Ilościowa glikomika i proteomika połączone ze strategią oczyszczania

Podsumowanie

Protokół o wysokiej przepustowości został opracowany dla połączonego oczyszczania proteomiki i glikomiki oraz kwantyfikacji LC-MS/MS w osoczu. Analiza deamidacji motywów glikozylacji sprzężonych z N była specyficzna dla miejsc deglikozylowanych. Dokładne oznaczanie ilościowe N-glikanów osiągnięto poprzez sprzężenie separacji N-glikanów wspomaganej filtrem z normalizacją indywidualności podczas znakowania strategią znaczników hydrazydu glikanów.

Streszczenie

W naukach biologicznych i klinicznych rośnie pragnienie integracji i korelacji wielu klas biomolekuł, aby rozwikłać biologię, zdefiniować ścieżki, poprawić leczenie, zrozumieć choroby i pomóc w odkrywaniu biomarkerów. Glikozylacja sprzężona z azotem jest jedną z najważniejszych i najbardziej niezawodnych modyfikacji potranslacyjnych białek i reguluje krytyczne funkcje komórki, takie jak sygnalizacja, adhezja i funkcja enzymatyczna. Techniki analityczne do oczyszczania i analizy N-glikanów pozostały stosunkowo statyczne w ciągu ostatniej dekady. Chociaż są dokładne i skuteczne, zwykle wymagają znacznej wiedzy specjalistycznej i zasobów. Chociaż opracowano pewne wysokoprzepustowe schematy oczyszczania, nie znalazły one jeszcze powszechnego zastosowania i często opierają się na wzbogacaniu glikopeptydów. Jedna z obiecujących metod, opracowana przez Thomasa-Oatesa i wsp., Filter Aided N-glycan separation (FANGS), została jakościowo zademonstrowana na tkankach. W tym miejscu dostosowaliśmy FANGS do osocza i połączyliśmy je z normalizacją indywidualności podczas znakowania strategią znaczników hydrazydu glikanu, aby osiągnąć dokładną względną kwantyfikację za pomocą chromatografii cieczowej spektrometrii mas i wzmocnionej jonizacji elektronrozpylania. Ponadto zaprojektowaliśmy nową funkcjonalność protokołu, uzyskując tandem, proteomikę typu shotgun i analizę miejsca glikozylacji na osoczu kury. Wykazaliśmy, że N-glikany oczyszczone na filtrze i derywatyzowane za pomocą hydrofobowych znaczników hydrazydowych były porównywalne pod względem obfitości i klasy do tych przez ekstrakcję do fazy stałej (SPE); Ten ostatni jest uważany za złoty standard w tej dziedzinie. Co ważne, zmienność w obu protokołach nie różniła się statystycznie. Dane proteomiczne, które zostały zebrane zgodnie z danymi glikomicznymi, miały taką samą głębokość w porównaniu ze standardowym trawieniem trypsyny. Deamidacja peptydów jest zminimalizowana w protokole, ograniczając niespecyficzną deamidację wykrywaną na motywach glikozylacji. Pozwoliło to na bezpośrednią analizę miejsca glikozylacji, chociaż protokół może również uwzględniać znakowanie miejsca ¹⁸O. Ogólnie rzecz biorąc, zademonstrowaliśmy nowy, wysokoprzepustowy, bezstronny, oparty na filtrach protokół do ilościowej analizy glikomicznej i proteomicznej.

Wprowadzenie

W dziedzinie proteomiki, preparat próbek wspomagany filtrem (FASP) został szeroko przyjęty ze względu na jego zdolność do minimalizacji ilości materiału wyjściowego, zmniejszenia artefaktów przygotowania próbki i maksymalizacji przepustowości próbki¹. Jednak taka metoda jeszcze się nie pojawiła i nie zyskała popularności w dziedzinie glikomiksu. Opracowanie wysokoprzepustowych, ilościowych przepływów pracy jest konieczne ze względu na integralną rolę glikozylacji w obronie biologicznej i jej modulacji przez raka lub choroby^2,3. U ssaków N-glikany składają się z powtarzających się jednostek sacharydowych (heksozy (Hex), heksozaminy (HexNac), kwasy sjalowe (NeuAc) i fukozy (Fuc)), które zdobią strukturę rdzenia (Hex₃HexNac₂)⁴ kowalencyjnie związaną z asparaginą. Chociaż glikoprzestrzeń jest znacznie duża, gdy liczy się izomery (>10¹²), jest dość mała na podstawie składu, a masy cząsteczkowe zwykle wahają się od 1,000-8,000 Da⁵. Jednorodność składu klasy i hydrofilowość glikanów stanowią wyjątkowe wyzwanie dla procesów oczyszczania, separacji i spektrometrii mas (MS)⁶.

Tradycyjnie, N-glikany są trawione z białek lub peptydów przez peptyd-N-glikozydazę F (PNGase F), a następnie wzbogacane przez chromatografię powinowactwa lektyny⁷, wychwytywane przez kulki hydrazydowe⁸ lub oczyszczane przez ekstrakcję do fazy stałej (SPE)^9,10. Chociaż wszystkie te metody są bardzo skuteczne, wprowadzają dodatkowe etapy odsalania i ograniczają liczbę próbek przetwarzanych jednocześnie. W ciągu ostatniej dekady zaproponowano szereg wysokoprzepustowych platform dla glikomiksów. Kim i in. opublikowali półautomatyczną metodę wykorzystującą sterowaną próżniowo, SPE 96-dołkową płytkę¹¹. Alternatywnie, grupa Manna opracowała metodę filtra powinowactwa (N-gliko-FASP), która wymagała wstępnej derywatyzacji filtra za pomocą kompozytu lektyn¹². Wreszcie, grupa Thomasa-Oatesa zaproponowała metodę półilościową, Filter Aided N-Glycan Separation (FANGS), która wykorzystuje wąski rozmiar składu glikoprzestrzeni¹³. Opierając się na filtrach odcinających masę cząsteczkową, małe zanieczyszczenia zostały najpierw wypłukane na odpady, a następnie N-glikany zostały strawione i wymyte. Deglikozylowane białka pozostają na filtrze w tym protokole i mogą być poddane FASP in-line.

