Artykuł metodologiczny

Izolacja, charakterystyka i badanie funkcjonalne sieci komórek odpornościowych dziąseł

DOI:

10.3791/53736

⸱

16 lutego 2016

 ,  ,  , 
1Oral Immunity and Inflammation Unit, NIDCR, NIH, 2Manchester Immunology Group, Faculty of Life Sciences, University of Manchester, 3Manchester Collaborative Centre for Inflammation Research, University of Manchester

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ustaliliśmy technikę izolacji, charakterystyki fenotypowej i analizy funkcjonalnej komórek odpornościowych z mysiego dziąsła.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sieci komórek odpornościowych w tkankach odgrywają istotną rolę w pośredniczeniu w lokalnej odporności i utrzymaniu homeostazy tkanek, jednak niewiele wiadomo o populacjach komórek odpornościowych w błonie śluzowej jamy ustnej i dziąsłach. Opracowaliśmy technikę izolacji i badania komórek odpornościowych z mysich tkanek dziąseł, obszaru o stałej ekspozycji na drobnoustroje i miejsca podatnego na powszechną chorobę zapalną, zapalenie przyzębia. Nasz protokół pozwala na szczegółową charakterystykę fenotypową populacji komórek odpornościowych rezydujących w dziąśle, nawet w stanie stacjonarnym. Nasza procedura pozwala również uzyskać wystarczającą ilość komórek o wysokiej żywotności do wykorzystania w badaniach funkcjonalnych, takich jak ocena wydzielania cytokin ex vivo. To połączenie fenotypowej i funkcjonalnej charakterystyki sieci komórek odpornościowych dziąseł powinno pomóc w badaniu mechanizmów związanych z odpornością jamy ustnej i homeostazą przyzębia, ale także poszerzy naszą wiedzę na temat mechanizmów związanych z miejscową immunopatologią.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tkanki dziąseł otaczają uzębienie ludzkie i mysie i są stale narażone na działanie złożonego biofilmu zęba 1. Sieć komórek odpornościowych strzegąca bariery dziąsłowej ma zasadnicze znaczenie dla utrzymania integralności tkanek, zapewnienia homeostazy z lokalnymi drobnoustrojami komensalnymi, a jednocześnie zapewnienia skutecznej odporności na prowokację patogenną 2. Aby osiągnąć homeostazę, układ odpornościowy jest starannie dostosowany do środowiska dziąseł, tworząc wysoce wyspecjalizowaną sieć komórek odpornościowych, jednak niewiele wiadomo o populacjach komórek odpornościowych dziąseł i ich roli w utrzymaniu odporności tkankowej 2.

Gdy homeostaza immunologiczna jest zaburzona w dziąśle, czy to przez zwiększoną podatność gospodarza, i/lub obecność dysbiotycznych społeczności mikroorganizmów, powstaje stan zapalny, zapalenie przyzębia 34. Zapalenie przyzębia jest powszechną chorobą zapalną, prowadzącą do utraty struktur podporowych zębów. W ciężkich postaciach występuje u około 10% populacji ogólnej 5. Analiza kluczowych czynników związanych z podatnością i progresją paradontozy okazała się trudna 6. Jednak modele zwierzęce okazały się niezwykle przydatne w zrozumieniu mechanizmów inicjacji i progresji zapalenia przyzębia 7. Modele mogą być wykorzystane do zdefiniowania kluczowych populacji komórek i mediatorów molekularnych, które są niezbędne do utrzymania homeostazy immunologicznej i napędzają rozwój zapalenia przyzębia. Taki wgląd zmieni nasze rozumienie specyficznej dla dziąseł kontroli homeostazy immunologicznej i pogłębi naszą obecną wiedzę na temat patogenezy chorób.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury eksperymentalne opisane w tym protokole były zgodne z wymaganymi wytycznymi i zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt, NIDCR/NIH.

1. Przygotuj się z wyprzedzeniem

  1. Przygotuj kompletne pożywki: RPMI uzupełnione o 2 mM L-glutaminy, 100 jednostek/ml penicyliny, 100 ug/ml streptomycyny i 10% FBS.
  2. Przygotuj pożywkę DNazy: 50 ml pożywki RPMI uzupełnionej 7,5 μg DNazy (przygotuj świeżość, trzymaj na lodzie przez cały czas).
  3. Przygotuj pożywkę kolagenazy-DNazy: 5 ml pożywki DNazy plus 3,2 mg/ml kolagenazy typu IV (przygotuj świeżość, trzymaj na lodzie przez cały czas).
  4. Bufor FACS do wstępnego schładzania: 0,5 % FBS rozcieńczony w PBS.
  5. Wstępnie schłodzić wirówkę do temperatury 4 °C.
  6. Inkubator z wytrząsarką ogrzaną do temperatury 37 °C.

