Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Metoda wysokiej rozdzielczości do monitorowania aktywacji IRF3 zależnej od fosforylacji

11.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53723

⸱

24 stycznia 2016

 ,  ,  , 
1CRCHUM - Research center, Centre Hospitalier de l'Université de Montréal, Université de Montréal, 2Department of Biochemistry and Molecular Medicine, Université de Montréal, 3Faculty of Medicine, Université de Montréal

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy procedurę pozwalającą na szczegółową analizę zależnej od fosforylacji aktywacji czynnika transkrypcyjnego IRF3. Osiąga się to poprzez połączenie SDS-PAGE o wysokiej rozdzielczości i natywnej PAGE sprzężonej z immunoblotami przy użyciu wielu przeciwciał fosfospecyficznych.

Streszczenie

Czynnik transkrypcyjny IRF3 jest krytyczny dla pierwszej linii obrony przed patogenami, głównie poprzez β interferonu i ekspresję genów przeciwwirusowych. Szczegółowa analiza aktywacji IRF3 jest niezbędna, aby zrozumieć, w jaki sposób patogeny indukują lub unikają wrodzonej odpowiedzi przeciwwirusowej. Różne aktywowane formy IRF3 można rozróżnić na podstawie ich fosforylacji i statusu monomeru i dimeru. Dyskryminację in vivo między różnymi aktywowanymi gatunkami IRF3 można osiągnąć poprzez oddzielenie form fosforylowanych IRF3 na podstawie ich przesunięć ruchliwości na SDS-PAGE. Dodatkowo poziomy monomeru i dimeru IRF3 można monitorować za pomocą elektroforezy niedenaturującej. W tym miejscu szczegółowo opisujemy procedurę osiągania najwyższej rozdzielczości, aby uzyskać jak najwięcej informacji na temat statusu aktywacji IRF3. Osiąga się to poprzez połączenie SDS-PAGE o wysokiej rozdzielczości i natywnej PAGE sprzężonej z immunoblotami przy użyciu wielu przeciwciał całkowitych i fosfospecyficznych. Ta eksperymentalna strategia stanowi przystępne cenowo i czułe podejście do uzyskania wszystkich informacji niezbędnych do pełnej analizy aktywacji IRF3 za pośrednictwem fosforylacji.

Wprowadzenie

Czynnik regulacyjny 3 (IRF3) powszechnie i konstytutywnie wyrażany czynnik transkrypcyjny interferonu (IFN) jest krytyczny dla pierwszej linii obrony przed patogenami, głównie poprzez indukcję IFNβ, ale także poprzez indukcję ligandu 5 (CCL5) chemokiny (motyw C-C) i kilku białek przeciwwirusowych, w tym białka indukowanego przez IFN z powtórzeniami tetratrikopeptydu IFIT1/2/31-3. Zgłaszano aktywację IRF3 po zakażeniu licznymi wirusami lub ekspozycji na kwas poliinozyno-policytydylowy (poli I:C) lub lipopolisacharyd (LPS)4. Co ważne, większość badanych wirusów wyewoluowała mechanizmy unikania odpowiedzi za pośrednictwem IRF3, a tym samym ucieczki wrodzonejobrony immunologicznej gospodarza5. W związku z tym monitorowanie aktywacji IRF3 ma ogromne znaczenie dla zrozumienia mechanizmów molekularnych wrodzonej obrony przeciwwirusowej gospodarza, ale także dla zidentyfikowania strategii stosowanej przez wirusy w celu przeciwdziałania tej odpowiedzi.

Wiele opublikowanych raportów dostarcza jednak tylko ograniczoną analizę aktywacji IRF3 przeprowadzoną przez monitorowanie indukcji genu docelowego IRF3 (IFNB1 i IFIT1) i/lub test genu reporterowego lucyferazy w połączeniu z analizą IRF3 metodą elektroforezy IRF3 z dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE). Jednak liczne badania biochemiczne, analiza zachowania różnych mutantów IRF3 i wyjaśnienie struktury krystalicznej IRF3 6-11 przyczyniły się do ustalenia, że IRF3 jest poddawany złożonemu zestawowi sekwencyjnych modyfikacji potranslacyjnych przez fosforylację w wielu miejscach. Zestaw fosforylacji biorący udział w aktywacji IRF3 wydaje się być zależny od bodźca i najprawdopodobniej od typu komórki. W niezakażonych komórkach IRF3 współistnieje jako nieufosforylowane i hipofosforylowane gatunki zawierające fosforeszty, w tym Thr135 i Ser173, w regionie N-końcowym 1-198 aa6,12-14. Akumulacja tej hipofosforylowanej formy IRF3 jest indukowana przez induktory stresu, czynniki wzrostu i czynniki uszkadzające DNA6. Fosforylacja reszt Ser / Thr w regionie C-końcowym IRF3 zawierającym domenę transaktywacji jest wyzwalana po aktywacji przez wirusy, poli I:C lub LPS w sposób zależny od typu komórki15-17. C-końcowa fosforylacja IRF3 obejmuje nie mniej niż 7 odrębnych miejsc fosfoakceptorowych zorganizowanych w dwóch głównych klastrach, Ser385 / Ser386 i Ser396 / Ser398 / Ser402 / Thr404 / Ser405, z których każde przyczynia się do aktywacji IRF3 poprzez dimeryzację, akumulację jądrową, asocjację z koaktywatorami białka wiążącego CREB (CBP) / p300, wiązanie DNA z sekwencjami konsensusowymi wrażliwego elementu odpowiedzi IFN (ISRE) i transaktywację docelowych genów9,10,17-19. Uważa się również, że fosforylacja Thr390 przyczynia się do indukowanej przez wirusa aktywacji IRF320. Analizy spektrometrii mas IRF3 wykazały, że reszty Ser386, Thr390, Ser396 i Ser402 są bezpośrednio fosforylowane przez inhibitor kinaz kinazy ε κB (IKKε)/ kinazy wiążącej TANK 1 (TBK1)9,10. Fosforylacja reszt C-końcowych jest również wymagana do zakończenia aktywacji IRF3 poprzez poliubikwitynację i degradację za pośrednictwem proteasomu10. Proces ten jest również zależny od fosforylacji w Ser339, która jest niezbędna do rekrutacji izomerazy propylowej Pin110,11. Gatunki IRF3 zawierające co najmniej reszty fosfo-Ser339/386/396 są uważane za formy hiperfosforylowane. Dokładna sekwencja i funkcja każdego z tych miejsc pozostaje kwestią dyskusyjną 10,21. Jest teraz jasne, że aktywowany IRF3 nie reprezentuje stanu jednorodnego, ale że istnieją różne aktywowane gatunki wykazujące różne cechy fosforylacji lub dimeryzacji 10,22.

