Tutaj pokazujemy wstrzyknięcie ciśnieniowe substancji neurofarmakologicznych podczas rejestracji pojedynczej komórki u przytomnego, zachowującego się makaka. Procedura ta pozwala na manipulację farmakologiczną w bezpośrednim sąsiedztwie miejsca rejestracji kory mózgowej.
Artykuł metodologiczny
System iniekcji ciśnieniowych do badania neurofarmakologii przetwarzania informacji w korze mózgowej makaków zachowujących się w stanie czuwania
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Odgórna modulacja przetwarzania informacji korowych jest funkcjonalnie ważna dla wielu procesów poznawczych, w tym modulacji przetwarzania informacji sensorycznych przez uwagę. Jednak niewiele wiadomo o tym, które systemy neuroprzekaźników są zaangażowane w takie modulacje. Praktycznym sposobem odpowiedzi na to pytanie jest połączenie zapisu pojedynczej komórki z miejscową i tymczasową manipulacją neurofarmakologiczną w odpowiednim modelu zwierzęcym. W tym miejscu demonstrujemy technikę łączącą ostre zapisy pojedynczych komórek z wstrzyknięciem środków neurofarmakologicznych w bezpośrednie sąsiedztwo elektrody rejestrującej. Film przedstawia przygotowanie systemu wtrysku/rejestracji ciśnieniowej, w tym przygotowanie substancji do wstrzyknięcia. Pokazujemy małpę rezusa wykonującą zadanie uwagi wzrokowej oraz procedurę rejestracji pojedynczej jednostki z blokowymi manipulacjami farmakologicznymi.
Wprowadzenie
W obszarach korowych i podkorowych, na aktywność neuronalną wpływają różne neuromodulatory, na przykład acetylocholina1. Ten modulacyjny wpływ na odpowiedzi neuronalne został opisanyw badaniach in vitro2, a także w zapisach elektrofizjologicznych od znieczulonychzwierząt3 i ogólnoustrojowych manipulacjach farmakologicznych uludzi4. Niemniej jednak dokładna rola różnych neuromodulatorów i udział różnych podtypów receptorów są w dużej mierze nieznane. Aby zmierzyć wpływ określonych neuromodulatorów na aktywność pojedynczych neuronów, pożądane jest wywołanie tymczasowej zmiany neuromodulatora jak najbliżej elektrody rejestrującej. Ponadto ważne jest, aby te manipulacje były wykonywane u przytomnych zwierząt, ponieważ funkcje poznawcze są obecne tylko przy braku znieczulenia. Dodatkowo znieczulenie oddziałuje z układem cholinergicznym i GABA-ergicznym5,6 i może prowadzić do zmian w aktywności neuronalnej3.
W ciągu ostatnich dziesięcioleci rozwinięto i udoskonalono dwie główne metody lokalnego dostarczania leków: jonoforezę i iniekcję ciśnieniową. W obu metodach leki są podawane za pomocą mikropipet wykonanych ze szkła lub stali. W przypadku jonoforezy prąd elektryczny reguluje uwalnianie leku7. Dodatkowo istnieje znaczący udział elektroosmozy w całkowitej ilości wyrzucanych cząsteczek8, korelujący ze średnicą końcówki9 mikropipety, a także ze stężeniem8 użytej substancji. Jonoforeza jest potężnym narzędziem do szybkiego i precyzyjnego manipulowania małymi objętościami tkanki nerwowej. Do iniekcji jonoforetycznych zwykle stosuje się mikropipety wielocylindrowe10, z których jedna działa jako urządzenie rejestrujące, podczas gdy pozostałe pozycje służą jako pipety podające. Ograniczeniem tej metody jest to, że można stosować tylko naładowane cząsteczki, co poważnie ogranicza wybór leków.
Wtrysk ciśnieniowy wykorzystuje albo sprężanie powietrza, albo ciśnienie mechaniczne do wyrzucania substancji z mikropipety. Za pomocą tej metody można użyć dowolnej substancji rozpuszczalnej, naładowanej lub nienaładowanej, w tym dużych cząsteczek. Metoda wtrysku ciśnieniowego została po raz pierwszy opisana przez Reyniersa w 1933 roku i dalej udoskonalona w latach 50. W latach osiemdziesiątych XX wieku metoda została jeszcze bardziej udoskonalona, aby umożliwić dostarczanie ilości w zakresie nanolitrów (głównie lidokainy12) do określonego obszaru mózgu13, przy jednoczesnym wykonywaniu zapisu pojedynczej komórki. Wyrzucana objętość była zwykle monitorowana poprzez obserwację ruchu markera, takiego jak łąkotka w górnej części pipety13. Iniekcje ciśnieniowe zostały po raz pierwszy zastosowane w latach 90. u obudzonych zwierząt, zarówno zewnątrzkomórkowych14, jak i wewnątrzkomórkowych15,16. Opierając się na skumulowanej wiedzy zdobytej w tych badaniach, możliwe jest obecnie wiarygodne rejestrowanie z różnych struktur mózgu w połączeniu z manipulacją farmakologiczną (patrz17 w celu porównania najnowszych systemów iniekcji ciśnieniowych).
