Tutaj prezentujemy protokół indukcji nadciśnienia ocznego w mysim oku, który powoduje utratę komórek zwojowych siatkówki, co obserwuje się w jaskrze. Mikrogranulki magnetyczne są wstrzykiwane do przedniej komory i przyciągane do kąta tęczówkowo-rogówkowego za pomocą magnesu, aby zablokować odpływ cieczy wodnistej.
Artykuł metodologiczny
Magnetyczny model okluzji mikrokulek do wywoływania jaskry zależnej od nadciśnienia ocznego u myszy
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wykorzystanie modeli jaskry u gryzoni było niezbędne do zrozumienia mechanizmów molekularnych, które leżą u podstaw patofizjologii tej wieloczynnikowej choroby neurodegeneracyjnej. Wraz z pojawieniem się licznych transgenicznych linii myszy rośnie zainteresowanie indukowalnymi mysimi modelami nadciśnienia ocznego. W tym miejscu przedstawiamy model okluzyjny jaskry oparty na wstrzyknięciu mikrogranulek magnetycznych do przedniej komory oka za pomocą zmodyfikowanej mikroigły z fasetowanym skosem. Mikrogranulki magnetyczne są przyciągane do kąta tęczówki i rogówki za pomocą ręcznego magnesu, aby zablokować odpływ cieczy wodnistej z komory przedniej. To zaburzenie dynamiki wodnistej powoduje stały wzrost ciśnienia wewnątrzgałkowego, co z kolei prowadzi do utraty komórek zwojowych siatkówki, co obserwuje się u pacjentów z jaskrą u ludzi. Model okluzji mikrokulek przedstawiony w tym manuskrypcie jest prosty w porównaniu z innymi indukowalnymi modelami jaskry, a także wysoce skuteczny i powtarzalny. Co ważne, przedstawione tutaj modyfikacje minimalizują typowe problemy, które często pojawiają się w modelach okluzji. Po pierwsze, zastosowanie skośnej szklanej mikroigły zapobiega cofaniu się mikrogranulek i zapewnia, że podczas wstrzykiwania dochodzi do minimalnego uszkodzenia rogówki, zmniejszając w ten sposób skutki związane z urazami. Po drugie, zastosowanie mikrokulek magnetycznych zapewnia zdolność przyciągania większości koralików do kąta tęczówkowo-rogówkowego, skutecznie zmniejszając liczbę koralików unoszących się w komorze przedniej, unikając kontaktu z innymi strukturami (np. tęczówką, soczewką). Wreszcie, zastosowanie ręcznego magnesu zapewnia elastyczność podczas obsługi małego oka myszy, aby skutecznie kierować mikrokulkami magnetycznymi i zapewnić, że po wyjęciu mikroigły nie ma refluksu mikrogranulek z oka. Podsumowując, przedstawiony tutaj model myszy z mikrokulkami okluzji jest potężnym narzędziem badawczym do badania zmian neurodegeneracyjnych, które zachodzą podczas wystąpienia i progresji jaskry.
Wprowadzenie
Jaskra jest postępującą i nieodwracalną chorobą powodującą ślepotę, która dotknie około 80 milionów ludzi na całym świecie do 2020 roku1. U pacjentów z jaskrą utrata wzroku jest spowodowana selektywną śmiercią komórek zwojowych siatkówki (RGC), neuronów wyjściowych, które przekazują informacje wizualne z siatkówki do mózgu. Jaskra jest chorobą neurodegeneracyjną związaną z wiekiem, z wieloma czynnikami ryzyka, z których najczęstszym jest podwyższone ciśnienie wewnątrzgałkowe (IOP). Rzeczywiście, IOP jest jedynym modyfikowalnym czynnikiem ryzyka jaskry, a obecne metody leczenia koncentrują się wyłącznie na kontrolowaniu ciśnienia w oku. Jednak wiele czynników genetycznych, komórkowych i środowiskowych wpływa na wystąpienie i postęp tej choroby. Dlatego zrozumienie różnych mechanizmów, które ostatecznie przyczyniają się do śmierci neuronów, jest niezbędne do opracowania skutecznych metod leczenia jaskry.
Modele zwierzęce jaskry są niezbędne do badania patofizjologii chorób oraz do identyfikowania i testowania obiecujących metod leczenia. Rosnąca dostępność transgenicznych linii myszy, w tym szczepów warunkowego nokautu i myszy przenoszących genetycznie kodowane znaczniki fluorescencyjne, zwiększyła zapotrzebowanie na indukowalne modele jaskry myszy. Na przestrzeni lat opracowano kilka modeli jaskry u gryzoni (omówionych w2,3). W wielu z tych modeli jaskra jest wywoływana przez zakłócenie dynamiki cieczy wodnistej, co skutkuje podniesieniem ciśnienia wewnątrzgałkowego. Modele okluzji, w których mikrogranulki lub inne substancje są wstrzykiwane do przedniej komory oka w celu zablokowania drenażu wodnego, zyskały popularność w ostatnich latach, częściowo ze względu na ich względną łatwość zwiększenia IOP4-14.
Model okluzji mikrokulek jaskry, po raz pierwszy przeprowadzony u naczelnych 12, królików 8 i szczurów 4,9,11, został niedawno zaadaptowany do użytku u myszy 5,6,10. W tych badaniach dokomorowe wstrzyknięcie mikrogranulek polistyrenu, samodzielnie lub w połączeniu z materiałem lepkosprężystym, powodowało podwyższenie ciśnienia wewnątrzgałkowego, co prowadziło do późniejszej śmierci RGC 6,10. Jednak refluks po wyjęciu igły z oka i przemieszczenie mikrogranulek z kąta tęczówkowo-rogówkowego to częste problemy, które pojawiają się podczas zabiegu. Aby zminimalizować te wady, zastosowano magnesy do przyciągania mikrogranulek magnetycznych do kąta tęczówkowo-rogówkowego oka 4,9.
Opisany tutaj protokół jest zmodyfikowaną procedurą opartą na poprzednich badaniach 9,10, która wykorzystuje magnetyczne mikrokulki i ręczny magnes dostosowany do oka myszy (Rysunek 1). W naszym protokole wprowadzono kilka ważnych modyfikacji, aby zapewnić skuteczny i powtarzalny wzrost ciśnienia wewnątrzgałkowego u myszy. Po pierwsze, wstrzykiwanie mikrogranulek odbywa się za pomocą starannie przygotowanej szklanej mikroigły z fasetowanym skosem. Powstałe w ten sposób gładkie powierzchnie mikroigły, a także jej zaostrzona końcówka zapewniają minimalne uszkodzenia podczas nakłuwania rogówki. Zastosowanie tej szklanej mikroigły powoduje również zwiększoną kontrolę, gdy końcówka mikroigły wchodzi do przedniej komory, zmniejszając w ten sposób ryzyko uszkodzenia pobliskich struktur, takich jak tęczówka i soczewka. Ponadto niewielka zmiana iniekcyjna ułatwia samonaprawę rogówki i zmniejsza niepożądane skutki związane z urazami.
