Artykuł metodologiczny

Dostarczanie RNAi do poczwarek Anopheles gambiae

10.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53738

⸱

8 marca 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Biology Department, Boston College, 2Division of Biology, Kansas State University, 3Discovery Research, Biogen

W tym artykule

Podsumowanie

Interferencja RNA (RNAi) jest niezwykle cennym narzędziem do odkrywania funkcji genów. Jednak zdolność do celowania w geny za pomocą RNAi w stadiach przeddorosłych jest ograniczona w przypadku głównego wektora malarii u ludzi Anopheles gambiae. Opisujemy protokół RNAi w celu zmniejszenia funkcji genu poprzez bezpośrednią iniekcję podczas rozwoju poczwarki.

Streszczenie

Interferencja RNA (RNAi), zjawisko naturalnie występujące w organizmach eukariotycznych, jest niezwykle cennym narzędziem, które może być wykorzystane w laboratorium do funkcjonalnych badań genomicznych. Zdolność do selektywnego eliminowania pojedynczych genów za pomocą tej odwróconej techniki genetycznej pozwoliła wielu badaczom na szybkie odkrycie biologicznych ról wielu genów w wielu organizmach poprzez ocenę fenotypów utraty funkcji. W przypadku głównego wektora malarii u ludzi, Anopheles gambiae, dominującą metodą stosowaną w celu zmniejszenia funkcji docelowych genów jest wstrzyknięcie dwuniciowego (dsRNA) do hemofelu dorosłego komara. Chociaż metoda ta okazała się skuteczna, knockdown genów u dorosłych wyklucza funkcjonalną ocenę genów, które ulegają ekspresji i potencjalnie odgrywają role w stadiach przeddorosłych, a także genów, które ulegają ekspresji w ograniczonej liczbie komórek u dorosłych komarów. Opisujemy metodę wstrzykiwania dsRNA inhibitora proteazy serynowej 2 (SRPN2) we wczesnym stadium poczwarki i walidujemy knockdown białka SRPN2, obserwując obniżone poziomy białka docelowego i tworzenie się pseudoguzów melanotycznych u dorosłych komarów knockdown SRPN2. Ten ewidentny fenotyp został opisany wcześniej dla knockdownu funkcji SRPN2 w stadium dorosłym, a my podsumowaliśmy ten dorosły fenotyp za pomocą knockdownu SRPN2 zainicjowanego podczas rozwoju poczwarki. W połączeniu z roztworem dsRNA znakowanym barwnikiem, technika ta umożliwia łatwą wizualizację jakości iniekcji i dystrybucji dsRNA w hemoelelu za pomocą prostej mikroskopii świetlnej.

Wprowadzenie

Malaria to choroba zakaźna przenoszona przez komary, która dotyka wiele milionów osób każdego roku. Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) podaje, że w 2013 roku z powodu malarii zmarło około 584 000 osób, z czego 78 procent wystąpiło u dzieci poniżej piątegoroku życia. Patogeny wywołujące malarię u ludzi są pasożytami apikompleksanu z rodzaju Plasmodium i są przenoszone między ludzkimi gospodarzami przez samice komarów Anopheles. Przenoszenie następuje, gdy komar pobiera posiłek z krwi od osoby, która jest zarażona, a następnie osadza zakaźne pasożyty w osobie niezakażonej w kolejnym posiłku z krwi. W obrębie rodzaju Anopheles, Anopheles gambiae jest gatunkiem o największej zdolności wektorowej i jest najbardziej znanym wektorem malarii w Afryce Subsaharyjskiej1-3.

Obecnie, zwalczanie komarów za pomocą środków owadobójczych nadal jest główną metodą stosowaną w celu zmniejszenia obciążenia ludzi malarią. Chociaż stosowanie insektycydów od lat sześćdziesiątych XX wieku okazało się niezwykle skuteczne, wzrost odporności na insektycydy spowodował potrzebę opracowania nowych insektycydów i alternatywnych strategii zwalczania wektorów4-7. W 2010 r. łącznie 49 z 63 krajów zgłaszających się do WHO wskazało na występowanie oporności na insektycydy u wektorów malarii1. Ponadto narzędzie IR Mapper, które wykorzystuje recenzowaną literaturę do oceny danych dotyczących oporności w regionach afrotropikalnych, informuje, że w latach 2001-2012 nastąpił odpowiednio 46% i 27% wzrost oporności na pyretroidy i dichlorodifenylotrichloroetan (DDT)7.

Interferencja RNA (RNAi) została zidentyfikowana na początku lat 90. jako technika, która może być wykorzystana do inaktywacji genów w roślinie Petunia8,9 i w grzybie Neurospora crassa9,10. Wkrótce potem, w 1998 roku, RNAi zostało po raz pierwszy udokumentowane w Caenorhabditis elegans jako sposób na zmniejszenie ekspresji genów w modelu zwierzęcym poprzez wprowadzenie antysensownego lub dwuniciowego RNA (dsRNA) za pomocą metod iniekcji lub karmienia9,11. Od czasu swojego odkrycia, RNAi zrewolucjonizował dążenie do genomiki funkcjonalnej, umożliwiając naukowcom wykorzystanie genetyki odwrotnej do szybkiego zbadania funkcjonalnych ról genów będących przedmiotem zainteresowania za pomocą wysoce selektywnego mechanizmu wyciszania genów po transkrypcji. W niektórych organizmach, takich jak Drosophila melanogaster, zastosowanie organizmów transgenicznych, które wyrażają interferujące konstrukty RNA, odniosło duży sukces w przypadku knockdownu genów (KD). Chociaż wykorzystanie transgenów w An. gambiae dla RNAi zostało wykorzystane i może okazać się przydatne w badaniach przesiewowych na dużą skalę, generowanie transgenicznych szczepów komarów jest zarówno pracochłonne, jak i czasochłonne, zwykle zajmuje od dwóch do trzech miesięcy, aby przejść od identyfikacji interesującego genu do wygenerowania odpowiedniego stada transgenicznego12. Obecnie podstawową metodą genu KD u An. gambiae jest wstrzyknięcie do hemolimfy, w stadium dorosłym, dsRNA specyficznego dla danego genu12,13. Proces ten trwa zwykle około jednego miesiąca od identyfikacji interesującego genu do oceny genu KD, okazując się znacznie szybszy niż metody transgeniczne12. Metody oznaczania RNAi w stadium larwalnym zostały niedawno opracowane w An. gambiae i Aedes aegypti poprzez podawanie nanocząsteczek14-17 lub doustne dostarczanie cząsteczek dsRNA na bazie mikroalg18, oferując możliwości przeprowadzenia funkcjonalnej analizy genomowej we wczesnych stadiach rozwoju. W metodach bezpośredniego wstrzykiwania, karmienia i dostarczania nanocząstek, dsRNA jest pobierane autonomicznie przez komórkę docelową i rozszczepiane przez enzym Dicer na 21-25 nukleotydowych "krótkich interferujących RNA" (siRNA)19,20. Te siRNA są następnie włączane do kompleksu wyciszającego indukowanego RNA (RISC), z którego jedna nić zostanie odrzucona, umożliwiając wiązanemu z RNA kompleksowi RISC związanie się i rozszczepienie docelowego mRNA, a tym samym zmniejszenie jego poziomu i zahamowanie jego translacji19,20.

