Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ex vivo Obrazowanie na żywo przerzutów do płuc i ich mikrośrodowiska

12.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53741

⸱

3 lutego 2016

 ,  ,  , 
1Department of Anatomy, University of California, 2Hubrecht Institute-Royal Dutch Academy of Science and University Medical Center Utrecht, 3Department of Cell and Developmental Biology, Sackler Faculty of Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy stosunkowo prostą metodę obrazowania na żywo ex vivo interakcji komórka nowotworowa - zrąb w obrębie przerzutów do płuc, wykorzystując fluorescencyjne reportery u myszy. Wykorzystując mikroskopię konfokalną z wirującym dyskiem, technika ta umożliwia wizualizację żywych komórek przez co najmniej 4 godziny i może być dostosowana do badania innych stanów zapalnych płuc.

Streszczenie

Przerzuty są główną przyczyną zachorowalności i śmiertelności związanej z rakiem. Przerzuty są procesem wieloetapowym, a ze względu na jego złożoność, dokładne procesy komórkowe i molekularne, które rządzą rozprzestrzenianiem się i wzrostem przerzutów, są nadal nieuchwytne. Obrazowanie na żywo pozwala na wizualizację dynamicznych i przestrzennych oddziaływań komórek i ich mikrośrodowiska. Guzy lite często dają przerzuty do płuc. Jednak anatomiczne położenie płuc stanowi wyzwanie dla obrazowania przyżyciowego. Protokół ten zapewnia stosunkowo prostą i szybką metodę obrazowania na żywo ex vivo dynamicznych interakcji między komórkami nowotworowymi i otaczającym je zrębem w obrębie przerzutów do płuc. Za pomocą tej metody można przez kilka godzin wizualizować w czasie rzeczywistym ruchliwość komórek nowotworowych, a także interakcje między komórkami nowotworowymi a komórkami zrębu w ich mikrośrodowisku. Używając transgenicznych fluorescencyjnych myszy reporterowych, fluorescencyjnej linii komórkowej, wstrzykiwanych fluorescencyjnie znakowanych cząsteczek i / lub przeciwciał, można uwidocznić wiele składników mikrośrodowiska płuc, takich jak naczynia krwionośne i komórki odpornościowe. Do obrazowania różnych typów komórek wykorzystano mikroskop konfokalny z wirującym dyskiem, który umożliwia długotrwałe, ciągłe obrazowanie z szybką, czterokolorową akwizycją obrazu. Filmy poklatkowe skompilowane ze zdjęć zebranych w wielu pozycjach i płaszczyznach ogniskowych pokazują interakcje między żywymi komórkami przerzutowymi i odpornościowymi przez co najmniej 4 godziny. Technika ta może być dalej wykorzystywana do testowania chemioterapii lub terapii celowanej. Co więcej, metoda ta może zostać zaadaptowana do badania innych patologii związanych z płucami, które mogą wpływać na mikrośrodowisko płuc.

Wprowadzenie

Najbardziej śmiertelnym aspektem raka są przerzuty, które odpowiadają za ponad 90% zachorowalności i śmiertelności związanej z rakiem1. Przerzuty są procesem wieloetapowym, a ze względu na jego złożoność, dokładne mechanizmy komórkowe i molekularne, które rządzą rozprzestrzenianiem się i wzrostem przerzutów, są nadal nieuchwytne. Aby uzyskać przerzuty, komórki nowotworowe w guzie pierwotnym muszą odłączyć się od sąsiednich komórek i błony podstawnej, przejść przez macierz zewnątrzkomórkową, wewnątrznaczyniowe, przemieszczać się przez naczynia krwionośne lub limfatyczne, wynaczynić w miejscu wtórnym, a na koniec przetrwać i ustalić guzy wtórne. Oprócz właściwości komórek nowotworowych, wkład mikrośrodowiska, które obejmuje sąsiedni zrąb wraz z normalnymi odpowiednikami komórek rakowych, ma kluczowe znaczenie dla wysiewu i tworzenia zmian przerzutowych2.