Po drugie, wstrzykiwanie mikrokulek magnetycznych i użycie ręcznego magnesu pozwala na precyzyjną kontrolę przyciągania koralików do kąta tęczówkowo-rogówkowego w małym oku myszy. Zastosowano mikrogranulki magnetyczne o średnicy 4,5 μm, ponieważ ten rozmiar mikrogranulek nie zapychał przygotowanego otworu mikroigłowego i co ważne, po wstrzyknięciu mikrogranulki te skutecznie blokowały drenaż cieczy wodnistej. Takie podejście nie tylko zmniejsza refluks wstrzykiwanych mikrogranulek, ale także zapewnia, że maksymalna liczba mikrogranulek gromadzi się w obszarze docelowym, aby skutecznie zablokować drenaż cieczy wodnistej. Co więcej, strategia ta zmniejsza również liczbę kulek unoszących się w komorze przedniej, unikając kontaktu z innymi strukturami, takimi jak tęczówka i soczewka, oraz zapobiegając przedostawaniu się do komory tylnej. Łącznie modyfikacje te zapewniają, że operacja wstrzyknięcia mikrogranulek jest wykonywana ze względną łatwością i w odpowiednim czasie, co skutkuje wysoce powtarzalną, skuteczną i trwałą indukcją nadciśnienia ocznego u myszy.
Protokół
Poniższa procedura została wykonana zgodnie z wytycznymi Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami w zakresie Wykorzystania Zwierząt Doświadczalnych oraz Oświadczeniem dotyczącym wykorzystywania zwierząt w badaniach okulistycznych i wizualnych Stowarzyszenia Badań nad Wzrokiem i Okulistyką (ARVO).
1. Przygotowanie mikroigły do iniekcji dokomorowej przedniej
- Za pomocą ściągacza wygeneruj mikroigłę z kapilary ze szkła borokrzemianowego
- Pod mikroskopem użyj ostrego ostrza, aby ostrożnie utworzyć otwór na końcu mikroigły. Powstały otwór powinien mieć kształt eliptyczny o średnicy osi głównej i pomocniczej wynoszącej odpowiednio około 190 μm i 70 μm. Zmierz obszar przygotowanego otworu mikroigłowego, najpierw uzyskując obrazy za pomocą linijki umieszczonej pod mikroskopem, a następnie dokonując kwantyfikacji za pomocą oprogramowania do analizy obrazu.
- W systemie do ukosowania mikropipet umieść mikroigłę pod kątem 20 stopni w stosunku do płytki do ukosowania, tak aby otwór mikroigły dotykał płytki. Ukosuj przez około 10 minut, aż krawędzie będą płaskie i gładkie. Dodaj kilka kropli wody destylowanej, aby wspomóc ten proces.
- Obróć mikroigłę, aby ukosować dwie krawędzie otaczające otwór, aż końcówka będzie ostra.
- Usuń wszystkie zanieczyszczenia i wodę z otworu końcówki mikroigły za pomocą miotełki do kurzu w aerozolu.
- Dokładnie zbadaj gotową mikroigłę pod mikroskopem. Wyrzuć mikroigły ze złamaniami, aby zminimalizować ryzyko złamania mikroigły podczas operacji.
- Wysterylizuj mikroigłę, spłukując ją najpierw etanolem, a następnie sterylnym zrównoważonym roztworem soli (BSS).
2. Przygotowanie roztworu mikrokulek magnetycznych
Uwaga: Mikrokulki magnetyczne użyte w tym badaniu są pokryte grupami epoksydowymi. Aby zapobiec wszelkim niepożądanym skutkom, takim jak zbrylanie się kulek i niepożądane interakcje molekularne, te grupy epoksydowe muszą najpierw zostać usunięte z mikrogranulek przed przystąpieniem do operacji iniekcji.
- Usuwanie grup epoksydowych z kulek magnetycznych
- Przygotować roztwór 0,02 M wodorotlenku sodu (NaOH, MW 39,997 g/mol) w 10-krotnym buforze Tris (MW 121,14 g/mol).
- Delikatnie wymieszaj zapas roztworu mikrokulek magnetycznych (średnica 4,5 μm, 4 x 108 kulek/ml), aż kulki zostaną równomiernie zawieszone w roztworze.
- Szybko odpipetować 1 ml roztworu kulek magnetycznych do 50 ml 0,02 M NaOH w 10-krotnym buforze Tris.
- Obracaj przez 24 godziny w temperaturze obrotowej, aby usunąć grupy epoksydowe z koralików.
- Zbierz koraliki, przymocowując magnes do dna tuby. Ustaw rurkę poziomo, aby upewnić się, że wszystkie koraliki są przyciągane do magnesu. Obracaj przez dodatkowe 4 godziny przy obiegu regulowanym.
- Za pomocą mikropipety ostrożnie usunąć supernatant, nie naruszając osadu z kulek.
- Delikatnie zmieszaj granulkę w 50 ml 10x buforu Tris, aż kulki będą dobrze zawieszone.
- Powtórz kroki od 2.1.4 do 2.1.6.
- Zagęszczanie i ponowne zawieszanie mikrokulek magnetycznych w sterylnym zrównoważonym roztworze soli
Uwaga: Konieczne jest skoncentrowanie zapasu roztworu kulek magnetycznych w sterylnym zrównoważonym roztworze soli (BSS), aby osiągnąć końcowe stężenie 1,6 x 106 kulek/μl, tak aby 2,4 x 106 kulek można było wstrzyknąć do przedniej komory w końcowej objętości 1,5 μl, która jest odpowiednia dla małego oka myszy.
- Umyj koraliki w 5 ml ultraczystej wody laboratoryjnej, delikatnie wirując przez 2 minuty.
- Zbierz koraliki, przyciągając je do dna rurki za pomocą magnesu.
- Za pomocą mikropipety ostrożnie usuń wodę, nie naruszając granulek kulek.
- Powtórz kroki od 2.2.1 do 2.2.3 jeszcze trzy razy.
- W okapie z przepływem laminarnym umyj kulki 500 μl BSS, pipetując w górę iw dół. Pozostałe czynności opisane w tej sekcji należy wykonać w sterylnych warunkach w okapie z przepływem laminarnym.
- Zbierz koraliki, przyciągając je do dna rurki za pomocą magnesu.
- Za pomocą mikropipety ostrożnie usuń BSS, nie naruszając osadu kulek.
- Powtórz kroki od 2.2.5 do 2.2.7 jeszcze trzy razy.
- Zawiesić przez pipetowanie kulek w górę i w dół w 250 μl BSS.
