Tutaj prezentujemy nowatorskie podejście do obrazowania Ca2+ za pomocą bioluminescencyjnego reportera. Podejście to wykorzystuje stopiony konstrukt GFP-aequorin, który wiąże się z Ca2+ i emituje światło, eliminując potrzebę wzbudzenia światła. Co istotne, metoda ta pozwala na długie, ciągłe obrazowanie, dostęp do głębokich struktur mózgu i wysoką rozdzielczość czasową.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
In vivo (in vivo) Funkcjonalne obrazowanie mózgu oparte na bioluminescencyjnym wskaźniku wapnia GFP-aequorin
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Funkcjonalne obrazowanie in vivo stało się potężnym podejściem do badania funkcji i fizjologii komórek mózgowych i struktur będących przedmiotem zainteresowania. Niedawno opracowano nową metodę obrazowaniaCa2+ z wykorzystaniem bioluminescencyjnego reportera GFP-aequorin (GA). Ta nowa technika opiera się na fuzji genów GFP i aequorin, wytwarzając cząsteczkę zdolną do wiązania wapnia i – z dodatkiem jej kofaktora koelenterazyny – emitowania jasnego światła, które może być monitorowane przez kolektor fotonów. Linie transgeniczne z genem GFP-aequorin zostały wygenerowane zarówno dla myszy, jak i Drosophila. U Drosophila gen GFP-aequorin został umieszczony pod kontrolą binarnego systemu ekspresji GAL4/UAS, co pozwala na ukierunkowaną ekspresję i obrazowanie w mózgu. Następnie wykazano, że metoda ta jest w stanie wykryć zarówno wewnętrzne stany przejściowe Ca2+, jak i Ca2 + uwalniane z wewnętrznych magazynów. Co najważniejsze, pozwala na dłuższy czas trwania ciągłego nagrywania, obrazowania na większych głębokościach w mózgu i nagrywania w wysokich rozdzielczościach czasowych (do 8,3 ms). Tutaj przedstawiamy podstawową metodę wykorzystania obrazowania bioluminescencyjnego do rejestrowania i analizowania aktywności Ca2+ w ciałach grzybów, strukturze kluczowej dla uczenia się i pamięci w mózgu muchy.
Wprowadzenie
Podstawowe wzorce i funkcje aktywności w mózgu i jego odrębnych strukturach od dawna są przedmiotem intensywnych badań w dziedzinie neuronauki. Być może jednymi z najwcześniejszych udanych podejść stosowanych w celu rozwiązania tego problemu były bezpośrednie pomiary fizjologiczne zmian aktywności elektrycznej – jednak alternatywne metody, które umożliwiają obrazowanie na żywo zmian napięcia, pH lub stężenia wapnia (jako wskaźnika aktywności) przyniosły dodatkowe możliwości do badania aktywności neuronalnej 1. Techniki obrazowania niosą ze sobą szeroki wachlarz zalet, takich jak zmniejszona inwazyjność i możliwość monitorowania aktywności w obrębie całych struktur mózgu. Co więcej, u zwierząt z podatną genetyką, w tym muszki owocowej Drosophila, rozwój genetycznie kodowanych wskaźników wapnia, takich jak cameleon, GCaMPsi inne1, umożliwił naukowcom monitorowanie pojedynczych neuronów, populacji neuronów i całych struktur mózgu. Podczas gdy bardziej tradycyjne fluorescencyjne metody obrazowania wapnia wykorzystujące GCaMPs (GFP sfuzjony z kalmoduliną) lub FRET (CFP i YFP połączone z kalmoduliną) okazały się użytecznymi technikami zapewniającymi dobrą rozdzielczość przestrzenną i czasową, leżący u podstaw proces wzbudzenia światła rodzi pewne ograniczenia w jego zastosowaniach eksperymentalnych. Ze względu na naturę wzbudzenia świetlnego, w sposób nieunikniony dochodzi do autofluorescencji, fotowybielania i fototoksyczności, co w konsekwencji ogranicza głębokość struktur, które można obrazować, czas trwania nagrań, a także ciągłość zapisu w czasie rzeczywistym. Innymi słowy, nagrania muszą być często wykonywane z przerwami, aby uniknąć tych niepożądanych skutków ubocznych.
