadzone w szklanych naczyniach do hodowli komórkowych o średnicy 35 mm i objętości roboczej 1 ml.

  1. Umyj naczynie ze szklanym dnem dwukrotnie roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami o pH 7,4 (PBS).
  2. Utrwal komórki za pomocą 4% paraformaldehydu przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Przemyć komórki dwukrotnie PBS i przepuszczać 0,1% Triton X-100 w PBS przez 5 minut.
  4. Traktuj komórki przez 20 minut w temperaturze pokojowej barwnikiem specyficznym dla F-aktyny, AlexaFluor 488 Phalloidin (1:40, 25 μl falloidyny w 1 ml PBS).
  5. Przepłucz komórki dwukrotnie PBS i zablokuj 10% normalną surowicą kozią w temperaturze RT przez 1-2 godziny.
  6. Rozcieńczyć poliklonalne przeciwciało anty-MAP2 kurczaka (1:2,500) w PBS z 2% normalną surowicą kozią i inkubować O/N w temperaturze 4 oC.
  7. Po inkubacji dwukrotnie przepłukać w PBS.
  8. Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe (Alexa Red 594-sprzężone z kozim przeciwciałem IgG przeciwko kurczakowi (1:500) 2% normalnej surowicy koziej i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
  9. Spłucz PBS i dodaj 10 μl/naczynie barwnika Hoescht.
  10. Inkubować przez 3 minuty w temperaturze pokojowej i dwukrotnie przemyć PBS.
    Uwaga: Oznaczone komórki są teraz gotowe do kroku 3 (zliczanie F-aktyny puncta).
  11. Konserwować próbkę komórkową za pomocą 100 μl odczynnika zapobiegającego blaknięciu jako środka do szkiełek nakrywkowych i przechowywać w temperaturze 4 oC w ciemności do długotrwałego przechowywania.
    nuta: Falloidyna jest stosunkowo stabilna w PBS w temperaturze +4 °C w ciemności przez okres do 1 tygodnia, a fluorescencję można zachować za pomocą odczynników zapobiegających blaknięciu szkiełek nakrywkowych. Jednak optymalne obrazy uzyskuje się po 1-3 dniach od barwienia, ponieważ falloidyna może zacząć dyfundować przy dłuższym przechowywaniu.

3. Liczenie F-aktyny Puncta

  1. Włącz mikroskop fluorescencyjny i przełącz na obiektyw 20×. Otwórz oprogramowanie mikroskopu i skonfiguruj program o rozmiarze obrazu 1280×960 pikseli i rozdzielczości obrazu 0,17 μm/piksel przy powiększeniu 1×.
  2. Uzyskaj obrazy współznakowanych neuronów F-aktyny / MAP2 pod zielonymi (495 nm) / czerwonymi (613 nm) kanałami fluorescencyjnymi.
  3. Wybierz 5 zielonych (F-aktyna)/czerwonych (MAP2) znakowanych immunologicznie/niebieskich (Hoescht) obrazów fluorescencyjnych pojedynczego neuronu z wyraźnie zdefiniowanymi trzpieniami dendrytycznymi.
  4. Zidentyfikuj struktury bogate w F-aktynę w segmencie dendrytycznym drugiego rzędu (zakres długości 25-75 μm) z ciągłą immunofluorescencją MAP2.
  5. Obróć zaznaczony obszar obrazów do poziomu poziomego. Skopiuj i wklej jako nowy obraz.
  6. Odejmij tło obrazów, stosując spójne korekty dla każdego dania.
  7. Policz jasnozieloną punkcję F-aktyny i ręcznie prześledź długość wybranego segmentu dendrytycznego przez przeszkolonych niezależnych obserwatorów. Wyeksportuj dane do pliku arkusza kalkulacyjnego.
  8. Obliczyć gęstość, dzieląc całkowitą punktę (N) znakowaną F-aktyną przez długość (L) dendrytów znakowanych MAP2. Wyraż dane jako liczbę punktów F-aktyny na 10 μm dendrytu
    nuta: W każdym wybranym segmencie dendrytycznym uwzględniono Puncta (wielkość ≤1,5 μm) fluorescencji F-aktyny o natężeniu piku co najmniej 50% powyżej średniej intensywności barwienia w trzonie dendrytycznym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W obecnych metodach, najpierw hodujemy neurony korowe szczurów o niskiej gęstości w 35-milimetrowych naczyniach ze szklanym dnem, co pozwala nam zidentyfikować dendryty poszczególnych neuronów. Na rycinie 1 obrazy różnicowego kontrastu interferencyjnego (DIC) pokazują zmiany morfologiczne w rozwoju neuronów korowych płodu szczura w dniach 4, 6, 10, 14, 21 i 27 in vitro. Należy zauważyć, że długość i liczba dendrytów zwiększa się wraz z dojrzewaniem hodowanych neu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym protokole opisujemy hodowlę neuronów korowych szczurów o niskiej gęstości w 35-milimetrowych naczyniach ze szklanym dnem, co pozwala nam zidentyfikować dendryty poszczególnych neuronów. Następnie używamy barwienia falloidyną i MAP2 w celu wykrycia zmian dendrytycznych. Następnie użyliśmy specjalistycznego oprogramowania do ilościowego określenia zmian w F-aktynie puncta.