- Upewnij się, że roztwór kulki jest dobrze homogenizowany. Następnie szybko przetrzymywać 25 μl zawiesiny do sterylnych probówek o pojemności 0,5 ml. Końcowe stężenie roztworu kulek podstawowych wynosi 1,6 x 106 kulek/μl.
- Przechowywać w temperaturze 4 °C.
3. Indukcja nadciśnienia ocznego
Uwaga: Sekcja 3 to operacja dwuosobowa. W przypadku, gdy dana czynność ma być wykonana przez konkretną osobę, identyfikowana jest właściwa osoba. Ogólnie rzecz biorąc, osoba 1 obsługuje mysz pod mikroskopem, podczas gdy osoba 2 jest odpowiedzialna za manipulowanie pompą mikrostrzykawki. Całkowity czas trwania zabiegu chirurgicznego powinien być krótszy niż 10 minut (kroki od 3.9 do 3.17).
- Wykonaj zabiegi na dorosłych myszach C57BL/6. Myszy domowe w standardowym środowisku z dostępem do pożywienia i wody ad libitum. W tym artykule wykorzystano samice myszy C57BL/6 w wieku od 3 do 4,5 miesiąca. Jednak protokół ten można dostosować do samców i myszy w różnym wieku, a także innych szczepów myszy, w tym myszy transgenicznych i nokautujących.
- Zmierz wyjściowe ciśnienie wewnątrzgałkowe u obudzonych myszy przed znieczuleniem i wstrzyknięciem mikrogranulek za pomocą skalibrowanego tonometru odbicia. Nałóż jedną kroplę chlorowodorku proparakainy na rogówkę.
- Delikatnie przytrzymuj mysz, przytrzymując skórę między uszami. Umieść mysz na blacie tak, aby zwierzę czuło się komfortowo, a oczy były dostępne. Trzymaj tonometr prostopadle do powierzchni rogówki i wykonaj co najmniej trzy zestawy po dziesięć kolejnych odczytów na oko, aby uzyskać średnią IOP. Pomiar ciśnienia wewnątrzgałkowego u obudzonych myszy jest preferowany w celu ominięcia wpływu znieczulenia na IOP. Alternatywnie, IOP można zmierzyć u znieczulonych myszy po kroku 3.4.
- Przygotuj podstawowy koktajl mysi mieszaninę anestezjologiczną składającą się z 20 mg/ml ketaminy, 2 mg/ml ksylazyny i 0,4 mg/ml acepromazyny.
- Wywołać znieczulenie u myszy poprzez dootrzewnowe podanie mieszanki koktajlowej (1 μl/g masy ciała). Stosowanie koktajlu znieczulającego do wstrzykiwań jest preferowane w stosunku do znieczuleń gazowych (np. izofluranu), ponieważ zapewnia elastyczność podczas obchodzenia się z głową myszy, ponieważ zwierzę nie jest podłączone do maski inhalacyjnej. Ponadto dłuższy okres rekonwalescencji wymagany w przypadku znieczulenia do wstrzykiwań zapewnia, że mikrogranulki osadzają się pod kątem tęczówki i rogówki bez cofania się do przedniej komory.
- Podawać podskórnie 0,05 mg buprenorfiny na kg masy ciała.
- Leczyć oko tropikamidowymi kroplami do oczu, aby wywołać rozszerzenie źrenic. Ze względu na mały rozmiar mysiej komory przedniej, źrenica musi być rozszerzona, aby łatwo uwidocznić ustawienie i postęp mikroigły podczas wstrzykiwania.
- Nałożyć miejscowo maść na oko przeciwległe (nieoperowane), aby uniknąć wysuszenia rogówki podczas zabiegu.
- Podłączyć czystą mikroigłę do zespołu iniekcyjnego pompy mikrostrzykawkowej. Wymieniaj mikroigłę po każdej operacji, aby uniknąć zanieczyszczenia między zwierzętami.
- Osoba 1: Przenieś znieczuloną mysz na platformę operacyjną. Pod mikroskopem upewnij się, że źrenica jest całkowicie rozszerzona, a mięśnie oczu są rozluźnione, aby nie było ruchu gałek ocznych. Brak ruchów gałek ocznych zapewnia stabilność podczas iniekcji. Delikatnie zetrzyj krople do oczu z tropikamidu z oka za pomocą chłonnych wacików.
- Osoba 2: Wymieszaj roztwór mikrokulek magnetycznych, pipetując w górę iw dół.
- Za pomocą pompki mikrostrzykawkowej natychmiast napełnić mikroigłę (przygotowaną w punkcie 1) 1,5 μl homogenizowanego roztworu mikrokulek magnetycznych (2,4 x 106 kulek). Upewnij się, że na końcówce mikroigły nie ma pęcherzyków powietrza. Po załadowaniu mikroigły należy jak najszybciej wykonać kroki od 3.12 do 3.13, tak aby roztwór mikrokulek magnetycznych pozostał w jednorodnej zawiesinie.
- Umieść obciążoną mikroigłę pod kątem 45°, umieszczoną z przodu w stosunku do rąbka. Osoba 1: podeprzyj oko za pomocą plastikowych kleszczy. Upewnij się, że kąt między mikroigłą a plastikowymi kleszczami wynosi około 90°.
- Osoba 2: Za pomocą załadowanej mikroigły delikatnie nakłuj rogówkę tak, aby końcówka mikroigły weszła do komory przedniej. Upewnij się, że obciążona mikroigła pozostaje pod kątem 45° w stosunku do rąbka podczas nakłuwania. Unikaj kontaktu z obiektywem lub tęczówką. Upewnij się, że mikroigła nie dostanie się do tylnej komory. Osoba 1: kontynuuj podtrzymywanie oka za pomocą plastikowych kleszczy.
- Osoba 1: Nie poruszając głową myszy, umieść magnes obok oka, naprzeciwko końcówki mikroigły, aby przyciągnąć kulki magnetyczne do przedniej komory i zminimalizować kontakt koralików z wewnętrzną powierzchnią rogówki. Osoba 2: Za pomocą pompki mikrostrzykawkowej wstrzyknąć 1,5 μl roztworu kulek magnetycznych do komory przedniej. Roztwór mikrogranulek wstrzykuje się przez okres od 15 do 30 sekund. Osoba 1: Trzymaj magnes naprzeciwko końcówki mikroigłowej przez cały czas trwania wstrzyknięcia.
- Osoba 2: Po wstrzyknięciu całej objętości koralików powoli wyjmij mikroigłę z oka. Osoba 1: Aby uniknąć refluksu mikrogranulek, kontynuuj przyciąganie kulek magnetycznych w kierunku komory przedniej, trzymając magnes obok oka przez dodatkowe 30 do 60 sekund.