Wiele wewnętrznych cech podstawowej biologii komarów moduluje zdolność wektorową, w tym preferencje gospodarza (np. węch, wąch, gustation), krycie, rozmnażanie i odporność. Biorąc pod uwagę znaczenie tych procesów biologicznych, prawdopodobne jest, że ich modulacja na poziomie genetycznym lub farmakologicznym stworzy nowe możliwości zwalczania wektorów, w tym obchodzenia oporności na środki owadobójcze, oraz zapewni nowe narzędzia dla szerzej zintegrowanych podejść do zarządzania wektorami. Wykorzystanie genomiki funkcjonalnej do oceny ról genów leżących u podstaw tych wewnętrznych cech biologicznych umożliwi identyfikację nowych celów i dostarczy nowych informacji na temat tego, w jaki sposób możemy skutecznie tworzyć nowe, skuteczniejsze strategie kontroli. Opisano rozwój i zastosowanie metody szybkiej iniekcji do inicjacji RNAi w stadium poczwarki An. gambiae. Obserwujemy, że wstrzyknięcie wyzwalacza RNAi w stadium poczwarki umożliwia obserwację wynikowych fenotypów u dorosłych we wczesnym stadium, tj. wcześniej po pojawieniu się, niż można by zaobserwować, gdyby knockdown genu został zainicjowany u dorosłych po wschodach. Metoda ta umożliwia knockdown genu rozpoczynający się w okresie rozwoju poczwarki i rozciągający się na stadia dorosłe, tak że knockdown genu zainicjowany podczas rozwoju poczwarki może utrzymywać się i wpływać na wczesne dorosłe typy komórek dostępne dla hemolimfy, a także typy komórek, które są bardziej dostępne dla hemolimfy podczas metamorfozy niż u osoby dorosłej, takie jak neurony czuciowe znajdujące się w dorosłych przydatkach po pojawieniu się.

Protokół

1. Synteza i przygotowanie dsRNA

  1. Zidentyfikuj region knockdown o długości 200-800 pz (w celu wygenerowania odpowiedniego dsRNA) w genie będącym przedmiotem zainteresowania, który według przewidywań nie będzie miał możliwych do zidentyfikowania skutków poza celem (np. brak homologii sekwencji ≥18 pz w innym genie) i kontrolę negatywną (np. sekwencję heterologiczną, która nie występuje w genomie owadów docelowych, taką jak gen Escherichia colilacZ (GenBank Gene ID: 945006). Alternatywnie należy zastosować kontrolę pozytywną (np. dającą łatwy do zaobserwowania fenotyp, taki jak SRPN221,22, GenBank Gene ID: 1270169). Sekwencja dsRNA ukierunkowana na SRPN2 została zdefiniowana w Michel et al. (2005)21.
    Uwaga: E-RNAi jest zasobem bioinformatycznym o otwartym kodzie źródłowym, który jest przydatny do identyfikacji takich regionów i procesu projektowania starterów oligonukleotydowych23.
  2. Wykonać standardową amplifikację PCR (tj. Wykonaną za pomocą polimerazy DNA Taq przy użyciu 30-35 cykli) przy użyciu matrycy genomowego DNA lub cDNA w celu uzyskania matrycy syntezy dsRNA otoczonej sekwencją promotora T7 (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3') i przystąpić do przygotowania i oczyszczenia dsRNA przy użyciu komercyjnego zestawu do transkrypcji in vitro zgodnie z instrukcjami producenta. Użyj warunków amplifikacji SRPN2 PCR i informacji o starterze, jak przedstawiono w A i in. (2011)22.
  3. Określić ilościowo wydajność amplikonów oczyszczonego RNA za pomocą spektroskopii absorbancji ultrafioletu o długości fali 260 nm i dostosować do pożądanego stężenia (np. 3 μg/μl) w wodzie wolnej od RNaz.
    1. W celu rozwiązania problemów z niskimi stężeniami RNA należy zmniejszyć objętość cieczy, obracając próbki w wirówce próżniowej w temperaturze pokojowej lub liofilizując próbki i odtwarzając je w mniejszych objętościach wody. Czas potrzebny do liofilizacji próbki będzie się różnić w zależności od początkowej objętości próbki i stężeń dsRNA.
  4. Sprawdź jakość i długość dsRNA na 2% żelu agarozowym przygotowanym z 1x buforem TBE lub TAE i wybarwionym bromkiem etydyny (EtBr), wraz z matrycą DNA używaną do reakcji transkrypcji. dsRNA będzie migrować wolniej niż matrycowe DNA. Jakość i długość można ocenić, upewniając się, że nie ma niespecyficznych produktów dsRNA i porównując produkty ze standardowym markerem DNA.
    Uwaga: EtBr jest silnym mutagenem i należy się z nim odpowiednio obchodzić.
    Uwaga: Przy stężeniu dsRNA wynoszącym 3 μg/μl, 0,5 μl próbki jest więcej niż wystarczające do wizualizacji na żelu agarozowym barwionym EtBr.
  5. Przechowywać dsRNA w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będzie to potrzebne. Wielokrotne cykle zamrażania/rozmrażania mogą powodować degradację, dlatego należy przygotować podwielokrotności na duże ilości dsRNA.