Identyfikacja i kwantyfikacja glikanów metodą jonizacji elektrorozpylania (ESI) MS wymaga separacji off-line dla (częściowej) rozdzielczości izomerów i derywatyzacji w celu wykrycia gatunków o niskiej liczebności. Znakowanie w indywidualności podczas normalizacji za pomocą strategii znaczników hydrazydu glikanu zapewnia zgodność z chromatografią cieczową z odwróconymi fazami (RPLC)^14,15. Znacznik hydrofobowy 4-fenetylobenzohydrazydu (P2PGN) pośredniczy w hydrofilowości glikanów, zwiększając jonizację średnio czterokrotnie¹⁶. Chociaż inne techniki, takie jak permetylacja¹⁷ lub chemia znakowania reagującego na aminy¹⁸, oferują podobne korzyści, w reakcji hydrazydowej glikany reagują stechiometrycznie 1:1 w łatwych warunkach. Względną kwantyfikację uzyskuje się przez analizę tandemową próbek derywatyzowanych za pomocą natywnych (NAT) lub ¹³znaczników izotopów stabilnych C₆ (SIL).

Poniższa metoda rozwija FANGS do zastosowań plazmowych i łączy je ze znacznikiem hydrofobowym P2GPN w celu dokładnej względnej kwantyfikacji. Co więcej, zaprojektowano go do przeprowadzania proteomiki metodą shotgun, profilowania deamidacyjnego i ilościowego glikomika na pojedynczej podwielokrotności próbki, bez naruszania integralności analiz.

Protokół

1. Denaturacja i alkilowanie białek i glikoprotein

1. W przypadku preparatów wzorcowych załadować 2,5 μl roztworu glikoproteiny (np. fetuiny lub RNazy B) o stężeniu 0,1 μg/μl) do filtra odcinającego o masie cząsteczkowej (MW) o masie cząsteczkowej 30 kDa lub 10 kDa.
   1. W przypadku biologicznych próbek osocza należy sprawdzić stężenie białka za pomocą standardowego testu białkowego Bradford¹⁹ lub kwasu bicinchoninowego²⁰ (BCA). Rozcieńczyć osocze, jeśli to konieczne, 100 mM wodorowęglanem amonu (NH₄HCO₃) w H₂O (bufor trawienny PNGazy) o pH ~ 7 do zawartości 10-100 mg / ml białka całkowitego. Załaduj 2,5 μl osocza (25-250 μg białka) na filtr.
      Uwaga: Protokół ten został przetestowany wyłącznie na osoczu z próbek krwi pobranych w obecności kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA).
2. Dodać 2 μl 1 M roztworu ditiotreitolu (DTT) do każdej próbki w filtrze.
3. Rozcieńczyć próbkę 200 μl buforu do trawienia PNGazy.
4. Zakryj rurkę z próbką filtra i lekko przekręć wiry, uważając, aby nie zakłócić pracy filtra z jego gniazda. Inkubować próbkę w temperaturze 56 °C przez 30 minut w celu denaturacji białek i glikoprotein.
5. Aby alkilować próbki, dodać 50 μl 1 M jodoacetamidu, aby uzyskać końcowe stężenie ~200 mM i inkubować w temperaturze 37 °C przez 60 min.
   UWAGA: Jeśli analiza proteomiczna nie jest pożądana, krok 1.5 można pominąć.
6. Skoncentrować zdenaturowaną glikoproteinę na filtrze, odwirowując próbki o masie 14 000 x g przez 40 minut.

2. Trawienie enzymatyczne glikanów sprzężonych z N

1. Przemyć próbkę 100 μl buforu do trawienia PNGazy. Skoncentrować glikoproteinę na filtrze o sile 14 000 x g przez 20 minut i przelać przepływ.
   1. Powtórzyć etap płukania i koncentratu dwukrotnie, w sumie trzy razy, uzyskując koncentrat w martwej objętości filtra (~5 μl). Odrzuć cały przepływ.
   2. Wyrzuć fiolkę zbiorczą po zakończeniu mycia. Zbierz wszystkie przyszłe eluenty i płyny do płukania w nowej fiolce do zbierania.
      UWAGA: Bufor trawienny PNGazy w H₂¹⁸O może być używany podczas etapu mineralizacji PNGazy F do znakowania stabilnymi izotopami odglikozylowanych miejsc asparaginy, które ulegają chemicznej deamidacji.
2. Dodać 2 μl PNGazy F bez glicerolu (75 000 x jednostek/ml) do filtrowania po przeniesieniu do świeżej fiolki do pobrania. Dodać 98 μl buforu mineralizującego PNGazy, zwiększając całkowitą objętość do 100 μl, i delikatnie pipetować w górę i w dół na filtrze, aby wymieszać. Enzymatyczne trawienie glikanów w warunkach określonych w krokach 2.2.1, 2.2.2 LUB 2.2.3.
   UWAGA: Można stosować trzy metody deglikozylacji białek. W przypadku wyłącznie analizy glikomicznej (bez proteomiki) zalecana jest długa inkubacja opisana w kroku 2.2.1. W przypadku badań glikomicznych i proteomicznych, kroki 2.2.2 i 2.2.3 pozwolą na uzyskanie wysokiej jakości peptydów przy minimalnej niespecyficznej deamidacji.
   1. Protokół trawienia tylko glikomiksowego (18 godzin): Inkubować próbki w temperaturze 37 °C przez 18 godzin, aby enzymatycznie rozszczepić wszystkie N-glikany.
   2. Protokół mineralizacji Spike-in (SPI): Próbki należy inkubować w temperaturze 50 °C przez 2 godziny. Działając szybko, usuń próbki i dodaj dodatkowe 2 μl wolnej od glicerolu PNGazy F (75 000 x jednostki/ml). Lekko wirować próbki przez 1-2 sekundy, aby wymieszać. Próbki należy inkubować w temperaturze 50 °C przez dodatkowe 2 godziny.
   3. Protokół roztwarzania mikrofalowego (MD): Umieść próbki w pływającym stojaku na probówkę do mikrowirówek. Próbki należy umieścić na wodzie w zlewce o pojemności 1 litra wypełnionej 1 litrem wody dejonizowanej (DI). Umieść zlewkę na środku kuchenki mikrofalowej (950 W) z obrotową płytą. Kuchenka mikrofalowa o mocy 60% (570 W) przez 5 min. Aby ostygnąć, wyjmij próbki i przytrzymaj w temperaturze pokojowej przez 2 minuty. Następnie podgrzewaj w kuchence mikrofalowej przez dodatkowe 5 minut przy 60% mocy.
      UWAGA: Ustawienia mocy mikrofal będą musiały być dostosowane w oparciu o maksymalną moc wyjściową kuchenki mikrofalowej. Średnia moc powinna być utrzymywana na stałym poziomie między modelami.

