Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Synteza termożelujących kompozytów siarczanowych poli(N-izopropylacyloamidu)-grafto-chondroityny z mikrocząstkami alginianowymi dla inżynierii tkankowej

11.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53704

⸱

26 października 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical Engineering, Rowan University, 2Department of Biological Sciences, Rowan University, 3Department of Biomedical Engineering, Drexel University

W tym artykule

Podsumowanie

Przygotowano rusztowanie do wstrzykiwań inżynierii tkankowej składające się z mikrocząsteczek poli(N-izopropylacrylamidu)-siarczanu chondroityny (PNIPAAm-g-CS)-zawierającego poli(N-izopropylacrylamid). W tym badaniu analizowana jest siła adhezji, właściwości pęcznienia i biokompatybilność in vitro. Opracowane tutaj techniki charakterystyki mogą mieć zastosowanie do innych systemów termożelowania.

Streszczenie

Biomateriały do wstrzykiwania są definiowane jako materiały do implantacji, które mogą być wprowadzone do organizmu w postaci płynu i zestalać się in situ. Takie materiały mają zalety kliniczne, ponieważ są wszczepiane w minimalny sposób inwazyjny i łatwo tworzą wypełniające przestrzeń ciała stałe w ubytkach o nieregularnych kształtach. Biomateriały do wstrzykiwań są szeroko badane jako rusztowania dla inżynierii tkankowej. Jednak w przypadku naprawy niektórych obszarów nośnych w ciele, takich jak krążek międzykręgowy, rusztowania powinny mieć właściwości adhezyjne. Zminimalizuje to ryzyko przemieszczenia podczas ruchu i zapewni intymny kontakt z otaczającą tkanką, zapewniając odpowiednie przenoszenie sił. W tym miejscu opisano przygotowanie i charakterystykę rusztowania złożonego z wrażliwego termicznie siarczanu poli(N-izopropylacrylamidu)-grafto-chondroityny (PNIPAAM-g-CS) i mikrocząstek alginianu. Kopolimer PNIPAAm-g-CS tworzy lepki roztwór w wodzie o temperaturze pokojowej, w którym zawieszone są cząstki alginianu w celu zwiększenia przyczepności. Powyżej dolnej temperatury krytycznej roztworu (LCST), około 30 °C, kopolimer tworzy stały żel wokół mikrocząstek. Dostosowaliśmy standardowe procedury charakteryzacji biomateriałów, aby uwzględnić odwracalne przejście fazowe PNIPAAm-g-CS. Wyniki wskazują, że wprowadzenie cząstek alginianu o stężeniu 50 lub 75 mg/ml do 5% (w/v) roztworów PNIPAAm-g-CS czterokrotnie zwiększa wytrzymałość na rozciąganie przyczepności samego PNIPAAm-gCS (p<0,05). Włączenie mikrocząstek alginianowych znacznie zwiększa również zdolność pęcznienia PNIPAAm-g-CS (p<0,05), pomagając w utrzymaniu żelu wypełniającego przestrzeń w ubytkach tkanek. Wreszcie, wyniki zestawu do testów toksykologicznych in vitro, 2,3-bis-(2-metoksy-4-nitro-5-sulfofenylo)-2H-tetrazolium-5-karboksanilidu (XTT) i testu żywotności żywej/martwej wskazują, że klej jest w stanie wspierać przeżycie i proliferację zamkniętych w kapsułkach komórek ludzkiej nerki zarodkowej (HEK) w ciągu 5 dni.

Wprowadzenie

Biomateriały do wstrzykiwania to te, które mogą być wygodnie dostarczone do organizmu w postaci płynu i zestalają się in situ. Takie materiały są szeroko stosowane w medycynie regeneracyjnej, gdzie są wykorzystywane do dostarczania zamkniętych komórek do dotkniętego miejsca 1-4 i działają jako trójwymiarowa tymczasowa macierz zewnątrzkomórkowa dla komórek 5. Dla pacjenta biomateriały do wstrzykiwania są korzystne, ponieważ zabiegi chirurgiczne związane z implantacją są minimalnie inwazyjne, a faza stała może wypełnić ubytki tkanek o nieregularnych kształtach, eliminując potrzebę stosowania implantów o niestandardowych rozmiarach.

Możliwość wstrzykiwania można osiągnąć za pomocą różnych mechanizmów. Czynniki zewnętrzne, takie jak pH, zostały zbadane jako czynnik wyzwalający powstawanie żeli, które otaczają komórki i bioaktywne cząsteczki6-8. Jednak pH może nie być najwygodniejszym wyzwalaczem do stosowania we wszystkich środowiskach fizjologicznych. Inną tradycyjną alternatywą dla osiągnięcia możliwości wstrzykiwania jest zastosowanie polimeryzacji chemicznej in situ lub sieciowania. Grupa naukowców opracowała rozpuszczalny w wodzie system redoks składający się z nadsiarczanu amonu i N,N,N',N'--tetrametyloetylenodiaminy i wykorzystała go do reakcji makromerów składających się z glikolu polietylenowego i glikolu poli(propylenowego) 9,10. Zan i wsp. W ramach projektu 11 opracowano iniekcyjne sieci polialkoholu winylowego chitozanu usieciowane aldehydem glutarowym. W takich systemach należy wziąć pod uwagę cytotoksyczność składników reaktywnych, zwłaszcza w przypadku zastosowań obejmujących enkapsulację komórek. Ponadto polimeryzacja egzotermiczna może wytwarzać wystarczająco wysokie temperatury, aby zagrozić otaczającej tkance, co opisano w przypadku polimerowych cementów kostnych 12,13.

Jeszcze inne systemy polimerowe do wstrzykiwania zostały opracowane, które wykazują zmianę ze stanu ciekłego na stały ze wzrostem temperatury jako wyzwalacza. Znane jako systemy termożelujące, są to wodne roztwory polimerów, które nie wymagają bodźca chemicznego, monomerów ani środków sieciujących, aby osiągnąć tworzenie in situ 14. Przemiana fazowa zachodząca zwykle w temperaturze zbliżonej do temperatury fizjologicznej indukuje tworzenie się fizycznie usieciowanej trójwymiarowej sieci. Poloksamery, takie jak Pluronic F127, są jednymi z najszerzej przebadanych polimerów do termożelowania dostarczania leków 15-17 i enkapsulacji komórek 18,19. Jednak powszechnie przyjmuje się, że żele te nie są stabilne w warunkach fizjologicznych. Badania wykazały zwiększoną stabilność przy użyciu przedłużaczy łańcucha 20 lub chemicznych środków sieciujących 21,22. Niemniej jednak stosowanie tych odczynników może ograniczyć potencjał materiałów do enkapsulacji komórek.