Aby zapewnić pełne zrozumienie aktywacji IRF3 w odpowiedzi na określone patogeny, konieczne jest scharakteryzowanie, które z aktywowanych gatunków są indukowane. Udowodniono, że indukcja docelowych genów IRF3, IFNB1 i IFIT1, zapewnia wiarygodny odczyt aktywacji IRF3. Jednak monitorowanie ekspresji tych genów nie rozróżnia różnych stanów aktywacji IRF3. Kompleksowa analiza stanów aktywacji IRF3 w określonym otoczeniu opiera się na szczegółowej charakterystyce jego stanu fosforylacji i dimeryzacji10. Nieufosforylowane (forma I), hipofosforylowane (forma II) i hiperfosforylowane (formy III i IV) formyIRF3 6,18,23 mogą być z powodzeniem rozwiązane przez ograniczoną mobilność w analizie SDS-PAGE o wysokiej rozdzielczości. Monomeryczne i dimeryczne gatunki IRF3 można skutecznie zidentyfikować za pomocą natywnej analizy PAGE. Podejścia te są znacznie ulepszone, gdy są stosowane w połączeniu z przeciwciałami fosfospecyficznymi skierowanymi przeciwko różnym miejscom fosfoakceptorowym IRF3.

Standardowe protokoły pozwalają na niską rozdzielczość białek, co nie pozwala na efektywną separację różnych form fosforylowanych IRF3. W tym miejscu szczegółowo opisujemy procedurę osiągania najwyższej rozdzielczości w celu monitorowania indukcji odrębnych gatunków IRF3 aktywowanych przez wirusa za pomocą SDS-PAGE sprzężonego z natywnym PAGE w połączeniu z immunoblot przy użyciu przeciwciał całkowitych i fosfospecyficznych. Rozróżnianie in vivo między różnymi aktywowanymi formami IRF3 przeprowadza się na podstawie ich zmian ruchliwości zaobserwowanych na SDS-PAGE. Dodatkowo monomer i dimer IRF3 można odróżnić za pomocą elektroforezy niedenaturującej. Połączenie tych dwóch uzupełniających się technik z immunoblot okazuje się niedrogim i czułym podejściem do uzyskania wszystkich niezbędnych informacji do pełnej analizy aktywacji IRF3 za pośrednictwem fosforylacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Protokół został tutaj opisany z wykorzystaniem komórek A549 zainfekowanych wirusem Sendai (SeV). Jednakże protokół SDS-PAGE i natywnego PAGE działa również we wszystkich przetestowanych dotychczas typach komórek ludzkich i mysich, w szczególności w komórkach mieloidalnych stymulowanych różnymi bodźcami aktywującymi IRF3 9,15,19,24,25.

