En Face Wykrywanie tlenku azotu i ponadtlenku w warstwie śródbłonka nienaruszonych tętnic

Podsumowanie

W tym artykule opisujemy dostosowaną, stosunkowo łatwą metodę wykorzystującą barwnik fluorescencyjny diaminofluoresceiny-2 dioctan (DAF-2DA) i dihydroetydyd (DHE) do jednoczesnego wykrywania i wizualizacji wewnątrz komórkowego tlenku azotu (NO) i anionu ponadtlenkowego (O₂^.−) w świeżo wyizolowanych nienaruszonych aortach mysiego modelu otyłości.

Streszczenie

Tlenek azotu (NO) pochodzący ze śródbłonka wytwarzany z śródbłonkowej syntazy NO (eNOS) jest jedną z najważniejszych cząsteczek wazoprotekcyjnych w fizjologii układu krążenia. Dysfunkcyjne eNOS, takie jak rozprzęganie eNOS, prowadzi do zmniejszenia biodostępności NO i wzrostu produkcji anionów ponadtlenkowych (O₂^.−), a to z kolei sprzyja chorobom sercowo-naczyniowym. Dlatego odpowiedni pomiar poziomów NO i_O2^.− w komórkach śródbłonka ma kluczowe znaczenie dla badań nad chorobami sercowo-naczyniowymi i powikłaniami. Ze względu na niezwykle labilną naturę NO i O₂ ⁻ trudno jest zmierzyć NO i O₂ ⁻ bezpośrednio w naczyniu krwionośnym. Opracowano wiele metod pomiaru produkcji NO i_O2^. Jest jednak albo niewrażliwy, albo niespecyficzny, albo wymagający technicznie i wymaga specjalnego sprzętu. Tutaj opisujemy adaptację metody barwnika fluorescencyjnego do jednoczesnego wykrywania i wizualizacji en face wewnątrzkomórkowych NO i_O2^{. −} przy użyciu przepuszczalnego dla komórek dioctanu diaminofluoresceiny-2 (DAF-2DA) i dihydroetydydy (DHE), odpowiednio, w nienaruszonych aortach mysiego modelu otyłości wywołanej karmieniem dietą wysokotłuszczową. Mogliśmy wykazać zmniejszone wewnątrzkomórkowe poziomy NO i zwiększone O₂^{. −} w świeżo izolowanych nienaruszonych aortach myszy otyłej w porównaniu z kontrolną szczupłą myszą. Wykazaliśmy, że metoda ta jest łatwą techniką bezpośredniego wykrywania i wizualizacji NO i_O2. ⁻ w nienaruszonych naczyniach krwionośnych i może być szeroko stosowana do badania (dys)funkcji śródbłonka w warunkach (fizjo)patologicznych.

Wprowadzenie

Komórki śródbłonka naczyń krwionośnych utrzymują funkcjonalną i strukturalną integralność naczyń krwionośnych poprzez uwalnianie czynników wazoaktywnych¹. Wśród tych czynników tlenek azotu (NO) pochodzący ze śródbłonka wytwarzany z L-argininy za pośrednictwem śródbłonkowej syntazy NO (eNOS) jest najważniejszym i najlepiej scharakteryzowanym czynnikiem w fizjologii układu sercowo-naczyniowego². NO powoduje rozluźnienie mięśni gładkich i hamuje proliferację komórek, hamuje agregację płytek krwi oraz adhezję i infiltrację komórek zapalnych do przestrzeni podśródbłonkowej, chroniąc w ten sposób przed rozwojem chorób naczyniowych³. W wielu stanach fizjologicznych i patologicznych, w tym starzeniu się, nadciśnieniu, cukrzycy, hiperlipidemii itp., Występuje dysfunkcja śródbłonka charakteryzująca się zmniejszoną biodostępnością NO i zwiększoną produkcją_O2^.- i sprzyja patogenezie miażdżycy². Badania z ostatnich lat pokazują, że rozprzęganie eNOS jest ważnym mechanizmem dysfunkcji śródbłonka, w którym enzym eNOS wytwarza O₂^.- zamiast NO, w różnych wyżej wymienionych warunkach^1,4. Dlatego analiza funkcji śródbłonka, w szczególności śródbłonkowej produkcji NO i generacji_O2^.- ma kluczowe znaczenie dla badań eksperymentalnych nad chorobami sercowo-naczyniowymi i powikłaniami.