Tradycyjne metody badania siewu i wzrostu przerzutów badają stany statyczne, ponieważ tkanki są wycinane i cięte do histologii. Dane te generują jedynie migawkę tego wysoce dynamicznego procesu. Chociaż z tych badań można uzyskać pewne przydatne informacje, skomplikowany proces, w którym komórki nowotworowe i zrębowe oddziałują na siebie podczas tworzenia przerzutów, nie może być odpowiednio oceniony tymi metodami. Co więcej, nie jest możliwe uzyskanie wglądu w wzorce migracji komórek nowotworowych lub zrębowych, które są ważne w tworzeniu kolonii w odległym miejscu. Aby skutecznie badać proces przerzutowy, niezbędna jest wizualizacja różnych interakcji między komórkami nowotworowymi a ich mikrośrodowiskiem w sposób ciągły i w czasie rzeczywistym.

Płuco jest częstym miejscem przerzutów z guzów litych, takich jak rak piersi, jelita grubego, trzustki, czerniak i mięsak3. Obrazowanie przyżyciowe było wcześniej wykorzystywane do badania interakcji komórka-komórka w różnych modelach guza pierwotnego i przerzutów4,5. Metody obrazowania płuc u myszy, w tym obrazowanie przyżyciowe, obrazowanie przekroju płuc i test przerzutów do płuc ex vivo, zostały opublikowane6–9. Obrazowanie przyżyciowe płuc myszy wykorzystuje okno ssania klatki piersiowej w celu ustabilizowania płuc6. Metoda ta służy do obrazowania poklatkowego mikrokrążenia płucnego i przestrzeni pęcherzykowych. Anatomiczne umiejscowienie płuc stanowi wyzwanie dla obrazowania przyżyciowego. Aby uzyskać dostęp do płuc, należy otworzyć klatkę piersiową, co prowadzi do utraty podciśnienia i zapadnięcia się płuc. Ta metoda pozwala na wizualizację tylko niewielkiej części płuc i jest wymagająca technicznie; Niepotrzebna komplikacja w badaniach, które badają procesy niezależne od przepływu krwi. Co więcej, metoda ta wymaga również zagłuszania ruchu spowodowanego oddychaniem. Odbywa się to albo poprzez zbieranie obrazów między oddechami, albo podczas analiz po akwizycji obrazu10. Alternatywne obrazowanie wycinka płuca ex vivo zapewnia stabilność i głębokość, a także przygotowuje miąższ płuc do barwienia immunologicznego7. Jednak długotrwały proces cięcia prowadzi do znacznego opóźnienia między momentem uśmiercenia zwierzęcia a rozpoczęciem sesji obrazowania. Co więcej, proces cięcia płuc myszy powoduje znaczną śmierć komórek8, wpływając w ten sposób na jakość i ilość próbek obrazowania i być może niepotrzebnie zmieniając interakcje guz-zręb. Aby technicznie połączyć metody obrazowania przyżyciowego z obrazowaniem wycinków płuc, wykorzystując jednocześnie zalety tych dwóch technik, opracowano stosunkowo szybką i łatwą metodę obrazowania płuc ex vivo. Metodę tę uzyskano poprzez obrazowanie niepodciętych płatów całych płuc. Za pomocą tej metody można przez kilka godzin wizualizować w czasie rzeczywistym ruchliwość komórek nowotworowych, a także interakcje między komórkami nowotworowymi a komórkami zrębu w ich mikrośrodowisku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie opisane procedury muszą być wykonywane zgodnie z wytycznymi i przepisami dotyczącymi wykorzystania kręgowców, w tym po uzyskaniu uprzedniej zgody lokalnej Instytucjonalnej Komisji ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt (IACUC).

1. Generowanie przerzutów do płuc dla obrazowania żywych tkanek ex vivo (metoda transgeniczna lub wstrzyknięcie do żyły ogonowej)

UWAGA: Przerzuty do płuc można wywołać, wykorzystując genetycznie zmodyfikowane modele mysie lub poprzez dożylne (i.v) wstrzyknięcie komórek nowotworowych.