Z powodu tych wyzwań, opracowano dodatkowe alternatywne metody obrazowania wapnia. Jedną z najbardziej obiecujących metod jest obrazowanie bioluminescencyjne, które opiera się na świetle wytwarzanym w wyniku reakcji enzymatycznej po związaniu wapnia. Obrazowanie bioluminescencyjne nie wymaga wzbudzenia światłem, a co za tym idzie, nie napotyka takich samych trudności, jak konwencjonalne obrazowanie wapniowe. Bioluminescencyjny reporter Aequorin – wyizolowany z Aequorea victoria, tej samej meduzy, od której również wyizolowano GFP – wiąże wapń poprzez swoje trzy struktury dłoni EF i ulega zmianie konformacyjnej, co prowadzi do utleniania jego kofaktora koelenterazyny i uwolnienia światła niebieskiego (λ=469 nm)2,3. Aequorin ma bardzo niskie powinowactwo do wapnia (Kd = 10 μM), co czyni go idealnym do monitorowania stanów przejściowych wapnia, ponieważ wytwarza bardzo mało szumu tła i nie zakłóca wewnątrzkomórkowego systemu buforowania wapnia4. Chociaż aequorin był wcześniej używany do monitorowania procesu indukcji neuronalnej w jaju Xenopus5, wytwarzane światło jest zbyt słabe, aby można je było wykorzystać do obrazowania aktywności neuronalnej w czasie rzeczywistym. Aby sprostać temu wyzwaniu, Philippe Brûlet i jego koledzy z Instytutu Pasteura stworzyli konstrukt genetyczny łączący geny GFP i aequorin, naśladując rodzimy stan meduzy4. Ten produkt genu fuzyjnego ponownie wiąże wapń poprzez trzy struktury dłoni EF aequoryny, która ulega zmianie konformacyjnej prowadzącej do utleniania celenterazyny, która przekazuje energię nieradiacyjnie do GFP. Ten transfer energii powoduje uwolnienie zielonego światła (λ=509 nm) z GFP, zamiast niebieskiego światła z aequorin. Fuzja GFP i aequorin zapewnia również większą stabilność białka, pomagając białku fuzyjnemu wytwarzać światło od 19 do 65 razy jaśniejsze niż sama aequorin4. Zastosowanie podejścia bioluminescencyjnego w mózgu rozszerza obecne eksperymentalne zastosowanie obrazowania wapnia zarówno pod względem czasu trwania ciągłego zapisu, jak i liczby struktur w mózgu, które można zarejestrować. Ogólnie rzecz biorąc, w kontekście wcześniejszych prac oznacza to, że zarówno globalna, jak i większa różnorodność regionalizowanych "aktywności" mózgu może być monitorowana (poprzez wskaźnik zastępczy stanów przejściowych wapnia). Co ważniejsze, aktywność może być monitorowana przez dłuższy czas, w czasie rzeczywistym i w sposób ciągły, co z łatwością nadaje się do dążenia do pełnego zrozumienia podstawowych funkcji mózgu.
W ciągu ostatnich kilku lat, nasze laboratorium i inne opracowały transgeniczne muszki wykazujące ekspresję GFP-aequorin pod kontrolą binarnego systemu ekspresji (GAL4/UAS-GFP-aequorin)5,6. Zastosowaliśmy bioluminescencję GFP-aequorin do rejestrowania aktywności wytwarzanej przez naturalne bodźce, takie jak zapach7,8, a także badaliśmy składniki komórkowe modulujące aktywność Ca2 + w ciałach grzybów po stymulacji receptora acetylocholiny poprzez bezpośrednie zastosowanie nikotyny9. Ponadto wykorzystaliśmy również GFP-aequorin, aby odpowiedzieć na szereg pytań eksperymentalnych, na które wcześniej nie można było odpowiedzieć, takich jak długoterminowe obrazowanie spontanicznych stanów przejściowych wapnia i wizualizacja głębszych struktur mózgu10. Ostatnio użyliśmy systemu GAL4 / UAS do ekspresji receptora ATP ssaków P2X211 kanału kationowego w neuronach projekcyjnych (PN) i użyliśmy systemu LexA do ekspresji GFP-aequorin w ciałach grzybów (MB247-LexA,13XLexAop2-IVS-G5A-BP) (dzięki uprzejmości B. Pfeiffer, Janelia Farm, USA). Pozwoliło nam to aktywować PN poprzez zastosowanie ATP, który z kolei aktywuje ciała grzybów (dalszy cel PN), naśladując bardziej naturalne warunki, takie jak reakcja na bodziec zapachowy. Ogólnie rzecz biorąc, ta technika łącząca P2X2 i GFP-aequorin rozszerza możliwości eksperymentalne. Ogólnie rzecz biorąc, daje to możliwość lepszego zrozumienia wzorców aktywności w mózgu, inicjując nowe badania nad tym, jak różne bodźce i zaburzenia mogą zmieniać podstawowe wzorce aktywności.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie próbek
- Przygotowanie rozwiązań i konfiguracja
- Wszystkie linie Drosophila melanogaster należy utrzymywać w temperaturze 24 °C na standardowym podłożu spożywczym. Przechowywać je w małej gęstości w fiolce, aby uzyskać znormalizowany rozmiar i wagę much.