Poli(N-izopropylokrylamid) to syntetyczny polimer termożelujący, który zyskał znaczną uwagę w inżynierii tkankowej i dostarczaniu leków 14. Wodne roztwory poli(N-izopropyloakrylamidu) (PNIPAAm) wykazują niższą temperaturę krytyczną roztworu (LCST), zwykle występującą około 32 - 34 °C 23,24. Poniżej LCST woda nawadnia łańcuchy PNIPAAm. Powyżej temperatury przejścia polimer staje się hydrofobowy, co powoduje dramatyczną separację faz 25-27 i tworzenie stałego żelu bez użycia toksycznych monomerów lub środków sieciujących. Jednak homopolimery PNIPAAm wykazują słabe właściwości elastyczne i zatrzymują mało wody w temperaturze fizjologicznej ze względu na hydrofobowość 28. W tej pracy decydujemy się na kowalencyjne włączenie siarczanu chondroityny do sieci PNIPAAm, która oferuje potencjał degradacji enzymatycznej 29, aktywność przeciwzapalną 30,31 oraz zwiększone wchłanianie wody i składników odżywczych 32. Kopolimery PNIPAAm z CS otrzymano w naszym laboratorium poprzez polimeryzację monomeru NIPAAm w obecności CS funkcjonalizowanego metakrylanem w celu wytworzenia kopolimeru szczepionego (PNIPAAm-g-CS). Ze względu na niską gęstość usieciowania kopolimeru, PNIPAAm-g-CS tworzy lepki roztwór w wodzie w temperaturze pokojowej i elastyczny żel w temperaturze fizjologicznej dzięki LCST 29. Roztwory polimerowe stają się ponownie płynne po schłodzeniu poniżej LCST ze względu na odwracalność przejścia.

Wykazaliśmy, że PNIPAAm-g-CS ma potencjał do funkcjonowania jako rusztowanie inżynierii tkankowej, dzięki właściwościom mechanicznym, które można dostosować, degradacji i cytokompatybilności z ludzkimi embrionalnymi komórkami nerki (HEK) 293 29. Jednak w niektórych obszarach nośnych, takich jak krążek międzykręgowy, rusztowania inżynierii tkankowej powinny mieć zdolność do tworzenia znacznego interfejsu z otaczającą tkanką dysku, aby wyeliminować ryzyko zwichnięcia 33. Interfejs ten jest również niezbędny do odpowiedniego przenoszenia siły przez granicę faz między implantem a tkanką 33. W naszej pracy zawiesiliśmy mikrocząstki alginianu w wodnych roztworach PNIPAAm-g-CS i stwierdziliśmy, że żelowanie lokalizuje mikrocząstki, które zapewniają adhezję z otaczającą tkanką 34. W tym artykule przedstawiono etapy przygotowania termożelującego polimeru adhezyjnego. Standardowe techniki charakterystyki biomateriałów, obrazowania komórek i oznaczania żywotności zostały dostosowane tak, aby uwzględniały wrażliwość polimeru na temperaturę i odwracalność przemiany fazowej. Polimer do wstrzykiwań opisany w tym artykule ma szeroki potencjał w zakresie dostarczania leków i zastosowań w inżynierii tkankowej poza tymi opisanymi w tym artykule. Co więcej, opisane tutaj metody charakterystyki mogą mieć zastosowanie do innych systemów termożelowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Synteza siarczanu poli(N-izopropylacrylamidu)-g-chondroityny

  1. Przed syntezą hydrożelu bioadhezyjnego należy oczyścić monomer N-izopropylokryloamidu (NIPAAm) i siarczan chondroityny (CS) metakrylanu.
    1. Odważyć co najmniej 10 g NIPAAm i rozpuścić monomer w 400 ml n-heksanu w temperaturze 60 °C. Okresowo mieszać pojemnik aż do całkowitego rozpuszczenia. Rekrystalizuj roztwór w zamrażarce o temperaturze -20 °C przez 24 godziny.
    2. Wyjąć skrystalizowany monomer z pojemnika i przefiltrować próżniowo n-heksan za pomocą lejka Buchnera. Umieść monomer w piecu próżniowym w temperaturze pokojowej na 24 godziny, aby usunąć pozostały n-heksan. Przechowuj monomer w zamrażarce o temperaturze -20 °C do późniejszego użycia (patrz krok 1.2).
    3. Odważyć i rozpuścić 2,0 g siarczanu chondroityny w 8,0 ml wody dejonizowanej. Delikatnie podgrzać roztwór do temperatury 60 °C.
    4. Doprowadzić pH roztworu do 10 za pomocą około 10 do 40 μl 50% (w/w) NaOH.
    5. Dodać 0,298 ml bezwodnika metakrylowego (MA). Chłodnica zwrotna przez 24 godziny, mieszając w temperaturze 60 °C.
    6. Wlać 400 ml roztworu acetonu do słoika i schłodzić O/N w zamrażarce o temperaturze -20 °C.
    7. Po upływie 24 godzin powoli wlać cały roztwór metakrylu CS (mCS) do 400 ml zimnego acetonu, mieszając przy
      8. tym mieszadłem magnetycznym.
    8. Usuń mCS z acetonu i umieść osad w piecu próżniowym. Wykonaj ten krok szybko, aby utrzymać nienaruszony i spójny stan mCS. Pozostawić pozostały aceton do odparowania w próżni przez co najmniej 24 godziny.
  2. Współrozpuść 10 g oczyszczonego NIPAAm i 2,209 g mCS w 232 ml wody dejonizowanej.
  3. Oczyść roztwór z tlenu za pomocą obojętnego azotu gazowego. Utrzymuj energiczne, ale niskie natężenie przepływu gazu, aby zapobiec bulgotaniu roztworu przez 15 minut.
  4. Kontynuować przedmuchiwanie roztworu azotem gazowym i dodać 0,976 ml tetrametyloetylenodiaminy (TEMED).
  5. Następnie należy rozpocząć reakcję polimeryzacji przez zmieszanie 97,6 mg nadsiarczanu amonu (APS).
  6. Mieszaj roztwór przez około 20 sekund i szybko zamknij roztwór, aby zapobiec przedostawaniu się powietrza do naczynia. Pozostaw roztwór do polimeryzacji w świetle fluorescencyjnym przez 24 godziny.
  7. Po upływie 24 godzin umieścić naczynie reakcyjne w piecu o temperaturze 37 °C. Pozwól hydrożelowi przejść ze stanu ciekłego do żelowego. Zanurz spolimeryzowany hydrożel w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem 1X (PBS) na łącznie 7 dni, aby umożliwić dyfuzję nieprzereagowanego monomeru z hydrożelu.
  8. Za pomocą nożyczek pokrój hydrożel na kilka małych kawałków o średnicy nie większej niż 5 cm. Aby zapobiec przejściu hydrożelu ze stanu żelowego do ciekłego, należy pokroić polimer w kostkę w roztworze PBS o temperaturze 37 °C. Przenieść porcje do stożkowych probówek o pojemności 50 ml.
  9. Przygotuj próbki do liofilizacji, owijając górne części probówek chusteczkami Kimwipes i gumkami. Zamrażać probówki w temperaturze -70 °C przez 1 do 2 godzin.
  10. Umieść stożkowe probówki na liofilizatorze, aby usunąć całą wodę z hydrożelu. Przed uruchomieniem liofilizator musi osiągnąć temperaturę i ciśnienie odpowiednio około -40 °C i 0,04 mbar. Do całkowitego wyschnięcia potrzeba co najmniej 7 dni.
  11. Zmielić liofilizowany polimer na drobny proszek i przechowywać w lodówce o temperaturze 4 °C do późniejszego użycia (patrz krok 3.1).