Nieustającym problemem dla obu metod dostarczania leków jest trudność w określeniu dokładnej objętości wstrzykniętego leku. Jest to jeszcze większe wyzwanie w przypadku eksperymentów z rozbudzonymi, zachowującymi się rezusami, gdzie zwierzę wykonuje zadanie eksperymentalne w oddzielnym pomieszczeniu. Można temu zaradzić, stosując system sterowany programowo, zamiast polegać na wizualnym znaczniku w celu ciągłego monitorowania wstrzyknięcia.
Opisany tutaj system jest rozszerzeniem dobrze znanego systemu zapisu elektrofizjologicznego (Mini Matrix System) i łączy pipetę iniekcyjną z wieloma równolegle zorientowanymi elektrodami rejestrującymi w określonych odległościach w konfigurowalnym układzie. Farmakologiczna manipulacja tkanką w pobliżu elektrody rejestrującej jest możliwa przy użyciu tylko niewielkiej ilości substancji, co zapewnia szybki powrót do zdrowia i umożliwia wiele bloków wstrzyknięć i kontroli/odzyskiwania w ograniczonym oknie czasowym oferowanym przez zadanie behawioralne zwierzęcia.
Protokół
Opieka nad zwierzętami i wszystkie procedury eksperymentalne zostały przeprowadzone zgodnie z niemieckimi przepisami dotyczącymi opieki nad zwierzętami i zatwierdzone przez rząd powiatowy Brunszwiku, Dolna Saksonia, Niemcy.
Uwaga: Ze względu na to, że eksperyment przeprowadzany jest in vivo, kluczowe jest zachowanie najwyższych możliwych standardów higieny. Jeśli to możliwe, pracuj w sterylnych warunkach.
1. Przygotowanie systemu iniekcyjnego/rejestrującego
- Wysterylizuj probówkę łączącą mikropipetę ze strzykawką. Użyć możliwie najkrótszej rurki w układzie doświadczalnym między pompą wtryskową a elektrofizjologicznym systemem rejestracji.
- Wyczyść rurki prowadzące systemu nagrywania za pomocą przewodów czyszczących. Zanurz je w sterylnym oleju silikonowym i kilkakrotnie przepuść przez poszczególne rurki prowadzące.
- Włóż mikropipetę ze szkła kwarcowego do jednej rurki prowadzącej systemu nagrywania. Zobacz rysunek 1A.
- Po zamocowaniu mikropipety w systemie rejestrującym, przymocuj sterylną rurkę do metalowego trzpienia mikropipety. Trzymaj się; Chociaż mikropipeta jest zamocowana w systemie, może łatwo pęknąć podczas zakładania probówki. Użyj dwóch sterylnych pęset, aby wywrzeć równy nacisk na szpilkę i rurkę.
- Użyj płynnego super kleju, aby uszczelnić połączenie między probówką a mikropipetą. Odczekaj co najmniej 3 godziny, aż klej stwardnieje przed napełnieniem mikropipety płynem.
- Wprowadzić mikroelektrody (np. platynowo-wolframową w izolacji szkłem kwarcowym) w inne pozycje systemu rejestrującego przed lub po włożeniu mikropipety.
2. Przygotowanie substancji
- Wysterylizuj probówki mikrowirówkowe o pojemności 1,5 ml w celu późniejszego przechowywania roztworów iniekcyjnych za pomocą autoklawu lub innej niezawodnej procedury.
- Zważyć odpowiednią substancję, chlorowodorek skopolaminy, aby przygotować 5 ml roztworu o stężeniu 0,1 molowym. Rozpuścić w sterylnym roztworze soli fizjologicznej (0,9% NaCl).
- W sterylnych warunkach w dygestorium przefiltrować roztwór za pomocą filtra strzykawkowego o wystarczająco dużej średnicy porów, np. 0,2 μm.
- Pod wyciągiem dygestorium podzielić roztwór na objętości wystarczające do przeprowadzenia pojedynczego doświadczenia, np. w przypadku skopolaminy, 500 μl w sterylnej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Używaj ciemnych rurek, aby chronić substancję przed światłem; Alternatywnie owiń tuby folią aluminiową. W przypadku skopolaminy roztwór należy przechowywać do 14 dni w temperaturze 4 °C.
3. Codzienne przygotowanie systemu iniekcyjnego/rejestrującego
Uwaga: Po zamontowaniu w systemie rejestrującym, elektrody i mikropipeta są przechowywane w roztworze enzymu (Tergazyme, 1% roztwór z wodą dejonizowaną) między nagraniami. Przed każdym nagraniem należy wykonać następujące czynności.
- Pobrać probówkę z substancją, która ma być wstrzyknięta. Pozwól mu osiągnąć RT, jeśli jest przechowywany w lodówce.
- Wyjąć system iniekcyjny/rejestrujący z roztworu enzymatycznego i przepłukać elektrody oraz mikropipetę wodą dejonizowaną, aby całkowicie oczyścić z roztworu enzymu.
- Zdejmij przednią pokrywę systemu rejestrującego, aby wizualnie sprawdzić uszczelnienie między mikropipetą a probówką.
- Nałóż sterylny olej silikonowy na szczelinę rurki prowadzącej (patrz rysunek 1A) oraz końcówki elektrod i mikropipety, aby nasmarować system w celu zapewnienia płynnego ruchu.
- Sprawdź końcówki elektrod i mikropipet za pomocą mikroskopu, aby upewnić się, że są nienaruszone. Ustawić elektrody i mikropipetę pod mikroskopem tak, aby wystawały z rurek prowadzących o tej samej długości. Wbij je w rury prowadzące, zatrzymując się, gdy tylko przestaną być widoczne. Określa się to jako zerowe położenie elektrody. Ustaw głębokość elektrod i mikropipety na 0 w oprogramowaniu.