Istnieje wiele metod metodologicznych, które zostały opracowane do analizy i pomiaru produkcji NO w próbkach biologicznych. Ze względu na niezwykle labilną naturę NO, który łatwo utlenia się do NO₂^- i NO₃^- o okresie półtrwania od 3 do 6 sekund, trudno jest zmierzyć NO bezpośrednio. W związku z tym oznaczenie NO₂^-/NO₃^- w próbkach płynów zastosowano jako wskaźnik NO uwalnianego z komórek lub tkanek⁵. Chociaż procedura jest stosunkowo łatwa, na metodę łatwo wpływa wysokie tło stabilnego NO₂^-/NO₃^- zawartego w roztworze. Ponieważ NO stymuluje rozpuszczalną cyklazę guanylanową do wytwarzania cyklicznego monofosforanu guanozyny (cGMP)⁶, określono również komórkowy poziom cGMP w celu oszacowania uwalniania NO⁷. Ponownie, jest to pośrednie oszacowanie i może nie być specyficzne, ponieważ niektóre czynniki pochodzące ze śródbłonka, takie jak peptyd natriuretyczny typu C (CNP), mogą również zwiększać poziomy cGMP poprzez aktywację cyklazy guanylanowej w cząstkach^{stałych 8}. NO jest wytwarzany z L-argininy z wytwarzaniem L-cytruliny jako produktu ubocznego⁹, pomiar produkcji L-cytruliny jest zatem również stosowany jako pośrednia metoda szacowania produkcji NO. Głównymi wadami tej metody jest to, że jest ona radioaktywna i nie mierzy bioaktywnych poziomów NO, ponieważ uwolniony NO może zostać szybko dezaktywowany przez O₂^.−; Co więcej, L-cytrulina może być przetworzona do L-argininy¹⁰. Inne metody chemiczne, takie jak detekcja chemiluminescencji¹¹, elektronowy rezonans spinowy¹² lub elektrochemiczny porfirowy czujnik NO¹³, są stosowane przez kilku badaczy. Metody te zwykle nie są łatwe w obsłudze, procedurach wykrywania i wymagają specjalnego sprzętu. Należy również wspomnieć, że w wielu badaniach stosuje się eksperymenty z kąpielą narządową z izolowanymi naczyniami krwionośnymi ze śródbłonkiem lub bez niego w celu oceny funkcji śródbłonka i pośredniego pomiaru relaksacji naczyń krwionośnych za pośrednictwem śródbłonka. Jednak ta metoda, chociaż jest w większości zbliżona do sytuacji fizjologicznej, ale ściśle mówiąc, nie mierzy funkcji NO, raczej ocenia ogólne reakcje naczynioruchowe za pośrednictwem śródbłonka, które odzwierciedlają efekty netto funkcji eNOS, produkcji innych czynników relaksacyjnych pochodzących ze śródbłonka i czynników kurczących się pochodzących ze śródbłonka, produkcji O₂., a także reakcje komórek mięśni gładkich na te czynniki. Zwykle wymagana jest szczegółowa analiza funkcji eNOS lub produkcji NO³.

Wiele grup badawczych, w tym nasza, w ostatnich latach używało metody barwnika fluorescencyjnego do wykrywania wewnątrzkomórkowej produkcji NO^14-19. W metodzie tej do pomiaru funkcji wolnego NO i NOS w żywych komórkach i tkankach in vitro lub ex vivo wykorzystano przepuszczalny dla komórek dioctan diaminofluoresceiny-2 (DAF-2DA). Zasada jest taka, że w żywych komórkach DAF-2DA jest deacetylowany przez wewnątrzkomórkową esterazy do niefluorescencyjnej 4,5-diaminofluoresceiny (DAF-2), która następnie została przekształcona w fluorescencyjną triazol DAF-2 (DAF-2T) w reakcji z NO. Fluorescencję z DAF-2T można obserwować pod mikroskopem fluorescencyjnym lub fluorescencyjnym mikroskopem konfokalnym ¹⁴. Intensywność fluorescencji wewnątrzkomórkowej odzwierciedla zatem wewnątrzkomórkową produkcję NO w komórkach lub śródbłonku w nienaruszonym naczyniu krwionośnym. W połączeniu ze specyficznym barwnikiem fluorescencyjnym, takim jak dihydroethidium (DHE), można jednocześnie ocenić wewnątrzkomórkowe wytwarzanie NO i_O2^{. −} w komórkach lub naczyniach krwionośnych¹⁴. Podobnie, DHE jest również związkiem przepuszczalnym dla komórek, który jest utleniany przez O₂. ^- wewnątrz komórek, a produkt utleniania następnie interkaluje z kwasami nukleinowymi, wydzielając jaskrawoczerwony kolor wykrywalny ilościowo przez mikroskop fluorescencyjny lub fluorescencyjny mikroskop konfokalny. DHE jest bardzo specyficznym barwnikiem do wykrywania O₂^{. -} z próbek biologicznych, ponieważ wykrywa zasadniczo rodniki ponadtlenkowe, jest dobrze zatrzymywany przez komórki i może nawet tolerować łagodne wiązanie²⁰. Jedną z zalet tej metody barwnika fluorescencyjnego jest to, że wykrywa i wizualizuje NO i/lub O₂ ⁻ en face bezpośrednio na nienaruszonej warstwie śródbłonka żywego naczynia krwionośnego.