1. Infekcja komórek A549

  1. Hodować komórki A549 w płytce 15 cm w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w 20 ml pożywki F12K/Ham zawierającej 10% inaktywowanej cieplnie płodowej surowicy bydlęcej (HI-FBS) oraz 1% L-glutaminy (pełna pożywka F12K/Ham).
    UWAGA: Wszystkie roztwory stosowane do hodowli komórkowej i zabiegów muszą być sterylne.
  2. Na 24 godziny przed infekcją odessać pożywkę i przemyć komórki 10 ml destylowanego roztworu soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (D-PBS) w temperaturze pokojowej (RT).
  3. Do każdej płytki dodać 1 ml 0,25% roztworu trypsyny-EDTA tak, aby pokryć komórki, i inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 min.
  4. Przerwać inkubację w momencie, gdy komórki zaczną odrywać się od płytki, delikatnie opukując ją dłonią. Inaktywować trypsynę, dodając 10 ml uprzednio podgrzanej pełnej pożywki F12K/Ham na płytkę, a następnie przenieść komórki do stożkowej probówki 15 ml.
  5. Wirować przy 350 x g przez 3 min w temperaturze pokojowej (RT). Usunąć nadsącz i resuspendować osad komórkowy w 8 ml pełnej pożywki F12K/Ham, aby uzyskać jednorodną zawiesinę pojedynczych komórek.
  6. Policzyć komórki za pomocą hemocytometru. Wysiać komórki w gęstości 1 x 106 komórek na płytkę 60 mm w 4 ml uprzednio podgrzanej pełnej pożywki F12K/Ham. Inkubować przez 20–24 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Po 20–24 godzinach komórki tworzą monowarstwę o 90% konfluencji (co odpowiada 1,5 x 106 komórkom).
  7. Usunąć pożywkę i przemyć komórki 2 ml bezzsrytkowej pożywki F12K/Ham (SFM). Dodać 2 ml świeżej pożywki SFM na płytkę 60 mm.
  8. Rozmrozić na lodzie alikwot wirusa Sendai (SeV) (przechowywany w alikwotach w temperaturze -80 °C) i krótko wymieszać na wortexie.
  9. Rozcieńczyć wirusa w uprzednio podgrzanej pożywce SFM, aby uzyskać stężenie 60 HAU/100 µl. Wymieszać, delikatnie pipetując w górę i w dół, a następnie dodać 100 µl rozcieńczonego wirusa na płytkę, aby przeprowadzić infekcję w dawce 40 HAU/106 komórek. Do płytki kontrolnej nieinfekowanej nie dodawać wirusa.
  10. Inkubować komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Podczas pierwszej godziny infekcji potrząsać płytkami ręcznie 3 lub 4 razy lub użyć automatycznego wytrząsarki orbitalnej bądź kołyszącej umieszczonej bezpośrednio w inkubatorze.
  11. Po 2 godzinach od infekcji dodać 2 ml pożywki F12K/Ham zawierającej 20% HI-FBS, aby uzyskać końcowe stężenie 10% HI-FBS.
  12. Inkubować komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez kolejne 1, 4 i 7 godzin, aby osiągnąć całkowity czas infekcji wynoszący odpowiednio 3, 6 i 9 godzin. W każdym z tych punktów czasowych przejść do kroku 2.1.

2. Przygotowanie ekstraktów z całych komórek (WCE)

  1. Usunąć pożywkę do infekcji. Zebrać komórki poprzez zdrapywanie w 1 ml lodowatego D-PBS i przenieść zawiesinę komórkową do schłodzonej rurki do wirowania o pojemności 1,5 ml.
  2. Osadzić komórki poprzez wirowanie przy 16 000 x g w temperaturze 4 °C przez 20 s i ostrożnie odlać wszystkie pozostałości D-PBS.
    UWAGA: Na tym etapie osad komórkowy można bezpośrednio poddać ekstrakcji białek lub zamrozić gwałtownie w ciekłym azocie lub w kąpieli z suchego lodu i etanolu, a następnie przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu lizy.
  3. Przygotować bufor do lizy zawierający 50 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 10% glicerolu i 1% Nonidet P-40 w wodzie dejonizowanej (ddH2O). Bezpośrednio przed użyciem dodać inhibitory proteaz (1 µg/ml leupeptyny i 2 µg/ml aprotininy) oraz inhibitory fosfataz (5 mM fluorku sodu, 1 mM aktywowanego ortowanadanu sodu, 2 mM p-nitrofenylofosforanu i 10 mM β-glicerofosforanu pH 7,5).
    UWAGA: Bufor do lizy bez inhibitorów można przechowywać w temperaturze 4 °C. Specyficzny protokół aktywacji ortowanadanu sodu opisano w Tabeli specyficznych odczynników/sprzętu.
  4. Resuspendować osad komórkowy w 70 µl buforu do lizy. Zazwyczaj stężenie lizatu będzie wynosić około 2 µg/µl.
  5. Inkubować na lodzie przez 20 min. Zamrozić gwałtownie lizat poprzez inkubację w kąpieli z ciekłego azotu przez 15 s. Rozmrozić lizat w RT do całkowitego rozpuszczenia i mieszać na vortexie przez 10 s. Powtórzyć cykl zamrażania/rozmrażania/mieszania 3 razy.
    1. Alternatywnie etap zamrażania można przeprowadzić w kąpieli z etanolu i suchego lodu przez 1 min.
  6. Wirować przy 16 000 x g w temperaturze 4 °C przez 20 min. Przenieść nadsącz (odpowiadający WCE) do nowej, schłodzonej rurki do wirowania o pojemności 1,5 ml. Przechowywać WCE przez cały czas na lodzie.
  7. Oznaczyć ilość białek, stosując dowolną procedurę kwantyfikacji białek kompatybilną z buforem do lizy, taką jak test białek metodą Bradforda26.