- Napełnić sterylną strzykawkę sterylnym roztworem soli fizjologicznej i wprowadzić igłę do probówki, uważając, aby nie przebić ścianki probówki. Wyjąć mikropipetę z rurki prowadzącej, aby uzyskać wizualną kontrolę przepływu substancji.
- Przepłukać co najmniej 2 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej przez probówkę i mikropipetę, aby upewnić się, że w strzykawce lub w probówce nie pozostało powietrze. Nie należy wywierać zbyt dużego nacisku na tłok strzykawki. Upewnij się, że połączenie między probówką a mikropipetą jest uszczelnione. Jeśli widoczny jest wyciek, ponownie przyklej złącze (patrz krok 1.5) i odłóż nagrywanie.
- Napełnić nową sterylną strzykawkę roztworem do wstrzyknięcia i wymienić ją na cylinder strzykawki z solą fizjologiczną, tj. trzymać igłę strzykawki wypełnionej solą fizjologiczną w probówce. Upewnij się, że żadne powietrze nie jest przepuszczane do systemu. Najlepiej osiągnąć to poprzez napełnienie piasty igły solą fizjologiczną po wyjęciu beczki wypełnionej solą fizjologiczną.
- Przepłukać system 250 μl roztworu, który ma być wstrzykiwany, w celu całkowitego usunięcia soli fizjologicznej z probówki.
- Za pomocą oprogramowania sterującego silnikiem wsunąć elektrody i mikropipetę do rurek prowadzących na głębokość co najmniej -500 μm.
- Opuść pierścień rury prowadzącej (Rysunek 1A) na spód rur prowadzących, aby utrzymać ich stałą pozycję względną.
- Oczyść podstawę systemu etanolem, w szczególności w miejscu, w którym będzie dotykać komory nagrywającej małpy.
- Zamknij system nagrywania, zakładając przednią pokrywę i dokręcając.
4. Walidacja systemu wtryskowego
Uwaga: Chociaż firma kalibruje system, zaleca się walidację wyrzucanych objętości za pomocą materiałów użytych w konfiguracji eksperymentalnej (probówki, strzykawki itp.).
- Przygotuj system zgodnie z opisem w kroku 3, trzymając elektrody i mikropipetę wysunięte z rurek prowadzących. Zalecana jest głębokość co najmniej 7 000 μm, aby uniknąć utraty objętości pomiarowej z powodu przywierania wzdłuż zewnętrznej powierzchni mikropipety i elektrod.
- Ustawić system rejestrujący w pozycji, w której będzie używany podczas eksperymentu i włożyć strzykawkę do pompy do mikroiniekcji. Zamocować strzykawkę na miejscu za pomocą gumowej opaski i regulowanego uchwytu (patrz Rysunek 1A). Przesunąć ruchomą część pompy, aż znajdzie się na swoim miejscu za tłokiem strzykawki.
- Za pomocą sterowanego programowo zespołu silnikowego wysunąć objętość wystarczająco dużą, aby można ją było dokładnie zmierzyć, np. 1 000 nl. Zaleca się użycie jednego kroku do wyrzucenia całej objętości, aby uniknąć skutków działania kapilarnego wzdłuż powierzchni mikropipety. Bardzo niskie prędkości (1 nl/s) mogą również prowadzić do takiego efektu podczas procedury walidacji.
- Zbierz całkowitą objętość do pojemnika umieszczonego pod mikropipetą lub ostrożnie zbierz wyrzuconą kroplę bezpośrednio z końcówki mikropipety. Oszacuj wyrzuconą objętość za pomocą pipety lub ważąc za pomocą precyzyjnej wagi.
- Powtórz procedurę kilka razy, aby potwierdzić pomiary.
5. Ostre nagrania
- Ustaw pozycję x-y systemu nagrywania. Określa to punkt, w którym rurki prowadzące docierają do opony twardej w przewlekle wszczepionej komorze zapisu. Upewnij się, że rury prowadzące są całkowicie schowane (rura prowadząca z pozycja 0).
- Ustawić system rejestracji na miejscu i umieścić strzykawkę w pompie do mikroiniekcji. Zamocować strzykawkę na miejscu za pomocą gumowej opaski i regulowanego uchwytu (patrz Rysunek 1A). Przesunąć ruchomą część pompy, aż znajdzie się na swoim miejscu za tłokiem strzykawki. Jeśli na końcu rurki prowadzącej widoczna jest kropla substancji, ostrożnie usuń ją za pomocą sterylnego wacika.
- Należy przygotować zwierzę do rejestracji zgodnie z procedurą laboratoryjną (zob.wytyczne w punkcie 18).
- Bezpiecznie zamontuj system nagrywania w komorze nagrywania małpy.
- Powoli ręcznie opuść rurki prowadzące do komory nagrywającej, aż do osiągnięcia opony twardej, a następnie napędzaj elektrody za pomocą oprogramowania sterującego silnikiem.
- Ponieważ nie jest możliwe zmierzenie impedancji mikropipety, należy najpierw przejechać elektrodami i regularnie sprawdzać ich impedancje na różnych głębokościach. Po pomyślnym przeprowadzeniu penetracji opony twardej bez uszkodzenia elektrod, należy przesunąć mikropipetę.