- Osoba 1: Za pomocą magnesu przyciągnij koraliki do kąta tęczówki. Upewnij się, że koraliki tworzą równomiernie rozłożony pierścień na obwodzie przedniej komory. Na tym etapie należy unikać przyciągania koralików do rogówki, ponieważ mają one tendencję do przyklejania się do wewnętrznej powierzchni rogówki w kontakcie.
- Operowane oko należy leczyć kroplami do oczu z antybiotykiem, aby zminimalizować ryzyko infekcji.
- Pozwól myszy odzyskać sprawność na poduszce grzewczej, aż do całkowitego wybudzenia (~ 3 do 4 godzin). Ustaw mysz tak, aby operowane oko było skierowane do góry. Takie ustawienie zapobiegnie gromadzeniu się wstrzykniętych kulek na wewnętrznej powierzchni rogówki przez przyciąganie grawitacyjne. Ponadto taka pozycja zmniejszy ryzyko infekcji, ponieważ operowane oko nie będzie miało kontaktu z żadną ściółką i/lub innymi materiałami, które mogą być obecne w klatce. W przypadku, gdy zwierzę wykazuje jakiekolwiek oznaki niepokoju, w razie potrzeby należy podać dodatkowe dawki buprenorfiny.
- Pozwól myszom dojść do siebie po zabiegu przez co najmniej 2 dni przed wykonaniem pomiarów IOP. Zmierz IOP zgodnie z opisem w 3.2. Monitoruj ciśnienie wewnątrzgałkowe co najmniej raz w tygodniu lub częściej, w razie potrzeby i o tej samej porze dnia, aby zminimalizować wahania związane z okołodobą.
- Do pomiarów ciśnienia wewnątrzgałkowego należy użyć przeciwległego oka operowanej myszy jako kontroli wewnętrznej. Alternatywnie, użyj pomiarów z nienaruszonych, nieoperowanych lub pozorowanych myszy jako naiwnych kontroli.
4. Ocena przeżycia komórek zwojowych siatkówki w komórkach zwojowych i aksonach
- Myszy z perfuzją poddane nadciśnieniu ocznemu przez dosercowe wstrzyknięcie 0,1 M roztworu buforu fosforanowego (PBS), a następnie lodowate 4% paraformaldehydu (PFA).
- Perfekować nienaruszone, nieobsługiwane myszy zgodnie z opisem w 4.1 i używać ich jako nieuszkodzonych kontrol. Nie zaleca się stosowania przeciwległych oczu u operowanych myszy do oceny przeżycia RGC, ponieważ zgłaszano zmiany w przeciwległych oczach po urazie15,16 i mogą zakłócić interpretację danych. Alternatywnie, jako kontrole należy użyć pozorowanych oczu, do których wstrzyknięto 1,5 μl BSS.
- Za pomocą mikronożyczek ostrożnie przeciąć tkankę łączną wokół oka, aby odizolować ją od oczodołu. Oddziel nerw wzrokowy od oka, przecinając go na poziomie głowy nerwu wzrokowego.
- Za pomocą igły 30 G wykonać otwór w rogówce, aby umożliwić przenikanie roztworu utrwalającego do oka. Umieścić oko w 4% PFA i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C w celu dodatkowego utrwalenia.
- Umieścić nerw wzrokowy w roztworze zawierającym 2% PFA i 2,5% aldehydu glutarowego w 0,1 M kakodylanu sodu (MW: 214 g/mol) i inkubować O/N w temperaturze 4 °C w celu dodatkowego utrwalenia.
5. Kwantyfikacja gęstości RGC Soma na płaskich siatkówkach
Uwaga: Poniższa procedura została zaadaptowana z protokołu autorstwa Nadala-Nicolasa i wsp. 17 i przedstawia ilościowe oznaczanie RGC przy użyciu przeciwciała przeciwko specyficznemu dla mózgu białku homeobox/domeny POU 3A (Brn3a) na płaskich mocowaniach siatkówki. Można również stosować alternatywne metody znakowania RGC, w tym immunohistochemię z przeciwciałem przeciwko białku wiążącemu RNA z wielokrotnym splicingiem (RBPMS) lub znakowanie wsteczne za pomocą Fluorogold lub DiI.
- Pod mikroskopem preparacyjnym usuń przednią część oka, wykonując nacięcie wzdłuż całego rąbka, aż rogówka łatwo się odczepi. Usuń rogówkę i soczewkę. Ostrożnie odłącz siatkówkę od oka, wykonując nacięcia wzdłuż ora serrata i nerwu wzrokowego.
- Przygotuj płaski montaż siatkówki, wykonując cztery małe jednakowo odległe nacięcia od obwodu siatkówki w kierunku nerwu wzrokowego, aby wyraźnie wyznaczyć cztery ćwiartki siatkówki. Za pomocą małej szczoteczki delikatnie usuń resztki ciała szklistego z siatkówki. Usunięcie jak największej ilości cieczy szklistej ma kluczowe znaczenie dla uzyskania czystego i silnego sygnału immunohistochemicznego.
- Ostrożnie przenieś siatkówkę na 48-dołkową płaską płytkę hodowlaną zawierającą 0,5% Triton X-100 w PBS, tak aby siatkówka była swobodnie pływająca. Upewnij się, że warstwa komórek zwojowych jest skierowana do góry.
- Umieścić płytkę hodowlaną w temperaturze -70 °C na 15 minut. Po rozmrożeniu siatkówki należy ją poddać dalszej przepuszczalności poprzez dwukrotne przemycie w świeżym 2% Triton X-100 w PBS.
- Rozcieńczyć przeciwciało Brn3a do 0,3 - 0,5 μg/ml PBS zawierającym 2% Triton X-100 i 2% normalnej surowicy osła. Inkubować siatkówkę w roztworze przeciwciała pierwszorzędowego Brn3a, delikatnie potrząsając O/N w temperaturze 4 °C. Siatkówki powinny być przez cały czas całkowicie zanurzone w 150 do 200 μl roztworu.
- Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe IgG przeciwko kozom do 2 μg/ml PBS zawierającym 2% Triton X-100 i inkubować siatkówkę w tym roztworze przez 2 godziny w temperaturze pokojowej z delikatnym potrząsaniem. Siatkówka powinna być przez cały czas całkowicie zanurzona w roztworze przeciwciała. Przykryj płytkę hodowlaną folią aluminiową na pozostałe kroki, aby zapobiec fotowybielaniu.
- Za pomocą szczoteczki ostrożnie przenieś siatkówkę na szkiełko, aby tkanka leżała jak najbardziej płasko. Suszyć na powietrzu przez 10 min. Zamontuj za pomocą medium montażowego zapobiegającego blaknięciu.