2. Izolacja, rozwarstwienie i izolacja komórek z bloków dziąsłowych

  1. Poddaj myszy eutanazji, wystawiając je na działanie CO2 w odpowiedniej komorze, zgodnie z wytycznymi ARAC.
  2. Otwórz klatkę piersiową i jamę brzuszną, aby odsłonić serce i narządy wewnętrzne. W celu perfuzji należy wykonać nacięcie w żyle głównej dolnej i przelać 3 ml PBS przez lewą komorę za pomocą strzykawki o pojemności 3 ml z igłą 27 G.
  3. Unieruchom ciało i głowę myszy na podkładce brzuchem do góry.
  4. Przetnij nożyczkami każde spoidło wargi w kierunku szyi, oddzielając skórę pokrywającą żuchwę i okolicę szyi, odsłaniając leżące poniżej tkanki i mięśnie. Rozetnij dolną wargę, aby odsłonić żuchwę.
  5. Przeciąć między dolnymi siekaczami, aby oddzielić obie strony żuchwy i unieruchomić każdą stronę, aby uzyskać dostęp do jamy ustnej.
  6. Wizualizuj i rozbierz podniebienie z dala od jamy nosowej.
  7. Wypreparuj obszary za pomocą 10 ostrzy i uwzględnij obszary trzonowców szczęki i żuchwy wraz z otaczającym dziąsłem (ryc. 1). Wykonaj pionowe nacięcia tuż przed pierwszym zębem trzonowym i za trzecim trzonem oraz poziome nacięcie na granicy dziąsła (biały kołnierz tkanki otaczającej zęby).
  8. Umieść bloki szczęki i żuchwy w stożkowej probówce o pojemności 50 ml z 5 ml kolagenazy/DNazy (przechowywać na lodzie).
  9. Inkubować w inkubatorze z wytrząsarką w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę i w ciągu ostatnich 5 minut inkubacji dodać 50 μl 0,5 M EDTA.
  10. Dodać 5 ml zimnej pożywki DNazy do probówki o pojemności 50 ml z chusteczkami i delikatnie zamieszać, aby wymieszać.
  11. Przenieść 4 bloki tkanki na szalkę Petriego i zalać 500 μl pożywki DNazy. Usuń dziąsło z każdego bloku tkanki, używając ostrza skalpela i kierując ostrze w obszary dziąseł i przestrzeni międzyzębowych.
  12. Przenieść tkanki i pożywkę z płytki Petriego, jak również poprzednią pożywkę DNazy używaną podczas sekcji, do nowej probówki o pojemności 50 ml przez sitko do komórek (rozmiar 70 μm). Umyj pożywką DNazy (3-5 ml) wszystkie używane narzędzia i przefiltruj.
  13. Używając tłoka sterylnej strzykawki o pojemności 3 ml, rozgnieć tkankę o sitko, filtrując zimną pożywką DNazy (30 do 35 ml).
  14. Umyj sitko komórkowe zimną pożywką DNazy.
  15. Wirować w temperaturze 4 °C, 314 x g przez 6 min.
  16. Odrzucić sklarowany osad i zawiesić go ponownie w 1 ml kompletnego podłoża.
  17. Policz komórki (oczekiwana ilość powinna wynosić od 8 x 10 5 do 1,2 x 106 komórek o żywotności >80%) za pomocą automatycznego licznika komórek.