2. Przygotuj probówki z barwnikiem Fast Green FCF (FGD)

  1. Rozcieńczyć barwnik Fast Green FCF z roztworu podstawowego (≥85% zawartości barwnika) do 0,1% (v/v) (roztwór roboczy) w wodzie wolnej od RNaz.
  2. Odpipetować 1 μl barwnika na dno probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.
  3. Umieść probówki w bloku grzewczym o temperaturze 65 °C na około 3 godziny, aby odparować płyn, a następnie umieść probówki w temperaturze pokojowej na co najmniej 30 minut, aby ostygły przed użyciem. Ten suchy, stały barwnik odtworzy się w roztworze do rezawieszania dsRNA.

3. Ciągnij igły iniekcyjne

  1. Za pomocą podgrzewanego ściągacza igłowego wyciągnąć igły ze szkła borokrzemianowego do średnicy końcówki 10-30 μm. Ustawienia naciągu odpowiadają: Regulacja grzałki nr 1 = 100, Regulacja grzałki nr 2 = 70.
  2. Aby uniknąć uszkodzenia cienkiej końcówki igły, umieść wszystkie wyciągnięte igły poziomo na szalce Petriego na pasku szpachli formierskiej.
    Uwaga: Dodatkowe informacje na temat metod wyciągania igieł kapilarnych można znaleźć bardziej szczegółowo w podręcznikuMR4 MR4 Research and Malaria Research and Reference Reagent Resource Center.

4. Przygotuj stację wtryskową

  1. Zbierz potrzebne materiały: szklane igły mikrokapilarne naciągnięte na cienką końcówkę, mikrowtryskiwacz, cienką bibułę filtracyjną i grubą bibułę filtracyjną, szalki Petriego, pipety transferowe, pędzel i mikroskop preparacyjny.
  2. Przygotować mikrowstrzykiwacz zgodnie z instrukcją zawartą w instrukcji obsługi mikroiniektora i ustawić objętość wtrysku na żądaną objętość na impuls (np. maksymalnie 69 nl na impuls).
  3. Na platformie, którą można łatwo manewrować pod mikroskopem (np. płaska strona stojaka na rurki styropianowe), ułóż dwa arkusze bibuły filtracyjnej z cienką bibułą filtracyjną na górze i zabezpiecz taśmą wokół krawędzi.
  4. Zawiesić ponownie 10 μl każdego roztworu dsRNA w oddzielnych kolorowych probówkach z barwnikiem i umieścić na lodzie.

5. Zbieraj poczwarki do iniekcji

  1. Napełnij małą szalkę Petriego o wymiarach 60 mm x 15 mm 10 ml wody dejonizowanej i zbierz ~50 bladych poczwarek (w ciągu pierwszych 24 godzin po przepoczwarzeniu) z tacki owadobójczej za pomocą jednorazowej plastikowej pipety do przenoszenia.
  2. Usuń wszystkie poczwarki, które mają średnie lub ciemne opalanie skórek.
    Uwaga: Gdy naskórek zaczyna się opalać, trudniej jest wniknąć w naskórek, a wstrzyknięcie powoduje znacznie większą śmiertelność.

6. Wstrzyknięcie dsRNA

  1. Pod mikroskopem preparacyjnym odłamać dystalną końcówkę igły do wstrzykiwań za pomocą cienkich kleszczyków.
  2. Przygotować igłę do wstrzykiwań, wypełniając ją olejem mineralnym (za pomocą strzykawki z igłą o rozmiarze 30 cali) i usuwając nadmiar oleju za pomocą mikrowstrzykiwacza.
  3. Napełnij igłę iniekcyjną od przodu maksymalną ilością dsRNA i wyrzuć jeden impuls pod mikroskopem, aby zapewnić dozowanie płynu. W przypadku, gdy płyn nie zostanie wchłonięty i/lub wydalony, należy sprawdzić, czy dystalna końcówka igły nie jest zablokowana i upewnić się, że igła jest dobrze zamocowana w mikrowstrzykiwaczu.
  4. Wybierz 1-3 poczwarki i umieść je na bibule filtracyjnej.
  5. Za pomocą pędzla umieść poczwarki na bibule filtracyjnej z dostępem do naskórka grzbietowego, a następnie użyj pędzla, aby popchnąć bibułę filtracyjną i wchłonąć nadmiar wody.
  6. Ustabilizuj poczwarkę końcówką pędzla i wbij igłę w naskórek grzbietowy między klatką piersiową a brzuchem pod kątem około 30° w stosunku do grzbietowej powierzchni poczwarki. Wstrzyknięcie powinno być skierowane w kierunku tylnego końca poczwarki, a igła powinna być przesuwana w kierunku od przodu do tyłu.
  7. Wstrzyknąć dwa impulsy (69 nl na impuls) roztworu dsRNA o stężeniu 3 μg/μl do hemolimfy i sprawdzić rozkład koloru w całym ciele. Jeśli nie zostanie zidentyfikowany żaden kolor, należy nieznacznie przesunąć pozycję igły do wstrzykiwań, aby usunąć końcówkę z przeszkód i powtórzyć podawanie płynu.
  8. Użyj zwilżonego pędzla, aby delikatnie przenieść poczwarkę z igły do wody w celu hodowli. Poczwarka powinna przykleić się do pędzla przy lekkim kontakcie.

7. Warunki po wstrzyknięciu

  1. Umieścić szalkę Petriego z wstrzykniętymi poczwarkami w klatce na komary o odpowiednim przepływie powietrza (np. klatce siatkowej lub pojemniku z siatkową pokrywką). Warunki odchowu poczwarek powinny utrzymywać się na stałym poziomie 27 ± 3 °C, wilgotności 75 ± 5% i znajdować się w cyklu światło-ciemność trwającym 16:8 godzin.
  2. Przygotuj 10% (w/v) roztwór glukozy i umieść nasączony roztworem wacik na siatce klatki dla komarów do karmienia dorosłych.