  1. Generowanie przerzutów do płuc do celów obrazowania poprzez krzyżowanie genetycznie zmodyfikowanego modelu mysiego z nowotworem z transgeniczną myszą reporterową, np., krzyżując model myszy z rakiem piersi, długiego powtórzenia końcowego wirusa guza piersi myszy – środkowego antygenu T poliomy (MMTV-PyMT)11 do ACTB-ECFP model mysi12.
    UWAGA: Model ACTB-ECFP wykazuje ekspresję ulepszonego cyjanowego białka fluorescencyjnego (ECFP) pod promotorem β-aktyny, w wyniku czego wszystkie komórki fluorescują w niebieskim kanale CFP. Niemniej jednak komórki nowotworowe są zdecydowanie najbardziej widoczne i pod mikroskopem jawią się jako skupiska komórek ECFP-dodatnich. W modelu mysim MMTV-PyMT rozwija się postępująca choroba, w której wzrost guza sutka wiąże się z rozsiewem komórek nowotworowych do obwodowych tkanek, zwłaszcza do płuc. U myszy MMTV-PyMT na tle genetycznym FVB/n mikroprzetwory można zaobserwować około 10–1 tygodnia życia. Zazwyczaj przekształcają się one w makroprzerzuty około 14 tygodnia życia.13.
    LUB
  2. Generowanie przerzutów eksperymentalnych z wykorzystaniem pierwotnych komórek lub syngenicznych linii komórkowych. Użyj in vitro zmodyfikowane pierwotne komórki nowotworowe lub linie komórkowe (np.., transdukcją), a następnie wstrzyknięciem dożylnym (i.v.)14.
    1. Krótko mówiąc, w niniejszym protokole należy wstrzyknąć (+) wykazujący ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) MMTV-PyMT linia komórkowa do fluorescencyjnych myszy reporterowych (ACTB-ECFP) lub myszy typu dzikiego. Następnie należy przeprowadzić wizualizację tych komórek, nazywanych komórkami VO-PyMT15 przy użyciu zielonego kanału GFP.
      UWAGA: Oryginalna linia komórkowa VO-PyMT została opracowana w Vanderbilt Orthopaedics w Nashville, TN. Skrót VO oznacza Vanderbilt Orthopaedics.
    2. Po wstrzyknięciu 106 komórki (w 200 µl), obserwuj ekstrawasację komórek nowotworowych natychmiast oraz do kilku godzin po wstrzyknięciu; obserwuj mikroprzerzuty w okresie od 1 do 3 tygodni po wstrzyknięciu oraz wykrywaj makroprzerzuty 3 tygodnie po wstrzyknięciu15.
      UWAGA: Można wstrzyknąć mniejszą liczbę komórek, aby wydłużyć czas od momentu iniekcji do wzrostu przerzutów.

2. Markowanie interesujących komponentów w mikrośrodowisku przerzutowym (transgeniczne i/lub wstrzykiwalne)

UWAGA: Markowanie można przeprowadzić za pomocą myszy transgenicznych i/lub różnych substancji wstrzykiwalnych. Należy upewnić się, że do markowania różnych typów komórek użyto różnych kolorów fluorescencji.

  1. Oznacz składniki mikrośrodowiska przerzutniczego z wykorzystaniem myszy transgenicznych. Skrzyżuj wcześniej wspomniany model mysi z nowotworem (np. MMTV-PyMT x ACTB-ECFP) z transgenicznym modelem mysim, w którym interesujące komórki zstrojowe są oznakowane białkiem fluorescencyjnym innym niż ECFP, np. c-fms-EGFP4,16.
    UWAGA: Oprócz wizualizacji komórek nowotworowych w kanale CFP, pozwala to na wizualizację komórek mieloidalnych w kanale GFP4.
    ORAZ/LUB
  2. Oznacz różne składniki mikrośrodowiska przerzutniczego przy użyciu substancji wstrzykiwalnych u transgenicznych myszy z reporterem fluorescencyjnym lub (niefluorescencyjnych) myszy typu dzikiego.
    UWAGA: Można wstrzyknąć kilka związków w celu oznakowania różnych elementów mikrośrodowiska przerzutniczego, np. przeciwciało Gr-1 sprzężone z AF647 jest tutaj wykorzystywane do oznakowania neutrofilli i niektórych monocytów13, a dekstrany o różnych masach cząsteczkowych służą do oznakowania naczyń włosowatych płuc. Sposób przygotowania tych substancji wstrzykiwalnych opisano w kroku 4.