3. Rozdział WCE za pomocą wysokorozdzielczego SDS-PAGE

  1. Przygotuj trzy żele do elektroforezy denaturującej.
    1. Do detekcji form IRF3 wlej dwa żele o długości co najmniej 16 cm z żelem rozdzielającym składającym się z 7,5% akryloamidu/bis-akryloamidu (37,5:1), 375 mM Tris-HCl pH 8,8 (RT), 0,1% dodecylosiarczanu sodu (SDS), 1% persiarczanu amonu i 0,1% TEMED w ddH2O oraz żelem koncentrującym składającym się z 4% akryloamidu, 62,5 mM Tris-HCl pH 6,8 (RT), 0,05% SDS, 1% persiarczanu amonu i 0,1% TEMED w ddH2O.
      Uwaga! Akryloamid, TEMED i SDS są toksyczne i/lub drażniące. Należy nosić rękawice ochronne i pracować pod wyciągiem.
    2. Do detekcji białek SeV wlej jeden żel o długości co najmniej 8,5 cm o charakterystyce podobnej do żelu opisanego w punkcie 3.1.1, z wyjątkiem tego, że żel rozdzielający zawiera 12% akryloamidu.
  2. Zdenaturuj WCE otrzymany w kroku 2.6, dodając w stosunku 1:4 (v/v) 5x bufor do nakładania (125 mM Tris-HCl pH 6,8 (RT), 10% SDS, 20% (p/v) glicerolu, 0,0005% błękitu bromofenolowego i 25% β-merkaptoetanolu w ddH2O), a następnie podgrzej w temperaturze 100 °C przez 10 min. Krótko odwiruj probówki, aby zebrać kondensat utworzony w zakrętce.
    Uwaga! β-merkaptoetanol jest toksyczny przy wdychaniu. Należy nosić rękawice ochronne i pracować pod wyciągiem.
  3. Zamontuj żele w aparaturze do elektroforezy. Wypełnij komory górną i dolną buforem do prowadzenia zawierającym 25 mM Tris-Base, 0,1% SDS i 192 mM glicyny w wodzie destylowanej (dH2O).
  4. Nałóż 14 µl standardu masy cząsteczkowej do jednego dołka każdego żelu 16 cm oraz 7 µl standardu masy cząsteczkowej do jednego dołka żelu 8,5 cm. Nałóż 30 µg zdenaturowanego WCE (przygotowanego zgodnie z opisem w kroku 3.2) na dołek dwóch żeli przygotowanych w kroku 3.1.1 do detekcji form IRF3. Nałóż 8 - 10 µg zdenaturowanego WCE (przygotowanego zgodnie z opisem w kroku 3.2) na dołek żelu przygotowanego w kroku 3.1.2 do analizy SeV.
  5. Prowadź elektroforezę przy stałym prądzie 30 mA, aż front migracji dotrze do dna żelu.
    UWAGA: Migracja trwa zazwyczaj około 3 h dla żelu 16 cm i 45 min dla żelu 8,5 cm.
  6. Przejdź do transferu na membrany nitrocelulozowe (krok 5).

4. Analiza dimeryzacji IRF3 metodą Native-PAGE

UWAGA: Metoda ta została pierwotnie opisana przez zespół dr. T. Fujity27.

  1. Przygotować bufory do elektroforezy do komory górnej (-) i dolnej (+). Bufor do komory górnej składa się z 25 mM Tris-HCl pH 8.4 (RT), 192 mM glicyny i 1% deoksycholanu sodu (DOC) w ddH2O. Bufor do komory dolnej zawiera 25 mM Tris-HCl pH 8.4 (RT) i 192 mM glicyny w ddH2O.
    UWAGA: Bufory do elektroforezy do komory górnej i dolnej można przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia. Należy jednak upewnić się, że zostały one ogrzane do temperatury RT przed przeprowadzeniem elektroforezy.
  2. Odlać niedenaturujący żel rozdzielający o długości co najmniej 8,5 cm zawierający 7,5% akryloamidu/bis-akryloamidu (37,5:1), 375 mM Tris-HCl pH 8.8 (RT), 1% persiarczanu amonu i 0,1% TEMED w ddH2O.
  3. Przeprowadzić wstępny rozbieg żelu przy stałym natężeniu prądu 40 mA przez 30 min w lodzie. Wcisnąć aparat elektroforetyczny w lód mniej więcej do poziomu buforu w komorze dolnej. Ważne jest, aby żel nie znajdował się w lodzie.
  4. Podczas wstępnego rozbiegu zmieszać WCE przechowywany w lodzie z 2x buforem do nakładania native-PAGE w stosunku 1:1 (v/v), zawierającym 125 mM Tris-HCl pH 6.8 (RT), 30% glicerolu i 0,1% błękitu bromofenolowego w ddH2O.
  5. Niezwłocznie po zakończeniu wstępnego rozbiegu nanieść 8 - 10 µg WCE (przygotowanego zgodnie z opisem w kroku 4.4).
  6. Prowadzić elektroforezę przy stałym natężeniu prądu 25 mA w lodzie, zgodnie z opisem wstępnego rozbiegu, aż front migracji dotrze do dolnej krawędzi żelu (około 40 min).