8. Oceń nokdaun

  1. W pożądanym punkcie czasowym (punktach) oceń fenotypy u eksperymentalnych owadów, którym wstrzyknięto dsRNA, w porównaniu z kontrolą.
    1. Oceniaj owady dsSRPN2 i dsLacZ codziennie, schładzając dorosłe osobniki przez około 2-3 minuty w temperaturze -20 °C, przenosząc je na zimną płytkę w temperaturze 2 °C i identyfikując wszelkie formacje pseudoguza za pomocą mikroskopu preparacyjnego przy 15-krotnym powiększeniu i oświetleniu jasnego pola. Po ocenie przywrócić dorosłe osobniki do warunków owadożernych (27 ± 3 °C, 75 ± 5% wilgotności).
      Uwaga: Eksperymentalne i kontrolne dsRNA stosowane w tym protokole to odpowiednio dsSRPN2 i dsLacZ. Istnieje wiele opcji odpowiednich do sterowania; sugeruje się jednak, że podczas nauki tej techniki należy zastosować kontrolę pozytywną, dla której fenotyp i/lub ekspresję można łatwo zobrazować (np. za pomocą mikroskopii preparcyjnej) i/lub określić ilościowo [np. ilościowy PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR), Western blot]. Kwantyfikacja białka SRPN2 i transkryptu za pomocą odpowiednio Western blot i qRT-PCR opisano w Michel i in. (2005)21.

Wyniki

Iniekcja poczwarki w celu wywołania KD genu daje optymalne rezultaty, gdy jest wykonywana we wczesnym stadium poczwarki, kiedy stopień garbowania kutykuli jest niski (Rysunek 1A, lewa strona oraz 1B). Zwiększone garbowanie i twardnienie kutykuli, zazwyczaj po 24 godzinach, prowadzi do zwiększonej śmiertelności poczwarek po iniekcji (Rysunek 1A, środek i prawa strona). Tempo rozwoju poczwarek może się różnić w zależności od warunków w insektarium i zagęszczenia zwierząt24,25; dlatego najlepiej jest oceniać pigmentację wizualnie.

Podczas procesu iniekcji igła kapilarna jest wprowadzana do kutykuli grzbietowej pod kątem około 30° w kierunku od przodu do tyłu (Rycina 2A). Po wprowadzeniu igły i podaniu dsRNA + 0,01% (w/v) FGD, widoczny jest rozkład barwnika w całej hemolimfie (Rycina 2B).

Ocena wyklucia osobników dorosłych z poczwarek wstrzykniętych 0,01% (w/v) FGD wykazała średni odsetek wyklucia na poziomie 70%, w porównaniu do 96,7% wyklucia w niewstrzykniętej grupie kontrolnej (Rysunek 3A). Warto zauważyć, że u dużej liczby osobników, które nie przeżyły, zaobserwowano częściowe wyjście z poczwarki (Rysunek 3B). Wstrzyknięte zwierzęta nie wykazały opóźnień w czasie wyklucia (Rysunek 4A) ani stronniczego wpływu na którąkolwiek z płci (Rysunek 4B). Dodatkowa ocena przeżywalności osobników dorosłych przeprowadzona do 10. dnia po wykluciu nie wykazała widocznego wpływu na przeżywalność dorosłych po wykluciu (Rysunek 4C).

Walidację jakości KD oceniano na podstawie fenotypu melanotycznego pseudoguzka (ciemno pigmentowanego skupiska tkanek) związanego z wyciszeniem SRPN221,22 jako kontroli pozytywnej wyciszenia oraz braku fenotypów związanych z iniekcją dsLacZ jako kontroli negatywnej. Wykluły się dorosłe komary oceniano w 8. dniu po iniekcji (6-7 dzień po wykluciu). Melanotyczne pseudoguzki (Rycina 5A i 5B) zaobserwowano przez kutykulę u 93,5% dorosłych komarów dsSRPN2 w porównaniu do 0% dorosłych komarów dsLacZ (Rycina 6A). Skupiska ciemno zmelanizowanej tkanki zidentyfikowano podczas sekcji pigmentowanych obszarów (Rycina 5C). Pseudoguzki były widoczne na kutykuli osobników dorosłych już w 3. dniu po wykluciu i występowały również w części hemolimfy oraz tkankach jelita grupy dsSRPN2 (dane nie pokazano). W 5. dniu po iniekcji (wczesne stadium dorosłe) zaobserwowano znacząco obniżony poziom SRPN2 w izolatach białek hemolimfy dsSRPN2, ale nie w grupie dsLacZ ani w grupie nieiniekcyjnej (Rycina 6B).

figure-results-1
Rycina 1: Określanie stadium rozwojowego dla wstrzyknięcia dsRNA do poczwarki. Wczesne wstrzyknięcie dsRNA do poczwarki skutkuje optymalną przeżywalnością i przejściem do stadium imago. Niski stopień pigmentacji kutykuli (A, lewo oraz B) jest obserwowany w ciągu pierwszych 0-24 h po poczwarczeniu. Brązowienie kutykuli poczwarki przed wstrzyknięciem (A, środek i prawo) skutkuje umiarkowaną lub słabą przeżywalnością.

figure-results-2
Rycina 2: Miejsce wstrzyknięcia i rozmieszczenie znakowanego barwnikiem dsRNA. (A) Wstrzyknięcie znakowanego barwnikiem dsRNA za pomocą igły kapilarnej w grzbietową część kutykuli pod kątem około 30°, w kierunku od przedniej do tylnej części ciała. (B>) Barwnik jest widocznie rozprzestrzeniony w hemolimfie poczwarki. Objętość wstrzykniętego dsRNA wyniosła 138 nl, znakowanie wykonano przy użyciu 0,01% FGD (w/v).

figure-results-3
Rycina 3: Wyklucie osobników dorosłych po wstrzyknięciu. (A) 70% pociorek z wstrzykniętym 0,01% FGD (w/v) wykluło się pomyślnie (n = 60), w porównaniu do 96,7% kontroli bez wstrzykiwania (n = 60). Wykonano trzy powtórzenia biologiczne. (B) Częściowe wyklucie z pocioreczki zaobserwowano u dużej liczby komarów, które nie przeżyły. Słupki błędów reprezentują standardowy błąd średniej (SEM).