3. Elucja N-glikanów

1. Eluować glikany przez odwirowanie próbki w temperaturze 14 000 x g przez 20 minut w temperaturze 20 °C.
2. Dodać 100 μl buforu trawiącego PNGazy do filtra i odwirować przy 14 000 x g przez 20 minut w temperaturze 20 °C. Zebrać płuczkę zawierającą pozostały glikan związany z N w tej samej fiolce zbiorczej co eluent. Powtórz dwa razy. Wyjmij filtr i umieść w nowej fiolce do pobierania.
3. Próbki glikanów inkubować w zamrażarce o temperaturze -80 °C aż do zamrożenia (30–60 min). Suszyć do końca, w temperaturze pokojowej, w koncentratorze próżniowym (4-6 godzin).
   UWAGA: N-glikany mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C przez okres do sześciu miesięcy przed derywatyzacją.

4. Trawienie FASP białka

UWAGA: Jeśli proteomika lub analiza miejsca deamidacji nie jest pożądana, sekcja 4 protokołu może zostać pominięta.

1. Przepłukać filtr zawierający zdeamidowane peptydy 400 μl 8 M buforu mocznikowego. Zakryć fiolkę zbiorczą i lekko wymieszać, aby wymieszać. Skoncentruj się na filtrze o sile 14 000 x g przez 15 minut. Odrzuć cały przepływ.
   1. Powtórz krok 4.1 jeszcze dwa razy, co daje w sumie trzy płukania buforem mocznikowym.
2. Przepłukać filtr zawierający deamidowane peptydy 400 μl 2 M mocznika, 10 mM buforu CaCl₂ (bufor do trawienia trypsyny). Zakryć fiolkę zbiorczą i lekko wymieszać, aby wymieszać. Skoncentruj się na filtrze o sile 14 000 x g przez 15 minut. Odrzuć cały przepływ.
   1. Powtórzyć krok 4.1 jeszcze dwa razy, co daje w sumie trzy płukania buforu do trawienia trypsyny.
   2. Wyrzuć fiolkę zbiorczą po zakończeniu mycia. Zbierz wszystkie przyszłe eluenty i płyny do płukania w nowej fiolce do zbierania.
3. Dodać 50 μl trypsyny modyfikowanej świnią w stosunku 1:50 lub 1:5 trypsyna do białka (w/w) w celu odkrycia lub ilościowych eksperymentów proteomicznych. Zakryć fiolkę zbiorczą i lekko wymieszać, aby wymieszać.
4. Próbki należy inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 godziny. Pracując szybko, usunąć próbki i dodać dodatkowe 50 μl trypsyny w stosunku 1:50 lub 1:5 trypsyna do białka. Lekko wirować próbki przez 1-2 sekundy, aby wymieszać. Próbki należy inkubować w temperaturze 50 °C przez dodatkowe 2 godziny.
5. Eluuj peptydy, wirując z prędkością 14 000 x g przez 15 minut.
6. Pozostałe peptydy wypłukać z filtra 400 μl 1% kwasu mrówkowego i 0,001% Zwittergent 3-16 (bufor gaszący). Eluować z filtra, wirując z prędkością 14 000 x g przez 15 minut.
7. Określić ilościowo stężenie peptydu w próbkach za pomocą testu Bradforda¹⁹ lub testu BCA²⁰.
8. Próbki peptydów inkubować w zamrażarce o temperaturze -80 °C do momentu zamrożenia (30–60 min). Suszyć do końca, w temperaturze pokojowej, w koncentratorze próżniowym (4-6 godzin).
   UWAGA: Wysuszone peptydy można przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do trzech miesięcy.
9. Zawiesić białka tryptyczne tuż przed analizą chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (LC-MS) w 2% acetonitrylu, 98%_H2Oi 0,1% kwasie mrówkowym (faza ruchoma A) do pożądanego stężenia. Stężenia peptydów tryptycznych od 2,5 μl osocza wahają się od 100 - 300 ng/μl.