5. Analiza immunoblottingu gatunków IRF3

  1. Przygotować bufor do transferu zawierający 25 mM Tris-Base i 192 mM glicyny w ddH2O. Bufor do transferu schłodzić do 4 °C przed użyciem.
  2. Namoczyć trzy arkusze membrany nitrocelulozowej, docięte do rozmiaru nieco większego niż żele, w pudełku plastikowym lub szklanym zawierającym bufor do transferu. Oznaczyć orientację membrany poprzez odcięcie jednego narożnika. Bufor do transferu można wykorzystać ponownie do 3 razy. Bufor przechowywać w temperaturze 4 °C pomiędzy użyciami.
  3. Wyjąć żele z form (SDS-PAGE i native-PAGE) i odciąć jeden narożnik każdego żelu w celu właściwej orientacji.
    1. W przypadku native-PAGE inkubować żel w temperaturze pokojowej przy delikatnym mieszaniu przez co najmniej 30 min w buforze do elektroforezy SDS-PAGE, aby usunąć DOC przed przeniesieniem do buforu do transferu.
  4. Inkubować żele (SDS-PAGE i native-PAGE) w buforze do transferu przez 5 - 10 min.
  5. Zmontować kanapkę transferową dla każdego żelu w kasecie do transferu z membraną skierowaną w stronę elektrody dodatniej (podkładka z pianki/papier filtracyjny/membrana/żel/papier filtracyjny/podkładka z pianki). Należy uważać, aby usunąć wszystkie pęcherzyki powietrza spomiędzy warstw kanapki.
  6. Przeprowadzić transfer zgodnie z zaleceniami producenta dla użytego urządzenia do transferu.
    UWAGA: Wszystkie inkubacje i płukania w kolejnych krokach należy przeprowadzać na platformie z wytrząsarką kołyszącą lub orbitalną.
  7. Po zakończeniu czasu transferu inkubować membrany przez 15 min w roztworze utrwalającym zawierającym 7% kwasu octowego, 40% etanolu i 3% glicerolu w ddH2O. Płukać membrany 3x przez 5 min w PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10,2 mM Na2HPO4 i 1,8 mM KH2PO4 w dH2O).
    Ostrzeżenie! Kwas octowy jest toksyczny, drażniący i łatwopalny. Należy stosować rękawice ochronne i pracować pod wyciągiem.
    UWAGA: Roztwór utrwalający można wykorzystać wielokrotnie.
  8. W przypadku membrany z native-PAGE przejść bezpośrednio do kroku 5.11.
  9. Szybko opłukać trzy membrany SDS-PAGE w dH2O przed inkubacją przez 1 min w roztworze czerwieni ponceau zawierającym 6,57 mM czerwieni ponceau i 1% kwasu octowego w ddH2O.
    UWAGA: Roztwór czerwieni ponceau można wykorzystać kilkukrotnie.
  10. Płukać membrany w dH2O, aż tło będzie wystarczająco białe, aby widoczne były czerwone prążki białek. Zaznaczyć markery ołówkiem i odciąć nadmiar membrany wokół białek. Odbarwić membrany poprzez inkubację przez 5 min w PBS przy mieszaniu.
  11. Inkubować membrany przez 1 h w temperaturze pokojowej lub przez noc w 4 °C w roztworze blokującym (PBS zawierający 0,05% Tween 20 i 5% beztłuszczowego mleka w proszku (PBS-T-milk). Płukać membrany 3x przez 5 min w PBS-T.
    UWAGA: Płukanie w PBS-T jest opcjonalne i wymagane tylko w przypadku stosowania przeciwciał rozcieńczonych w PBS-T zawierającym 5% albuminy surowicy bydlęcej (PBS-T-BSA) (Rysunek 1 i Tabela 1) w następnym kroku.
  12. Inkubować cztery membrany (z SDS-PAGE i native-PAGE) z przeciwciałami pierwszorzędowymi zgodnie z kolejnością szczegółowo opisaną na Rysunku 1 i w Tabeli 1. Przeprowadzić płukanie 5x przez 5 min w PBS-T.

figure-protocol-1
Rysunek 1. Sekwencja analiz immunoblottingowych. Schemat przedstawia poszczególne żele SDS-PAGE oraz native-PAGE wymagane do wykrycia różnych form fosforylowanych oraz monomerów/dimerów IRF3. Opisano konkretną kolejność stosowania przeciwciał na membranie uzyskanej z każdego żelu w procedurze immunoblottingu. Należy zauważyć, że przeciwciała anty-aktynowe są stosowane w pierwszej kolejności, aby zapewnić równą ilość naniesionych próbek przed zastosowaniem innych specyficznych przeciwciał. Alternatywna sekwencja, w której przeciwciała anty-aktynowe są stosowane po przeciwciałach anty-phospho-IRF3, również jest skuteczna. Etap strippingu jest przeprowadzany pomiędzy przeciwciałami anty-aktynowymi a anty-SeV lub pomiędzy przeciwciałami anty-phospho-IRF3 a anty-IRF3 ze względu na nakładanie się sygnałów o podobnej masie cząsteczkowej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Przeciwciała pierwszorzędoweRozcieńczenieBufor do rozcieńczaniaInkubacjaPrzeciwciała drugorzędoweUwagi
Anti-Actin1/10,000PBS-T-BSA15 min w RTAnti-mouseStosować po SDS-PAGE 
Rozcieńczone przeciwciała można wykorzystać wielokrotnie, jeśli są przechowywane w 4 °C w obecności 0.02 % azotku sodu.
Anti-IRF3-P-Ser3861/200PBS-T-BSAO/N w 4 °CAnti-rabbitStosować po Native-PAGE. 
Nie zaleca się ponownego wykorzystania rozcieńczonego przeciwciała 
Anti-IRF3-P-Ser3961/10,000PBS-T-BSAO/N w 4 °CAnti-rabbitStosować po SDS-PAGE. 
Nie zaleca się ponownego wykorzystania rozcieńczonego przeciwciała. Anti-IRF3-P-396 jest również dostępne w firmie Cell Signaling. Optymalne rozcieńczenie dla tego przeciwciała określono jako 1/1,000, lecz może ono różnić się w zależności od partii.  
Anti-IRF3-P-Ser3981/10,000PBS-T-BSAO/N w 4 °CAnti-rabbitStosować po SDS-PAGE.  Nie zaleca się ponownego wykorzystania rozcieńczonego przeciwciała 
Anti-IRF3 full length1/7,500PBS-T-milk3 h w RTAnti-rabbitStosować po SDS-PAGE.   Przeciwciało Anti-IRF3 full length można stosować po native-PAGE, jednak jest ono mniej czułe w wykrywaniu monomeru. Rozcieńczone przeciwciała można wykorzystać wielokrotnie, jeśli są przechowywane w 4 °C w obecności 0.02 % azotku sodu.  
Anti-IRF3-NES0.5  μg/mlPBS-T-milk3 h w RTAnti-rabbitStosować po Native-PAGE. Rozcieńczone przeciwciała można wykorzystać wielokrotnie, jeśli są przechowywane w 4 °C w obecności 0.02 % azotku sodu.
Anti-SeV1/14,000PBS-T-BSA3 h w RTAnti-rabbitStosować po SDS-PAGE. Rozcieńczone przeciwciała można wykorzystać wielokrotnie, jeśli są przechowywane w 4 °C w obecności 0.02 % azotku sodu.
UWAGA: Rozcieńczenie i bufor stosowany dla przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z HRP muszą zostać zoptymalizowane, ponieważ różnią się one w zależności od producenta.