- Zbadaj płaskie mocowania siatkówki pod mikroskopem fluorescencyjnym. Określić ilościowo liczbę RGC Brn3a dodatnich w trzech nienakładających się obszarach na kwadrant siatkówki, jak opisano. Rozdział 18
6. Kwantyfikacja aksonów RGC na przekrojach nerwu wzrokowego
- Zebrać nerw wzrokowy z kroku 4.5 i inkubować w 2% tetratlenku osmu (OsO4, MW 254,23 g/mol) przez 2 godz.
Uwaga: Ze względu na wysoką toksyczność, z tetratlenkiem osmu należy obchodzić się w dygestorium w odpowiednim stroju laboratoryjnym. - Odwodnić nerw wzrokowy, zanurzając go w rosnących stężeniach etanolu (50%, 70%, 90%, 95% i 100%) na 15 minut każdy.
- Przygotuj żywicę epoksydową, korzystając z następującej receptury: 15,72 ml Embed-812, 6,45 ml bezwodnika bursztynowego dodecenylu, 7,83 ml bezwodnika nadic metylu, 0,45 ml DMP-30.
- Sekwencyjnie inkubować nerw wzrokowy w roztworach składających się z następujących proporcji żywicy epoksydowej do tlenku propylenu (MW 58,08 g/mol): 0:1, 1:1, 0,75:0,25 i 1:0. Nerw wzrokowy jest inkubowany w każdym roztworze w RT przez okres O/N.
- Inkubować nerwy wzrokowe zatopione w 100% żywicy epoksydowej (ostatni krok od ppkt 6.4) w temperaturze 60 °C przez dodatkowe 48 godzin.
- Generuj półcienkie przekroje czynne nerwu wzrokowego (0,75 μm) za pomocą mikrotomu.
- Zabarwić przekroje nerwu wzrokowego 1% błękitem toluidynowym.
- Określ ilościowo aksony RGC w pięciu nienakładających się na siebie obszarach każdego odcinka nerwu wzrokowego, jak opisano 19.
Wyniki
Wtryskiwanie magnetycznych mikrokulek do przedniej komory oka u dorosłych myszy, opisane w niniejszym protokole, doprowadziło do silnego i powtarzalnego podwyższenia IOP. Tydzień po zabiegu IOP wzrosło z poziomu 10 ± 0,6 mm Hg (średnia ± S.E.M.), będącego średnim bazowym IOP w oczach przeciwległych, do 19 ± 0,5 mm Hg w oczach z nadciśnieniem (test t Studenta) t-test; ***p <0,01, n = 12, Tabela 1, Rycina 2). Następnie ciśnienie wewnątrzgałkowe (IOP) ustabilizowało się i pozostało podwyższone, osiągając średnią wartość 20 mm Hg przez co najmniej 6 tygodni, co było najdłuższym punktem czasowym badanym w niniejszym badaniu. Średni szczyt IOP w oczach po wstrzyknięciu mikrokulek w 2., 3. i 6. tygodniu po operacji wynosił 25 mm Hg. Przeważająca większość leczonych myszy wykształciła trwałe wysokie IOP, w związku z czym protokół ten nie wymaga ponownego wstrzyknięcia mikrokulek.
Aby ocenić przebieg czasowy utraty komórek zwojowych siatkówki (RGC) w tym modelu, w pierwszej kolejności przeprowadzono ilościowe oznaczenie ciał komórek RGC za pomocą immunobarwienia z zastosowaniem Brn3a, markera specyficznego dla RGC 17. Liczbę komórek Brn3a-dodatnich określono na preparatach płaskich siatkówek w 1, 2, 3 i 6 tygodniu po wywołaniu nadciśnienia wewnątrzgałkowego. Chociaż istotny wzrost ciśnienia wewnątrzgałkowego (IOP) stwierdzono już w 1. tygodniu po wstrzyknięciu mikrokulek, w ciągu pierwszych 2 tygodni od zabiegu nie zaobserwowano istotnej utraty ciał komórek RGC (Rysunek 3). Jednakże znaczna śmierć komórek RGC (2%) była widoczna w 3. tygodniu (2 430 ± 67 RGC/mm2, średnia ± S.E.M., n = 12) oraz w 6. tygodniu (2 350 ± 74 RGC/mm2, n = 10) po wywołaniu nadciśnienia wewnątrzgałkowego, w porównaniu z nienaruszonymi oczami kontrolnymi myszy nieoperowanych (3 141 ± 49 RGC/mm2, n = 23) (ANOVA, p <0.01).
Dysfunkcja i degeneracja aksonów RGC jest kluczową cechą jaskry. W związku z tym badano utratę aksonów w 3. i 6. tygodniu po wstrzyknięciu mikrokulek poprzez ilościowe oznaczenie aksonów RGC w przekrojach poprzecznych nerwu wzrokowego barwionych błękitem toluidyny (Rysunek 4). Znaczną utratę aksonów RGC (25%) zaobserwowano w 3. tygodniu (28 401 ± 702 aksonów/nerw, średnia ± S.E.M., n = 5) i 6. tygodniu (29 426 ± 948 aksonów/nerw, n = 6) po wstrzyknięciu mikrokulek w porównaniu z nienaruszonymi nerwami wzrokowymi z nieoperowanych oczu (39 467 ± 137 aksonów/nerw, n = 4) (ANOVA, p <0,01). Wspólnie dane te wykazują, że wstrzyknięcie magnetycznych mikrokulek do przedniej komory oka myszy prowadzi do powtarzalnego i trwałego podwyższenia IOP, co skutkuje degeneracją som i aksonów RGC.
| Czas po operacji OHT | N | Średnie IOP (mmHg) ± S.E.M. | Szczytowe IOP (mmHg) | ||||
| Przeciwstawny | Jaskra | Różnica | Przeciwstronny | Jaskra | |||
| 1 tydzień | 12 | 10 ± 0.4 | 19 ± 0.5 | 9 ± 0.6 | 12 ± 0.4 | 22 ± 0.6 | |
| 2 tygodnie | 13 | 11 ± 0.5 | 20 ± 0.8 | 9 ± 0.5 | 12 ± 0.9 | 25 ± 0.7 | |
| 3 tygodnie | 10 | 11 ± 0.8 | 20 ± 0.7 | 10 ± 0.9 | 13 ± 0.2 | 25 ± 0.9 | |
| 6 tygodni | 12 | 12 ± 0.5 | 20 ± 0.6 | 9 ± 0.7 | 13 ± 0.5 | 24 ± 0.6 | |
Tabela 1. Podwyższenie ciśnienia wewnątrzgałkowego w mysim modelu okluzji za pomocą magnetycznych mikrokulek. U budzących się samic myszy C57 BL/6 pomiar IOP przeprowadzono za pomocą skalibrowanego tonometru odbiciowego. W operowanych oczach odnotowano wzrost IOP wykryty w jednym tygodniu po operacji, który utrzymywał się przez co najmniej sześć tygodni po zabiegu.