figure-results-4
Rysunek 4: Szybkość wykluwania, ocena płci i przeżywalność osobników dorosłych. (A) Porównywalny czas wykluwania zaobserwowano po wstrzyknięciu poczwarkom 0,01% FGD (24 h = 80% i 48 h = 20%) w porównaniu do poczwarek niewstrzykniętych (24 h = 83% i 48 h = 17%). (B) Przybliżony równy odsetek wyklutych samców i samic zaobserwowano dla poczwarek wstrzykniętych 0,01% FGD (samice = 48% i samce = 52%) oraz poczwarek niewstrzykniętych (samice = 52% i samce = 48%). (C) Analiza przeżywalności wykazuje, że wstrzyknięcie 0,01% FGD nie wpływa na przeżywalność osobników dorosłych, ocenianą do 10. dnia po wykluciu. Wyniki reprezentują dane z trzech niezależnych eksperymentów z poczwarkami wstrzykniętymi 0,01% FGD (n = 60) oraz niewstrzykniętymi (n = 60) (równa liczba samców i samic). Słupki błędów reprezentują błąd standardowy średniej (SEM).

figure-results-5
Rysunek 5: Fenotyp dodatniej kontroli pseudo-guzów odzwierciedla skuteczny knockdown. Pseudo-guzy zaobserwowano na (A) brzusznej i (B) piersiowej kutykuli dorosłych komarów w 8. dniu po wstrzyknięciu dsSRPN2, lecz nie po wstrzyknięciu dsLacZ . (C) Obrazowanie przy większym powiększeniu (400X) (a) kutykuli oraz sekcja barwnych plam (b) wykazują skupiska ciemno zmelanizowanych komórek.

figure-results-6
Rycina 6: Ilościowe oznaczenie formowania się pseudo-guzów i obniżonego poziomu białka SRPN2. (A) Iniekcje na etapie poczwarki skutkują formowaniem się pseudo-guzów u 93,5% dorosłych osobników dsSRPN2 (n = 21) w porównaniu do 0% kontroli dsLacZ (n = 19). Wyniki uzyskane w 8. dniu po iniekcji. (B) Western blot (po lewej) pokazuje obniżone poziomy SRPN2 w izolatach białek hemolimfy dsSRPN2, ale nie w grupie dsLacZ ani w osobnikach nieiniekcyjnych (5. dzień po iniekcji). Wyniki oparte na trzech niezależnych eksperymentach. Stosowane rozcieńczenia przeciwciał anty-SRPN221 oraz anty-SRPN326 wynosiły odpowiednio 1:1 000 i 1:2 000. Przeciwciało kozie anty-królicze IgG-HRP (Produkt sc-2004, Santa Cruz Biotechnology, Dallas TX) zastosowano w rozcieńczeniu 1:5 000. Wszystkie poziomy białek zostały określone ilościowo (po prawej) na podstawie intensywności prążków (oprogramowanie ImageJ, NIH, Bethesda, MD), znormalizowane do SRPN3 i porównane statystycznie za pomocą nieparzystego testu t. P <0,05: *, P ≥0,05: n.s. (brak istotności statystycznej). Słupki błędów reprezentują błąd standardowy średniej (SEM).

Dyskusja

Obecne metody indukcji nietransgenicznego RNAi u komarów obejmują bezpośrednie wstrzyknięcie dsRNA do dorosłego hemocoela12,13 lub karmienie larw nanocząstkami powlekanymi spustem RNAi14-17 lub cząsteczkami dsRNA na bazie mikroalg18. Celowanie w dorosłego komara, choć niezwykle cenne, może wykluczyć dużą liczbę genów, które funkcjonują we wcześniejszych okresach rozwojowych. Knockdown zainicjowany przez żerowanie larw może prowadzić do niespójnych fenotypów w stadium dorosłym, częściowo ze względu na potencjał zmiennej trwałości białka w stadium poczwarki. W związku z tym wprowadzenie dodatkowej metody, która jest ukierunkowana konkretnie na inicjację RNAi podczas rozwoju poczwarki, zapewni środki do pełniejszej oceny funkcji genów w stadiach przeddorosłych, a także zwiększy możliwości oceny funkcji genów w stadiach dorosłych. Podobnie jak w przypadku podejścia opartego na wstrzyknięciu lub ekspresji dsRNA, nie można przewidzieć trwałości knockdownu genu. W związku z tym poziomy transkryptu lub białka powinny być oceniane pod kątem genu będącego przedmiotem zainteresowania w okresach rozwojowych. Chociaż obserwujemy kontynuację obniżonego poziomu białka w 5 dniu po wstrzyknięciu SRPN2 u zwierząt, którym wstrzyknięto SRPN2 dsRNA, czynniki takie jak obrót białka i okres półtrwania mogą się różnić dla różnych celów. Bardzo ważne jest również, aby upewnić się, że dsRNA, które ma być użyte do wstrzykiwań, jest dobrze skoncentrowane i wydaje się nienaruszone na żelu agarozowym. Zalecamy eksperymentatorom ponowną ocenę tych czynników, jeśli wyniki knockdown nie są wystarczające, a odpowiednie stężenia dsRNA mogą wymagać empirycznego przetestowania pod kątem określonych celów genowych.

Opisujemy metodę inicjacji interferencji RNA w stadium poczwarki rozwoju An. gambiae . Metoda ta polega na wprowadzeniu poprzez mikroiniekcję dsRNA bezpośrednio do hemokolu wczesnych poczwarek i pozwala na ocenę jakości iniekcji za pomocą znakowanego barwnikiem dsRNA. Możliwość wizualizacji jakości wstrzyknięcia stanowi krytyczne ulepszenie dla zapewnienia skutecznego knockdown i stanowi aspekt knockdown genu opartego na iniekcji, który nie był brany pod uwagę w większości wcześniej zgłoszonych protokołów opartych na dsRNA, koncentrujących się na stadium dorosłym. Celując w poczwarkę na początku tego okresu rozwojowego, geny, które mogą odgrywać rolę w tym krytycznym okresie rozwojowym lub we wczesnych stadiach dorosłości, mogą być oceniane funkcjonalnie. Dodatkowo metoda ta może umożliwić dostarczanie dsRNA do komórek i ustanowienie interferencji RNA w komórkach, które są dostępne podczas metamorfozy, ale mniej dostępne u w pełni ukształtowanych dorosłych komarów.