3. Przygotowanie materiałów przed sekcją

  1. 2% Agaroza
    1. Odważyć 0,2 g agarozy i dodać do 10 ml 1 x PBS. Podgrzać roztwór, aby rozpuścić agarozę. Agaroza krzepnie w temperaturze pokojowej (RT), dlatego należy przechowywać ją w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C aż do momentu użycia do inflacji.
  2. Kontroler temperatury i CO2
    1. Sprawdzić poziom ddH2O w komorze nawilżającej. Uzupełnić w razie potrzeby. Włożyć płytkę konfiguracyjną do uchwytu płytki stopnia temperaturowego (komora klimatyczna). Włączyć kontroler CO2 i ustawić stężenie CO2 na 5%. Upewnić się, że przepływ powietrza jest ustawiony na 0,4 Nl/min.
    2. Otworzyć zawory powietrza i CO2. Włączyć kontroler temperatury. Upewnić się, że temperatura w komorze klimatycznej oraz pokrywy jest ustawiona na 37 °C.
    3. Zwolnić ciśnienie powietrza w mierniku CO2. Sprawdzić wzrost poziomu CO2; proces równoważenia może trwać do 30 min.
  3. Konfokalny mikroskop dyskowy (spinning disk)
    UWAGA: Szczegóły konfiguracji mikroskopu zostały opisane wcześniej4,17.
    1. Włączyć lasery (laser argonowy dla wzbudzenia 48 nm oraz lity laser 405 nm, 561 nm i 640 nm). Włączyć mikroskop, kamerę, jednostkę sterującą dyskiem, AOTF, jednostkę sterującą laserem oraz kontroler kamery.
    2. Otworzyć migawkę mikroskopu, uruchomić komputer obsługujący mikroskop i otworzyć oprogramowanie.
  4. Przygotowanie narzędzi i platformy do sekcji.
    1. Włączyć sterylizator koralikowy i poczekać, aż osiągnie 250 °C. Oczyścić 2 pary nożyczek chirurgicznych i pęsety wodą z mydłem. Sterylizować narzędzia przez co najmniej 30 s. Pozostawić narzędzia do ostygnięcia. Jako platformy do sekcji użyć pokrywki polistyrenowej. Przykryć ją kawałkiem chłonnego papieru laboratoryjnego.

4. Przygotowanie wstrzykiwanych próbek

UWAGA: W zależności od okresu półtrwania i preferowanej odpowiedzi, należy wstrzyknąć przeciwciała znakowane fluorescencyjnie i/lub cząsteczki fluorescencyjne albo bezpośrednio przed uśmierceniem zwierzęcia, albo od kilku godzin do kilku dni wcześniej.

  1. Aby obrazować neutrofile i monocyty Gr1-dodatnie, przygotować w komorze z laminarnym przepływem powietrza strzykawkę zawierającą 7 µl roztworu zapasowego przeciwciała przeciw Gr-1 sprzężonego z AF647 (1 mg/ml) w 10 µl sterylnego PBS. Do strzykawki założyć igłę 27 G ½.
  2. Aby obrazować naczynia włosowate płuc, przygotować drugą i trzecią strzykawkę z 100 µl roztworu dekstranu 70 kD sprzężonego z rodamyną (4 mg/ml) lub dekstranu 10 kD sprzężonego z AF647 (4 mg/ml). Do strzykawek założyć igły 27 G ½.
  3. Wstrzyknąć dożylnie (i.v.) roztwór przeciwciała sprzężonego z AF647 na 5 hr przed wycięciem płuc.
  4. Wstrzyknąć dożylnie (i.v.) jeden lub oba roztwory dekstranu bezpośrednio przed wycięciem płuc.

5. Przygotowanie płuc do obrazowania żywego ex vivo

UWAGA: Należy pracować jak najbardziej sterylnie i ostrożnie, aby uniknąć niepotrzebnej aktywacji komórek odpornościowych w płucach.