- Dodaj 10 dziewiczych samic z 10 samcami do fiolki, pozwól im łączyć się w pary i przenoś je co 2 dni do świeżej fiolki. Następnie 10 dni później, gdy muchy zaczną się zamykać, zbieraj muchy codziennie. Prowadź dokładny zapis wieku much i utrzymuj je w dobrej kondycji.
- W dniu 3 należy oddzielić samce od samic i utrzymywać samice po 20 much w fiolce. Nagraj muchy w wieku 4 lub 5 dni.
- Przygotować roztwór Ringera o następujących stężeniach: 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES i 36 mM sacharozy i dostosować pH roztworu dokładnie do 7,3. Przygotować roztwory perfuzyjne zawierające 25 μM nikotyny i 100 mM KCl w roztworze Ringera.
- Przygotuj końcówkę do pipety o pojemności 1 000 μl: za pomocą końcówki w kształcie żyletki pod kątem (około 35° od końca końcówki) i usuń nadmiar podstawy poza 1 1/2 centymetra od końcówki.
- Przygotować pudełko do przechowywania (23 cm x 17 cm x 8,5 cm) próbki podczas inkubacji. Umieść dwie gąbki (12 cm x 8 cm x 3 cm) nasączone wodą na dnie [aby zapobiec wysuszeniu próbki] poniżej małego stojaka, na którym umieszczono próbki po zakończeniu ich przygotowania.
- Przygotuj próbki much tak, aby zawierały co najmniej 1 kopię aequorin UAS-GFP i jedną kopię linii Gal4 do sterowania ekspresją GFP-aequorin. Linia OK107 Gal4 (wyrażenie kierujące linią głównie w ciałach grzybów) jest krzyżowana z UAS-GFP-aequorin w tym preparacie.
UWAGA: Wnętrze pudełka musi być wodoodporne, a zewnętrzna strona musi blokować przedostawanie się światła do pudełka, aby zapobiec degradacji celendterazyny podczas inkubacji.
- Wszystkie linie Drosophila melanogaster należy utrzymywać w temperaturze 24 °C na standardowym podłożu spożywczym. Przechowywać je w małej gęstości w fiolce, aby uzyskać znormalizowany rozmiar i wagę much.
- Przygotowanie próbek
- Znieczulenie lodem należy znieczulić Drosophila, przenosząc go do szklanej fiolki i trzymając na lodzie przez 2 minuty przed przeniesieniem na schłodzoną szalkę Petriego w celu umieszczenia na końcówce pipety. Przygotować końcówki pipet na lekko zwilżonej bibule filtracyjnej na 100 ml szalce Petriego na lodzie pod mikroskopem preparacyjnym.
- Delikatnie za pomocą kleszczy umieść muchę wewnątrz końcówki pipety.
- Za pomocą pędzla delikatnie popchnij i wyrównaj muchę tak, aby głowa całkowicie wysunęła się poza krawędź końcówki, a obszar grzbietowy był częściowo odsłonięty przez sekcję usuniętą podczas kształtowania końcówki (ryc. 2B).
- Połącz małe (około 3-4 μl) porcje dwóch składników kleju dentystycznego. Ostrożnie nałóż klej wokół przedniej i tylnej głowy i szyi w dół do i wokół krawędzi końcówki pipety, omijając czubek głowy. Pozostaw klej do wyschnięcia na 2 minuty.
- Umieść końcówkę pipety z przyklejonym otworem muchowym w komorze rejestracyjnej (Rysunek 2D) i delikatnie dociśnij, aby zamocować na miejscu.
- Połącz dwa składniki kleju silikonowego (około 3-4 μl). Nałóż klej na płaską stronę komory wzdłuż krawędzi w miejscu, w którym stykają się komora i końcówka pipety, aby zapobiec wyciekowi roztworu Ringera. Pozostaw klej do wyschnięcia na 2 minuty.