Niedawna analiza mikromacierzy przeprowadzona przez Harkera i in. (2012) zidentyfikowała 560 transkryptów An. gambiae , które były regulowane w górę lub w dół co najmniej 4-krotnie na różnych etapach rozwoju, od zarodka do dorosłego osobnika. Spośród 560 zidentyfikowanych transkryptów, zestaw 309 był regulowany w górę podczas rozwoju poczwarki27. Odkrycia te sugerują, że istnieje wiele wymagań dotyczących zróżnicowanej ekspresji genów w trakcie rozwoju komara, w tym tych, które występują w fazie poczwarki, czyli w okresie, w którym organizm przechodzi metamorfozę. U wielu gatunków owadów, w tym An. gambiae, geny zaangażowane w procesy takie jak rozwój (tj. białka kutykularne poczwarki i białka wiążące chitynę)27-31 i odpowiedź immunologiczną (tj. białka podobne do receptora Toll)27,32-34 są silnie eksprymowane w stadium poczwarki. Po pojawieniu się w pełni ukształtowanego dorosłego osobnika następuje ciągła ekspresja genów w odpowiedzi na zmiany środowiskowe i fizjologiczne35. Warto zauważyć, że we wczesnym okresie rozwoju dorosłego następuje wzrost ekspresji genów rozwojowych (tj. dorosłych białek kutykularnych i sarkoplazmatycznych)36, a także innych kluczowych genów (tj. białka specyficznego dla plemników i enzymów metabolizmu cytochromu P450)27,36.

Kontrola pozytywna zastosowana w opracowaniu tego protokołu, SRPN2, jest inhibitorem proteazy serynowej An. gambiae (serpin). SRPN2 odgrywa ważną rolę w negatywnej regulacji melanizacji owadów, wrodzonej odpowiedzi immunologicznej o szerokim spektrum u owadów21,22. Knockdown SRPN2 u dorosłych komarów powoduje powstawanie pseudoguza21,22, fenotypu, który można łatwo zaobserwować za pomocą mikroskopii świetlnej. Biorąc pod uwagę, że ten odrębny fenotyp można łatwo ocenić u żywych owadów, użyliśmy SRPN2 do początkowych wstrzyknięć RNAi w stadium poczwarki. Ponadto SRPN2 ulega ekspresji na wszystkich etapach rozwojowych37, zapewniając w ten sposób dobry cel do wstrzyknięcia RNAi w stadium poczwarki i oceny funkcji u wczesnej osoby dorosłej. Wykazaliśmy, że opracowana przez nas metoda jest w stanie wywołać podobne powstawanie pseudoguza melanotycznego u dorosłych osób w wyniku iniekcji dsRNA wykonanych w stadium rozwoju poczwarki. Opracowując ten protokół, zaobserwowaliśmy, że wstrzyknięcie we wczesnym okresie rozwoju poczwarki (tj. pierwsze 24 godziny po linieniu larwalno-poczwarkowym) ma kluczowe znaczenie dla uzyskania optymalnego pojawienia się dorosłego osobnika. W przypadku, gdy po wstrzyknięciu uzyskuje się słabe wschody, zalecamy ocenę stopnia zaawansowania larw z większą dokładnością, aby uzyskać poczwarki z mniej rozległym stwardnieniem naskórka i zapewnić wczesną iniekcję w stadium poczwarki. Co więcej, zminimalizowanie uszkodzeń naskórka skutkuje optymalnym tempem wynurzania, a zwiększenie powiększenia podczas wstrzykiwania może pomóc w zapewnieniu, że nakłuwany jest tylko zamierzony obszar zwierzęcia. Jeśli igła przebije się do naskórka brzusznego, gromadzenie się cieczy znakowanej barwnikiem będzie widoczne na zewnętrznej stronie poczwarki lub nasyci bibułę filtracyjną. Zdecydowanie zaleca się wyrzucenie poczwarek, które mają więcej niż jedno nakłucie naskórka.

Dzięki bogatemu doświadczeniu wielu laboratoriów w wykonywaniu iniekcji dorosłym komarom, wcześniej zidentyfikowane podejścia do mikroiniekcji można dostosować za pomocą prostych modyfikacji protokołu do wykorzystania w eksperymentach z RNAi poczwarki. Ogólnie rzecz biorąc, celem tej metody jest zapewnienie naukowcom możliwości rozszerzenia ram czasowych, w których można przeprowadzać odwrotne analizy genetyczne, co dodatkowo umożliwi badania, które będą wspierać rozwój nowych strategii kontroli wektorów. Co ciekawe, eksperymenty na innych gatunkach, takich jak Rhodnius prolixus i Spodoptera frugiperda, ujawniają, że efekty wyciszania genów są zwykle znacznie większe, gdy są inicjowanew stadiach przeddorosłych. Na wszystkich etapach rozwoju, knockdown genów za pośrednictwem RNAi jest przedmiotem rozważań dotyczących szybkości i trwałości wyciszania genów oraz stabilności białek kodowanych przez docelowe geny. Idealnymi genami docelowymi RNAi są zwykle te, które kodują białko lub RNA, które ma krótki okres półtrwania i wysoki wskaźnik rotacji11,40.