W tym artykule opisujemy tę metodę barwnika fluorescencyjnego do wykrywania NO i O₂^.− którą dostosowaliśmy do wykrywania en face NO i O₂^.− w nienaruszonych aortach mysiego modelu otyłości wywołanej przez karmienie dietą wysokotłuszczową (HFD). Wykazaliśmy, że ta metoda może z powodzeniem i wiarygodnie mierzyć poziomy NO i_O2^{. −} oraz oceniać funkcję (dys) eNOS w warstwie śródbłonka świeżo izolowanych nienaruszonych aort myszy w otyłości.

Protokół

Praca na zwierzętach została zatwierdzona przez Komisję Etyki Urzędu Weterynaryjnego we Fryburgu, Szwajcaria. Protokół jest zgodny z wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami i eksperymentów w naszej placówce.

1. Przygotowanie zestawu do inkubacji izolowanych tętnic

1. Zbuduj system łaźni organowej, który może być podgrzewany do 37 °C i napowietrzany 95%_O2 i 5% CO₂ ze zbiornika na gaz węglowy.
2. Przygotować tyle buforu wodorowęglanowego Krebsa-Ringera, ile potrzeba, o stężeniu następującego składu: (118 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 2,5 mM CaCl₂, 1,2 mM MgSO₄, 1,2 mM KH₂PO₄, 25 mM NaHCO₃, 0,026 mM EDTA i 11,1 mM D-glukozy).
3. Utrzymuj bufor zapasowy na lodzie i napowietrzaj bufor 95%_O2 i 5% CO_{2 .}
4. Włączyć system kąpieli organowej, ustawić temperaturę na 37 °C, dodać 5 ml gotowego do użycia buforu do każdej komory i kontynuować napowietrzanie buforu z 95%_O2 i 5% CO_{2 .}
5. Umyć komory raz buforem Krebs-Ringer przez 30 minut.
6. Dodać 5 ml buforu Krebsa-Ringera do każdej komory i przykryć komorę, aby uniknąć parowania.

2. Izolacja aort myszy

1. Wstrzyknąć pentobarbital, który rozpuszcza się w 0,9% NaCl dootrzewnowo w stężeniu 150 mg/kg w celu uśmiercenia myszy.
2. Połóż mysz na wznak na desce chirurgicznej.
3. Spryskaj sierść w okolicy klatki piersiowej 70% etanolem w celu odkażenia i nawilżenia.
4. Otwórz jamę klatki piersiowej, przecinając żebro, aby odsłonić serce i płuca, a następnie usuń płuca.
5. Delikatnie usuń krew z jamy klatki piersiowej za pomocą papierowej chusteczki higienicznej.
6. Chwyć delikatnie serce kleszczami i odłącz aortę piersiową, przecinając okołonaczyniową tkankę tłuszczową między aortą a kręgosłupem nożyczkami chirurgicznymi.
7. Natychmiast zanurzyć całe tkanki w lodowatym (4 °C) buforze Krebsa-Ringera.
8. Usuń serce i łuk aorty pod mikroskopem preparacyjnym i utrzymuj piersiowy odcinek aorty w buforze.
9. Wypreparuj aortę wolną od przylegającej tkanki okołonaczyniowej pod mikroskopem za pomocą nożyczek chirurgicznych i kleszczy.
10. Chwyć końcową krawędź aorty kleszczami i wypłucz krew ze światła naczyniowego, delikatnie przepłukując bufor Krebsa-Ringera strzykawką 26 G × 1/2ʺ.
11. Oczyszczone pierścienie aortalne pokrój na segmenty o długości 3 mm.
    nuta: Na tym etapie zwróć uwagę, aby nie uszkodzić warstwy śródbłonka.