  1. Wstrzyknij myszy dopasowaną do protokołu zwierzęcego zatwierdzonego przez IACUC śmiertelną dawkę środka znieczulającego do jam ciała (i.p.), np. 1 ml 2,5% Avertinu. Odczekaj, aż mysz przestanie oddychać i całkowicie przestanie reagować na bodźce bolesne (ściśnięcie tylnej łapy).
    UWAGA: Należy unikać dyslokacji szyjnej oraz eutanazji dwutlenkiem węgla, ponieważ mogą one negatywnie wpłynąć na żywotność komórek płuc.
  2. Unieruchom mysz na stole sekcyjnym i wysterylizuj ją 70% etanolem.
  3. Za pomocą nożyczek chirurgicznych wykonaj najpierw poprzeczne nacięcie nadbrzusza przez skórę, a następnie podobne nacięcie przez otrzewną. Trzymaj stół sekcyjny w pozycji pionowej i przetnij aorty zstępującą tak, aby krew spłynęła do jamy brzusznej, a nie do klatki piersiowej.
  4. Wykonaj niewielki otwór w przeponie, aby zniwelować podciśnienie. Przetnij obszar wzdłuż 10. i 12. żebra, aby wyciąć przeponę i uzyskać widoczność płuc.
  5. Za pomocą nożyczek chirurgicznych przetnij skórę w górę aż do tchawicy nad klatką piersiową, pozostawiając samą klatkę piersiową nienaruszoną. Oddziel skórę od klatki piersiowej. Odsłoń tchawicę, usuwając otaczającą ją tkankę łączną, uważając, aby nie uszkodzić samej tchawicy (Rysunek 1A).
  6. Wykonaj niewielki otwór o średnicy około 1 mm w odsłoniętej tchawicy, równolegle do pierścieni chrzęstnych, jak najbliżej krtani (Rysunek 1B). Zachowaj ostrożność, aby nie przeciąć tchawicy całkowicie.
  7. Używając igły 20 G, delikatnie wprowadź ją na 4-5 mm do tchawicy, bez użycia siły (Rysunek 1D). Końcówka igły powinna być widoczna przez tchawicę (Rysunek 1C). Ustabilizuj igłę w tchawicy za pomocą pęsety. Alternatywnie można zawiązać szew wokół tchawicy, aby utrzymać igłę na miejscu.
    UWAGA: Zbyt głębokie wprowadzenie igły może doprowadzić do urazu carina (grzebienia tchawicy) lub spowodować nadmuchanie tylko jednej strony płuc.
  8. Napełnij strzykawkę 40 µl 2% agarozy o niskiej temperaturze topnienia w 37 °C (pobranej bezpośrednio z kąpieli termostatycznej). Upewniając się, że stół sekcyjny stoi pionowo, powoli wprowadź ciepłą agarozę przez igłę do płuc; użyj ~40 µl, aby nadmuchać płuca.
    UWAGA: Obserwuj nadmuchiwanie się płuc wewnątrz klatki piersiowej. Nie nadmuchuj płuc zbyt mocno, aby nie doszło do ich pęknięcia.
  9. Gdy płuca zostaną nadmuchane i wypełnią ~⅔ klatki piersiowej, odłącz strzykawkę, pozostawiając igłę w tchawicy, aby zapobiec wyciekowi agarozy.
  10. Wlej około 50 ml PBS o temperaturze 20 °C na nadmuchane płuca, aby agaroza wewnątrz płuc mogła stężnieć i zastygnąć. Powoli usuń igłę i zamknij tchawicę pęsetą, aby zapobiec wyciekowi niezastygłej agarozy.
  11. Odsłoń płuca, wykonując sternotomię, a następnie wyciń płuca. Podczas wycinania płuc przytrzymaj tchawicę, przecinając ją całkowicie. Delikatnie pociągnij tchawicę w górę, odcinając tkankę łączną i przełyk, wyciągając płuca z klatki piersiowej, aż zostaną one oddzielone od myszy (Rysunek 1E).
  12. Zanurz płuca w ciepłym medium RPMI-1640, aby wypłukać nadmiar krwi, a następnie delikatnie oddziel płaty, używając nożyczek i pęsety do przecięcia głównych oskrzeli płatowych w obrębie wnęki płuca (Rysunek 1F).
  13. Umieść płaty płuc płaską powierzchnią do dołu, aby zmaksymalizować powierzchnię obrazowania, w dołku 24-dołkowej płytki do obrazowania (Rysunek 1G). Dodaj 10 µl RPMI-1640 w 37 °C na wierzch płatów. Połóż kilka okrągłych szkiełek nakrywkowych o średnicy 15 mm na płatach, aby zapobiec ich pływaniu.
  14. Wlej ciepły PBS do sąsiednich dołków, aby zapobiec parowaniu medium RPMI-1640. Włóż płytkę 24-dołkową do ustabilizowanej komory klimatycznej i utrzymuj płaty płuc w temperaturze 37 °C w atmosferze powietrza i 5% CO2. Umieść komorę klimatyczną na stole mikroskopu konfokalnego.
    UWAGA: Można rozważyć zastosowanie innych mieszanin gazów (np. 5% O2, 5% CO2 w N2 w celu zbadania zachowania komórek w warunkach hipoksji/obniżonego poziomu tlenu).