Tabela 1. Specyfikacja przeciwciał użytych w procedurze immunoblottingu.

  1. Inkubować membrany z przeciwciałami wtórnymi sprzężonymi z peroksydazą chrzanową (HRP) zgodnie ze szczegółami podanymi na Rysunku 1 i w Tabeli 1. Przemyć membrany 5x 5 min w PBS-T, a następnie 2x 5 min w PBS, aby całkowicie usunąć ślady Tweeny.
  2. Inkubować membrany przez 1 min w objętości odczynnika do wzmocnionej chemiluminescencji wystarczającej do całkowitego pokrycia membran. Osuszyć membrany za pomocą papieru filtracyjnego.
  3. Umieścić membrany w analizatorze obrazu luminescencyjnego, aby zwizualizować prążki immunoreaktywne.
    1. Alternatywnie można przeprowadzić detekcję prążków immunoreaktywnych przy użyciu czułych filmów rentgenowskich.
  4. Przemyć membrany 3x 5 min w PBS.
    UWAGA: Na tym etapie membrany można przechowywać w stanie suchym. Jeśli jednak wymagane jest dalsze usuwanie przeciwciał (stripping), lepiej przeprowadzić stripping przed wysuszeniem membrany. Membrany można również przechowywać krótkoterminowo w PBS.
  5. W przypadku membran, które nie wymagają strippingu pomiędzy inkubacjami z przeciwciałami (patrz Rysunek 1), przejść bezpośrednio do kroku 5.20.
  6. Gdy stripping jest wymagany pomiędzy przeciwciałami (patrz Rysunek 1), inkubować membrany w uprzednio podgrzanym roztworze do strippingu zawierającym 2% SDS, 62,5 mM Tris-HCl pH 6,8 (RT) oraz 0,7% β-merkaptoetanolu w ddH2O w temperaturze 50 °C przez 20 min przy regularnym mieszaniu. Przemyć membrany 3x 5 min w PBS.
    UWAGA: Mieszanie podczas procedury strippingu jest kluczowe. Stripping można przeprowadzić w piecu do hybrydyzacji. Alternatywnie stripping można wykonać, zamykając membrany w plastikowych workach i zanurzając je w łaźni wodnej. W takim przypadku ważne jest przemieszanie membran 4–5 razy podczas inkubacji.
  7. Inkubować membrany przez 1 h w RT lub przez noc w 4 °C w PBS-T-milk.
  8. Powtórzyć kroki 5.12 do 5.16 zgodnie z Rysunkiem 1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rycina 2 przedstawia typowy obraz immunoblotingu białka IRF3 wykrytego za pomocą przeciwciał całkowitych przeciwko IRF3 oraz przeciwciał fosfospecyficznych przeciwko Ser396 i Ser398 po rozdzieleniu WCE metodą wysokorozdzielczego SDS-PAGE. W niestymulowanych komórkach A549 IRF3 jest wykrywane jako dwa prążki o masach 50 i 53 kDa w SDS-PAGE, odpowiadające nieufosforylowanej (forma I) i hipofosforylowanej (forma II) postaci IRF3. Ekspozycja komórek A549 na SeV przez okres od...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół, który tutaj opisujemy, składa się z kombinacji SDS-PAGE i native-PAGE o wysokiej rozdzielczości w połączeniu z użyciem kilku przeciwciał fosfospecyficznych w celu rozróżnienia monomerycznych/dimerycznych i fosfoform I-IV IRF3. Odpowiednie wykrycie tych gatunków IRF3 jest niezbędne do pełnego scharakteryzowania aktywacji IRF3 w określonych warunkach. Na przykład, stymulacja LPS aktywowanych makrofagów prowadzi do powstania dimerycznego, fosforylowanego IRF3 Ser396/398, który wykazuje hipofosforylowany (forma II)...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Autorzy dziękują byłym i obecnym członkom laboratorium za opracowanie protokołów. Prace były finansowane przez Kanadyjskie Instytuty Badań nad Zdrowiem (CIHR) [grant # MOP-130527] oraz przez Kanadyjską Radę ds. Badań Przyrodniczych i Inżynieryjnych [NSERC-355306-2012]. NG jest laureatem Tier II Canada Research Chair. AR jest stypendystą programu szkoleniowego Sieci Badań nad Zdrowiem Układu Oddechowego z Fonds de la recherche du Québec-Santé (FRQS).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