5. Derywatyzacja glikanów sprzężonych z N za pomocą hydrofobowych znaczników hydrazydowych

1. Rozpuść wysuszone ciężkie (SIL) lub lekkie (NAT) odczynniki P2GPN w 1 ml 75:25 MeOH:Acetic Acid (roztwór derywatyzacyjny), do końcowego stężenia 0,25 mg/ml. Odczynniki potrzebują do 10 minut, aby w pełni się rozpuścić. Intensywnie wirować, aby zapewnić całkowitą rozpuszczalność.
   Uwaga: W przypadku, gdy ten protokół derywatyzacji jest stosowany ze standardowymi N-glikanami w porównaniu z glikanami oczyszczonymi, stosunek molowy P2GPN: glikan powinien wynosić w przybliżeniu (i nie mniej) niż 17: 1.
2. Wysuszone N-glikany oznaczyć 200 μl (50 μg) odczynnika SIL lub NAT P2GPN. Pipetuj w górę i w dół, aby ponownie zawiesić wysuszone glikany. Wiruj próbki, a następnie wiruj próbki przez ~ 5 sekund na wirówce stołowej.
3. Glikany reagować z odczynnikiem przez 3 godziny w temperaturze 56 °C.
4. Natychmiast przenieś glikany z inkubatora do koncentratora próżniowego. Suszyć do końca w temperaturze 55 °C (3-5 godz.).
   UWAGA: Ten etap wygasza reakcję derywatyzacji; Próbka musi być całkowicie sucha, aby zapobiec reaktywności krzyżowej w kolejnych etapach.
   UWAGA: Wysuszone, oznakowane próbki można przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do sześciu miesięcy.
5. Ponownie zawiesić znakowane N-glikany w 25-50 μl_H2Otuż przed analizą LC-MS. Pipetuj w górę i w dół, aby upewnić się, że N-glikany są w pełni rozpuszczone.
   UWAGA: Objętość do ponownego zaparzenia zależy od początkowego stężenia glikoproteiny, które można oszacować na podstawie wyjściowego stężenia białka. Jednak zakres będzie się różnił w zależności od typu próbki i powinien być indywidualnie zoptymalizowany.
6. Odwirować próbki o masie 14 000 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant, uważając, aby końcówka pipety nie dotknęła dna probówki wirówkowej.
   Uwaga: Nadmiar znacznika może nie być widoczny gołym okiem, ale zostanie zmniejszony przez odwirowanie.
7. Połączyć parę próbek NAT i SIL, jeśli jest to pożądane w celu względnej oceny ilościowej, w stosunku 1:1 do analizy tandemowej.

6. Ultra-wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa i analiza spektrometrii mas

UWAGA: Warunki LC i MS opisane odpowiednio dla Easy nLC-1000 i Q Exactive High Field, zostały zoptymalizowane wewnętrznie dla analizy proteomicznej i analizy glikanów²¹. Warunki te mogą być dostosowane do innych ultrawysokociśnieniowych lub nano-LC systemów i innych spektrometrów masowych o wysokiej zdolności rozdzielczej, ale mogą wymagać niewielkich modyfikacji. Zastosowanie spektrometrii mas o wysokiej zdolności rozdzielczej jest niezbędne do identyfikacji glikanów i analizy deamidacji^22,23.

UWAGA: Kroki 6.1-6.3 można pominąć, jeśli stosuje się odpowiednią chromatografię z odwróconą fazą lub komercyjną pułapkę i kolumnę interakcji hydrofilowej.

1. Zsyntetyzować frytę w kapilarze ID 100 μM według Meiringa i wsp.²⁴ do stosowania jako pułapka.
2. Zapakuj pułapkę pod ciśnieniem w materiał opakowaniowy 2,6 μM, 100 A, C₁₈ i przyciąć na długość 5 cm.
3. Zapakuj kolumnę emitera ID 75 μM pod ciśnieniem z materiałem opakowaniowym 2,6 μM, 100 A, C₁₈ i przyciąć na długość 30 cm.
4. Przygotuj dwie różne metody LC-MS dla przepływów pracy związanych z proteomiką (6.4.1) i glikomiką (6.4.2).
   Uwaga: Próbki białek i glikanów mogą być badane na tym samym układzie pułapka/kolumna w dowolnej kolejności.
   1. W celu analizy białka wstrzyknij ~ 400 ng białka do kolumny w ruchomej fazie A (MPA). Badać próbkę przy prędkości 300 nl/min, zgodnie z tabelą 1, przy równowadze 1 μl kolumny wstępnej (500 barów) i równowadze 5 μl kolumny analitycznej (500 barów). Jonizować białka w warunkach MS podanych w tabeli 2.
   2. W celu analizy glikanów wstrzyknąć do kolumny 5 μl ponownie zawieszonych, oznaczonych P2GPN próbek równomolowych NAT/SIL. Badać próbkę z prędkością 300 nl/min, zgodnie z tabelą 3, przy równowadze 2 μl kolumny wstępnej (500 barów) i równowadze 5 μl kolumny analitycznej (500 barów). Jonizować glikany w warunkach MS podanych w tabeli 4.

) szt. Rozdział Rozdział Rozdział szt. szt. szt.

Godzina	%MPA (liczba miesięcy zamkniętych	%MPB (Biblioteka MPB)
0	100	0
5	Rozdział 98	cyfra arabska
105	Rozdział 80	20
135 Rozdział 135	68	Rozdział 32
136	5	95 Rozdział 95
151	5	95 Rozdział 95
152 Rozdział 152	100	0
Rozdział 167	100	0

Tabela 1. Warunki LC dla analizy proteomicznej. Przeprowadzono elucję gradientową z ruchomą fazą B (MPB, 98% acetonitryl, 2%_H2O, 0,1% kwas mrówkowy) w celu elucji peptydów do proteomiki strzelbowej, akwizycji zależnej od danych, eksperymentów MS.