- Skieruj elektrody i mikropipetę na docelową głębokość elektrody, na której spodziewany jest obszar zainteresowania mózgu. Powoli przesuwaj elektrodę, aż znajdzie się wystarczająco blisko, aby zarejestrować aktywność pojedynczej jednostki, o czym świadczy dobry stosunek sygnału do szumu w rejestrowanym sygnale. Co ważne, elektrodę rejestrującą i mikropipetę należy ustawić na tej samej głębokości, aby zapewnić minimalną odległość między elektrodą a mikropipetą.
- Jeśli to możliwe, utrzymuj elektrody i mikropipetę na tej głębokości przez cały czas trwania nagrania. Jeśli jednak jedynym sposobem na utrzymanie jakości sygnału rejestrowanego ogniwa jest przesunięcie elektrod, należy jednocześnie sterować elektrodami i mikropipetą, aby zachować odległość między nimi.
6. Zadanie uwagi przestrzennej
- W serii prób przedstaw na ekranie dwa ruchome wzory kropek, jeden umieszczony w polu recepcyjnym zarejestrowanego neuronu, a drugi na zewnątrz, wraz z centralnie przedstawionym punktem fiksacji, który zwierzę musi wyciąć podczas każdej próby19,20,
Uwaga: Małpa jest szkolona, aby reagować na zmianę kierunku we wzorze punktów (zdarzenie docelowe), ignorując każdą zmianę kierunku w innym wzorze kropki i jest nagradzana kroplą płynu za każde pomyślne ukończenie próby19,20. W ramach kontroli sensorycznej małpa musi zgłosić zmianę luminancji punktu fiksacji, ignorując oba wzorce poruszających się kropek (patrz rysunek 2 w celu uzyskania bardziej szczegółowego opisu zadania).
7. Manipulacja farmakologiczna podczas nagrywania
Uwaga: Podczas gdy małpa wykonuje zadanie, wstrzyknij substancję w sposób blokowy. Zdefiniowane są trzy kolejne bloki: kontrola, która działa jako linia bazowa; iniekcja, podczas której substancja jest wyrzucana; i rekonwalescencja, podczas której komórki, do których doprowadzono wstrzyknięcie, powracają do wartości wyjściowej.
- Podczas bloku iniekcyjnego należy wstrzykiwać z góry określoną ilość substancji w regularnych odstępach czasu, np. 2 nl co minutę z szybkością 2 nl/s. W tym przykładzie użyj chlorowodorku skopolaminy. Proces wtrysku jest kontrolowany za pomocą oprogramowania, które zapewnia różne opcje. Na przykład, użyj funkcji krokowej, aby zdefiniować objętość wtrysku i naciskaj przycisk wstrzykiwania co minutę zgodnie z zegarem oprogramowania nagrywającego.
Uwaga: Dokładny czas trwania bloku iniekcyjnego zależy od substancji i eksperymentu, np. w przypadku skopolaminy należy wstrzykiwać 2 nl co minutę przez 10 minut (łącznie 20 nl). Zaleca się, aby nie przesuwać elektrod i mikropipety podczas bloku iniekcyjnego. - Zwróć uwagę na czas i próbę, podczas której substancja jest wstrzykiwana, głębokość elektrod i mikropipety, a także ilość wyrzucanej substancji.
- Po bloku iniekcji należy zastosować blok odzyskiwania, do którego nie wstrzykuje się żadnej substancji. Czas trwania bloku odzyskiwania jest specyficzny dla danej substancji i musi zostać określony w badaniach wstępnych. Monitoruj i utrzymuj jakość nagrywania wybranych pojedynczych jednostek aż do końca bloku odzyskiwania.
- Powtarzaj trzy bloki tak długo, jak pozwala na to jakość nagrania i motywacja małpy.
8. Procedury po nagraniu
- Po zarejestrowaniu danych wsuń elektrody i mikropipetę do probówek prowadzących, a następnie ręcznie wsuń rurki prowadzące. Wyjmij system nagrywania z komory nagrywania małpy. Zdjąć strzykawkę z pompy iniekcyjnej i przenieść system do obszaru przygotowania w celu oczyszczenia.
- Obchodzić się ze zwierzęciem (w tym czyścić komorę rejestracyjną18) zgodnie ze standardowymi procedurami laboratorium i zwrócić je do pomieszczenia inwentarskiego.
- Opłucz zewnętrzną część rurek prowadzących nadtlenkiem wodoru (3%), a następnie wodą dejonizowaną. Wyjąć elektrody i mikropipetę z rurek prowadzących, spłukać wodą utlenioną, a następnie wodą dejonizowaną.
- Wymienić cylinder strzykawki na cylinder strzykawki wypełniony sterylnym roztworem soli fizjologicznej, trzymając igłę w probówce. Przepłukać probówkę i mikropipetę 1-2 ml soli fizjologicznej. Po przepłukaniu wyjmij beczkę i napełnij ją powietrzem. Ponownie włożyć cylinder do igły i osuszyć rurkę oraz mikropipetę od wewnątrz, delikatnie przepychając powietrze.
- Rurki prowadzące, przedłużone elektrody i mikropipetę należy przechowywać zanurzone w roztworze enzymu, aby uniknąć wysuszenia, a także zapewnić rozkład materiału organicznego.