Rysunek 1. Schemat etapów modelu jastrzębiego jaskry z okluzją za pomocą magnetycznych mikrokulek u myszy. Szczegółowy opis wszystkich procedur wykonywanych przed, w trakcie i po zabiegu chirurgicznym. Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.
Rycina 2. Wzrost ciśnienia wewnątrzgałkowego w mysim modelu okluzji z zastosowaniem magnetycznych mikrokulek. U czuwających samic myszy C57 BL/6 ciśnienie wewnątrzgałkowe (IOP) mierzono za pomocą skalibrowanego tonometru odbiciowego. W oczach z wstrzykniętymi mikrokuleczkami IOP było znacznie podwyższone w pierwszym tygodniu po operacji (ANOVA, p <0,01). Ciśnienie wewnątrzgałkowe (IOP) pozostawało istotnie podwyższone w stosunku do oka przeciwległego u myszy po iniekcji przez co najmniej 6 tygodni (ANOVA, p <0,01). (Grupa nienaruszona: n = 12; 1 tydzień: n = 12, 2 tygodnie: n = 13, 3 tygodnie: n = 10, 6 tygodni: n = 12). Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 3. Śmierć komórek zwojowych siatkówki w mysim modelu okluzji z użyciem magnetycznych mikrokulek. Komórki zwojowe siatkówki (RGCs) zwizualizowano za pomocą immunostainingu preparatów siatkówki w montażu płaskim z wykorzystaniem przeciwciała Brn3a w nienaruszonych siatkówkach kontrolnych (A) oraz siatkówki z jaskrą w 3. i 6. tygodniu po wstrzyknięciu mikrokulek w celu wywołania nadciśnienia wewnątrzgałkowego (OHT) (B, C). Paski skali: 20 µm. (D) Analiza ilościowa potwierdziła, że wstrzyknięcie mikrokulek spowodowało istotną utratę ciał komórek RGC w 3. i 6. tygodniu po zabiegu w porównaniu z oczami kontrolnymi. Gęstość ciał komórek RGC u zdrowych myszy C57/BL6 bez jaskry przedstawiono jako punkt odniesienia (białe słupki, 10% przeżywalności). Wartości wyrażono jako średnia ± S.E.M. (Intakt: n = 23; 1 tydzień: n = 6, 2 tygodnie: n = 6, 3 tygodnie: n = 12, 6 tygodni: n = 10, ANOVA, *** p <0.001). Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 4. Degeneracja aksonalna w mysim modelu okluzji z użyciem magnetycznych mikrokulek. Aksony RGC zwizualizowano poprzez barwienie przekrojów poprzecznych nerwu wzrokowego błękitem toluidyny w nienaruszonej grupie kontrolnej (A) oraz siatkówki z jaskrą w 3. i 6. tygodniu po wstrzyknięciu mikrokulek w celu wywołania nadciśnienia wewnątrzgałkowego (OHT) (B, C). Paski skali: 10 µm. (DAnaliza ilościowa potwierdziła, że wstrzyknięcie mikrokulek spowodowało istotną utratę aksonów RGC w 3. i 6. tygodniu po zabiegu w porównaniu z oczami kontrolnymi. Gęstość aksonów RGC u zdrowych myszy C57/BL6 bez jaskry przedstawiono jako punkt odniesienia (białe słupki, 10% przeżywalności). Wartości wyrażono jako średnia ± S.E.M. (Intakt: n = 4; 3 tygodnie: n = 5, 6 tygodni: n = 6, ANOVA, *** p) <0.001). Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Dyskusja
Przedstawiona tutaj technika wideo zawiera szczegółowe instrukcje krok po kroku, jak wykonać dokomorowe wstrzykiwanie mikrokulek magnetycznych, aby skutecznie i powtarzalnie wywołać wzrost ciśnienia wewnątrzgałkowego u myszy. Procedura ta powoduje trwały wzrost ciśnienia wewnątrzgałkowego, który nie wymaga dodatkowych zastrzyków i sprzyja wykrywalnej utracie somy i aksonów RGC w ciągu pierwszych 3 tygodni od indukcji nadciśnienia ocznego. Podwyższone ciśnienie wewnątrzgałkowe jest głównym czynnikiem ryzyka rozwoju jaskry u ludzi. Dlatego jest to cenny mysi model jaskry zależnej od nadciśnienia ocznego, który ma potencjał w szerokim zakresie zastosowań.
Częstą wadą związaną z wstrzykiwaniem mikrogranulek do komory przedniej jest refluks perełkowy przez miejsce wstrzyknięcia po wyjęciu igły, co często skutkuje tylko częściowym zablokowaniem odpływu wody i zwiększoną zmiennością. Aby rozwiązać ten problem, wprowadzono kilka ważnych modyfikacji. Po pierwsze, staranne przygotowanie czystej, ostrej szklanej mikroigły z fasetowanym skosem jest niezbędne do udanego wstrzyknięcia mikrogranulek. Odpowiednio przygotowana mikroigła umożliwia kontrolowaną i płynną penetrację rogówki przy minimalnym nacisku na delikatną powierzchnię oka. Małe nakłucie rogówki zapobiega cofaniu się mikrogranulek. Ponadto cienka mikroigła zmniejsza ryzyko uszkodzenia pobliskich struktur, takich jak tęczówka i soczewka, co może skutkować stanem zapalnym niezwiązanym z chorobą. Po drugie, zastosowanie ręcznego magnesu w strategicznych obszarach oczu podczas i po wstrzyknięciu jest kolejnym krytycznym aspektem tej techniki. Podczas iniekcji magnes służy do przyciągania mikrokulek magnetycznych do przedniej komory, zapobiegając refluksowi mikrokulek po wyjęciu mikroigły. Po wstrzyknięciu magnes jest następnie używany do kierowania mikrogranulek pod kątem tęczówki i rogówki, aby zablokować odpływ cieczy wodnistej.
Innym problemem często spotykanym w modelach okluzji mikrokulek jest to, że wielokrotne wstrzykiwanie kulek jest często konieczne do osiągnięcia trwałego wzrostu ciśnienia wewnątrzgałkowego 10,11. Może to być wynikiem przemieszczania się mikrogranulek z kątem tęczówki i rogówki z czasem. Połączenie ręcznego magnesu, jak opisano powyżej, i umiejscowienia myszy po operacji znacznie poprawia wynik. Preferowane jest stosowanie środków znieczulających do wstrzykiwań, które pozwalają na elastyczność w poruszaniu głową podczas zabiegu i wymagają dłuższego okresu rekonwalescencji pooperacyjnej. Ustawienie myszy z operowanym okiem skierowanym do góry przez kilka godzin po operacji przyczynia się do osiadania mikrogranulek w kącie tęczówki i zmniejsza ryzyko przemieszczenia się z powrotem do przedniej komory.