Schemat chirurgicznego dostępu do tchawicy; etapy preparacji, metodologia ekstrakcji tkanek, analiza biologiczna.
Rysunek 1. Protokół przygotowania płuc do obrazowania na żywo. (A) Odsłonięcie tchawicy po przygotowaniu myszy. (B) Wykonanie niewielkiego nacięcia w odsłoniętej tchawicy równolegle do pierścieni chrzęstnych. (C) igłę 20 G wprowadzono na głębokość 4–5 mm do tchawicy. (DPodawanie przez instylację 400 µl 2% agarozy o niskiej temperaturze topnienia do płuc. (E) Nadmuchane płuca oddzielone od myszy. (F) Płaty oddzielone po nadmuchaniu. (G) Płaty umieszczono w dołku 24-dołkowej płytki do obrazowania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

6. Akwizycja i analiza obrazów

UWAGA: Obrazy można pozyskiwać przy użyciu różnych mikroskopów konfokalnych z dyskiem obrotowym, obsługiwanych przez różne programy komputerowe. W niniejszym protokole do akwizycji obrazów wykorzystano program µManager z autorskim mikroskopem konfokalnym z dyskiem obrotowym lub program Zen z dostępnym komercyjnie mikroskopem konfokalnym z dyskiem obrotowym, natomiast program Imaris służy do edycji i analizy filmów.

  1. Nabyć obrazy przy użyciu µManager. Szczegółowy protokół krok po kroku dotyczący akwizycji obrazów za pomocą oprogramowania µManager został opisany wcześniej18.
    LUB
  2. Nabyć obrazy przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu, takiego jak Zen (patrz Rysunek S1).
    1. Kliknąć zakładkę „Locate” i wybrać obiektyw (10x lub 20x) w narzędziu „Light Path” (Rysunek S1A, czerwona ramka). Następnie kliknąć „Eyes – DAPI”, aby obejrzeć kanał CFP przez okular (Rysunek S1A, niebieska ramka). Zlokalizować próbkę ręcznie za pomocą mikroskopu. Kliknąć „All Off” po wycentrowaniu tkanki w polu widzenia.
    2. Kliknąć zakładkę „Acquisition”, aby ustawić wszystkie parametry akwizycji obrazu.
    3. W narzędziu „Channels” kliknąć przycisk „+” (Rysunek S1B, czerwona ramka). Pojawi się menu wyszukiwania, w którym należy znaleźć barwnik(i) obecne w próbce w „Dye Database” (Rysunek S1B). Wybrać barwnik i kliknąć „Add”.
      UWAGA: Program zoptymalizuje wszystkie filtry. Barwnik można usunąć, wybierając go, a następnie klikając przycisk kosza (Rysunek S1B, żółta ramka).
    4. W menu „Acquisition Mode” ustawić „Binning” na 5x5. Dwukrotnie kliknąć ECFP w menu kanałów, aby go wybrać. Obniżyć moc lasera do 20%, aby zapobiec fotoblakaniu próbki podczas ustawiania parametrów akwizycji obrazu.
    5. Zaznaczyć pole „Tiles” w sekcji „Experiment Manager”, wówczas narzędzie do kafelkowania pojawi się w grupie narzędzi „Multidimensional Acquisition” (Rysunek S1C). Kliknąć przycisk „Advanced Setup”, aby wyświetlić obraz na żywo z kamery. Kliknąć przycisk „Add” w sekcji „Positions”, aby dodać od 4 do 6 pozycji do eksperymentu. Aby usunąć pozycję, należy ją zaznaczyć i kliknąć przycisk kosza.
    6. W grupie narzędzi „Acquisition Parameter” otworzyć narzędzie „Focus Strategy” i wybrać z listy rozwijanej „Absolute Fixed Z-position”.
    7. Zaznaczyć pole Z-Stack w sekcji „Experiment Manager”, wówczas narzędzie Z-Stack pojawi się w grupie narzędzi „Multidimensional Acquisition” (Rysunek S1D). Dwukrotnie kliknąć jedną z pozycji w sekcji „Positions” i nacisnąć „Live”. Ręcznie ustawić pierwszą i ostatnią pozycję pola obrazowania. Ustawić interwał na 4 µm.
      UWAGA: Program określi liczbę przekrojów dla wybranego zakresu i interwału. Idealnie jest zastosować 5-7 przekrojów, aby zapewnić odpowiednią wizualizację i szybką akwizycję obrazu.
    8. Zaznaczyć pole „Time Series” w sekcji „Experiment Manager”. W narzędziu „Time Series”, które pojawiło się w grupie narzędzi „Multidimensional Acquisition” (Rysunek S1E), ustawić żądany czas trwania („Duration”) oraz interwał („Interval”).
    9. W menu „Acquisition Mode” ustawić „Binning” na 2x2. Dwukrotnie kliknąć fluorofor w menu kanałów, aby go wybrać, i zwiększyć moc lasera do 10%. Nacisnąć „Live” i dostosować czas ekspozycji („Exposure Time”). Powtórzyć tę czynność dla każdego fluoroforu.
    10. Zaznaczyć pole „Enable Auto Save”. Wybrać folder i wpisać nazwę pliku. Wszystkie nabyte obrazy zostaną automatycznie zapisane w tym folderze.
    11. Kliknąć „Start Experiment” w sekcji „Experiment Manager”, aby rozpocząć akwizycję obrazu.
  3. Po akwizycji obrazów skompilować surowe dane w oprogramowaniu Imaris. Przekonwertować obrazy na pliki .ims i dokonać niezbędnych korekt. Szczegółowy protokół krok po kroku dotyczący konwersji plików, wprowadzania korekt i zapisywania filmów za pomocą Imaris został opisany wcześniej18.
  4. Podczas zapisywania filmu ustawić częstotliwość klatek („Frame Rate”) na 5 klatek na sekundę (fps).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wykorzystując konfokalną mikroskopię z dyskiem rotacyjnym, różnorodne modele mysie oraz substancje wstrzykiwalne, można wizualizować i śledzić w czasie mikrośrodowisko przerzutowe. Przy użyciu potrójnego transgenicznego modelu mysiego MMTV-PyMT; ACTB-ECFP; c-fms-EGFP różne komponenty komórkowe są znakowane fluorescencyjnie (Rysunek 2A, Film 1). Typowa struktura miąższu płuc może być wizualizowana w kanale CFP, ponieważ wszystkie komórki wykazują ekspresję ECFP pod promotorem β-a...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W artykule opisano szczegółową metodę obrazowania ex vivo na żywo przerzutów do płuc w mysich modelach przerzutów. Ten protokół obrazowania zapewnia bezpośrednią wizualizację dynamicznych i przestrzennych interakcji komórka nowotworowa - zrąb w mikrośrodowisku płuc. Jest to stosunkowo łatwa i szybka metoda, która pozwala na wiarygodne obrazowanie przerzutów do płuc przez co najmniej 4 godziny. Filmy uzyskane z tych eksperymentów mogą być wykorzystane do śledzenia dynamicznych procesów, takich jak ruchliwość komó...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z zatwierdzonymi przez IACUC protokołami, UCSF.