Wyniki
Rysunek 2 przedstawia zadanie uwagi przestrzennej, które małpa wykonywała podczas procesu iniekcji. Małpa została przeszkolona, aby skupiać uwagę albo na bodźcu znajdującym się w polu recepcyjnym rejestrowanego neuronu (uwaga-wewnątrz), bodźcu znajdującym się poza polem recepcyjnym (uwaga-zewnątrz) lub punkcie fiksacji (uwaga-fiksacja). Warunki te umożliwiają porównanie aktywności neuronalnej w różnych stanach uwagi.
Rysunek 3 przedstawia histogram czasu okołobodźcowego (PSTH) dla przykładowego neuronu w eksperymencie z użyciem skopolaminy, antagonisty muskarynowego receptorów cholinergicznych. Wykres obrazuje supresję odpowiedzi podczas iniekcji skopolaminy w porównaniu do braku iniekcji, w sytuacji gdy w polu recepcyjnym neuronu prezentowany jest wzór poruszający się w preferowanym przez komórkę kierunku, na którym zwierzę skupia uwagę. Dwa pierwsze piki reprezentują odpowiedź neuronu na początek (on) i koniec (offset) sygnału przestrzennego, który pojawia się w jego polu recepcyjnym. Następnie widoczna jest odpowiedź na poruszający się wzór, który pojawia się na ekranie 500 ms po wystąpieniu sygnału. Szary obszar zacieniony określa okres analizy wykorzystany do obliczenia średniej częstotliwości wyładowań dla każdej próby. Zielony obszar podkreśla supresyjny wpływ iniekcji skopolaminy na częstotliwość wyładowań komórki. Ciemnozielony region pokazuje supresję w obrębie okresu analizy.
Rysunek 4A przedstawia wpływ skopolaminy na średnią częstotliwość wyładowań badanego neuronu w każdym z trzech stanów uwagi. Częstotliwość wyładowań neuronu dla dwóch warunków uwagi przestrzennej (uwaga wewnątrz lub na zewnątrz pola recepcyjnego rejestrowanego neuronu), a także dla warunku sensorycznego (uwaga skupiona na punkcie fiksacji), spadła krótko po pierwszej iniekcji w bloku iniekcji (obszar zacieniony na szaro), a podczas bloku regeneracji wzrosła z opóźnieniem do poziomu sprzed iniekcji.
Rycina 4B przedstawia rejestrację kontrolną z drugiego badanego neuronu, do którego wstrzyknięto sól fizjologiczną (0,9% NaCl), stosując ten sam protokół co w przypadku wstrzyknięcia skopolaminy. W bloku wstrzykiwania nie zaobserwowano zmian w częstotliwości wyładowań neuronu w porównaniu z blokiem kontrolnym.
Rysunek 1. Układ wykorzystywany do manipulacji farmakologicznych podczas rejestracji. (A) Przedstawiono pompę do mikroiniekcji oraz system rejestracji elektrofizjologicznej wyposażony w elektrody i mikropipetę. Powiększono szczelinę w rurce prowadzącej, do której wlewa się olej silikonowy w celu nasmarowania elektrod i mikropipety. (B) Przedstawiono przykładową mikropipetę (u góry) oraz elektrodę rejestrującą (u dołu). W celu porównania wielkości poniżej umieszczono monetę eurocent (średnica: 16 mm). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 2. Projekt zadania służący do kierowania uwagą przestrzenną. Małpy były trenowane w wykrywaniu zmiany kierunku ruchu w zaznaczonym wzorze kropek. Wskazówka była umieszczana albo w obrębie pola recepcyjnego neuronu (uwaga wewnątrz), jak pokazano na rycinie, albo poza nim (uwaga na zewnątrz). Jako kontrolę sensoryczną małpa była trenowana w wykrywaniu zmiany luminancji punktu fiksacji (uwaga na fiksację). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Rycina 3. Wpływ antagonisty skopolaminy na częstotliwość wyładowań. Przedstawiono peri-stimulus time histogram dla przykładowego neuronu w warunku skupienia uwagi wewnątrz pola recepcyjnego (attend-in) podczas bloku z iniekcją oraz podczas bloku kontrolnego. Oś X przedstawia czas w milisekundach po wystąpieniu sygnału, a oś Y pokazuje częstotliwość wyładowań w spikes/sec. Szary obszar oznacza okres analizy (300-800 ms po wystąpieniu bodźca) wykorzystany do obliczenia średniej częstotliwości wyładowań z prób. Zielony obszar zacieniowany pokazuje supresję częstotliwości wyładowań w dwóch warunkach. Ciemnozielony kolor wyróżnia supresję w obrębie okresu analizy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Rycina 4. Wpływ skopolaminy i soli fizjologicznej na częstotliwość wyładowań. (A) Wstrzyknięcie antagonisty skopolaminy. Przedstawiono uśrednioną z prób częstotliwość wyładowań wybranej komórki z Ryciny 3 w trakcie trwania eksperymentu dla bodźca preferowanego we wszystkich trzech warunkach uwagi. Oś x przedstawia czas rozpoczęcia próby w minutach, a oś y pokazuje częstotliwość wyładowań jednostki w impulsach na sekundę. Symbole (
uwaga skupiona (attend-in), 
uwaga na fiksacji (attend-fix), 
uwaga rozproszona (attend-out)) reprezentują częstotliwość wyładowań neuronu w okresie analizy w każdej pomyślnie przeprowadzonej próbie, a linie poziome (linia ciągła: attend-in, linia kropkowana: attend-fix, linia przerywana: attend-out) pokazują średnią częstotliwość wyładowań dla trzech różnych bloków eksperymentalnych (kontrolnego, wstrzykiwania, regeneracji). Szary obszar zacieniowany wskazuje blok wstrzykiwania, rozpoczynający się od pierwszej iniekcji i kończący 1 min po ostatniej iniekcji. Podczas bloku wstrzykiwania co minutę podawano 2 nL 0,1 molarnej skopolaminy z prędkością wstrzykiwania 2 nl/s. (B) Wstrzyknięcie soli fizjologicznej. Przedstawiono częstotliwość wyładowań wybranej komórki w trakcie eksperymentu kontrolnego dla bodźca preferowanego we wszystkich trzech warunkach uwagi. Szary obszar zacieniowany wizualizuje blok wstrzykiwania soli fizjologicznej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Dyskusja
Tutaj szczegółowo zilustrowaliśmy, jak wykonywać niezawodne i precyzyjne iniekcje oraz wysokiej jakości nagrania jednokomórkowe za pomocą "gotowego" systemu wtrysku ciśnieniowego. Chociaż ta metoda dostarczania leków była wcześniej stosowana u zachowujących się małp (omówiona w17), przedstawiony tutaj system ma zalety, omówione poniżej.