2. Synteza mikrocząstek usieciowanych alginianem wapnia

  1. Przygotować 2% (w/v) roztwór alginianu, rozpuszczając 400 mg w 20 ml wody dejonizowanej. Podgrzać roztwór do temperatury około 60 °C, aby ułatwić rozpuszczenie.
  2. Przygotować 2% (w/v) roztwór chlorku wapnia, dodając 400 mg do 20 ml wody dejonizowanej.
  3. Stwórz mieszaninę oleju w wodzie, łącząc 100 ml oleju rzepakowego, 1,0 ml Tween 20 i 20 ml 2% (w/v) alginianu. Emulgować mieszaninę przez 10 minut za pomocą homogenizatora przy 15 000 obr./min. Dodatkowo wymieszaj z mieszadłem magnetycznym z prędkością 200 obr./min lub 2,000 obr./min, aby utworzyć odpowiednio duże lub małe mikrocząstki.
  4. Odessać 2% (w/v) roztwór chlorku wapnia za pomocą strzykawki z końcówką igły 18 G. Powoli dodawać kroplami chlorek wapnia do emulsji.
  5. Po wyczerpaniu 20 ml chlorku wapnia należy pozostawić mikrocząstki zawarte w emulsji do usieciowania przez 10 minut.
  6. Równomiernie rozprowadzić partię mikrocząstek w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml i odwirować z siłą 1 400 x g przez 2 minuty, aby usunąć początkową warstwę oleju rzepakowego.
  7. Następnie umyć, odwirować i odwirować mikrocząstki izopropanolem w sumie trzy razy w ilości 1,400 g przez 2 minuty, aby usunąć wszelkie pozostałości oleju rzepakowego. Odrzucić supernatant izopropanolu po każdym etapie wirowania i przemyć świeżym izopropanolem.
  8. Po usunięciu oleju powtórz procedurę mycia jeszcze trzy razy wodą dejonizowaną, aby usunąć wszelkie pozostałości izopropanolu. Wyrzuć supernatant wody dejonizowanej po każdym etapie wirowania i przemyj świeżą wodą dejonizowaną. Usunąć około 100 mg mokrych mikrocząstek i przechowywać w fiolce. Mokre mikrocząstki zostaną wykorzystane do pomiaru średniej średnicy partii za pomocą mikroskopii świetlnej.
    1. Za pomocą mikroskopii świetlnej rozproszyć niewielką próbkę mokrych mikrocząstek w dejonizowanej wodzie na szkiełku mikroskopowym. W zależności od wielkości mikrocząstek użyj obiektywu 10X lub 20X i dostosuj przysłonę numeryczną, aż cząsteczki staną się ostre. Upewnij się, że mikroskop jest skalibrowany dla właściwego obiektywu i w razie potrzeby dostosuj jasność źródła światła. Użyj narzędzia liniowego, aby zmierzyć najdłuższą średnicę z 50 losowych mikrocząstek alginianowych i uzyskać średnią wielkość dla partii.
  9. Przygotuj mikrocząstki do liofilizacji, owijając je chusteczkami Kimwipes i zabezpieczając gumkami. Zamrażać mikrocząstki w temperaturze -70 °C przez 1 godzinę.
  10. Umieścić mikrocząstki na liofilizatorze i pozostawić próbkę do wyschnięcia na co najmniej 24 godziny. Zmielić liofilizowane mikrocząstki na drobny proszek za pomocą moździerza i tłuczka i przechowywać w lodówce o temperaturze 4 °C do późniejszego użycia (patrz krok 3.3).

3. Przygotowanie klejów

  1. Używając liofilizowanego proszku polimerowego, stworzyć 5% (w/v) roztwór PNIPAAm-g-CS, rozpuszczając 50 mg proszku hydrożelowego w 1 ml 1x PBS.
  2. Wymieszać roztwór za pomocą wiru i schłodzić w lodówce w temperaturze 4 °C przez 24 godziny.
  3. Gdy utworzy się lepki roztwór, należy utworzyć jednorodny kompozyt, dodając 25 lub 50 mg liofilizowanych mikrocząstek alginianu do roztworu hydrożelu i wirując. Przechowywać kompozyt w lodówce w temperaturze 4 °C do późniejszego użycia (patrz kroki 4.3 i 4.8).

4. Mechaniczne próby rozciągania bioadhezyjnego

  1. Przed wykonaniem prób rozciągania należy pobrać podłoże chrząstki z ucha świni.
    1. Rozmrozić ucho świni w ciepłym 0,9% (w/v) roztworze NaCl; pomoże to rozluźnić tkankę.
    2. Za pomocą skalpela wyizoluj i odetnij płaski, prostokątny obszar, przecinając pionowo warstwę naskórka, tkankę podskórną i chrząstkę. Unikaj przycinania zakrzywionych grzbietów ucha świni.
    3. Oddziel warstwę naskórka skóry od chrząstki, przecinając równolegle tkankę podskórną. Chrząstka to twarda, biała tkanka znajdująca się pod skórą świni
      4. .
    4. Ostrożnie zeskrob tkankę podskórną, która jest przyczepiona do chrząstki bokiem skalpela. Unikaj wrzynania się w tkankę chrzęstną ostrzem skalpela.
    5. Upewnij się, że tylko jedna strona chrząstki jest odsłonięta i płaska podczas próby rozciągania. W razie potrzeby spłaszcz chrząstkę, odcinając nierówną skórę od spodu.
    6. Pokrój tkankę chrzęstną na kilka części o wymiarach 1 cm x 1 cm. Przechowuj tkankę chrzęstną w stożkowych probówkach wypełnionych 0,9% (w/v) roztworem NaCl w zamrażarce o temperaturze -20 °C.
  2. Przygotować 2,0 l 0,9% (w/v) roztworu NaCl. Podgrzej roztwór soli do temperatury 37 °C. Temperatura tego roztworu będzie musiała być utrzymywana przez cały czas testowania.
  3. Rozmrozić zamrożoną chrząstkę. Próbki chrząstki wieprzowej i hydrożelu należy przechowywać w styropianowym pojemniku z wkładami z lodu.
  4. Przymocuj siłomierz do ramienia stanowiska testowego. Umieść płytę grzejną na górze stojaka siłowego i ustaw temperaturę na 50 °C.
  5. Przymocuj kawałek chrząstki o wymiarach 1 cm x 1 cm do bloku ze stali nierdzewnej za pomocą kleju cyjanoakrylowego i pęsety. Przyklej dodatkowy kawałek chrząstki do cylindra Delrin i przymocuj cylinder do siłomierza. Bardzo ważne jest, aby obie powierzchnie chrząstki były zwrócone do siebie i stykały się z hydrożelem.
  6. Umieść łaźnię wodną z pleksiglasu na płycie grzejnej i włóż blok ze stali nierdzewnej wraz z podłożem z chrząstki do wanny.
  7. Opuść ramię stanowiska testowego i wyrównaj ze sobą oba podłoża chrząstki. Podnieś ramię i pozostaw wystarczająco dużo miejsca na nałożenie hydrożelu.
  8. Za pomocą pipety wyporowej dozować 200 μl hydrożelu bioadhezyjnego na dolny kawałek chrząstki.
  9. Opuścić ramię stojaka siłowego z prędkością 1 mm/min, aż hydrożel zetknie się z górnym kawałkiem chrząstki i wywrze siłę napięcia wstępnego 0,001 N.
  10. Wlać roztwór soli o temperaturze 37 °C do kąpieli, aż objętość osiągnie wyznaczony poziom wody. Sprawdź temperaturę roztworu za pomocą termopary.
  11. Pozostaw hydrożel do zastygnięcia na łącznie 5 minut. Po zastygnięciu żelu podnieś ramię z prędkością 2 mm/min. Test jest zakończony, gdy bioadhezyjny oderwie się od podłoża chrząstki lub gdy nastąpi znaczny spadek siły, sygnalizujący awarię.
  12. Zbierz zarejestrowane dane i podnieś ramię stanowiska testowego. Wyjmij butlę Delrin z manometru. Wlać roztwór soli fizjologicznej do poprzedniego pojemnika i podgrzać do temperatury 37 °C.
  13. Oblicz naprężenia, odejmując siłę wywieraną przez polimer od siły wyporu "półfabrykatu", mocowania Delrin bez chrząstki lub kleju, podniesionego w tym samym tempie i dzielącego przez obszar wiązania.