TGL szt. Rozdział szt. osób . do

MS1 Parametry
Zakres masy (Th)	Rejon: 375-1500
rezolucja	120 000
Agc	1 ×10 6
Maksymalny czas jonizacji	Rozdział 30
Poziom FR obiektywu S	55
Temperatura kapilary (°C)	300
Napięcie natryskiwania	Pytanie 1,75
Parametry MS2
Rodzaj nabycia	Najlepsze 20
rezolucja	15 000
Agc	1 × 105
Maksymalny czas jonizacji	Rozdział 30
Współczynnik niedopełnienia	2 proc
Okno izolacyjne (Th)	1.4
Wykluczenie stanu opłaty	+1
Znormalizowana energia zderzenia	27 Rozdział 27
Czas wykluczenia (s)	20

Tabela 2: Warunki MS dla analizy proteomicznej. Podano parametry jonizacji elektronrozpylacyjnej, akwizycji MS¹ i akwizycji MS² w instrumencie orbitrap wykorzystującym dysocjację o wyższej energii (HCD).

) Rozdział Rozdział Rozdział Rozdział Rozdział

Godzina	%MPA (liczba miesięcy zamkniętych	%MPB (Biblioteka MPB)
0	95 Rozdział 95	5
1	70	Rozdział 30
Rozdział 41	60	Rozdział 40
Rozdział 46	37	Rozdział 63
Rozdział 47	10	90
55	10	90
56 Rozdział 56	95 Rozdział 95	5
Rozdział 66	95 Rozdział 95	5

Tabela 3: Warunki LC do analizy glikanów. Przeprowadzono elucję gradientową w celu elucji N-glikanów znakowanych hydrazydem do analizy MS.

szt. osób Rozdział osób szt. . Rozdział

MS1 Parametry
Zakres masy (Th)	600-1900
rezolucja	60 000
Agc	5 × 105
Maksymalny czas jonizacji	Rozdział 64
Poziom FR obiektywu S	65
Temperatura kapilary (°C)	Rozdział 325
Napięcie natryskiwania	Pytanie 1,75
Parametry MS2
Rodzaj nabycia	Najlepsze 12
rezolucja	15 000
Agc	5 × 104
Maksymalny czas jonizacji	100
Współczynnik niedopełnienia	1 proc
Okno izolacyjne (Th)	1.4
Stała pierwsza masa	125
Stopniowa znormalizowana energia zderzenia	20.10.30
Czas wykluczenia (s)	15

Tabela 4: Warunki MS dla analizy N-glikanu znakowanego hydrazydem. Podano parametry jonizacji elektronrozpylacyjnej, akwizycji MS¹ i akwizycji MS² w instrumencie orbitrap wykorzystującym dysocjację o wyższej energii (HCD).

7. Proteomika i analiza deamidacji

1. Identyfikuj białka/peptydy za pomocą standardowych narzędzi wyszukiwania bioinformatycznego.
   Uwaga: Poniższy protokół analizy został opracowany przy użyciu baz danych Swiss-Prot/TrEMBL w UniprotKB i wyszukiwania za pomocą SEQUEST w oprogramowaniu Proteome Discoverer 1.4, jednak protokół może być bezpośrednio przetłumaczony na dowolny silnik wyszukiwania i oceniania białek za pomocą oprogramowania GUI. Wszystkie poniższe polecenia są dostępne w interfejsach oprogramowania za pośrednictwem menu rozwijanych.
   1. Utwórz lub pobierz bazę danych sekwencji białek odpowiednich dla organizmu z danych genomicznych lub dostępnych baz danych proteomów, zgodnie z opisem Apweiler i wsp.²⁵
      Uwaga: Typowe bazy danych proteomu obejmują Swiss-Prot, TrEMBL i NCBI, ale mogą być również zbudowane na podstawie danych wewnętrznych.
   2. W oprogramowaniu wybierz wyszukiwarkę bazy danych i wybierz parametry zgodnie z jakością pozyskanych danych i pożądanym rygoryzmem wyszukiwania, zgodnie z opisem Perkinsa i wsp. dla MASCOT²⁶ lub Eng i wsp. dla SEQUEST²⁷.
      1. W przypadku danych o dużej dokładności masy, ustaw parametry wyszukiwania w oprogramowaniu w następujący sposób: max 2 pominięte rozszczepienia, tolerancja masy prekursora 5 ppm i tolerancja masy fragmentu 0,02 Da (dla zoptymalizowanego dokładnego wykrywania deamidacji²²) i uwzględnij następujące modyfikacje peptydu tryptycznego: modyfikację statyczną "karbamidometylu (C)" oraz modyfikacje dynamiczne "deamidacji (N/Q)" i "utleniania (M)". W przypadku stosowania etykietowania ^{trawienia 18}O, należy dołączyć "deamidacja ¹⁸O(1)" jako dodatkową modyfikację dynamiczną.
      2. Przeszukać, korzystając z wybranego silnika, surowe dane peptydowe w bazie danych białek (7.1.1).
         Uwaga: Tolerancje masy powinny być odpowiednie dla używanego przyrządu i nie powinny być dowolnie niskie.
         Uwaga: Funkcja wyszukiwania jest wykonywana automatycznie przez oprogramowanie przy użyciu różnych algorytmów specyficznych dla wyszukiwarki. Algorytm perkolatora (MASCOT), SEQUEST lub inne kombinacje algorytmów są wykorzystywane do identyfikacji białek z peptydów i oceny ważności trafień; Więcej informacji na temat dostępnych narzędzi znajduje się w przeglądzie przeprowadzonym przez Gonzalez-Galarza i wsp. ^28,29. W zależności od oprogramowania może być konieczne wybranie dodatkowych parametrów wyszukiwania według uznania użytkownika.
   3. Eksportuj zidentyfikowane peptydy w celu ręcznego kuratorowania i dalszej analizy.
2. Ręcznie przygotuj listę peptydów zawierających zidentyfikowaną deamidację na asparaginie motywu glikozylacji sprzężonej z N (N-X-(S / T), gdzie X ≠ P). Przeprowadź walidację krzyżową tych miejsc ze znanymi motywami glikozylacji z literatury i utwórz dwie pule wyników (zwalidowane i teoretyczne).
3. Użyj zliczania spektralnego³⁰, aby porównać procentowe obłożenie danego miejsca glikozylacji, porównując obfitość form deamidowanych i niedeamidowanych.