F12/HamLife Technologies11765-054Ciepły w 37 stopniach; C kąpiel przed użyciem.
Surowica bydlęca płoduLife Technologies12483-020
L-glutaminaLife Technologies25030-081
D-PBSLife Technologies14190-144Do hodowli komórkowych.
Trypsyna/EDTA 0,25%Life Technologies25200-072
Wirus Sendai Cantell SzczepCharles River Laboratories600503
HepesBioshopHEP001
Chlorek sodu (NaCl)BioshopSOD001.5
EDTABioshopEDT001
GlicerolBioshopGLY001.1Odetnij końcówkę końcówki i pipetuj powoli, ponieważ jest bardzo gruba.
IGEPAL CA-630Sigma-AldrichI7771Zarejestrowany znak towarowy odpowiadający detergentowi z poli(etylenoksy)etanolu (Nonidet P-40) oktylofenoksy
LeupeptinBioshopLEU001
AprotininBioshopAPR600.25 
Fluorek soduSigma-Aldrich201154
Ortowanadan soduMP Biomedicals159664Aktywacja ortowanadanu sodu 0,2 M: 1) Dostosować pH do 10,0 za pomocą 1 N NaOH lub 1 N HCl. Początkowe pH roztworu ortowatanu sodu może się różnić w zależności od dużej ilości substancji chemicznej. 2) Roztwór jest żółty przy pH 10,0. 3) Gotować do uzyskania bezbarwności. 4) Schłodzić do temperatury RT. 5) Ponownie ustawić pH do 10,0 i powtarzać kroki 3-4, aż roztwór pozostanie bezbarwny i ustabilizuje się na poziomie 10,0. Przechowywać aktywowane podwielokrotności ortowananadanu sodu w temperaturze -20 °C.
sól disodowa fosforanu p-nitrofenylu sześciowodnaSigma-AldrichP1585
Beta-glicerofosforanSigma-AldrichG6376 
Odczynnik do oznaczania białek Bio-Rad Bio-Rad500-0006 Cytotoksyczne
Akrylamid/Bis-Akrylamid (37,5 : 1) 40%BioshopACR005 Cytotoksyczne
Tris-BaseBioshopDEO701
Kwas solny (HCl)LabChemLC15320-4 Praca pod wyciągiem. Działa toksycznie i drażniąco.
Dodecylosiarczan sodu (SDS)BioshopSDS001.1 Drażniące.
Nadsiarczan amonuSigma-AldrichA3678
TEMEDInvitrogen15524-010Działa toksycznie i drażniąco.
Błękit bromofenolowyFisher ScientificB392-5
Beta-merkaptoetanolSigma-AldrichM6250Praca pod wyciągiem. Działa toksycznie na układ nerwowy, błony śluzowe. Może działać toksycznie na górne drogi oddechowe, oczy, ośrodkowy układ nerwowy.
GlycineBioshopGLN001.5
Deoksycholan soduSigma-AldrichD6750
Wodorotlenek sodu (NaOH)BioshopSHY700 Drażniące.
Membrana nitrocelulozowa (0,45 mm)Bio-Rad162-0115
Kwas octowy lodowatyBioshopACE222.4Praca pod wyciągiem. Toksyczny, drażniący i łatwopalny.
Pąs czerwonySigma-AldrichP3504   
Chlorek potasu (KCl)Sigma-AldrichP3911 Do kompozycji PBS do immunoblot.
Na2HPO4BioshopSPD307.5Do kompozycji PBS do immunoblot.
KH2PO4Sigma-AldrichP0662 Do kompozycji PBS do immunoblot.
Albumina surowicy bydlęcejSigma-AldrichA7906Do kompozycji PBS-T-BSA do immunoblot.
Odtłuszczone mleko w proszkuGoździk
Poly sorbate 20 (Tween)MP Biomedicals103168Odetnij końcówkę końcówki i pipetuj powoli, ponieważ jest bardzo gruba.
Anti-IRF-3-P-Ser386IBL-America18783Przechowywać w temperaturze -20 oC. Unikać zamrażania/rozmrażania.
Anti-IRF-3-P-Ser396Domowej roboty19Przechowywać pod ciśnieniem -80 oC. Unikać zamrażania/rozmrażania.
Phospho-IRF-3 (Ser396) (4D4G)Technologia sygnalizacji komórkowej4947sPrzechowywać w temperaturze -20 oC.
Anti-IRF-3-P-Ser398Domowej roboty15Przechowywać w temperaturze -80 oC. Unikać zamrażania/rozmrażania.
Motyw Actif anty-IRF-3 o pełnej długości39033Przechowywać w temperaturze -80 oC. Unikać zamrażania/rozmrażania.
Anty-IRF3-NESIBL-America18781Sklep o wartości -20 oC.
Western Lightning Chemiluminescence Reagent PlusPerkin-Elmer Life SciencesNEL104001EA
LAS4000mini aparatura z kamerą CCDGE healthcare
SDS-PAGE Wzorce masy cząsteczkowej, szeroki zakresBio-Rad161-0317Przechowywać w podany na -20 oC.