Aby określić zmiany w F-actin puncta, cała sieć neuronalna pojedynczego neuronu musi być wyraźnie widoczna, co pozwala...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Żaden z autorów nie ma do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została sfinansowana z grantów NIH DA013137, DA031604 i HD043680. Częściowe wsparcie zostało zapewnione przez grant szkoleniowy NIH T32 w zakresie nauk biomedyczno-behawioralnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Naczynia ze szklanym dnem 35 mm nr 1,5 szkło nakrywkoweMatTek CorporationP35G-1.5-20-C
DMEM/F12 mediumLife Technologies10565-018
Trypsyna-EDTALife Technologies15400-054
Poli-L-lizynaSigmaP9155
Kwas borowySigmaB0252
BoraksSigmaB9876
GlutaMaxLife Technologies35050-061100X
GlukozaVWR101174Y
HBSSSigmaH464110X
Neurobasel mediumLife Technologies21103-049
B-27 suplementLife Technologies17504-04450X
Antybiotyk-Antybiotyk rozwiązanieCellgro30004CI100X
Wodorowęglan soduLife Technologies25080
Vannas ScissorsWorld Instrumenty precyzyjne500086
Iris ScissorsWorld Instrumenty precyzyjne500216
Kleszcze do przysłonyŚwiat Instrumenty precyzyjne15914
Dumont #7Kleszcze Świat Instrumenty precyzyjne14097
Kleszcze Dumont #5Świat Instrumenty precyzyjne14095
ProLong GoldLife TechnologiesP36930
Paraformaldehyd SigmaP6148
Szkło osłonoweVWR631-0137
AlexaFluor 488 PhalloidinLife TechnologiesA12379
Normalna surowica końskaLife Technologies26050-070
Kurczak poliklonalny anty-MAP2abcamAb92434
Alexa Red 594-sprzężona koza anty-kurczakIgG Life TechnologiesA11042
NucBlue Live Cell Stain ReadyProbes Odczynnik Hoescht 33342Life TechnologiesR37605
Pakiet oprogramowania NIS-ElementsNikon Instruments
Nikon Eclipse TE2000-E odwrócony fluorescencyjny mikroskop sterowany komputerowo Instrumenty
0.2 i mu; m Filtr z nylonową membraną NalgeneFishersci151-4020
Nikon

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Heller, E. A., et al. The biochemical anatomy of cortical inhibitory synapses. PLoS One. 7, e39572(2012).
  2. Craig, A. M., Blackstone, C. D., Huganir, R. L., Banker, G. Selective clustering of glutamate and gamma-aminobutyric acid receptors opposite terminals releasing the corresponding neurotransmitters. Proc Natl Acad Sci USA. 91, 12373-12377 (1994).
  3. Johnson, O. L., Ouimet, C. C. A regulatory role for actin in dendritic spine proliferation. Brain Res. 1113, 1-9 (2006).
  4. Rao, A., Craig, A. M. Signaling between the actin cytoskeleton and the postsynaptic density of dendritic spines. Hippocampus. 10 (5), 527-541 (2000).
  5. Matus, A., Ackermann, M., Pehling, G., Byers, H. R., Fujiwara, K. High actin concentrations in brain dendritic spines and postsynaptic densities. Proc Natl Acad Sci USA. 79, 7590-7594 (1982).
  6. Allison, D. W., Gelfand, V. I., Spector, I., Craig, A. M. Role of actin in anchoring postsynaptic receptors in cultured hippocampal neurons: differential attachment of NMDA versus AMPA receptors. J Neurosci. 18, 2423-2436 (1998).
  7. Sekino, Y., Kojima, N., Shirao, T. Role of actin cytoskeleton in dendritic spine morphogenesis. Neurochem Int. 51, 92-104 (2007).
  8. Zhang, W., Benson, D. L. Stages of synapse development defined by dependence on F-actin. J Neurosci. 21 (14), 5169-5181 (2001).
  9. Bertrand, S. J., Aksenova, M. V., Mactutus, C. F., Booze, R. M. HIV-1 Tat protein variants: Critical role for the cysteine region in synaptodendritic injury. Exp Neurol. 248, 228-235 (2013).
  10. Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Aksenova, M. V., Espensen-Sturges, T. D., Booze, R. M. Synaptodendritic recovery following HIV Tat exposure: neurorestoration by phytoestrogens. J Neurochem. 128 (1), 140-151 (2014).
  11. Lau, P. M., Zucker, R. S., Bentley, D. Induction of filopodia by direct local elevation of intracellular calcium ion concentration. J Cell Biol. 145, 1265-1275 (1999).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Kolce dendrytyczneplastyczno synaptycznabarwienie falloidynpierwotna hodowla neuron wimmunofluorescencja MAP2ga zie dendrytycznemikroskopia fluorescencyjnaintegralno synaptyczna

Powiązane artykuły