5. Badanie pęcznienia PNIPAAm-g-CS z mikrocząstkami alginianu

  1. Przygotować fiolki z czystego szkła i odpowiednio je oznaczyć punktem czasowym, typem próbki i numerem próbki. Kleje mogą być również tworzone, jak opisano wcześniej. Przygotować łącznie pięć próbek (n = 5) dla każdego rodzaju próbki na punkt czasowy.
  2. Wstępnie zważyć wszystkie szklane fiolki i zapisać ich początkową masę w temperaturze pokojowej.
  3. Za pomocą strzykawki dozować około 0,4 ml przygotowanej próbki kleju do każdej z pięciu fiolek. Powtórz ten krok dla każdego typu próbki we wszystkich testowanych punktach czasowych.
  4. Zważyć i zanotować masę każdej fiolki wraz z próbką kleju w temperaturze pokojowej.
  5. Podgrzej wstępnie inkubator orbitalny i 1 l 1x roztworu PBS do temperatury 37 °C.
  6. Ułóż wszystkie fiolki na stojaku i włóż stojak do inkubatora. Pozwól klejom przejść z płynu w żel przez około 5 do 10 minut.
  7. Dodać 5,0 ml 1x PBS do każdej fiolki. Należy pamiętać, aby ostrożnie dodać roztwór PBS wzdłuż boku fiolki, aby zapobiec rozpadnięciu się krążka hydrożelu.
  8. Zakryć każdą fiolkę w taki sposób, aby zapobiec parowaniu roztworu PBS i utrzymać temperaturę wewnętrzną inkubatora na poziomie 37 °C. Każdy zestaw krążków hydrożelowych będzie musiał pozostać zanurzony w PBS przez określony czas.
  9. Po upływie 7 dni należy odkręcić zestaw fiolek i usunąć roztwór PBS z każdej fiolki. Ponownie zważyć każdą fiolkę z próbką kleju w temperaturze pokojowej.