Podczas gdy strategie transgenicznego RNAi mogą być również stosowane w celu rozwiązania problemów dotyczących szybkości i trwałości RNAi w stadiach przeddorosłych, techniki transgeniczne mają wiele wad (np. czas potrzebny do wygenerowania linii transgenicznych, eksperymentalne ramy czasowe dla komarów w celu wytworzenia owadów o regulowanej ekspresji dsRNA oraz utrzymanie stad transgenicznych). W przeciwieństwie do tego, nasz protokół zapewnia łatwiejszą i szybszą metodę inicjowania knockdownu genów podczas rozwoju poczwarki oraz w typach komórek, które powstają i są dostępne podczas metamorfozy, ale są mniej dostępne u dorosłych. Zastosowanie znakowanych barwnikiem zawiesin dsRNA pozwala na łatwą ocenę powodzenia iniekcji i dyspersji wprowadzonego materiału w poczwarkach. Nasze dane dotyczące początku tworzenia się guza u dorosłych, którym wstrzyknięto poczwarkę, w porównaniu ze zwierzętami, którym wstrzyknięto jako dorosłe, są zgodne z inicjacją knockdownu za pośrednictwem RNAi w stadium poczwarki. Korzystając z naszej linii komarów G3 i w naszych warunkach owadobójczych, obserwujemy tworzenie się dorosłego melanotycznego pseudoguza już po 10 dniach od wstrzyknięcia u dorosłych osobników, którym wstrzyknięto trzy do pięciu dni po wschodach. Wykonując wczesną iniekcję w stadium poczwarki, obserwujemy widoczne tworzenie się melanotycznego pseudoguza już po pięciu dniach od wstrzyknięcia (tj. trzy do czterech dni po wzejściu). Dane te sugerują, że metoda ta umożliwia zainicjowanie knockdownu genu w okresie wcześniej niedostatecznie zbadanym (tj. rozwoju poczwarki). Nasza metoda znakowania barwnikiem może również okazać się przydatna do opracowania nowych protokołów iniekcji larw, ze względu na półprzezroczysty charakter naskórka we wszystkich stadiach larwalnych. Podczas gdy kontrola zastosowana w tym badaniu wymaga progresji do stadium dorosłego, aby wykazać fenotyp knockdown, przyszłe eksperymenty mające na celu ocenę fenotypów specyficznych dla stadium poczwarki po wstrzyknięciu wczesnych poczwarek dostarczą cennych informacji na temat rozszerzenia tej metody na dodatkowe okresy rozwojowe, takie jak późny rozwój poczwarki. Podsumowując, metoda ta zapewnia cenny protokół RNAi do inicjacji fazy poczwarki w procesie knockdownu genu za pośrednictwem RNAi i rozszerza funkcjonalne narzędzia genomiczne dostępne do wykorzystania w społeczności badawczej owadów wektorowych.

Oświadczenia

Otwarty dostęp do tego artykułu wideo jest opłacany przez firmę Biogen.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować dr Flaminii Catteruccii i jej grupie badawczej (Harvard School of Public Health, Boston, MA) za dostarczenie naszemu laboratorium kolonii G3 użytej w tych badaniach oraz za matrycę DNA LacZ. Dziękujemy Adamowi Jenkinsowi (Boston College, Chestnut Hill, MA) za pomoc w utrzymaniu owada. Wydział Biologii Boston College hojnie sfinansował badania związane z rozwojem tej techniki.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zestaw MEGAscript RNAiAmbionAM1626
Wtryskiwacz Nanoject IIDrummond3-000-204
Przełącznik nożny Nanoject IIDrummond3-000-026
Kapilary ze szkła borokrzemianowegoDrummond3-000-203-G/X
Szklany ściągacz do mikropipetNarishignePB-7
Fast Green FCF barwnikSigmaF7258Może zastąpić nietoksycznym barwnikiem spożywczym.
Plastikowe pipety transferoweThermo Scientific1371150¼ calowe odcięte od końcówki, aby uzyskać szerszy otwór.
Whatman " cienki" Bibuła filtracyjna GE Healthcare1001-090Jest to średnica 9 cm stopnia 1, ale może być zmieniona w zależności od rozmiaru wkładki iniekcyjnej.
Western blot " gruby" bibuła filtracyjnaBioRad107-3931Jest to bibuła filtracyjna zwykle stosowana do plam zachodnich.
szalki Petriego (60 mm x 15 mm)Fisher ScientificFB0875713A
Pędzel (rozmiar 0)Michael' s Rozmiari marka pędzla Art 10474940 mogą się różnić w zależności od dostępności i preferencji użytkownika.
Mikroskop świetlny preparacyjny ---- -----Może się to różnić w zależności od dostępności i preferencji użytkownika.