Jak pokazano na rysunku 4A, opisany tutaj system może zapewnić stabilny pomiar aktywności pojedynczego neuronu z zastrzykami farmakologicznymi i bez nich w bezpośrednim sąsiedztwie miejsca rejestracji. Jak pokazano na rysunku 4B, wstrzyknięcie substancji kontrolnej, soli fizjologicznej, nie doprowadziło do zmiany szybkości wypalania. Ta kontrola pokazuje, że sam proces wstrzykiwania nie ma mierzalnego wpływu na właściwości wypalania zarejestrowanych neuronów.
Konfiguracja przestrzenna neuronu, elektrody rejestrującej i mikropipety ma kluczowe znaczenie w tych eksperymentach. Chociaż dokładny pomiar ich względnego położenia w tkance podczas rejestracji nie jest możliwy, możemy rozważyć i kontrolować możliwe źródła wariancji. Po pierwsze, podczas wstrzykiwania objętości istnieje ryzyko, że interesujący nas neuron może zostać przemieszczony z dala od elektrody rejestrującej, co wpłynie na stabilność rejestrowanych sygnałów. Z tego powodu rozsądne jest porównanie szybkości wypalania przed i po bloku wtrysku w celu sprawdzenia stabilności sygnału. Po drugie, konfiguracja rurki prowadzącej systemu rejestrującego określa odległość między elektrodami a mikropipetą (np. 305 μm w koncentrycznym systemie 3-kanałowym użytym w tym eksperymencie). Ponieważ system zapewnia precyzyjną kontrolę położenia elektrod i mikropipet w tkance, odległość między nimi można zminimalizować poprzez staranną kalibrację głębokości względnej przed zapisem (krok 3.5) i utrzymywanie ich na tej samej głębokości podczas zapisów.
Potencjalne ograniczenia
Oprócz wewnętrznej kontroli jakości przez producenta, system musi zostać zweryfikowany w warunkach laboratoryjnych, ponieważ mogą być używane różne marki probówek, strzykawek itp., co może prowadzić do różnic w wyrzucanych objętościach. Chociaż system może być używany do wstrzykiwania bardzo małych objętości, jak w eksperymencie pokazanym tutaj, są one poniżej minimalnej objętości, która może być zwalidowana ze względu na praktyczne limity pomiarowe w normalnym środowisku laboratoryjnym. Jednak większe objętości iniekcji mogą być używane do wnioskowania o relacji między woluminem zdefiniowanym programowo a woluminem wyrzuconym przez sprzęt. W przypadku stosowania przezroczystych probówek możliwa jest dodatkowa kontrola wzrokowa procesu wtryskiwania poprzez pomiar przemieszczenia znacznika wizualnego.
Wprowadzenie mikropipety do systemu jest bardziej wymagające niż wprowadzenie elektrody, ponieważ średnica mikropipety jest nieco większa, a materiał jest bardziej delikatny. Ponadto połączenie rurki z trzpieniem mikropipety jest trudne, ponieważ wiąże się z dużym ryzykiem złamania górnej części mikropipety. Jednak żywotność pomyślnie załadowanej mikropipety wynosi kilka miesięcy, nawet przy codziennym użytkowaniu.
W praktyce nie spotkaliśmy się jeszcze z zatorem w układzie wtryskowym podczas czyszczenia układu po nagraniu. Niemniej jednak kontrola "online" nie jest możliwa i istnieje ryzyko, że fizyczna blokada (taka jak tkanka na końcówce mikropipety) może uniemożliwić wstrzyknięcie substancji. W związku z tym może być wskazane konserwatywne przeanalizowanie danych, na przykład włączenie do dalszej analizy tylko tych komórek, które wykazują znaczące zmiany w szybkości wypalania między blokami kontrolnymi i iniekcyjnymi eksperymentu.