6. Jakościowa żywotność komórek przy użyciu testu żywego/martwego

  1. Przed wykonaniem testu żywego/martwego za pomocą PNIPAAm-g-CS należy wyhodować ludzkie embrionalne komórki nerki 293 (HEK-293) do 80% konfluencji.
    1. Zamrożoną zawiesinę komórek HEK-293 należy szybko rozmrozić, umieszczając kriowial w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, a następnie odwirować komórki przy 400 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
    2. Aby uzyskać pożywkę do wzrostu komórek pierwszego pasażu, należy połączyć zmodyfikowaną pożywkę Eagle's Eagle's Medium (DMEM) o wysokiej zawartości glukozy (4,5 g/l) z inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (FBS) do końcowego stężenia 20% i 100-krotnym roztworem penicyliny-streptomycyny (pen-strep) do końcowego stężenia 100 j.m./ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny. W przypadku wszystkich innych przejść przełącz się na DMEM z 10% FBS i 1x pen-strep.
    3. Zawiesić osad komórkowy w 10 ml pożywki wzrostowej i przenieść zawiesinę na jedną szalkę Petriego o średnicy 100 mm. Równomiernie rozprowadź komórki, delikatnie przechylając naczynie od przodu do tyłu i od lewej do prawej kilka razy w każdym kierunku.
    4. Hodować komórki w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 . W razie potrzeby zmieniaj podłoże co dwa dni.
    5. Gdy komórki osiągną 80% zbieżności, powiel kulturę w wielu naczyniach. Usuń podłoże z płytki.
    6. Dodaj 1 ml 0,5% trypsyny do płytki. Pozostawić płytki do inkubacji w temperaturze 37 °C przez 10 minut. Sprawdź, czy komórki odrywają się od powierzchni, delikatnie obracając płytką.
    7. Aby podzielić kulturę w stosunku 1:10, dodaj 9 ml zwykłej pożywki wzrostowej (DMEM z 10% FBS) do trypsynizowanych komórek i delikatnie wymieszaj, przechylając naczynie.
    8. Dozować 1 ml rozcieńczonej zawiesiny komórkowej do każdego nowego naczynia i dodać 9 ml pożywki wzrostowej. Delikatnie wymieszaj, przechylając naczynie.
    9. Hodować komórki w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 . W razie potrzeby zmieniaj pożywkę co dwa dni, aż komórki osiągną 80% zbieżności.
  2. Usuń pożywkę z dwóch naczyń hodowlanych wyrośniętych do 80% zbieżności.
  3. Dodaj 1 ml 0,5% trypsyny do każdej płytki. Pozostawić płytki do inkubacji w temperaturze 37 °C przez 10 minut. Sprawdź, czy komórki odrywają się od powierzchni, delikatnie obracając płytką.
  4. Umyć komórki HEK-293 na płytce dwukrotnie 3 ml pożywki wzrostowej i dodać obie zawiesiny do tej samej stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
  5. Odwirować stożkową probówkę o pojemności 15 ml przez 10 minut przy 400 x g w temperaturze 4 °C.
  6. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 3 ml pożywki, pipetując w górę i w dół.
  7. Pobrać pipetę 10 μl zawiesiny komórek do hemocytometru i przeprowadzić liczenie komórek w celu określenia gęstości komórek. Zwiększyć objętość zawiesiny pożywki, jeśli początkowe stężenie komórek jest zbyt wysokie, i odwrotnie, zmniejszyć objętość, jeśli stężenie jest zbyt niskie, aby zachować docelowe stężenie 1 x 106 komórek/ml. Odwirować komórki HEK-293 przy 400 x g i ponownie zawiesić osad komórkowy w odpowiednio skorygowanej objętości pożywki.
  8. Delikatnie zwirować zawiesinę komórkową i równomiernie rozprowadzić mieszaninę komórek do czterech oddzielnych stożkowych probówek o pojemności 15 ml dla następujących warunków testowych: monowarstwa kontroli pozytywnej, kontrola ujemna zabita w PNIPAAm-g-CS przy użyciu 70% (v/v) metanolu, komórki HEK-293 zamknięte w PNIPAAm-g-CS i komórki HEK-293 zamknięte w PNIPAAm-g-CS z mikrocząstkami alginianu.
  9. Stwórz monowarstwy kontroli pozytywnej, pipetując wiele objętości 300 μl mieszanki komórek na 24-dołkową płytkę w celu wygenerowania 4-6 powtórzonych próbek.
  10. Usunąć pożywkę ze stożkowych probówek odnoszących się do zabitej kontroli, PNIPAAm-g-CS i PNIPAAm-g-CS z mikrocząstkami alginianu.
    1. Odwirować stożkowe probówki przez 5 minut przy 400 x g i usunąć supernatant.
    2. Utrzymać to samo stężenie komórek poprzez ponowne zawieszenie komórek w tej samej objętości PNIPAAm-g-CS co usunięte pożywki. Odpipetować komórkę polimerową, mieszać w górę i w dół za pomocą pipety serologicznej, aż do uzyskania jednorodnej konsystencji.
      1. W przypadku wysiewu mikrocząstkami alginianowymi, przenieść zawiesinę komórek PNIPAAm-g-CS (otrzymaną zgodnie z opisem w ppkt 6.10.2) do szalki hodowlanej o średnicy 35 mm i wprowadzić cząstki do mieszanki. Odpipetować komórkę, mieszać w górę i w dół za pomocą pipety serologicznej, aż do uzyskania jednorodnej konsystencji.
    3. Za pomocą pipety serologicznej dozować wielokrotne 300 μl mieszanki komórek polimerowych do każdej z studzienek w celu zabicia kontroli, PNIPAAm-g-CS i PNIPAAm-g-CS z mikrocząstkami alginianu, aby wytworzyć 4 - 6 powtórzonych próbek.
  11. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 10-15 minut i pozwolić, aby PNIPAAm-g-CS przeszedł z cieczy w żel (polimer tworzy nieprzezroczysty, biały krążek).
  12. Umieść podgrzewacz do szkiełka w okapie i ustaw temperaturę na 37 °C. Użyj podgrzewacza do szkiełka, aby utrzymać temperaturę płytki studzienki i odpipetować 600 μl wstępnie podgrzanego podłoża do każdej studzienki. Aby dodatkowo zapobiec przejściu polimeru w stan ciekły, umieść lampę ze świetlówką nad naczyniem, aby ogrzać powietrze nad nim.
  13. Inkubować komórki przez 5 dni w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
  14. Po upływie pięciu dni przygotować żywą/martwą mieszankę barwników za pomocą homodimeru etydyny (EthD-1) i kalceiny AM. Obie substancje są wrażliwe na światło i przygotowywane w dniu stosowania.
    1. Rozmrozić kalceinę AM i EthD-1 z zestawu w RT.
    2. Dodaj 5 ml sterylnego 1x PBS do stożkowej probówki i zawiń ją w folię aluminiową.
    3. Dodać 6,67 μl 2 mM EthD-1 do stożkowej probówki. Dokładnie wymieszaj mieszaninę roztworu.
    4. Następnie dodaj 2,5 μl 4 mM kalceiny AM do stożkowej probówki. Dokładnie wymieszaj mieszaninę.
  15. Usunąć pożywki z dołków monowarstwy (kontrola pozytywna), PNIPAAm-g-CS i PNIPAAm-g-CS z mikrocząstkami alginianu. Umyj wszystkie studzienki dokładnie, ale delikatnie, PBS i wyjmij PBS.
  16. Pozostawić krążki hydrożelu zawierające mikrocząstki alginianu do upłynnienia w temperaturze pokojowej i dodać 2 ml 50 mM cytrynianu sodu do każdej ze studzienek.
  17. Usunąć pożywkę z dołków z zabitymi komórkami (kontrola ujemna). Pozostawić krążki hydrożelu do upłynnienia w temperaturze pokojowej i dodać 300 μl 70% (v/v) metanolu do każdego dołka.
  18. Inkubować płytkę przez 45 minut w temperaturze 37 °C.
  19. Usunąć roztwory cytrynianu sodu i metanolu ze studzienek i odpipetować każdą z zawiesin hydrożelowych do oddzielnych probówek do mikrowirówek. Odwirować probówki o masie 2 000 x g przez 10 minut, aby oddzielić komórki od zawiesiny hydrożelowej.
  20. Ostrożnie usunąć zawiesinę, pipetując roztwór z rurki stożkowej i pozostawiając osad komórkowy. Zawiesić osad w 300 μl PBS i przenieść na oryginalną płytkę studzienki.
  21. Dodaj 300 μl mieszanki barwników żywych i martwych do każdej z studzienek. Owiń płytkę studzienki folią aluminiową i inkubuj przez 45 minut na bujaku w temperaturze RT.
  22. Zobrazuj wszystkie próbki pod odwróconym mikroskopem fluorescencyjnym z obiektywem 10X. Żywe komórki i zabite komórki będą wykazywać odpowiednio zieloną i czerwoną fluorescencję.