8. Względna ocena ilościowa glikanów

Uwaga: Poniższa identyfikacja i kwantyfikacja zostały przeprowadzone przy użyciu oprogramowania XCalibur. Można jednak zastąpić je dowolnym oprogramowaniem, które analizuje surowe dane i automatycznie integruje piki chromatograficzne.

1. Wygeneruj teoretyczną listę kompozycji glikanów z biologicznie możliwych kombinacji heksoz, deoksy-heksoz, heksozaminy, kwasów sjalowych i innych sacharydów. W tym celu Walker i wsp. opublikowali bazę danych glikanów ludzkich.¹⁵ i mogą być używane w stanie, w jakim się znajdują. W przypadku teoretycznych baz danych na przestrzeń kombinatoryczną muszą być nałożone specyficzne dla gatunku ograniczenia biologiczne, a zasady te zostały opisane przez Kronewittera i wsp.^{Lokal mieszkalny 31}.
2. Obliczyć masy monoizotopowe glikanów (M) z mas atomowych dla każdego składu dla stanów ładunku protonów +1-3. Zmodyfikuj masy monoizotopowe, aby uwzględnić dodanie znacznika P2GPN NAT (254.14191 g/mol) lub SIL (260.162042 g/mol).
3. Otwórz program "Processing Setup" z widoku mapy drogowej w XCalibur. Ustaw metodę przetwarzania zgodnie z dokładnym opisem w materiale uzupełniającym od Walkera i wsp. ¹⁵ przy użyciu listy wygenerowanej w kroku 8.2 zawierającej teoretyczne masy monoizotopowe dla gatunków [M+H]¹⁺, [M+2H]²⁺ i [M+3H]³⁺.
   Uwaga: Aby potwierdzić tożsamość glikanu poza dokładną masą, w przypadku serii dupleksowych NAT/SIL należy sprawdzić, czy pary NAT i N-glikanu SIL koeluują się z tym samym czasem retencji. Jakościowo, krzyżowo walidować identyfikacje za pomocą widm MS², które muszą zawierać piki należące do serii jonów oksonium³².
4. Wyeksportuj zintegrowane, wyekstrahowane obszary chromatogramu jonowego (XIC) do programu Excel, aby uzyskać obfitość SIL i NAT, jak dokładnie opisano w materiale uzupełniającym od Walkera i wsp. ¹⁵
5. W programie Excel zaprogramuj komórki w nowej kolumnie, aby obliczyć poprawkę na nakładanie się masy cząsteczkowej, dostosowując obfitość SIL zgodnie z równaniem opublikowanym przez Walkera i wsp.¹⁵:
   ,
   gdzie A jest pikiem monoizotopowym, a teoretyczne nakładanie się izotopów, , mogą być obliczane niezależnie dla każdego składu.
6. W drugiej kolumnie zaprogramuj komórki tak, aby normalizowały kanały NAT i SIL za pomocą równania dla całkowitego znormalizowanego czynnika glikanowego (TGNF) na widmo, jak opisano przez Walkera i wsp.¹⁵:
   ,
   gdzie N jest liczbą N-glikanów powyżej granicy oznaczalności.
7. W nowej kolumnie zaprogramuj komórki tak, aby przyjmowały stosunek glikanów SIL: NAT (lub odwrotnie) w celu obliczenia zmiany stężenia między dwiema próbkami.

Wyniki

Rysunek 1: Podano schemat metody sprzężonego z hydrofobowym znakowaniem FANGS-P2GPN (metoda A) dla połączonej analizy proteomicznej i glikomiksowej. Podkreślono etapy, które różnią się między przetwarzaniem wyłącznie glikomicznym a tandemową analizą glikomiczną i proteomiczną, z identyfikacją miejsca glikozylacji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Metoda hydrofobowego znakowania P2GPN oparta na filtrach (Metoda A) została zweryfikowana pod kątem identyfikacji, kwantyfikacji i odchylenia masy cząsteczkowej przy użyciu zbiorczych próbek osocza kur (Rysunek 1). Wyłącznie dla eksperymentów glikomicznych dokonano porównań obfitości N-glikanów ekstrahowanych metodą A z karbografem SPE (złoty standard, metoda B) (ryc. 2). Nie stwierdzono istotnych różnic w obfitości glikanów między obiema metodami. Zmienność wewnętrzną oceniono również poprzez ilościowe określenie stosunku SIL: NAT glikanów ekstrahowanych tą samą metodą. Rozkłady logarytmu₂ obu metod były gaussowskie, wyśrodkowane na zero i nie różniły się znacząco (rysunek 3A-B). Zakresy masy cząsteczkowej między tymi dwoma protokołami całkowicie się pokrywały, co sugeruje, że filtr nie dyskryminował N-glikanów na podstawie zakresu masy cząsteczkowej i hydrofilowości (ryc. 4).