3. Barwienie DHE i DAF-2DA

1. Oczyszczone segmenty aorty przenieść za pomocą kleszczyków do komór kąpieli narządowej wypełnionych buforem Krebsa-Ringera w temperaturze 37 °C, napowietrzonym 95%_O2 i 5% CO₂,
   Uwaga: Dotykaj kleszczami tylko przybyszowej strony pierścieni aortalnych i nie zaciskaj naczyń krwionośnych.
2. Wyrównać tętnice w komorze do kąpieli narządowej przez 30 minut.
3. Dodać acetylocholinę (ACh) do kąpieli narządowej do końcowego stężenia 1 μM i inkubować tętnice przez 10 minut.
4. Przygotować 1 ml roztworu DHE/DAF-2DA (5 μM każdego barwnika, rozcieńczonego z 1 000× bulionu) ze wstępnie podgrzanym buforem Krebsa-Ringera w 1,5 ml probówce do mikrowirówki. Owiń probówkę mikrowirówki folią aluminiową, aby uniknąć ekspozycji na światło.
5. Po stymulacji przenieść pierścienie aortalne z kąpieli narządowej do roztworu DHE/DAF-2DA w probówce mikrowirówkowej w temperaturze 37 °C napowietrzonej 95%_O2 i 5% CO₂ i inkubować pierścienie aortalne przez 30 min.
   Uwaga: Od tego kroku utrzymuj aorty zawsze w ciemności.
6. Przenieść pierścienie aortalne do nowej probówki mikrowirówkowej z buforem Krebsa-Ringera do płukania i powtórzyć płukanie trzy razy w ciągu 1 minuty.
7. Przenieś pierścienie aorty do 4% roztworu paraformaldehydu w celu utrwalenia przez 30 minut.
8. Przygotować 1 ml roztworu 4',6-diamidyno-2-fenyloindolu (DAPI) (300 nM, rozcieńczonego z 1 000× bulionu) z buforem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Przeciwbarwione aorty przez 3 min.
9. Przenieść aorty do nowej probówki mikrowirówkowej z buforem PBS do płukania przez 1 min. Powtórzyć mycie trzy razy.
   Uwaga: Zwróć uwagę, aby nie zacisnąć pierścieni aortalnych ani nie uszkodzić warstwy śródbłonka.

4. Montaż En Face

1. Dodaj kroplę podłoża montażowego do szkiełka.
2. Przeciąć pierścienie aorty wzdłużnie nożyczkami mikrochirurgicznymi pod mikroskopem, spłaszczyć zwinięte aorty i zamontować je twarzą na podłożu montażowym ze śródbłonkiem skierowanym w dół na szkiełku podstawowym. Nie poruszaj aortami do przodu i do tyłu.
3. Przykryj szkiełko szkiełkiem nakrywkowym i uszczelnij szkiełko lakierem do paznokci.
4. Po wyschnięciu na powietrzu w osłonie świetlnej można użyć szkiełek do obrazowania bezpośrednio w ciągu kilku godzin lub przechowywać je w temperaturze -20 °C przez kilka następnych dni.

5. Konfokalne obrazowanie mikroskopowe

1. Użyj mikroskopu konfokalnego, aby wykryć sygnały fluorescencyjne. Włącz maszynę i zoptymalizuj ustawienia obrazowania, takie jak powiększenie, prędkość skanowania, rozdzielczość, stos Z.
   1. W przypadku tego protokołu należy użyć prędkości skanowania 200 Hz, rozdzielczości 1,024 × 1,024 pikseli i rozmiaru kroku Z 0,25 μm. Wzbudzić fluorescencję z DAF-2DA za pomocą lasera argonowego 488 nm i wykryć przy 515 nm, podczas gdy wzbudzić fluorescencję z DHE przy 514 nm i wykryć przy emisji 605 nm.
2. Użyj 10-krotnych powiększeń, aby ustawić ostrość na próbce, aż sygnał DAPI będzie czysty za pomocą promieni ultrafioletowych, a następnie dostosuj obiektyw do 40-krotnych powiększeń.
3. Zdefiniuj zakres warstwy śródbłonka, dostosowując położenie Z na panelu sterowania. Sygnałami jąder barwionych DAPI są owalne lub okrągłe kropki w warstwie śródbłonka.
4. Zeskanuj od góry (warstwa śródbłonka na granicy światła) próbki przez pełną grubość sygnału śródbłonka i zarejestruj obrazy. Wybierz co najmniej 3 różne pola do skanowania każdej próbki.