- Rozwarstwienie
- Przymocuj taśmę na kanale perfuzyjnym, krótszą krawędzią i rozciągającą się do tyłu komory.
- Umieść komorę z muchą na bloku preparacyjnym pod mikroskopem, włącz świetlówkę. Odmierzyć pipetą 1 ml roztworu Ringera do komory.
- Użyj cienkiego noża chirurgicznego, aby usunąć naskórek. Wykonaj równoległe nacięcia od tyłu głowy do okolicy czułka. Następnie przeciąć wzdłuż krawędzi oka, a następnie wykonać prostopadłe nacięcie nad anteną, łącząc poprzednie nacięcia. Wykonaj ostatnie nacięcie równolegle do tego z tyłu głowy. Użyj cienkich, ostrych kleszczyków, aby usunąć naskórek (ryc. 2C).
- Użyj cienkich, ostrych kleszczy, aby delikatnie chwycić i usunąć odsłoniętą tkankę oddechową, aż mózg i [fluorescencyjne] ciało grzyba zostaną wyraźnie uwidocznione.
- Użyj bardzo ostrych kleszczy, aby ostrożnie chwycić i uszczypnąć tkankę neuroepitelialną pokrywającą mózg, aby umożliwić przenikanie celelenterazyny.
UWAGA: Alternatywnie papaina może być użyta do przepuszczalności neuroepitelii9. - Za pomocą pipety przemyj dwukrotnie roztworem Ringera, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia z sekcji i umieść próbkę w ciemnym pudełku.
- Odmierzyć pipetą 1 ml roztworu Ringera zawierającego 5 μM benzylo-coelenterazine do komory. Zamknąć pudełko i pozostawić do inkubacji z koelenograzyną w temperaturze pokojowej przez co najmniej 2 godziny.
2. Obrazowanie
- Instalacji
- Uruchom system nagrywania: włącz mikroskop, komputer, kamerę i system odwadniający, a następnie ustaw kontrolę środowiska w pomieszczeniu na 25 °C.
- Otwórz program Measurement and Automation Explorer na komputerze. Kliknij "Urządzenia i interfejsy", następnie kliknij dwukrotnie "NI Motion Devices", a na koniec kliknij prawym przyciskiem myszy "PCI-7334" i wybierz "zainicjuj urządzenie".
- Otwórz program Photon Imager. Utwórz nowy folder i nazwij pierwszy plik nagrania. Kamera musi osiągnąć -80 °C, zanim system będzie działał.
- Ustaw system perfuzji - dodaj KCl, nikotynę i roztwór Ringera do zbiorników i dostosuj tak, aby każdy roztwór rozpływał się z prędkością 2 ml / min. Przemyj roztworem Ringera przed rozpoczęciem eksperymentu.
- Przygotuj próbkę
- Umieść miskę blokową do obrazowania na uchwycie pod mikroskopem pod 5-krotnym powiększeniem i włóż rurkę perfuzyjną do kanału przez nakłucie.
- Ustaw mikroskop w trybie fluorescencyjnym, a następnie wyśrodkuj i ustaw ostrość na korpusach grzybów (MB). Dostosuj do 20X, a następnie ponownie wyśrodkuj i ustaw ostrość.
- Umieść urządzenie odwadniające nad basenem drenażowym, wyreguluj wysokość bocznika drenażowego tak, aby końcówka znajdowała się tuż nad basenem i uruchom roztwór Ringera na 30 sekund, aby zapewnić odpowiedni drenaż.
- Pociągnij osłonę w dół, aby odgrodzić urządzenie od światła. Korzystając ze zautomatyzowanego systemu w imagerze fotonowym, dokonaj precyzyjnych regulacji ostrości i wykonaj referencyjny obraz fluorescencyjny MB.
- nagranie
- Dostosuj szybkość fotonów do żądanej prędkości nagrywania (od 50 ms do 1 sekundy lub więcej). Wybierz tryb fotonowy i otwórz migawkę. Zapisuj genotyp, płeć, wiek i numer próbki we wpisach dziennika. Dostosuj położenie pól ROI nad kielichem i ciałami komórek (CCB) oraz płatami przyśrodkowymi, klikając pola ROI i przeciągając, przytrzymując kontrolę.
- Nagrywaj linię bazową przez około 5 do 10 minut (zgodnie z potrzebami).
- Stosuj nikotynę przez 1 minutę. Zanotowaj start/stop w dzienniku. Myć roztworem Ringera przez 5 minut.