Zapewnienie, że liczba wstrzykiwanych kulek jest względnie stała, jest kolejnym krytycznym krokiem w celu zminimalizowania różnic między zwierzętami. Ponieważ mikrogranulki osadzają się na dnie probówki, konieczne jest pełne zhomogenizowanie roztworu mikrogranulek i pobranie odpowiedniej objętości do mikroigły w odpowiednim czasie. Wstrzyknięcie mniejszej liczby kulek do komory przedniej może spowodować niepełne zablokowanie struktur drenażowych cieczy wodnistej, co może skutkować słabym lub zmiennym wzrostem ciśnienia wewnątrzgałkowego. Warto zauważyć, że chociaż ostatecznym celem wstrzyknięcia mikrogranulek jest podniesienie ciśnienia wewnątrzgałkowego, należy zachować ostrożność, gdy pomiary IOP od obudzonych myszy są wyższe niż wartości szczytowe zgłoszone w tym badaniu (~ 25 mmHg). Bardzo wysokie ciśnienie wewnątrzgałkowe zwiększa ryzyko uszkodzenia niedokrwiennego, a także może powodować ból u zwierzęcia. Zwiększenie ciśnienia wewnątrzgałkowego powinno być brane pod uwagę jako jeden z wielu czynników oceny powodzenia operacji. W związku z tym wynik procedury powinien być oceniany na podstawie kilku parametrów, w tym podwyższenia ciśnienia wewnątrzgałkowego, zgonu RGC soma i utraty aksonów.
Chociaż opisany tutaj protokół powoduje, że większość mikrogranulek z powodzeniem osiada pod kątem, potencjalnym ograniczeniem tego modelu jest to, że te kulki, które pozostają unoszące się w komorze przedniej, mogą zakłócać obrazowanie siatkówki na żywo przez rogówkę, a także testy elektrofizjologiczne lub behawioralne, które wymagają skutecznego przejścia światła. Innym ważnym aspektem, który należy wziąć pod uwagę przy korzystaniu z tego modelu okluzji mikrokulek, jest to, że zakres podniesienia ciśnienia wewnątrzgałkowego i późniejszej degeneracji RGC różni się w zależności od wieku i tła genetycznego operowanej myszy [4]. W związku z tym zakres podwyższenia ciśnienia wewnątrzgałkowego i oś czasu degeneracji RGC będą musiały zostać określone dla każdej konkretnej linii myszy transgenicznych i/lub przedziału wiekowego.
Cechą tego modelu jest to, że podwyższone ciśnienie wewnątrzgałkowe powoduje stopniową utratę zgonu RGC w ciągu pierwszych trzech tygodni po wstrzyknięciu mikrogranulek, a znaczny zgon RGC wykrywa się po 3 tygodniach od zabiegu. W związku z tym model ten umożliwia badanie wczesnych i/lub subtelnych zmian, które zachodzą w tej chorobie, przed jawną utratą somy RGC i aksonów. Nie zaobserwowano znaczącego wzrostu śmiertelności z powodu RGC w okresie od 3 do 6 tygodni po indukcji nadciśnienia ocznego. W rzeczywistości utrata somy i aksonów RGC pozostała stabilna na poziomie ~22 - 25% między 3 a 6 tygodniami, pomimo udanego i trwałego podniesienia ciśnienia wewnątrzgałkowego w tych punktach czasowych. Dłuższy czas utrzymywania się ciśnienia wewnątrzgałkowego może być wymagany, aby wystąpiła dodatkowa utrata RGC u myszy C57BL/6, które wydają się być bardziej odporne na uszkodzenia RGC w porównaniu z innymi szczepami myszy. 5 Dodatkowe modyfikacje przedstawionego tutaj protokołu, w tym dostosowanie rozmiaru koralików i dodatkowe wstrzyknięcia, mogą być wymagane do zbadania utraty RGC w późniejszych punktach czasowych. Dlatego nasz protokół jest idealny do badań skoncentrowanych na wczesnych zmianach patofizjologicznych, które korelują z umiarkowaną neurodegeneracją RGC, które są istotne dla wystąpienia i wczesnej progresji jaskry u ludzi.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Autorzy pragną podziękować doktorom Davidowi Calkinsowi (Vanderbilt University) i Jamesowi Morganowi (Cardiff University) za podzielenie się swoją wiedzą i za pomocne rady dotyczące rozwoju tej procedury. Badanie to było wspierane przez granty z Kanadyjskiego Instytutu Badań nad Zdrowiem (ADP). Y.A.I. i N.B. są stypendystami staży podoktorskich w Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQS). N.B. otrzymał stypendium H.H. Jaspera od Groupe de Recherche sur le Système Nerveux Central (GRSNC). A.D.P. jest Chercheur Boursier National FRQS.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Ściągacz | Narishige | PC-10 | |
| Cienkościenne szklane kapilary | World Precision Instruments | TW150F-4 | Kapilara, ma średnicę zewnętrzną 1,5 mm i średnicę wewnętrzną 1,12 mm |
| Mikroskop stereoskopowy | Zeiss | MZ9.5 | Zakres współczynnika powiększenia od 2,5 do 6,0. Mikroskop używany do wytwarzania igieł i chirurgii iniekcji mikrokulek. |
| Przełącznik nożny | Linemaster | T-91-SE | |
| Ostrze ze stali nierdzewnej | Pióro | nr 11 | |
| Ukosowanie mikroelektrod | Science Products | BV-10 | |
| Aerozol do kurzu | Fisher | 23-022-523 | |
| Wodorotlenek sodu | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Vortex | Fisher Scientific | 12-812 | |
| Dynabeads M-450 Epoxy | Life Technologies | 14011 | Koraliki magnetyczne są 4,5 i mikro; m średnicy. Roztwór podstawowy ma stężenie 4 x 108 kulek/ml. Przechowywać w temperaturze 4°C. |
| Rotatory mini-rurek | Fisher Scientific | 05-450-127 | |
| 3 Magnesy ręczne | Geomag | 0,45 Tesli. Magnes służący do przygotowania mikrogranulek i chirurgii iniekcji mikrogranulek. | |
| Pipeta serologiczna 25 ml | Costar | 4489 | |
| Pipeta | Drummond | 4-000-101 | |
| Kaptur biologiczny | Biostad | 377355 | |
| Zrównoważony roztwór soli (BSS) | Alcon | 0065-0800-25 | |
| P1,000 Mikroprobówka | Gilson | F123602 | |
| Microtube 1,5 ml | Sarstedt | 72.690 | |
| P200 Mikropipeta | Gilson | F123601 | |
| 0,2 ml probówka do | PCR Sarstedt | 72737.002 | |
| Ketamina | Substancja kontrolowana | ||
| Ksylazyna | Bayer Healthcare | ||
| Acepromazyna | Vetoquinol | ||
| U-100 Insulina Strzykawka | Becton Dickinson and Company | 329461 | |
| Balance | Ohaus | CS 200 | |
| Buprenorfina | Substancja kontrolowana | ||