6. Analiza obrazów

1. Użyj oprogramowania, aby otworzyć dane zeskanowane przez mikroskop konfokalny. Wybierz trzy kolejne obrazy z każdego pola do analizy i oceń co najmniej 3 różne pola na próbkę. Wyeksportuj wybrane obrazy i zapisz je jako pliki JPEG.
2. Określ ilościowo obrazy z barwienia DAF-2DA, DHE i DAPI za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu. Aby uzyskać obraz z barwienia DAPI, wybierz "Wtyczki"→"Analizuj"→"Licznik komórek", aby policzyć liczbę dodatnich jąder DAPI.
   1. W przypadku obrazów z barwienia DAF-2DA i DHE wybierz "Analizuj" → "Zmierz", aby przeanalizować intensywność sygnałów i przyjmij wartość "Średnia" jako względną intensywność sygnału. Następnie przedstaw wyniki jako stosunek jąder dodatnich DAF-2DA do DAPI lub stosunek DHE do DAPI. Dla każdej próbki należy wziąć średnią wartość każdego obrazu i pola.
3. Podziel wynik każdej próbki przez średnią z grupy kontrolnej, aby uzyskać zmianę krotności. Analizę statystyczną przeprowadzono za pomocą niesparowanego testu Studenta t lub ANOVA z posttestem Dunnetta lub Bonferroniego. Podaj dane jako średnią±SEM. Rozważ różnice w średnich wartościach jako znaczące przy p<0,05¹⁴.

Wyniki

Otyłość jest ważnym czynnikiem ryzyka choroby niedokrwiennej serca i wiąże się ze zmniejszoną biodostępnością śródbłonka NO, co jest cechą charakterystyczną miażdżycowej choroby naczyniowej²¹.^{Wykazano, że} rozprzęganie eNOS jest ważnym mechanizmem dysfunkcji śródbłonka w wielu stanach fizjologicznych i patologicznych, w tym starzeniu się22, miażdżycy i otyłości¹⁴. Dlatego tutaj porównujemy chude i otyłe myszy, aby pokazać reprezentatywny wynik poziomów NO i...

Dyskusja

Wykrywanie NO lub O₂^.− za pomocą barwników fluorescencyjnych było często stosowane w wielu badaniach na hodowanych komórkach śródbłonka, a także w kriosekcjach tkanek²³. Tutaj rozszerzyliśmy tę metodę na nienaruszone żywe naczynia krwionośne, tj. wykrywanie en face poziomów NO i_O2^{. −} w warstwie śródbłonka odpowiednio za pomocą DAF-2DA i DHE, co jest skuteczne, stosunkowo proste i intuicyjne. W porównaniu z metodą kriosekcji naczyniowych, metoda ta w...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Dihydroethidium (DHE)	Invitrogen	D 1168	rozpuścić w DMSO do 5  mmol/L jako 1 000x zapas, przechowywany w temperaturze -20  ° C
Diaminofluoresceina-2 Dioctan (DAF-2DA)	Calbiochem	251505	rozpuścić w DMSO do 5  mmol/L jako 1 000x zapas, przechowywany w temperaturze -20  ° C
4',6-diamidyn-2-fenyloindol (DAPI)	Invitrogen	D 1306	rozpuścić w wodzie do 300  &mikro; mol/L jako 1 000x zapas, przechowywany w temperaturze 4  ° C
Medium montażowe	Vector robocizna. (REACTOLAB)	H-1000
Nω Chlorowodorek estru metylowego -nitro-L-argininy (L-NAME)	Sigma-aldrich	N5751
Pentobarbital	Sigma-aldrich	P3636
Multi-Myograph System	Duński mikroskop Myo Technology A/S	Model 610M
	Nikon	SMZ800
	Leica	DM6000
Oprogramowanie do przetwarzania obrazu	National Institute of Health (NIH)	Image J
Nożyczki chirurgiczne	S& T AG	SDC-11
Nożyczki mikrochirurgiczne	FST	15000-01
Kleszcze	S& T AG	JF-5
Szkiełko nakrywkowe o średnicy okrągłej 15  mm	VWR	631-1579
Końcówki 1 ml	VWR	RFL-1200c
Wskazówki 200 μ l	VWR	613.0659
Probówki Eppendorf Safe-Lock 1,5 ml	Eppendorf
Chlorek acetylocholiny	Sigma-aldrich	A-6625