- Poczekaj 5 minut na odzyskanie i przygotuj wpis w dzienniku KCl oraz timer.
- Zastosuj KCl przez 1 minutę. Uwaga start/stop w dzienniku. Myć roztworem Ringera przez 1 min.
- Przełącz się w tryb fluorescencyjny, zrób końcowe zdjęcie fluorescencyjne i wyłącz roztwór Ringera.
- Naciśnij "Stop". Pojawi się okno dialogowe z prośbą o wyłączenie systemu. Wybierz "Nie", aby kontynuować nagrywanie.
- Otwórz osłonę, przesuń system drenażowy, przełącz obiektyw obiektywu na 5X, wyjmij rurkę perfuzyjną. Wyjmij próbkę/naczynie nagrywające ze sceny, wyczyść obiektyw 20X, spłukując i dwukrotnie wycierając obiektyw wodą.
- Naciśnij biały przycisk odtwarzania w górnej części okna programu, aby rozpocząć następne nagrywanie.
3. Analiza i tworzenie filmów
- Wyodrębnianie wartości fotonów
- Otwórz program do analizy fotonów (np. Photon Viewer) i otwórz pierwszy przykładowy plik arkusza kalkulacyjnego.
- Wybierz kartę kontrolki wyświetlania. Wybierz zwrot z inwestycji, klikając region, trzymając kontrolę. Dostosuj rozmiar, orientację i kształt obszarów zainteresowania, aby objąć CCB oświetlone GFP i płaty przyśrodkowe.
- Dodaj dodatkowy zwrot z inwestycji, klikając "Zdefiniuj ROI", a następnie klikając i przeciągając na ekranie, aby utworzyć nowy zwrot z inwestycji.
- Wybierz zakładkę "Film", aby odtworzyć wideo z fotonem. Dostosuj "szerokość s" i "kroki s" zgodnie z potrzebami. W razie potrzeby dostosuj rozmieszczenie ROI.
- Wybierz reprezentatywne zrzuty ekranu fluorescencji GFP, odpowiedzi nikotynowej i odpowiedzi KCl. Przytnij zrzuty ekranu i wklej obraz do slajdu prezentacji w celu późniejszej analizy i porównania.
- Dostosuj zarówno "szerokość w sekundach", jak i "krok w sekundach" do prędkości nagrywania w sekundach. Wybierz długość analizy, przesuwając szare znaczniki na górnym panelu do obszaru nawiasu przed inicjacją bodźca i tuż po zakończeniu odpowiedzi.
- Wybierz "Zawieś widoki podczas gry", naciśnij "<". Wybierz zakładkę "Wykres zliczania" i dostosuj jednostki zgodnie z potrzebami oraz kolory linii, aby pasowały do koloru ROI.
- Po zakończeniu analizy naciśnij "Eksportuj dane zliczania". Wybierz zrzuty ekranu połączonych nagrań CCB i obszaru płata przyśrodkowego zainteresowania z każdej strony. Przytnij zrzuty ekranu i wklej obraz do slajdu z obrazami odpowiedzi. Slajd ten zostanie później wykorzystany w końcowej analizie.
- Przykładowa analiza: jedna metoda szczegółowej analizy wyodrębnionych danych fotonowych
- Otwórz pliki arkusza kalkulacyjnego w folderze "Eksport stawek zliczania".
- Ponownie sformatuj komórki w pierwszej kolumnie oznaczonej godziną, aby wyświetlić czas w godzinach i minutach.
- Odwołaj się do odpowiedniego slajdu dla próbki. Usuń wszystkie wartości z wyjątkiem kolumn czasu i dwóch reprezentatywnych wskaźników ROI.
- Określ czas rozpoczęcia stymulacji nikotynową - dostępne w pliku wpisu dziennika w głównym folderze - usuń dodatkowe dane przed rozpoczęciem lub podświetl wartość.
- Znajdź najwyższą/szczytową wartość zarówno dla CCB, jak i płata przyśrodkowego oraz oznaczenie/podświetlenie.
- Określ czas rozpoczęcia i zakończenia odpowiedzi zarówno dla CCB, jak i płata przyśrodkowego, tworząc oszacowanie przy użyciu punktu czasowego z odpowiedniej odpowiedzi na wykresie na slajdzie i wybierz wartość rzeczywistą poprzez zmianę wartości w pobliżu tych punktów. Podkreśl obszar między tymi punktami zarówno w CCB, jak i w płatach przyśrodkowych. Alternatywnie użyj makra9.