Bibliografia

  1. Juang, Y. T., et al. Primary activation of interferon A and interferon B gene transcription by interferon regulatory factory-3. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (17), 9837-9842 (1998).
  2. Lin, R., Hiscott, J. A role for casein kinase II phosphorylation in the regulation of IRF-1 transcriptional activity. Mol Cell Biochem. 191 (1-2), 169-180 (1999).
  3. Grandvaux, N., et al. Transcriptional profiling of interferon regulatory factor 3 target genes: direct involvement in the regulation of interferon-stimulated genes. J Virol. 76 (11), 5532-5539 (2002).
  4. Thompson, M. R., Kaminski, J. J., Kurt-Jones, E. A., Fitzgerald, K. A. Pattern recognition receptors and the innate immune response to viral infection. Viruses. 3 (6), 920-940 (2011).
  5. Grandvaux, N., tenOever, B. R., Servant, M. J., Hiscott, J. The interferon antiviral response: from viral invasion to evasion. Curr Opin Infect Dis. 15 (3), 259-267 (2002).
  6. Servant, M. J., et al. Identification of Distinct Signaling Pathways Leading to the Phosphorylation of Interferon Regulatory Factor 3. J Biol Chem. 276 (1), 355-363 (2001).
  7. Qin, B. Y., et al. Crystal structure of IRF-3 reveals mechanism of autoinhibition and virus-induced phosphoactivation. Nat Struct Biol. 10 (11), 913-921 (2003).
  8. Takahasi, K., et al. X-ray crystal structure of IRF-3 and its functional implications. Nat Struct Biol. 10 (11), 922-927 (2003).
  9. Mori, M., et al. Identification of Ser-386 of interferon regulatory factor 3 as critical target for inducible phosphorylation that determines activation. J Biol Chem. 279 (11), 9698-9702 (2004).
  10. Clement, J. F., et al. Phosphorylation of IRF-3 on Ser 339 generates a hyperactive form of IRF-3 through regulation of dimerization and CBP association. J Virol. 82 (8), 3984-3996 (2008).
  11. Saitoh, T., et al. Negative regulation of interferon-regulatory factor 3-dependent innate antiviral response by the prolyl isomerase Pin1. Nat Immunol. 7 (6), 598-605 (2006).
  12. Wathelet, M. G., et al. Virus infection induces the assembly of coordinately activated transcription factors on the IFN-beta enhancer in vivo. Mol Cell. 1 (4), 507-518 (1998).
  13. Karpova, A. Y., Trost, M., Murray, J. M., Cantley, L. C., Howley, P. M. Interferon regulatory factor-3 is an in vivo target of DNA-PK. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (5), 2818-2823 (2002).
  14. Zhang, B., et al. The TAK1-JNK cascade is required for IRF3 function in the innate immune response. Cell Res. 19 (4), 412-428 (2009).
  15. Solis, M., et al. Involvement of TBK1 and IKKepsilon in lipopolysaccharide-induced activation of the interferon response in primary human macrophages. Eur J Immunol. 37 (2), 528-539 (2007).
  16. Soucy-Faulkner, A., et al. Requirement of NOX2 and reactive oxygen species for efficient RIG-I-mediated antiviral response through regulation of MAVS expression. PLoS Pathog. 6 (6), e1000930(2010).
  17. Lin, R., Heylbroeck, C., Pitha, P. M., Hiscott, J. Virus-dependent phosphorylation of the IRF-3 transcription factor regulates nuclear translocation, transactivation potential, and proteasome-mediated degradation. Mol Cell Biol. 18 (5), 2986-2996 (1998).
  18. Yoneyama, M., et al. Direct triggering of the type I interferon system by virus infection: activation of a transcription factor complex containing IRF-3 and CBP/p300. EMBO J. 17 (4), 1087-1095 (1998).
  19. Servant, M. J., et al. Identification of the minimal phosphoacceptor site required for in vivo activation of interferon regulatory factor 3 in response to virus and double-stranded RNA. J Biol Chem. 278 (11), 9441-9447 (2003).
  20. Bergstroem, B., et al. Identification of a novel in vivo virus-targeted phosphorylation site in interferon regulatory factor-3 (IRF3). J Biol Chem. 285 (32), 24904-24914 (2010).
  21. Takahasi, K., et al. Ser386 phosphorylation of transcription factor IRF-3 induces dimerization and association with CBP/p300 without overall conformational change. Genes Cells. 15 (8), 901-910 (2010).
  22. Noyce, R. S., Collins, S. E., Mossman, K. L. Differential modification of interferon regulatory factor 3 following virus particle entry. J Virol. 83 (9), 4013-4022 (2009).
  23. McCoy, C. E., Carpenter, S., Palsson-McDermott, E. M., Gearing, L. J., O'Neill, L. A. Glucocorticoids inhibit IRF3 phosphorylation in response to Toll-like receptor-3 and -4 by targeting TBK1 activation. J Biol Chem. 283 (21), 14277-14285 (2008).
  24. Oliere, S., et al. HTLV-1 evades type I interferon antiviral signaling by inducing the suppressor of cytokine signaling 1 (SOCS1). PLoS Pathog. 6 (11), e1001177(2010).
  25. Kato, H., et al. Cell type-specific involvement of RIG-I in antiviral response. Immunity. 23 (1), 19-28 (2005).
  26. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  27. Iwamura, T., et al. Induction of IRF-3/-7 kinase and NF-kappaB in response to double-stranded RNA and virus infection: common and unique pathways. Genes Cells. 6 (4), 375-388 (2001).
  28. tenOever, B. R., Servant, M. J., Grandvaux, N., Lin, R., Hiscott, J. Recognition of the measles virus nucleocapsid as a mechanism of IRF-3 activation. J Virol. 76 (8), 3659-3669 (2002).
  29. Bibeau-Poirier, A., et al. Involvement of the I{kappa}B Kinase (IKK)-Related Kinases Tank-Binding Kinase 1/IKKi and Cullin-Based Ubiquitin Ligases in IFN Regulatory Factor-3 Degradation. J Immunol. 177 (8), 5059-5067 (2006).
  30. Grandvaux, N., et al. Sustained Activation of Interferon Regulatory Factor 3 during Infection by Paramyxoviruses Requires MDA5. J Innate Immun. 6 (5), 650-662 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Aktywacja IRF3analiza fosforylacjiSDS PAGENative PAGEimmunoblotwirus Sendaiekstrakt z ca ych kom rekprzeciwcia a fosfoswoisteelektroforeza niedenaturuj cael wysokiej rozdzielczo ci
Metoda wysokiej rozdzielczości do monitorowania aktywacji IRF3 zależnej od fosforylacji
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.