Rysunek 2: Równomolową mieszaninę N-glikanów NAT i SIL ekstrahowaną metodą A lub metodą B przygotowano z 2,5 μl osocza kurzego (N = 4). Próbki analizowano za pomocą UPLC-MS zgodnie z zalecanymi parametrami sugerowanymi w punkcie 6. Obfitość dla każdego glikanu, w każdym kanale NAT/SIL, obliczono poprzez całkowanie obszaru pod ekstrahowanym chromatogramem jonowym (MMA = 3 ppm), skorygowanie o nakładanie się masy cząsteczkowej i dostosowanie przez TGNF. Współczynniki te są wyświetlane z ich błędami standardowymi. Obfitość N-glikanów Metody B: Metody A nie różniła się istotnie (p >0,05). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Porównano zmienność wewnątrzczłonkowską w strategiach (A) metody A (N = 133) lub (B) metody B (N = 123). Równomolowe mieszaniny N-glikanów NAT i SIL, pochodzące z tego samego schematu ekstrakcji, analizowano na trzech kontrpróbach technicznych. Rozkłady logarytmu₂ były wyśrodkowane na zero i nie różniły się znacząco między tymi dwoma przepływami pracy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Porównano zakresy masy cząsteczkowej glikanów z każdej strategii. W wyniku tych dwóch procesów uzyskano glikany o tym samym zakresie masy cząsteczkowej. N-glikany wykryte w jednym protokole w porównaniu z drugim spadły tuż powyżej granicy wykrywalności (liczebność 1 ×^{10 5}) i nie odzwierciedlają systematycznego błędu systematycznego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Zatrzymanie zdeglikozylowanych białek przez filtr masy cząsteczkowej umożliwiło analizę całego proteomu inline i identyfikację miejsca glikozylacji. Porównano wiele protokołów łącznego oczyszczania glikanów i białek z tradycyjnym preparatem FASP bez deglikozylacji (Tabela 5). Nasze typowe 18-godzinne trawienie PNGazy F oparte na filtrze, a następnie trawienie trypsyny FASP (protokół Std) spowodowało znaczny poziom niespecyficznej deamidacji, co może zakłócać identyfikację glikozytów. W związku z tym zbadano metodę wykorzystującą krótszy czas inkubacji w podwyższonej temperaturze (50 °C) i etap skoku PNGazy F (protokół SPI) jako alternatywę, wraz z protokołem trawienia mikrofalowego (protokół MD), w celu zminimalizowania nieswoistej deamidacji. Glikany zaobserwowane w nowych metodach trawienia nie różniły się znacząco składem ani obfitością od standardowego trawienia PNGazy F przez filtr przez 18 godzin w temperaturze 37 °C (Figura 5). W połączeniu z krótką inkubacją trypsyny, nieswoista deamidacja została znacznie zmniejszona, z fałszywie dodatnim odsetkiem glikozytów <5% (Tabela 5).

.

		Białka					peptydy					Peptydy zdeamidowane					Glikozyty					Glikoproteiny
		+		-			+		-			+		-			+		-			+		-
FASP				249					3083					795					5					5
18godz		217		304			6013		5086			1029		733			257		24			112		18
MD		270		266			5190		5125			465		455			254		8			102		7
SPI		281		288			4729		4482			602		573			232		10			145		8

Tabela 5: Dokonano porównań danych proteomicznych ze standardowego trawienia trypsyny z metodą znakowania IN-line FANGS-P2GPN. Preparaty prowadzono z (+) i bez (-) PNGazy F w celu określenia częstości tła nieswoistej deamidacji i oszacowania częstości fałszywie dodatnich wyników glikozytów. Białka zidentyfikowano z 1% wskaźnikiem fałszywych odkryć (FDR); peptydy filtrowano na podstawie "wysokiej" pewności peptydów w Proteome Discoverer 1.4 (q <0,01); glikozyty zidentyfikowano na podstawie unikalnych sekwencji zawierających deamidację konserwatywnego motywu glikozylacji (N-X-S/T); a glikoproteiny zdefiniowano jako zidentyfikowane białka zawierające co najmniej jeden zidentyfikowany glikozyt.

Rysunek 5: Skrócone protokoły dla glikanów zostały opracowane w celu zminimalizowania deaminacji w próbkach i porównane z 18-godzinnym trawieniem FANGS PNGase F. Średnie różnice w liczebności wynosiły odpowiednio 10% i 5% dla protokołów MD (2.2.3) i SPI (2.2.2). Spośród 48 zidentyfikowanych glikanów, 90% wykazywało mniej niż 1,5-krotną różnicę. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Potrzebne są wysokoprzepustowe metody ilościowe, aby ułatwić rutynową analizę glikanów. Przez ostatnie trzydzieści lat analiza glikomiki była ograniczona do podzbioru grup badawczych, pomimo jej znaczenia w chorobach, zastosowaniach klinicznych i farmaceutykach. Metoda oczyszczania i znakowania FANGS-P2GPN dla glikomiki i proteomiki przeprowadza tę samą analizę na pojedynczej podwielokrotności próbki, zmniejszając koszty dostaw i ilość potrzebnego materiału (szczególnie ważne w badaniach na ludziach i myszach). Co więcej, wysiłki mające na celu zminimalizowanie zmienności w preparatach są niezwykle ważne, ponieważ każdy dodatkowy krok przyczynia się do błędu, potencjalnie maskując ważne, ale mało obfite zmiany w badaniach kliniczno-kontrolnych. Sprzężenie FANGS z hydrofobowym znakowaniem hydrazydowym umożliwia prowadzenie próbek białek i glikanów na tej samej kolumnie RPLC, zwiększa jonizację glikanów, zapewnia względną kwantyfikację i może być ilościowo stosowane do osocza.

Do analizy N-glikanów kluczowe znaczenie ma użycie sugerowanego poziomu PNGazy F, aby osiągnąć pełną deglikozylację. Chociaż glikany są narażone na działanie rozpuszczalników, denaturacja białek i nadmiar enzymu pomagają zapewnić skuteczne i całkowite rozszczepienie. W celu dokładnego określenia ilościowego glikanów konieczne jest upewnienie się, że są one całkowicie wysuszone po derywatyzacji, aby wygasić reakcję i zapobiec reakcjom krzyżowym podczas mieszania gatunków NAT i SIL. Wreszcie, przy rozszerzaniu przepływu pracy o analizę glikozytów, czas etapów ma kluczowe znaczenie dla zminimalizowania nieswoistej deamidacji. Zmodyfikowane protokoły przewidziane dla połączonej analizy glikomicznej i proteomicznej działają spójnie, gdy są odpowiednio wykonywane.