- Połącz wszystkie próbki z jednej grupy eksperymentalnej w nowym arkuszu kalkulacyjnym.
- Wyrównaj do wartości szczytowej, określając, że wartość wiersza jest przypadająca na każdą wartość szczytową CCB. Odejmij niższe wartości od najwyższej wartości wiersza, aby określić przybliżoną wartość wiersza, do której należy ponownie skopiować dane próbki. Sprawdź, czy wszystkie wartości szczytowe są wyrównane.
- Skopiuj arkusz dwukrotnie i usuń kolumny płata przyśrodkowego lub kolumny CCB, tworząc strony zawierające tylko wartości CCB lub płata przyśrodkowego.
- Usuń dane po zakończeniu wszystkich odpowiedzi CCB. Utwórz cztery wiersze oznaczone jako Łączna liczba fotonów, Długość odpowiedzi (czas trwania), Amplituda szczytu i Opóźnienie odpowiedzi. Skopiuj i wklej to ponownie poniżej oryginałów.
- Użyj funkcji SUMA, aby określić całkowitą liczbę fotonów podczas odpowiedzi. Użyj funkcji LICZBA, aby określić długość odpowiedzi. Skopiuj i połącz komórkę o najwyższej wartości, aby określić wartość amplitudy szczytu. Użyj funkcji COUNT — wybierz od początku perfuzji nikotyny do początku odpowiedzi — aby określić opóźnienie odpowiedzi.
- Skopiuj wartości za pomocą funkcji łączenia i pomnóż (wszystkie z wyjątkiem amplitudy szczytowej) przez prędkość zapisu w sekundach.
- W razie potrzeby można utworzyć wykresy słupkowe/pudełkowe dla obliczonych parametrów, takich jak całkowita liczba fotonów, amplituda piku i długość odpowiedzi (np. Rysunek 5B, C, D).
- W kolumnie po odpowiedzi fotonu danych pierwotnych uśrednij punkty danych pierwotnych dla każdego punktu czasowego przy użyciu funkcji średniej. W razie potrzeby należy dodać kolumnę określającą błąd standardowy średniej (SEM) dla każdej z uśrednionych wartości fotonów w danym punkcie czasowym.
- Użyj kolumny średniej, aby skonstruować średni profil odpowiedzi [Wykres] dla grupy próbnej CCB. Aby to zrobić, wybierz kolumnę określającą czas jako wartości osi x i kolumnę średnich wartości fotonów jako oś y, a na koniec wybierz narzędzie do tworzenia wykresu rozrzutu.
- Powtórz tę procedurę analizy z danymi z płatów przyśrodkowych.
- Tworzenie obrazów do filmu
- Otwórz przeglądarkę fotonów.
- Wybierz zakładkę kontrolki wyświetlania. Kliknij ROI, trzymając kontrolę, aby go wybrać, usunąć i/lub zminimalizować.
- Zmodyfikuj "szerokość s" (czas akumulacji) zgodnie z potrzebami, aby określić zawartość każdej klatki.
- Zmodyfikuj "krok s", aby zdefiniować nakładanie się każdej klatki.
- Wybierz "eksportuj widoki podczas gry", naciśnij "<". Obrazy do filmu zostaną wyeksportowane do folderu "wyświetl eksporty" jako seria plików .png.
- Używanie Virtual Dub do tworzenia wideo: szczegółowa metoda tworzenia filmów
- Utwórz nowy folder o nazwie "resultats" w folderze eksportu widoku zawierającym obrazy.
- Przynieś skrypt (renommer. VBS) do folderu z obrazami.
- Kliknij dwukrotnie renommer. VBS do uruchomienia.
- Nazwy obrazów zostaną automatycznie zmienione numerycznie i skopiowane do folderu "resultats".
- Otwórz VirtualDub.exe.
- Wybierz otwórz plik wideo — wybierz pierwszy obraz (kolejne obrazy zostaną załadowane automatycznie).
- Wybierz wideo — wybierz liczbę klatek na sekundę, dostosuj zgodnie z potrzebami.
- Wybierz wideo — wybierz kompresję, wybierz kodek Cinepak według promienia.