Bibliografia

  1. World Health Organization. World Malaria Report. , Available from: http://www.who.int/topics/malaria/en (2014).
  2. Kelly-Hope, L. A., McKenzie, F. E. The multiplicity of malaria transmission: a review of entomological inoculation rate measurements and methods across sub-Saharan Africa. Malar. J. 8 (1), 1-16 (2009).
  3. The malERA Consultative Group on Vector Control. A Research Agenda for Malaria Eradication: Vector Control. PLoS Med. 8 (1), e1000401(2011).
  4. Enyati, A., Hemmingway, J. Malaria Management: Past, Present, and Future. Annu. Rev. of Entomol. 55 (1), 569-591 (2010).
  5. Edi, C. V., et al. CYP6 P450 Enzymes and ACE-1 Duplication Produce Extreme and Multiple Insecticide Resistance in the Malaria Mosquito Anopheles gambiae. PLoS Genet. 10 (3), 1004236(2014).
  6. Mitchell, S. N., et al. Metabolic and Target-Site Mechanisms Combine to Confer Strong DDT Resistance in Anopheles gambiae. PLoS ONE. 9 (3), e92662(2014).
  7. Knox, T. B., et al. An online tool for mapping insecticide resistance in major Anopheles vectors of human malaria parasites and review of resistance status for the Afrotropical region. Parasite Vector. 7 (76), 1-14 (2014).
  8. Napoli, C., Lemieux, C., Jorgensen, R. Introduction of a Chimeric Chalcone Synthase Gene into Petunia Results in Reversible Co-Suppression of Homologous Genes. Plant Cell. 2, 279-289 (2002).
  9. Sen, G. L., Blau, H. M. A brief history of RNAi: the silence of the genes. FASEB J. 20 (9), 1293-1299 (2006).
  10. Romano, N., Macino, G. Quelling: transient inactivation of gene expression in Neurospora crassa by transformation with homologous sequences. Mol. Microbiol. 6 (22), 3343-3353 (1992).
  11. Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  12. Catteruccia, F., Levashina, E. A. RNAi in the Malaria Vector, Anopheles gambiae: Therapeutic Applications of RNAi: Methods and Protocols. Methods Mol. Biol. 555, 63-75 (2009).
  13. Garver, L., Dimopoulos, G. Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A). gambiae). J. Vis. Exp. (5), e230(2007).
  14. Mysore, K., Andrews, E., Li, P., Duman-Scheel, M. Chitosan/siRNA nanoparticle targeting demonstrates a requirement for single-minded during larval and pupal olfactory system development of the vector mosquito Aedes aegypti. BMC Dev. Biol. 14 (9), 1-16 (2014).
  15. Mysore, K., Flannery, E. M., Tomchaney, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Disruption of Aedes aegypti Olfactory System Development through Chitosan/siRNA Nanoparticle Targeting of semaphorin-1a. PLoS Negl. Trop. Dis. 7 (5), (2013).
  16. Zhang, X., Zhang, J., Zhu, K. Y. Chitosan/double-stranded RNA nanoparticle-mediated RNA interference to silence chitin synthase genes through larval feeding in the African malaria mosquito (Anopheles gambiae). Insect Mol. Biol. 19 (5), 683-693 (2010).
  17. Zhang, X., et al. Chitosan/Interfering RNA Nanoparticle Mediated Gene Silencing in Disease Vector Mosquito Larvae. J. Vis. Exp. (97), e52523(2015).
  18. Kumar, A., Wang, S., Ou, R., Samrakandi, M., Beerntsen, B. T., Sayre, R. T. Development of an RNAi based microalgal larvicide to control mosquitoes. Malaria World J. 4 (6), 1-7 (2013).
  19. Huvenne, H., Smagghe, G. Mechanisms of dsRNA uptake in insects and potential of RNAi for pest control: A review. J. Insect Physiol. 56 (3), 227-235 (2010).
  20. Burand, J. P., Hunter, W. B. RNAi: Future in insect management. J. Invertebr. Pathol. 112, S68-S74 (2013).
  21. Michel, K., Budd, A., Pinto, S., Gibson, T. J., Kafatos, F. C. Anopheles gambiae SRPN2 facilitates midgut invasion by the malaria parasite Plasmodium berghei. EMBO Rep. 6 (9), 891-897 (2005).
  22. An, C., Budd, A., Kanost, M. R., Michel, K. Characterization of a regulatory unit that controls melanization and affects longevity of mosquitoes. Cell Mol. Life Sci. 68 (11), 1929-1939 (2011).
  23. Horn, T., Boutros, M. E-RNAi: a web application for the multi-species design of RNAi reagents--2010 update. Nucleic Acids Res. 38, W332-W339 (2010).
  24. Benedict, M. Q. Methods in Anopheles Research. , Malaria Research and Reference Reagent Resource Center. (2014).
  25. Lyimo, E. O., Takken, W., Koella, J. C. Effect of rearing temperature and larval density on larval survival, age at pupation and adult size of Anopheles gambiae. Entomol. Exp. Appl. 63, 265-271 (1992).
  26. Michel, K., et al. Increased melanizing activity in Anopheles gambiae does not affect development of Plasmodium falciparum. Proc. Natl. Acad. Sci. 103 (45), 16858-16863 (2006).
  27. Harker, B. W., et al. Transcription Profiling Associated With Life Cycle of Anopheles gambiae. J Med Entomol. 49 (2), 316-325 (2012).
  28. Dotson, E. M., Cornel, A. J., Willis, J. H., Collins, F. H. A family of pupal-specific cuticular protein genes in the mosquito Anopheles gambiae. Insect Biochem. Molec. Biol. 28, 459-472 (1998).
  29. Hopkins, T. L., Krchma, L. J., Ahmad, S. A., Kramer, K. J. Pupal cuticle proteins of Manduca sexta: characterization and profiles during sclerotization. Insect Biochem. Molec. Biol. 30, 19-27 (1999).
  30. Liang, J., Zhang, L., Xiang, Z., He, N. Expression profile of cuticular genes of silkworm, Bombyx mori. BMC Genomics. 11 (173), 1-13 (2010).
  31. Zhou, X., Riddiford, L. M. Broad specifies pupal development and mediates the "status quo" action of juvenile hormone on the pupal-adult transformation in Drosophila and Manduca. Development. 129, 2259-2269 (2002).
  32. Luna, C., Wang, X., Huang, Y., Zhang, J., Zheng, L. Characterization of four Toll related genes during development and immune responses in Anopheles gambiae. Insect Biochem. Molec. Biol. 32, 1171-1179 (2002).
  33. Tauszig, S., Jouanguy, E., Hoffmann, J. A., Imler, J. -L. Toll-related receptors and the control of antimicrobial peptide expression in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (19), 10520-10525 (2000).
  34. Tryselius, Y., Samakovlis, C., Kimbrell, D. A., Hultmark, D. CecC, a cecropin gene expressed during metamorphosis in Drosophila pupae. Eur. J. Biochem. 204, 1-5 (1992).
  35. Goodisman, M. A. D., Isoe, J., Wheeler, D. E., Wells, M. A. Evolution of Insect Metamorphosis: a Microarray-Based Study of Larval and Adult Gene Expression in the Ant Camponotus Festinatus. Evolution. 59 (4), 858-870 (2005).
  36. Cook, P. E., Sinkins, S. P. Transcriptional profiling of Anopheles gambiae mosquitoes for adult age estimation. Insect Mol. Bio. 19 (6), 745-751 (2010).
  37. Suwanchaichinda, C., Kanost, M. R. The serpin gene family in Anopheles gambiae. Gene. 442 (1-2), 47-54 (2009).
  38. Araujo, R. N., et al. RNA interference of the salivary gland nitrophorin 2 in the triatomine bug Rhodnius prolixus (Hemiptera: Reduviidae) by dsRNA ingestion or injection. Insect Biochem. Molec. Biol. 36 (9), 683-693 (2006).
  39. Griebler, M., Westerlund, S. A., Hoffmann, K. H., Meyering-Vos, M. RNA interference with the allatoregulating neuropeptide genes from the fall armyworm Spodoptera frugiperda and its effects on the JH titer in the hemolymph. J. Insect Physiol. 54 (6), 997-1007 (2008).
  40. Scott, J. G., et al. Towards the elements of successful insect RNAi. J. Insect Physiol. 59 (12), 1212-1221 (2013).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Iniekcja dsRNAwyciszanie gen wrozw j w stadium poczwarkipseudoguzy melanotycznebia ko SRPN2iniekcja do hemolimfyznakowane barwnikiem dsRNAfunkcjonalne badania genomiczne

Powiązane artykuły