7. Ilościowa żywotność komórek przy użyciu testu XTT

  1. Hoduj komórki HEK-293 do 80% konfluencji. Usuń pożywkę wzrostową z dwóch naczyń hodowlanych.
  2. Dodaj 1 ml 0,5% trypsyny do każdej płytki. Pozostawić płytki do inkubacji w temperaturze 37 °C przez 10 minut. Sprawdź, czy komórki odrywają się od powierzchni, delikatnie obracając płytką.
  3. Umyć komórki HEK-293 na płytce dwukrotnie 3 ml pożywki i dodać obie zawiesiny do tej samej stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
  4. Odwirować stożkową probówkę o pojemności 15 ml przez 10 minut przy 400 x g w temperaturze 4 °C.
  5. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 3 ml pożywki, pipetując w górę i w dół.
  6. Pobrać pipetę 10 μl zawiesiny komórek do hemocytometru i przeprowadzić liczenie komórek w celu określenia gęstości komórek. Jak opisano wcześniej, należy zachować docelowe stężenie 1 x 106 komórek/ml. Odwirować komórki HEK-293 przy 400 x g i ponownie zawiesić osad komórkowy w odpowiednio skorygowanej objętości pożywki.
  7. Delikatnie zwirować zawiesinę komórkową i równomiernie rozprowadzić mieszaninę komórek do czterech oddzielnych stożkowych probówek o pojemności 15 ml dla następujących warunków testowych: monowarstwa kontroli pozytywnej, kontrola ujemna zabita w PNIPAAm-g-CS przy użyciu 70% (v/v) metanolu, komórki HEK-293 zamknięte w PNIPAAm-g-CS i komórki HEK-293 zamknięte w PNIPAAm-g-CS z mikrocząstkami alginianu.
  8. Stwórz monowarstwy kontroli pozytywnej, pipetując 300 μl mieszanki komórek na 24-dołkową płytkę w celu wygenerowania 4-6 powtórzonych próbek.
  9. Usunąć pożywkę ze stożkowych probówek odnoszących się do zabitej kontroli, PNIPAAm-g-CS i PNIPAAm-g-CS z mikrocząstkami alginianu.
    1. Odwirować stożkowe probówki przez 5 minut przy 400 x g i usunąć supernatant.
    2. Utrzymać to samo stężenie komórek poprzez ponowne zawieszenie komórek w tej samej objętości PNIPAAm-g-CS co usunięte pożywki. Odpipetować komórkę, mieszać w górę i w dół za pomocą pipety serologicznej, aż do uzyskania jednorodnej konsystencji.
      1. W przypadku wysiewu mikrocząstkami alginianu należy przenieść zawiesinę komórek PNIPAAm-g-CS do naczynia hodowlanego o średnicy 35 mm i wprowadzić cząstki do mieszanki. Odpipetować komórkę, mieszać w górę i w dół za pomocą pipety serologicznej, aż do uzyskania jednorodnej konsystencji.
    3. Za pomocą pipety serologicznej dozować 300 μl mieszaniny komórek polimerowych do każdej z studzienek w celu zabicia kontroli, PNIPAAm-g-CS i PNIPAAm-g-CS z mikrocząstkami alginianu w celu wytworzenia 4-6 powtórzonych próbek.
  10. Po dodaniu wszystkich próbek zawierających komórki do płytki 24-dołkowej, należy dozować wielokrotność 300 μl objętości PNIPAAm-g-CS i PNIPAAm-g-CS z mikrocząstkami alginianowymi bez komórek w sąsiednich studzienkach, aby wytworzyć 4-6 powtórzonych próbek.
  11. Inkubować 24-dołkową płytkę w temperaturze 37 °C przez 10-15 minut i pozwolić, aby PNIPAAm-g-CS przeszedł z cieczy w żel (polimer tworzy nieprzezroczysty, biały dysk).
  12. Umieść podgrzewacz do szkiełkek w okapie i ustaw temperaturę na 37 °C. Użyj podgrzewacza do szkiełka, aby utrzymać temperaturę płytki studzienki i odpipetować 600 μl wstępnie podgrzanego przezroczystego DMEM do każdej studzienki. Aby dodatkowo zapobiec przejściu polimeru w stan ciekły, umieść lampę ze świetlówką nad naczyniem, aby ogrzać powietrze nad nim.
  13. Inkubować komórki przez 5 dni w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 .
  14. Po upływie pięciu dni przygotować odczynnik 2,3-bis-(2-metoksy-4-nitro-5-sulfofenylo)-2H-tetrazolium-5-karboksyanilid (XTT) od producenta. Odczynnik XTT jest światłoczuły i przygotowany w dniu użycia.
    1. Wyjąć z lodówki bursztynową butelkę zawierającą proszek XTT. Za pomocą sterylnej strzykawki i igły wstrzyknąć 5 ml klarownego DMEM (bez czerwieni fenolowej) przez gumową przegrodę do bursztynowej butelki.
    2. Podgrzewać odczynnik do temperatury 56 °C w łaźni wodnej przez 10 minut lub do rozpuszczenia.
    3. Odczynnik XTT należy następnie rozcieńczyć do 20% (v/v) w stożkowej probówce o pojemności 15 ml owiniętej folią aluminiową. Nadmiar odczynnika XTT rozmieścić w probówkach do mikrowirówek i umieścić w zamrażarce o temperaturze -20 °C w celu długotrwałego przechowywania.
  15. Usunąć pożywkę z dołków z martwymi komórkami (kontrola ujemna) i dodać 300 μl 70% (v/v) metanolu do każdej studzienki. Inkubować przez 45 minut w temperaturze 37 °C i usunąć metanol ze studzienek.
  16. Usunąć pożywki z pozostałych studzienek monowarstwy (kontrola pozytywna), PNIPAAm-g-CS i PNIPAAm-g-CS z mikrocząstkami alginianowymi. Umyj wszystkie studzienki dokładnie, ale delikatnie, PBS, a następnie wyjmij PBS.
  17. Dodać 300 μl 20% odczynnika XTT do każdego z dołków. Owinąć 24-dołkową płytkę folią aluminiową i inkubować przez 24 godziny na bujaku w temperaturze pokojowej.
  18. Po 24 godzinach dodać 200 μl 50 mM cytrynianu sodu do wszystkich studzienek i inkubować na kołysce przez jedną dodatkową godzinę.
  19. Przenieść wszystkie zawiesiny polimerowe do probówek do mikrowirówek i wirować przy 2 000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  20. Przenieść 200 μl supernatantu z każdej probówki do mikrowirówki na płytkę 96-dołkową. Za pomocą czytnika płytek do mikromiareczkowania uzyskać odczyty absorbancji właściwej przy 450 nm i odczyty absorbancji niespecyficznej przy 690 nm.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zsyntetyzowano i scharakteryzowano termowrażliwy kopolimer szczepiony pod kątem siły bioadhezji, właściwości pęcznienia oraz cytokompatybilności in vitro. Zdecydowano się zbadać alginian ze względu na jego dobrze udokumentowane właściwości mukoadhezyjne. Mikrocząsteczki alginianu o średnicy 59,7 ± 14,9 µm zmieszano z 5% (w/v) PNIPAAm-g-CS w stężeniach 25, 50 i 75 mg/ml. Stężenia te oparto na połowie, wartości równej oraz dwukrotności ekwiwalentnej suchej masy PNIPAAm-g-CS w roztw...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Istnieje kilka krytycznych etapów syntezy kompozytu hydrożelowo-mikrocząsteczkowego i oceny jego siły adhezji, zdolności pęcznienia i biokompatybilności komórkowej. Polimeryzacja wolnorodnikowa PNIPAAm-g-CS wymaga udanej metakrylacji siarczanu chondroityny, całkowitego rozpuszczenia składników monomeru oraz warunków reakcji beztlenowej. Stosunek monomeru NIPAAm do metakryloizowanego siarczanu chondroityny w mieszaninie reakcyjnej został wybrany, ponieważ wykazano, w naszej poprzedniej pracy, że generuje on kopolimery o w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy pragną wyrazić wdzięczność za pomoc dr Jennifer Kadlowec w opracowaniu protokołu badania rozciągania kleju.