Pomimo swojej małej średnicy, mikroelektrody i pipety przemieszczają tkankę mózgową i mogą powodować miejscowe uszkodzenia tkanek. Można to zminimalizować, ręcznie umieszczając końcówkę rurek prowadzących tuż nad oponą twardą. Elektrody następnie przenikają oponę twardą, a ich nienaruszoność można wywnioskować, mierząc ich impedancję online. Następnie wprowadza się mikropipetę. W przypadku stosowania tego podejścia zaleca się regularne usuwanie tkanki powyżej opony twardej, aby jeszcze bardziej zmniejszyć ryzyko pęknięcia elektrody lub pipety.
Porównanie z metodami alternatywnymi
Zastosowany tutaj system wykazuje wyraźne zalety w porównaniu z innymi systemami wtrysku ciśnieniowego. Jedną z mocnych zalet jest średnica mikropipety (około 100 μm), która jest o połowę mniejsza niż w przypadku innych dostępnych sond17 , a tym samym minimalizuje uszkodzenia tkanek nerwowych. W przeciwieństwie do poprzednich konstrukcji, obecny system wykorzystuje przestrzennie oddzieloną elektrodę rejestrującą i mikropipetę. Chociaż inne systemy zapewniają mniejszą odległość między elektrodą a pipetą, opisany tutaj system umożliwia niezależną zmianę głębokości elektrod i pipety, umożliwiając w ten sposób zmienne odległości względne w trakcie sesji nagrywania. Co ważne, nie trzeba iść na żadne kompromisy w kwestii jakości nagrywania, ponieważ system wtryskowy jest rozszerzeniem uznanego urządzenia rejestrującego. Chociaż w tym protokole używana jest tylko jedna mikropipeta, a tym samym jedna substancja, możliwe jest wstrzyknięcie kilku substancji w ramach jednej procedury eksperymentalnej. Aby to osiągnąć, kilka mikropipet można wkręcić w oddzielne rurki prowadzące i podłączyć do strzykawek zamontowanych w poszczególnych pompach iniekcyjnych. Wreszcie, sterowanie systemem jest łatwe, ponieważ do przesuwania elektrod i mikropipety oraz do wykonania wtrysku ciśnienia podczas eksperymentu potrzebny jest tylko jeden program komputerowy.
Porównując wtryskiwanie ciśnieniowe do jonoforezy, istnieją względne zalety i wady. Na przykład wstrzyknięcie ciśnieniowe wymaga wprowadzenia większej objętości do tkanki niż jonoforeza, co zwiększa ryzyko przemieszczenia neuronów. Obecny protokół wykorzystywał objętości w zakresie nL i rzadko doświadczaliśmy zauważalnych zmian w jakości sygnału zarejestrowanej komórki. System pozwala również na wstrzykiwanie większych objętości, co jest potencjalnie przydatne w przypadku manipulacji behawioralnych, ale może mieć wpływ na stabilność zapisu neuronalnego. Niewątpliwą przewagą iniekcji ciśnieniowej nad jonoforezą jest większa różnorodność substancji użytkowych, ponieważ nie ma wymogu stosowania substancji naładowanych. Należy jednak sprawdzać i porównywać wartości pH między substancjami doświadczalnymi i kontrolnymi (np. solą fizjologiczną).
Może pojawić się pytanie, dlaczego stosować od dawna znaną metodę wstrzykiwania ciśnienia zamiast nowszych technik, takich jak optogenetyka do manipulowania aktywnością neuronalną. Chociaż optogenetyka jest dobrze ugruntowana u gryzoni, nie jest jeszcze wiarygodnie ugruntowana u małp rezusów. W szczególności nie pozwala jeszcze na lokalną manipulację komórkami selektywnymi dla określonego typu neuroprzekaźnika. W dłuższej perspektywie widzimy ogromny potencjał dla połączenia zalet manipulacji farmakologicznych z zaletami manipulacji optogennych w wyjaśnianiu neuronalnych podstaw funkcji poznawczych.
Tutaj pokazaliśmy, w jaki sposób wstrzyknięcie ciśnieniowe może być wykorzystane do farmakologicznego manipulowania miejscowo ograniczonym obszarem w mózgu obudzonych, zachowujących się rezusów. Mamy nadzieję, że ta metoda zainspiruje innych naukowców do zbadania neuromodulacyjnego wkładu w dynamikę aktywności neuronalnej.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez granty Deutsche Forschungsgemeinschaft za pośrednictwem Collaborative Research Center 889 "Cellular Mechanisms of Sensory Processing" dla S.T. (Projekt C04). Dziękujemy Sinie Plümer, Leonore Burchardt, Dirkowi Prüsse, Klausowi Heisigowi i Ralfowi Brockhausenowi za wsparcie techniczne i związane ze zwierzętami oraz naszym współpracownikom z Oddziału Komórek Macierzystych Niemieckiego Centrum Naczelnych, dr Katharinie Debowski i Annie Magerhans, za pomoc techniczną w procesie filtracji.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| (-)-Chlorowodorek skopolaminy | Sigma-Aldrich | 55-16-3 | Mr 339,81 g/mol |
| NaCl 0,9% | B. Braun Melsungen AG | 3079870 | 5ml |
| Terg-a-zyme | Sigma-Aldrich | Z273287 | enzym detergen |
| Nadtlenek wodoru | Roth | Stosowany w 3% roztworze z wodą dejonizowaną | |
| Etanol | Chemie-Vertieb Hannover | 104642 | 70% |
| Woda | |||
| Injekt 40 Duo | B. Braun Melsungen AG | 9166432V | Strzykawka i igła |
| Probówki do mikrowirówek Eppendorf Safe-Lock, bursztynowe | Eppendorf | 0030 120.191 | 1,5ml |
| Mikropipeta ze szkła kwarcowego | Thomas Recording | ||
| Elektroda rejestrująca | Thomas Recording | elektroda z włókna kwarcowego/platynowo-wolframowego; wartość impedancji 1-2 MΩ i 0,3-0,5 MΩ | |
| PharmedBPT-Schlauch | Saint-Gobain Performance Plastics | 3702003 | Rozmiar: 0,25 x 2,05 mm (szer.: 0,9 mm) |
| Loctite 401 | Henkel | 233641 | Superglue |
| Olej silikonowy | Thomas Recording | M-1000 | |
| Minisart RC15 | Sartorius | 17761----------R | Filtr strzykawkowy |
| Wielokanałowy system mikroiniekcji | Thomas Nagranie | wielokanałowy manipulator mikroelektrod " System Eckhorn" wyposażony w mikroelektrody i mikropipety oraz precyzyjną wielokanałową pompę do mikroiniekcji | |
| Niestandardowe | wewnętrzne oprogramowanie laboratoryjne McLab do kontrolowania prezentacji bodźców |
Bibliografia
- Noudoost, B., Moore, T. The role of neuromodulators in selective attention. Trends Cogn Sci. 15 (12), 585-591 (2011).