3. Stymulacja i barwienie FACS komórek dziąseł

  1. Stymulować zawiesinę jednokomórkową za pomocą PMA (50 ng/ml) i jonomycyny (2,5 μg/ml) w obecności 1 μl/ml Brefeldin A.
  2. Inkubować przez 3,5 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  3. Odwirować i przepłukać PBS i odwirować w temperaturze 4 °C; 314 x g przez 6 min.
  4. Wybarwić ogniwa za pomocą barwnika żywotności zgodnie z instrukcjami producenta.
  5. Barwienie markerów zewnątrzkomórkowych (CD45, TCRγδ, TCRβ, CD4, CD8, TCRγδ lub przeciwciał z wyboru) zgodnie z instrukcjami producenta.
  6. Przemyć komórki zimnym buforem FACS i odwirować w temperaturze 4 °C, 314 x g przez 5 minut.
  7. Delikatnie wiruj, aby rozbić osad komórkowy.
  8. Utrwal komórki 2% paraformaldehydem przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
  9. Przemyć komórki zimnym buforem FACS, odwirować w temperaturze 4 °C, 314 x g przez 5 minut i zabarwić na cytokiny wewnątrzkomórkowe.
    1. Napełnić probówki FACS roztworem zimnej 0,5% saponiny rozcieńczonej w buforze FACS i odwirować w temperaturze 4 °C, 314 x g przez 5 minut.
    2. Dodać 300 μl 0,5% roztworu saponin do probówek FACS, inkubować przez 15 minut w ciemności w temperaturze 4 °C, a następnie odwirować w temperaturze 4 °C, 314 x g przez 5 minut.
    3. Wybarwić komórki pod kątem markerów wewnątrzkomórkowych (IL-17A i IFNγ lub cytokiny z wyboru) zgodnie z instrukcjami producenta. Przemyć komórki 0,5% roztworem saponin i odwirować w temperaturze 4 °C, 314 x g przez 5 min.
    4. Przemyć ponownie buforem FACS i odwirować w temperaturze 4 °C, 314 x g przez 5 min.
    5. Ponownie zawiesić komórki w 300 μl buforu FACS.
  10. Analizuj wyniki na cytometrze przepływowym.

4. Analiza cytometrii przepływowej

  1. Wizualizuj komórki do analizy w kierunku rozrzutu do przodu (FSC) i bocznego (SCC) oraz bramki, aby wykluczyć zanieczyszczenia.
  2. Zaznacz pojedyncze komórki z parametrami obszaru rozproszenia do przodu (FSC-A) i wysokości (FSC-H).
  3. Komórki bramkowe, które są żywe (jak wskazuje barwienie żywotności) i dodatnie dla markera krwiotwórczego CD45 + do dalszej analizy (Figura 2A i 2C).
  4. Kontynuuj analizę określonych markerów, jak pokazano na rysunku 2 i rysunku 3.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zilustrować zastosowanie protokołu, pokazujemy reprezentatywne wyniki badania sieci komórek odpornościowych w dziąśle myszy z zapaleniem przyzębia i bez niego (WT vs. LFA-/-, Rysunek 2A-C). Reprezentatywne wykresy FACS pokazują żywe komórki krwiotwórcze CD45 + w dziąśle (ryc. 2A, 2C). Izolacja i przetwarzanie komórek odpornościowych za pomocą tego protokołu daje wystarczającą ilość komórek do prz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecna technika z powodzeniem pozwala uzyskać dużą liczbę komórek odpornościowych (z jednej myszy) odpowiednich nie tylko do charakterystyki fenotypowej, ale także do badań funkcjonalnych ex vivo. Inna grupa opublikowała wcześniej protokół izolacji i charakterystyki mysich komórek odpornościowych dziąseł i wprowadziła wartość stosowania wielokolorowej cytometrii przepływowej w badaniu zapalenia przyzębia w modelach zwierzęcych. Po wielu problemach związanych z rozwiązywaniem problemów, kluczową modyfi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy byli częściowo finansowani przez program stacjonarny NIDCR (N.M.M) i wspierani przez Wellcome Trust Stepping Stones Fellowship (097820/Z/11/B to J.E.K.) oraz przez grant Manchester Collaborative Centre for Inflammation Research (dla J.E.K.). Autorzy dziękują Teresie Wild za krytyczną recenzję rękopisu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Cienkie nożyczkiNarzędzia do nauki14058-11
Rękojeść do skalpela #3Narzędzia do nauki10003-12
Ostrza do skalpeli #10Narzędzia do nauki precyzyjnej10010-00Sterylne
kleszczyki do odłamkówIntegra Miltex6-304
Igły z regularnym skosem BD Medical30510927 G, długość 12,7 mm
MonojectCovidien8881513934końcówka Luer-lock, 3 ml
PBS, pH 7,4Life Technologies10010-049Bez wapnia i magnezu
RPMI 1640Lonza12-167FBez L-glutaminy
DNaza I z trzustki bydlęcejSigma-AldrichDN25-1G
Kolagenaza typu IVGibco (firmy Life technologies)17104-019
Płodowa surowica bydlęcaGemini Bio-products100-106
Gentamycyna 50 mg / mlJakość biologiczna120-098-661EA
Pen StrepGibco (firmy Life technologies)15140-122
L-glutaminaGibco (firmy Life technologies)25030-081
0,5 M EDTA pH 8,0Jakość biologiczna351-027-721EA
Probówki 50 mlCorning352070Polipropylen, sterylny
70 μ M Cell SitkaCorning352350
Szalki PetriegoCorning351029Sterylne
probówki FACS 5 mlCorning352052Sterylne
BD GolgiPlugBD Biosciences555029Zawiera roztwór brefeldyny A
12-mirystynian 13-octanu forbolu (PMA)Sigma-AldrichP8139
jonomycyna sól wapniowaSigma-Aldrich13909
Saponina z kory quillajaSigma-AldrichS4521
LIVE/DEAD Zestaw do naprawy barwników Aqua Dead CellTechnologiesL34957
Anti-Mouse CD45 Alexa Fluor 700eBioscience56-0451-82
Anti-Mouse CD4 eFluor 450eBioscience48-0042-82
Anti-Mouse TCR beta APC eFluor 780eBioscience47-5961-82
Przeciw myszom gamma delta TCR FITCeBioscience11-5711-82
Anty-mysz IL-17A APCeBioscience12-7311-82
Anty-mysie IFN-γ PEeBioscience11-5931-82
Przeciw myszom NK1.1 PE-CY7eBioscience25-5941-82
Anty-mysie CD90.2 APC eFluor 780eBioscience47-0902-82
Anty-mysie CD3e FITCeBioscience11-0031-82
Anty-mysie CD19 FITCeBioscience11-0193-82
Anty-mysie CD11b FITCeBioscience11-0112-82
Anty-mysz CD11c FITCeBioscience11-0114-82
Anty-mysz TCR beta FITCeBioscience11-5961-82
Anty-mysz Ly-6G FITCeBioscience11-5931-82
Anty-mysz Ly-6C FITCBD Pharmingen553104
Strzykawki Life