Badania opisane w tej publikacji były wspierane przez National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases oraz National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering of the National Institutes of Health pod numerem nagrody 1R15 AR 063920-01. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
N-izopropylokrylakamid, 99%, czysty, stabilizowanyAcros Organics2210-25-5Schłodzić i usunąć stabilizator za pomocą heksanu
Siarczan chondroityny Sól sodowa A (z tchawicy bydlęcej)Sigma-Aldrich39455-18-0Przechowywać w lodówce
HeksanyFisher ScientificH302-4Przechowywać w łatwopalnej szafce
50% (w/w) wodorotlenku soduFisher ScientificSS254-1z natury
Bezwodnik metakrylowySigma-Aldrich276685Silne opary; stosować w dygestoriach
AcetonFisher ScientificA18-4Schłodzić w lodówce przed użyciem
GazPraxair7727-37-9Numer części: NI 4.8, typ butli T, 99,998% czystego azotu (argon może być stosowany jako alternatywny gaz obojętny)
Tetrametyloetylenodiamina, 99% ekstra czystyAcros Organics110-18-9
Nadsiarczan amonuSigma AldrichA3678Higroskopijny i ulega degradacji w obecności wody
Tabletki soli fizjologicznej buforowane fosforanamiFisher ScientificBP2944Utrzymuj suchość
Kwas alginowy, sól sodowaAcros Organics177775000Użyj ciepła, aby pomóc w rozpuszczeniu
Chlorek wapnia dwuwodnyFisher ScientificC79
Olej rzepakowylokalny Donabycia w lokalnym sklepie
Tween 20Sigma-Aldrich93773
70% (v/v) IsopropoanolFisher ScientificA416-4
Uszy świniHaine's Pork ShopUzyskaj od lokalnego rzeźnika
Chlorek soduFisher ScientificS271-3
Ludzka embrionalna nerka 293 komórkiATCCATCC CRL-1573Przechowywać w ciekłym azocie do długotrwałego stosowania
DMEM: 1x, wysoka glukoza, bez pirogronianuLife Technologies11965126Przechowywać w lodówce
płodową surowicę bydlęcąLife Technologies10082-147Przechowywać w lodówce
Penn Strep: 10 000 U/mlLife Technologies15140-122
Trypsyna EDTA do lodówki: 0,5%, 10xLife Technologies15400-054Metanol do lodówki
VWRAAA44571-K7
Zestaw do żywotności żywych/martwych komórekLife TechnologiesL3224Światłoczuły, zamrożony
zestaw żywotności komórek XTTSigmaAldrich TOX2-1KTWrażliwy na światło, zamrożony
Przezroczysty DMEM: 1x, wysoka glukoza, bez fenoluLife Technologies21063-029Przechowywać w lodówce
PBS firmy Dulbecco: 1xLife Technologies14190136Chłodnicza
cytrynian soduEMD SX0445-1
Pipeta wyporowaBrandTech Scientific, INC2702904Dozuje 100 - 500 i mikro; l i w zestawie z dołączanymi końcówkami
nr 3. Rękojeść skalpela ze stali nierdzewnejSigma AldrichS2896
Sterylne ostrza chirurgiczne MiltexFisher Scientific12-460-440Rozmiar 10
Homogenizator klejnotów mocyFisher Scientific08-451-660Model # 125
Moździerz i tłuczek porcelanowySigma AldrichZ247464Mieści 50 ml
FreeZone 1 L stołowy system liofilizacjiLabconco7740020Zamroź próbki przed użyciem
Pompa łopatkowa z uszczelnieniem olejowymEdwardsA65301906Model # RV5
Wytrząsarka oscylacyjna inkubacyjnaVWR12620-946Model # 980153
Wirówka stołowa z chłodzeniemForma Scientific, INCModel # 5682
Podgrzewane pieceVWRModel # 1235PC
2 N miernik siłyShimpoFGV-0.5XYModel # FGV-0.5XY
Stanowisko testowe E-forceShimpoFGS-200PVModel # FGS-200PV
Wirówka kubełkowa wahadłowa do kultur tkankowychBeckman Coulter366830Model #6S-6KR
Mikrowirówka do hodowli tkankowychEppendorfModel #5415C
Zestaw hemacytometruHausser Scientific3720Wymaga wymiany szkła nakrywkowego slipy
Podgrzewacz do slajdówLab ScientificXH-2022Model # XH-2002
Przenośna lampa grzewczaUnderwriters LaboratoriesPomaga utrzymać temperaturę polimeru na poziomie 37 & deg; C
Odwrócony mikroskop fluorescencyjnyZeissModel Axiovert 25 CFL
Podgrzewana kąpiel wodnaVWRModel # 1235PC
Platforma bujanaVWRSeries 100
Multiskan FC czytnik płytek do mikromiareczkowaniaThermo ScientificType 357
Inkubator kultur komórkowychVWRModel # 2350T
Oczyszczacz Szafa bezpieczeństwa biologicznego klasy IILabconcoDelta Series
azotowy Sklep