- Jochems, A., Reboreda, A., Hasselmo, M., Yoshida, M. Cholinergic receptor activation supports persistent firing in layer III neurons in the medial entorhinal cortex. Behav Brain Res. 254, 108-115 (2013).
- Thiele, A., Herrero, J. L., Distler, C., Hoffmann, K. P. Contribution of cholinergic and GABAergic mechanisms to direction tuning, discriminability, response reliability, and neuronal rate correlations in macaque middle temporal area. J Neurosci. 32 (47), 16602-16615 (2012).
- Thienel, R., et al. Muscarinic antagonist effects on executive control of attention. Int J Neuropsychopharmacol. 12 (10), 1307-1317 (2009).
- Anthony, B. L., Dennison, R. L., Aronstam, R. S. Disruption of muscarinic receptor-G protein coupling is a general property of liquid volatile anesthetics. Neurosci Lett. 99 (1-2), 191-196 (1989).
- Yamakura, T., Bertaccini, E., Trudell, J. R., Harris, R. A. Anesthetics and ion channels: molecular models and sites of action. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 41, 23-51 (2001).
- Herr, N. R., Wightman, R. M. Improved techniques for examining rapid dopamine signaling with iontophoresis. Front Biosci. 5, 249-257 (2013).
- Bevan, P., Bradshaw, C. M., Pun, R. Y., Slater, N. T., Szabadi, E. The relative contribution of iontophoresis and electro-osmosis to the electrophoretic release of noradrenaline from multi barrelled micropipettes [proceedings]. Br J Pharmacol. 67 (3), 478-479 (1979).
- Herr, N. R., Kile, B. M., Carelli, R. M., Wightman, R. M. Electroosmotic flow and its contribution to iontophoretic delivery. Anal Chem. 80, 8635-8641 (2008).
- Thiele, A., Delicato, L. S., Roberts, M. J., Gieselmann, M. A. A novel electrode-pipette design for simultaneous recording of extracellular spikes and iontophoretic drug application in awake behaving monkeys. J Neurosci Meth. 158 (2-4), 207-211 (2006).
- Lalley, P. M. Microiontophoresis and Pressure Ejection: Modern Techniques in Neuroscience. Johansson, H., Windhorst, U. , 193-209 (1999).
- Malpeli, J. G., Schiller, P. H. A method of reversible inactivation of small regions of brain tissue. J Neurosci Meth. 1 (2), 145-159 (1979).
- Malpeli, J. G. Reversible inactivation of subcortical sites by drug injection. J Neurosci Meth. 86 (2), 119-128 (1999).
- Dias, E. C., Segraves, M. A. A pressure system for the microinjection of substances into the brain of awake monkeys. J Neurosci Meth. 72 (1), 43-47 (1997).
- Szente, M. B., Baranyi, A., Woody, C. D. Effects of protein kinase C inhibitor H-7on membrane properties and synaptic responses of neocortical neurons of awake cats. Brain Res. 506 (2), 281-286 (1990).
- Woody, C. D., Bartfai, T., Gruen, E., Nairn, A. lntracellular injection of cGMP-dependent protein kinase results in increased input resistance in neurons of the mammalian motor cortex. Brain Res. 386 (1-2), 379-385 (1986).
- Noudoost, B., Moore, T. A reliable microinjectrode system for use in behaving monkeys. J Neurosci Meth. 194 (2), 218-223 (2011).
- Association of Primate Veterinarians. Cranial Implant Care Guidelines for Nonhuman Primates in Biomedical Research. , Available from: http://www.primatevets.org/Content/files/Public/education/Cranial%20Implant%20Care%20Guidelines.pdf (2015).
- Treue, S., Martinez-Trujillo, J. C. Feature-based attention influences motion processing gain in macaque visual cortex. Nature. 399, 575-579 (1999).
- Martinez-Trujillo, J. C., Treue, S. Feature-based attention increases the selectivity of population responses in primate visual cortex. Curr Biol. 14 (9), 744-751 (2004).
Przedruki i uprawnienia