- W pliku wybierz Zapisz jako AVI, wideo zostanie utworzone automatycznie.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Fuzja GFP z ekworyną pozwala nam na wizualizację obszaru zainteresowania przed obrazowaniem bioluminescencyjnym poprzez wzbudzenie GFP w trybie fluorescencyjnym pod mikroskopem (Rysunek 3A, 4A, 6A, 6E). Jednym z najprostszych sposobów stymulacji ciał grzybowych jest aktywacja jonotropowych nikotynowych receptorów acetylocholiny. Choć acetylocholina jest endogennym ligandem tego receptora, stwierdziliśmy, że nikotyna wywołuje bardziej powtarzalne odpowiedzi w ciałach grzybowych. Wynika to częściowo z fakt...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Niedawno opracowane podejście oparte na bioluminescencji GFP-aequorin pozwala na funkcjonalne rejestrowanie in vivo aktywności Ca2 + w różnych neuronach, a także, w razie potrzeby, w innych rodzajach komórek, takich jak komórki gwiaździste nerki, jak opisano w Cabrero i in., 20135.
Modyfikacje, rozwiązywanie problemów, dodatkowe komponenty i krytyczne kroki
Drosophila Hodowli...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Jesteśmy wdzięczni E. Karplusowi z Sciences Wares, USA, za jego cenną i użyteczną pomoc i rady. Dziękujemy E. Carbogninowi, A. Avet-Rochex, M. Murmu, P. Pavot, D. Minocci, G. Vinatier i J. Stinnakre za ich wkład w rozwój i doskonalenie tej techniki. Dziękujemy również B. Pfeifferowi i G. Rubinowi, Janelia Farm, H.H.M.I., Ashburn, USA, za linię pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP. Prace te były wspierane przez stypendium Chateaubriand Fellowship, Ambasada Francji w Waszyngtonie, USA dla A. Larka, przez National Science Foundation (IOS 1352882) dla T. Kitamoto oraz przez francuskie ANR (ANR-05-NEUR-009 Drosaequorin, 2005 i FlyBrainImaging, 2011), Conseil Régional Ile-de France (NeRF i DIM), IFR-144, program interfejsu Physique-Chimie-Biologie CNRS (2009), oraz przez CNRS z Francji na rzecz JR Martina.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| CaCl2 | Merck | 1023911000 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 7365-45-9 | |
| KCl | prolabo | 26 764.298 | normapur |
| MgCl2 | prolabo | 25 108.295 | sacharoza normapur |
| Sigma-Aldrich | S0389 | ||
| Nikotyna | Sigma-Aldrich | N3876 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | Sól disodowa 5′-trifosforanu adenozyny hydrat |
| benzylo-coelenterazine | Prolume, nanolight | Cat #301 Coelenterazine h | http://www.prolume.com/ |
| klej dentystyczny | 3M ESPE&handel; | 46954 | Protemp IV |
| 3M ESPE&handel; | 36958 | Express 2 Regular Body Szybka | |
| taśma | 3M Scotch | 122s Końcówki | 3M Scotch Magic Tape |
| Corning Incorporated | 4868 | 100-1,000 µ l Uniwersalna komora i uchwyt na końcówkę do pipet | |
| (scena) | ręcznie robione | ||
| inkubacyjne | robione | ||
| kleszcze (nr 5) | Fine Science Tools | 11252-00 | Kleszcze do mikropreparacji |
| Kleszcze zakrzywione | Sigma-Aldrich | F4142 | Kleszcze do mikropreparacji |
| aplikator kleju | ręcznie robione | ||
| nóż | Fine Science Tools | 10316-14 | 5 mm Głębokość 15° dźgnięcie |
| kamerą EM-CCD | Andor | DU-897E-CS0-#BV | iXon (schłodzony do -80 stopni Celsjusza) C) |
| Mikroskop | Nikon | Eclipse-E800 | |
| zanurzeniowy obiektyw | obiektywowy Nikon | 20X Fluor .5w | |
| preparacyjny z fluorescencją | Leica MZ Fl III | luneta preparcyjna i lampa fluorescencyjna szczelne | |
| ciemne pudełko | Science Wares | Niestandardowe zbudowane przez Science Wares | |
| pompa perystaltyczna | Rurka Gilson | Minipuls 2 | |
| Fisher Scientific | zależy od grubości | Tygon R3603, | |
| system perfuzyjny | Warner | 64-0135 ( VC-66CS) | System sterowania zaworem perfuzyjnym, kompletny, z zaworami zaciskowymi, 6-kanałowe |
| regulatory perfuzji | Leventon | 201108 | |
| Eksplorator pomiarów i automatyzacji | Sciences Wares & Oprogramowanie National Instruments | N/A | http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| imager fotonów | Artykuły naukowe & Oprogramowanie National Instruments | N/A | http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| przeglądarka fotonów | Science Wares & Oprogramowanie National Instituments | N/A | http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| Excel | Microsoft | N/A | https://www.microsoft.com |
| wirtualny dub | otwarty dostęp | Nie dotyczy | oprogramowania http://virtualdub.sourceforge.net/ |
| UAS-GA2 | Martin et al., 2007, Ref. 1 | Brak | akcji {obecnie} publicznie dostępnych |
| pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP | B. Pfeiffer, Janelia Farms, Ashburn USA. | (STOCK #1117340) | pfeifferb@janelia.hhmi.org |
| P2X2 | i Misenboeck, Ref. 11 | Brak | akcji {obecnie} publicznie dostępnych |
| OK107 | Bloomington centrum magazynowe | 854 | http://flystocks.bio.indiana.edu/ |
Bibliografia
- Martin, J. -R. In vivo brain imaging: fluorescence or bioluminescence, which to choose. J Neurogenet. 22 (3), 285-307 (2008).