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. Defining The Normal Bacterial Flora Of The Oral Cavity. J Clin Microbiol. 43, 5721-5732 (2005).
  2. Belkaid, Y., Naik, S. Compartmentalized And Systemic Control Of Tissue Immunity By Commensals. Nat Immunol. 14, 646-653 (2013).
  3. Darveau, R. P. Periodontitis: A Polymicrobial Disruption Of Host Homeostasis. Nat Rev Microbiol. 8, 481-490 (2010).
  4. Hajishengallis, G. Immunomicrobial Pathogenesis Of Periodontitis: Keystones, Pathobionts, And Host Response. Trends Immunol. 35, 3-11 (2014).
  5. Eke, P. I., et al. Prevalence Of Periodontitis In Adults In The United States: 2009 And 2010. J Dent Res. 91, 914-920 (2012).
  6. Moutsopoulos, N. M., Lionakis, M. S., Hajishengallis, G. Inborn Errors In Immunity: Unique Natural Models To Dissect Oral Immunity. J Dent Res. , (2015).
  7. Hajishengallis, G., Lamont, R. J., Graves, D. T. The Enduring Importance Of Animal Modelsin Understanding Periodontal Disease. Virulence. 6, 229-235 (2015).
  8. Sharrow, S. O. Analysis Of Flow Cytometry Data. Current Protocols In Immunology. Coligan, J. E., et al. , Chapter 5, Unit 5 2 (2001).
  9. Arizon, M., et al. Langerhans Cells Down-Regulate Inflammation-Driven Alveolar Bone Loss. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 7043-7048 (2012).
  10. Moutsopoulos, N. M., et al. Defective Neutrophil Recruitment In Leukocyte Adhesion Deficiency Type I Disease Causes Local IL-17-Driven Inflammatory Bone Loss. Sci Transl Med. 6, 229-240 (2014).
  11. Gaffen, S. L., Jain, R., Garg, A. V., Cua, D. J. The IL-23-IL-17 Immune Axis: From Mechanisms To Therapeutic Testing. Nat Rev Immunol. 14, 585-600 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Gingival Immune CellsImmune Cell IsolationTissue DigestionFlow CytometryCytokine SecretionCollagenase DNaseCell StrainerEx Vivo StimulationPhenotypic CharacterizationFunctional Examination

Powiązane artykuły