| Tropicamid roztwór okulistyczny | Alcon | 0998-0355-15 | 1% Mydriacyl |
| Ręczna pompa mikrostrzykawkowa z cyfrowym wyświetlaczem World | Precision Instruments | DMP | |
| Ręczny mikromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Platforma | Fisher Scientific | 14-673-52 | 8 x 8 cali |
| Waciki chłonne | Kettenbach | 30601 | |
| P20 Mikropipeta | Gilson | F123600 | |
| Kleszcz z tworzywa sztucznego | Euroband | 1001 | Upewnij się, że kleszcz jest plastikowy i ma płaską powierzchnię, aby uniknąć uszkodzenia oka |
| Fluorochinolonowy roztwór okulistyczny | Alcon | Poduszka | |
| grzewcza | Sunbeam | E12107-834 | |
| Tonometr | iCare | TV02 | Tonometr odbicia TONOLAB |
| Paraformaldehyd, Para | Fisher Scientific | T353-500 | |
| Narzędzia | |||
| Mała szczotka | |||
| Roztwór aldehydu glutarowego | Sigma-Aldrich | G7651 | |
| Kakodylan sodu, tryhydrat | Canemco i Marivec | 124-65-2 | |
| Przeciwciało Brn-3a (C-20) | Santa Cruz Biotechnology | sc-31984 | |
| Płytka do hodowli tkankowej, 48 dołków | Falcon | 353078 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Surowica osła | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| Przeciwciało drugorzędowe przeciw kozom IgG (H + L), koniugat Alexa Fluor 594 | Life Technologies | A-11058 | |
| Folia | |||
| Szkiełka mikroskopowe | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Odczynnik przeciw blaknięciu złotego o powolnym blaknięciu | Life Technologies | S36936 | |
| Szkło nakrywkowe | Fisher Scientific | 12-548-5E | |
| Tetroksynek osmu 2% roztwór wodny | Mikroskopia elektronowa Nauki | 3294949 | |
| Embed-812 | Mikroskopia elektronowa Nauki | 14900 | |
| Bezwodnik bursztynowy dodecenylu | Mikroskopia elektronowa Nauki | 13710 | |
| Bezwodnik metylowy nadic | Nauki o mikroskopii elektronowej | 19000 | |
| DMP-30 | Mikroskopia elektronowa | 13600 | |
| Tlenek propylenu | Sigma-Aldrich | 110205-1L | |
| Forma zatapiająca-Dykstra | Mikroskopia elektronowa Nauki | 70907 | |
| Ultramikrotom Porter-Blum | Sorvall | MT-2 | |
| Błękit toluidynowy O (certyfikowana plama biologiczna) | Fisher-Scientific | T161-25 |
Bibliografia
- Quigley, H. A., Broman, A. T. The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020. Br J Ophthalmol. 90, 262-267 (2006).
- Bouhenni, R. A., Dunmire, J., Sewell, A., Edward, D. P. Animal models of glaucoma. J Biomed Biotechnol. 2012, 692609(2012).
- Morrison, J. C., Cepurna Ying Guo, W. O., Johnson, E. C. Pathophysiology of human glaucomatous optic nerve damage: insights from rodent models of glaucoma. Exp Eye Res. 93, 156-164 (2011).
- Bunker, S., et al. Experimental glaucoma induced by ocular injection of magnetic microspheres. J Vis Exp. , (2015).
- Cone, F. E., Gelman, S. E., Son, J. L., Pease, M. E., Quigley, H. A. Differential susceptibility to experimental glaucoma among 3 mouse strains using bead and viscoelastic injection. Exp Eye Res. 91, 415-424 (2010).
- Cone, F. E., et al. The effects of anesthesia, mouse strain and age on intraocular pressure and an improved murine model of experimental glaucoma. Exp Eye Res. 99, 27-35 (2012).
- El-Danaf, R. N., Huberman, A. D. Characteristic patterns of dendritic remodeling in early-stage glaucoma: evidence from genetically identified retinal ganglion cell types. Neuroscience. 35, 2329-2343 (2015).
- Ngumah, Q. C., Buchthal, S. D., Dacheux, R. F. Longitudinal non-invasive proton NMR spectroscopy measurement of vitreous lactate in a rabbit model of ocular hypertension. Exp Eye Res. 83, 390-400 (2006).
- Samsel, P. A., Kisiswa, L., Erichsen, J. T., Cross, S. D., Morgan, J. E. A novel method for the induction of experimental glaucoma using magnetic microspheres. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52, 1671-1675 (2011).
- Sappington, R. M., Carlson, B. J., Crish, S. D., Calkins, D. J. The microbead occlusion model: a paradigm for induced ocular hypertension in rats and mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 207-216 (2010).
- Urcola, J. H., Hernandez, M., Vecino, E. Three experimental glaucoma models in rats: comparison of the effects of intraocular pressure elevation on retinal ganglion cell size and death. Exp Eye Res. 83, 429-437 (2006).
- Weber, A. J., Zelenak, D. Experimental glaucoma in the primate induced by latex microspheres. J neuroscience meth. 111, 39-48 (2001).
- Ho, L. C., et al. In vivo assessment of aqueous humor dynamics upon chronic ocular hypertension and hypotensive drug treatment using gadolinium-enhanced MRI. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 3747-3757 (2014).
- Yang, Q., et al. Microbead-induced ocular hypertensive mouse model for screening and testing of aqueous production suppressants for glaucoma. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 3733-3741 (2012).
- Gallego, B. I., et al. IOP induces upregulation of GFAP and MHC-II and microglia reactivity in mice retina contralateral to experimental glaucoma. J neuroinflammation. 9, 92(2012).
- Rojas, B., et al. Microglia in mouse retina contralateral to experimental glaucoma exhibit multiple signs of activation in all retinal layers. J neuroinflammation. 11, 133(2014).
- Nadal-Nicolas, F. M., et al. Brn3a as a marker of retinal ganglion cells: qualitative and quantitative time course studies in naive and optic nerve-injured retinas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 3860-3868 (2009).
- Morquette, B., et al. REDD2-mediated inhibition of mTOR promotes dendrite retraction induced by axonal injury. Cell Death Differ. 22, 612-625 (2015).
- Almasieh, M., Zhou, Y., Kelly, M. E., Casanova, C., Di Polo, A. Structural and functional neuroprotection in glaucoma: role of galantamine-mediated activation of muscarinic acetylcholine receptors. Cell Death Dis. 1, 27(2010).
Przedruki i uprawnienia