Przepływ pracy pozwala na dokładne względne oznaczanie ilościowe N-glikanów z osocza w porównaniu ze złotym standardem, metodą SPE. Nie ma widocznej stronniczości w rodzajach ekstrahowanych glikanów pod względem masy cząsteczkowej, hydrofilowości i struktury składowej. Chociaż nie zbadaliśmy analizy jakościowej glikanów związanych z O, spodziewamy się, że FANGS może pomieścić dodanie etapu eliminacji β po trawieniu PNGazy F glikanów związanych z N. Jednak procedury wymagałyby znacznych modyfikacji w celu oczyszczenia odczynnika przed spektrometrią mas, a analiza peptydów miałaby znaczący wpływ. W przypadku proteomiki uzyskuje się taką samą głębokość pokrycia proteomu w porównaniu z tradycyjnymi metodami FASP. Co ważne, metody te pozwalają na minimalny odsetek fałszywych wykryć deamidacji N-glikanów. Chociaż metoda jest zgodna z znakowaniem ¹⁸O Asn podczas etapu trawienia PNGazy^22,23, niski wskaźnik fałszywego wykrywania miejsca glikozylacji sugeruje, że może to nie być konieczne, co jeszcze bardziej zmniejsza koszty i złożoność.

W tej metodzie proteom nie jest wzbogacony o glikoproteiny, co ma zarówno zalety, jak i wady. Niektóre glikoproteiny o niskiej obfitości mogą nie zostać wykryte w analizie. Jednak zajętość miejsc glikozylowanych na białko można porównać między próbkami biologicznymi. Dodatkowo eliminowany jest błąd i stronniczość wynikająca z oczyszczania powinowactwa do lektyn lub wzbogacania chemicznego. Podsumowując, sprzężenie FANGS z normalizacją indywidualności podczas znakowania strategią znaczników hydrazydu glikanu skutkuje uproszczoną, ilościową, wysokoprzepustową metodą tandemowej analizy glimu i proteomu o dużym potencjale zastosowania w klinicznych badaniach kliniczno-kontrolnych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kwas octowy (50%)	Sigma Aldrich	45754
Acetonitryl, klasa HPLC	Burdick & Jackson	AH015-4
Wodorowęglan amonu	Sigma Aldrich	A6141
Odczynnik Bradford	Sigma Aldrich	B6916	Alternatywa: Zestaw kwasu bicunchoninowego (Sigma Aldrich BCA1)
Chlorek wapnia	Sigma Aldrich	C1016
Wirówka	Eppendorf	5804 R	Alternatywne wirówki, które osiągają 14 000 x g są odpowiednie
DL-Dithiothreitol, 1  M w roztworze	Sigma Aldrich
Easy-nLC 1000	Thermo Scientific	LC120	Alternatywne nano lub ultra wysokociśnieniowe ciekły LC generują podobne dane, takie jak: 1. Dionex UltiMateÒ 3000 LC (Thermo Scientific); 2. Uniewinnienie UPLC (wody).
Pływający stojak	rurki TedPella	20831-20
Fetuin	New England Biolabs	P6042S
Fisher Scientific Isotemp Standardowe piece laboratoryjne	Fisher Scientific	11-690-625F	Alternatywne inkubatory osiągające 56  ° C są odpowiednie
Kwas mrówkowy	Sigma Aldrich	56302
GE Kuchenka mikrofalowa	General Electric	57B5 E82904	Każda kuchenka mikrofalowa z regulowanymi ustawieniami mocy jest odpowiednia
Zestaw do znakowania INLIGHT Glycan	Cambridge Isotope Laboratories	GTK-1000	Zestaw INLIGHT zawiera wersje NAT i SIL odczynnika P2GPN.
Jodoacetamid	Sigma Aldrich	A3221
Kinetix 2.6 mM, 100 Å, C18 masowa faza stacjonarna	Phenomenex	Alternatywa dla nośników masowych	: Dowolna C18 faza stacjonarna 5  mM
Mascot Daemon Software i Server	Matrix Science		Alternative: Oprogramowanie Proteome Discoverer (Thermo Scientific)
Metanol, klasa HPLC	Burdick & Jackson	AH230-4
PicoFrit Kolumna do samodzielnego pakowania: 360  μ m, OD 75  μ m ID, 15  μ m końcówka, niepowlekana, 5 w opakowaniu, 50 cm	Nowy Obiektyw	1 5 PF360-75-15-N-5
PNGase F (bez glicerolu), 75 000  jednostek/ml	New England BioLabs	P0705L
Q Exactive HF Hybrydowy spektrometr masowy kwadrupolowo-orbitrapowy	Thermo Scientific		Alternatywna wysoka dokładność masy (5  ppm) spektrometry mas dostarczą podobnych danych
RNaza B	New England Biolabs	P7817S
Trypsyna z trzustki świni	Sigma Aldrich	T6567-5X
Mocznik	Sigma Aldrich	51456
Koncentrator próżniSavant SPD131DDA Koncentrator SpeedVac	Thermo Scientific	SPD131DDA	Alternatywne koncentratory próżniowe są odpowiednie Filtry
Vivacon 500 30 kDa	Sartorius Stedim Biotech	VN01H22	Alternatywa: Filtry odśrodkowe Amicon Ultra 0,5 z Ultracel-10  Membrana kDa (Millipore UFC501096)
Woda, klasa HPLC	Burdick & Jackson	AH365-4
Woda, 18O	Cambridge Isotope Laboratories	OLM-240-97-1	Dodanie 18O w kroku trawienia PNGazy F jest opcjonalne i może nie być konieczne w przypadku badań deamidacji zakończonych z 95% pewnością
Xcalibur 2.0	Thermo Scientific	XCALIBUR20
Zestaw testowy Zwittergent Merck	Millipore	693030