- Shimomura, O., Johnson, F. H. Peroxidized coelenterazine, the active group in the photoprotein aequorin. Proc Natl Acad Sci USA. 75 (6), 2611-2615 (1978).
- Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. Further data on the bioluminescent protein, aequorin. J. Cell. Comp. Physiol. 62 (1), 1-8 (1963).
- Baubet, V., et al. Chimeric green fluorescent protein-aequorin as bioluminescent Ca2+ reporters at the single-cell level. Proc Natl Acad Sci USA. 97 (13), 7260-7265 (2000).
- Cabrero, P., Richmond, L., Nitabach, M., Davies, S. A., Dow, J. A. T. A biogenic amine and a neuropeptide act identically: tyramine signals through calcium in Drosophila tubule stellate cells. Proc. Biol. Sci. 280 (1757), 20122943(2013).
- Leclerc, C., Webb, S. E., Daguzan, C., Moreau, M., Miller, A. L. Imaging patterns of calcium transients during neural induction in Xenopus laevis embryos. J. Cell Sci. 113 (19), 3519-3529 (2000).
- Martin, J. -R., Rogers, K. L., Chagneau, C., Brûlet, P. In vivo bioluminescence imaging of Ca2+ signalling in the brain of Drosophila. PLoS One. 2 (3), e275(2007).
- Murmu, M. S., Stinnakre, J., Martin, J. -R. Presynaptic Ca2+ stores contribute to odor-induced responses in Drosophila olfactory receptor neurons. J. Exp. Biol. 213 (24), 4163-4173 (2010).
- Murmu, M. S., Stinnakre, J., Réal, E., Martin, J. -R. Calcium-stores mediate adaptation in axon terminals of Olfactory Receptor Neurons in Drosophila. BMC Neurosci. 12, 105(2011).
- Pavot, P., Carbognin, E., Martin, J. -R. PKA and cAMP/CNG channels independently regulate the cholinergic Ca2+-response of Drosophila mushroom body neurons. eNeuro. 2 (2), 0054-0068 (2015).
- Minocci, D., Carbognin, E., Murmu, M. S., Martin, J. -R. In vivo functional calcium imaging of induced or spontaneous activity in the fly brain using a GFP-apoaequorin-based bioluminescent approach. BBA-Mol Cell Res. 1833 (7), 1632-1640 (2013).
- Lima, S. Q., Miesenböck, G. Remote control of behavior through genetically targeted photostimulation of neurons. Cell. 121 (1), 141-152 (2005).
- Shimomura, O., Musicki, B., Kishi, Y., Inouye, S. Light-emitting properties of recombinant semisynthetic aequorins and recombinant fluorescein-conjugated aequorin for measuring cellular calcium. Cell Calcium. 14 (5), 373-378 (1993).
- Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nat Rev Mol Cell Bio. 4 (7), 517-529 (2003).
- Fiala, A., Spall, T. In vivo calcium imaging of brain activity in Drosophila by transgenic cameleon expression. Sci STKE. 2003 (174), PL6(2003).
- Wang, J. W., Wong, A. M., Flores, J., Vosshall, L. B., Axel, R. Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain. Cell. 112 (2), 271-282 (2003).
- Wilson, R. I., Turner, G. C., Laurent, G. Transformation of Olfactory Representations in the Drosophila Antennal Lobe. Science. 303 (5656), 366-370 (2004).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