Bibliografia

  1. Bidarra, S. J., Barrias, C. C., Granja, P. L. Injectable alginate hydrogels for cell delivery in tissue engineering. Acta Biomater. 10, 1646-1662 (2014).
  2. Choi, J., et al. Human extracellular matrix (ECM) powders for injectable cell delivery and adipose tissue engineering. J. Control. Release. 139, 2-7 (2009).
  3. Selvam, S., Pithapuram, M. V., Victor, S. P., Muthu, J. Injectable in situ. forming xylitol-PEG-based hydrogels for cell encapsulation and delivery. Colloid Surface B. 126, 35-43 (2015).
  4. Park, K. M., Lee, S. Y., Joung, Y. K., Na, J. S., Lee, M. C., Park, K. D. Thermosensitive chitosan-pluronic hydrogel as an injectable cell delivery carrier for cartilage regeneration. Acta Biomater. 5, 1956-1965 (2009).
  5. Ren, K., He, C., Xiao, C., Li, G., Chen, X. Injectable glycopolypeptide hydrogels as biomimetic scaffolds for cartilage tissue engineering. Biomaterials. 51, 238-249 (2015).
  6. Chiu, Y. L., et al. pH-triggered injectable hydrogels prepared from aqueous N-palmitoyl chitosan: In vitro characteristics and in vivo biocompatibility. Biomaterials. 30, 4877-4888 (2009).
  7. Shim, W. S., et al. pH- and temperature-sensitive, injectable, biodegradable block copolymer hydrogels as carriers for paclitaxel. Int. J. Pharm. 331, 11-18 (2007).
  8. Singh, N. K., Insitu Lee, D. S. gelling pH- and temperature-sensitive biodegradable block copolymer hydrogels for drug delivery. J. Control. Release. 193, 214-227 (2014).
  9. Wang, B., Zhu, W., Zhang, Y., Yang, Z., Ding, J. Synthesis of a chemically-crosslinked thermo-sensitive hydrogel film and in situ of model protein drugs. React. Funct. Polym. 66, 509-518 (2006).
  10. Zhu, W., Ding, J. Synthesis and characterization of a redox-initiated, injectable, biodegradable hydrogel. J. Appl. Polym. Sci. 99, 2375-2383 (2006).
  11. Zan, J., Chen, H., Jiang, G., Lin, Y., Ding, F. Preparation and properties of crosslinked chitosan thermosensitive hydrogel for injectable drug delivery systems. J. Appl. Polym. Sci. 101, 1892-1898 (2006).
  12. Togawa, D., Bauer, T. W., Lieberman, I. H., Takikawa, S. Histologic evaluation of human vertebral bodies after vertebral augmentation with polymethyl methacrylate. Spine. 28, 1521-1527 (2003).
  13. Berman, A. T., Reid, J. S., Yanicko, D. R., Sih, G. C., Zimmerman, M. R. Thermally induced bone necrosis in rabbits: relation to implant failure in humans. Clin. Orthop. Relat. R. 186, 284-292 (1984).
  14. Kretlow, J. D., Klouda, L., Mikos, A. G. Injectable matrices and scaffolds for drug delivery in tissue engineering. Adv Drug. Deliver. Rev. 59, 263-273 (2007).
  15. Ye, F., Yaghmur, A., Jensen, H., Larsen, S. W., Larsen, C., Ostergaard, J. Real-time UV imaging of drug diffusion and release from Pluronic F127 hydrogels. Eur. J. Pharm. Sci. 43, 236-243 (2011).
  16. Akash, M. S., Rehman, K. Recent progress in biomedical applications of pluronic (PF127): Pharmaceutical perspectives. J. Control Release. 209, 120-138 (2015).
  17. Sellers, D. L., Kim, T. H., Mount, C. W., Pun, S. H., Horner, P. J. Poly(lactic-co-glycolic) acid microspheres encapsulated in Pluronic F-127 prolong hirudin delivery and improve functional recovery from a demyelination lesion. Biomaterials. 35, 8895-8902 (2014).
  18. Jung, H., Park, K., Han, D. K. Preparation of TGF-β1-conjugated biodegradable pluronic F127 hydrogel and its application with adipose-derived stem cells. J. Control. Release. 147, 84-91 (2010).
  19. Lee, S. Y., Tae, G. Formulation and in vitro of an in situ photo-polymerizable pluronic hydrogel suitable for injection. J. Control. Release. 119, 313-319 (2007).
  20. Chen, Y. Y., Wu, H. C., Sun, J. S., Dong, G. C., Wang, T. W. Injectable and thermoresponsive self-assembled nanocomposite hydrogel for long-term anticancer drug delivery. Langmuir. 19, 3721-3729 (2013).
  21. Cellesi, F., Tirelli, N., Hubbell, J. A. Materials for cell encapsulation via a new tandem approach combining reverse thermal gelation and covalent crosslinking. Macromol. Chem. Physic. 203, 1466-1472 (2002).
  22. Cellesi, F., Tirelli, N., Hubbell, J. A. Towards a fully-synthetic substitute of alginate: development of a new process using thermal gelation and chemical cross-linking. Biomaterials. 25, 5115-5124 (2004).
  23. Hirokawa, Y., Tanaka, T. Volume phase transition in a nonionic gel. J. Chem. Phys. 81, 6379-6380 (1984).
  24. Freitas, R., Cussler, E. L. Temperature sensitive gels as extraction solvents. Chem. Eng. Sci. 42, 97-103 (1987).
  25. Schild, H., Tirrel, D. A. Microcalorimetric detection of lower critical solution temperatures in aqueous polymer solutions. J. Chem. Phys. 94, 4352-4356 (1990).
  26. Yagi, Y., Inomata, H., Saito, S. Solubility parameter of an N-isopropylacrylamide gel. Macromol. 25, 2997-2998 (1992).
  27. Illmain, F., Tanaka, T., Kokufuta, E. Volume transition in a gel driven by hydrogen bonding. Nature. 349, 400-401 (1990).
  28. Vernengo, J., Fussell, G. W., Smith, N. G., Lowman, A. M. Evaluation of novel injectable hydrogels for nucleus pulposus replacement. J. Biomed. Mater. Res. B. 84, 64-69 (2008).
  29. Wiltsey, C., et al. Characterization of injectable hydrogels based on poly(N-isopropylacrylamide)-g-chondroitin sulfate with adhesive properties for nucleus pulposus tissue engineering. J. Mater. Sci-Mater. M. 24, 837-847 (2013).
  30. Ronca, F., Palmieri, L., Panicucci, P., Ronca, G. Anti-inflammatory activity of chondroitin sulfate. Osteoarthr. Cart. 6, 14-21 (1998).
  31. Pipitone, V. Chondroprotection with chondroitin sulfate. Drug. Exp. Clin. Res. 17, 3-7 (1991).
  32. Moss, M., Kruger, G. O., Reynolds, D. C. The effect of chondroitin sulfate on bone healing. Oral Surg. Oral Med. O. 20, 795-801 (1965).
  33. Nerurkar, N., Elliott, D. M., Mauck, R. L. Mechanical design criteria fo intervertebral disc tissue engineering. J. Biomech. 43, 1017-1030 (2010).
  34. Wiltsey, C., et al. Thermogelling bioadhesive scaffolds for intervertebral disk tissue engineering: Preliminary in vitro of aldehyde-based versus alginate microparticle-mediated adhesion. Acta Biomater. 16, 71-80 (2015).
  35. Xia, Y., Yin, X., Burke, N., Stover, H. Thermal response of narrow-disperse poly(N-isopropylacrylamide) prepared by atom transfer radical polymerization. Macromol. 38, 5937-5943 (2005).
  36. Liu, Q., Zhang, P., Qing, A., Lan, Y., Lu, M. Poly(N-isopropylacrylamide) hydrogels with improved shrinking kinetics by RAFT polymerization. Polymer. 47, 2330-2336 (2006).
  37. Lemoine, D., Wauters, F., Bouchend'homme, S., Preat, V. Preparation and characterization of alginate microspheres containing a model antigen. Int. J. Pharm. 176, 9-19 (1998).
  38. Dang, T. D., Joo, S. W. Preparation of tadpole-shaped calcium alginate microparticles with sphericity control. Colloid. Surface. B. 102, 766-771 (2013).
  39. Moebus, K., Siepmann, J., Bodmeier, R. Novel preparation techniques for alginate-polaxamer microparticles controlling protein release on mucosal surfaces. Eur. J. Pharm. Sci. 45, 358-366 (2012).
  40. Lih, E., Lee, J. S., Park, K. M., Park,, D, K. Rapidly curable chitosan-PEG hydrogels as tissue adhesives for hemostasis and wound healing. Acta Biomater. 8, 3261-3269 (2012).
  41. Urban, J., Maroudas, A. Swelling of the intervertebral disc in vitro. Connect. Tissue Res. 9, 1-10 (1981).
  42. Ma, H. L., Hung, S. C., Lin, S. Y., Chen, Y. L., Lo, W. H. Chondrogenesis of human mesenchymal stem cells encapsulated in alginate beads. J. Biomed. Mater. Res. A. 64, 273-281 (2003).
  43. Leslie, S. K., et al. Controlled release of rat adipose-derived stem cells from alginate microbeads. Biomaterials. 34, 8172-8184 (2013).
  44. Peroglio, M., Eglin, D., Benneker, L. M., Alini, M., Grad, S. Thermoreversible hyaluronan-based hydrogel supports in vitro. and ex vivo. disc-like differentiation of human mesenchymal stem cells. Spine J. 13, 1627-1639 (2013).
  45. Chen, J. P., Cheng, T. H. Thermo-responsive chitosan-graft-poly(N-isopropylacrylamide) injectable hydrogel for cultivation of chondrocytes and meniscus cells. Macromol. Biosci. 6, 1026-1039 (2006).
  46. Schoichet, M. S., Li, R. H., White, M. L., Winn, S. R. Stability of hydrogels used in cell encapsulation: an in vitro comparison of alginate and agarose. Biotechnol. Bioeng. 50, 374-381 (1996).
  47. Dai, J., Wang, H., Liu, G., Xu, Z., Li, F., Fang, H. Dynamic compression and co-culture with nucleus pulposus cells promotes proliferation and differentiation of adipose-derived mesenchymal stem cells. J. Biomech. 47, 966-972 (2014).
  48. Feng, G., et al. Effects of hypoxias and scaffold architecture on rabbit mesenchymal stem cell differentiation towards a nucleus pulposus-like phenotype. Biomaterials. 32, 8182-8189 (2011).
  49. Feng, G., et al. Hypoxia differentially regulates human nucleus pulposus and annulus fibrosus cell extracellular matrix production in 3D scaffolds. Osteoarth. Cartilage. 21, 582-588 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Termożelujący hydrożelPNIPAAm-g-CSwytrzymałość na rozciąganieżywotność komórkowawstrzykiwalny biomateriałjądro miażdżystetest Live/Deadzdolność do pęcznienia
Synteza termożelujących kompozytów siarczanowych poli(N-izopropylacyloamidu)-grafto-chondroityny z mikrocząstkami alginianowymi dla inżynierii tkankowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.