Podziękowania

Dziękujemy Nguyen H. Nguyen za jej pomoc techniczną i Audrey O'Neill za wsparcie przy użyciu mikroskopu konfokalnego Zeiss Cell Observer. Praca ta była wspierana przez stypendium podoktorskie Departamentu Obrony (W81XWH-11-01-0139) oraz Weizmann Institute of Science-National Postdoctoral Award Program for Advancing Women in Science (do V.P.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
MMTV-PyMT/FVB myszyJackson Laboratory2374Samice myszy
Myszy ACTB-ECFP/FVBUCSF Werb labSamice myszy
c-fms-EGFP/FVB myszyUCSF Werb labSamice myszy
Myszy FVBJackson Laboratory1800Samice myszy
GFP+ VO-PyMTUCSF Werb lab
70 000 kDa Dekstran, sprzężony z rodaminąInvitrogenD1818Rozcieńczyć do  4mg/ml w 1 x PBS i przechowywać w temperaturze -20  °C. Stosować 0,4 mg na zwierzę. 
10 000 kDa Dextran, Alexa Fluor 647 sprzężonyInvitrogenD22914Rozcieńczyć do  4 mg/ml w 1 x PBS i przechowywać w temperaturze -20  °C. Stosować 0,4 mg na zwierzę. 
Przeciwciało przeciw mysim Gr-1 Alexa Fluor 647UCSF Rdzeń przeciwciała monoklonalnegoStock 1 mg / ml. Stosować 7 ug na zwierzę.
Znieczulenie anestezjologicznezatwierdzone przez IACUC, stosowane do znieczulenia i/lub eutanezji
1X PBSUCSF urządzenie
PBS, sterylne USP Amresco INCK813-500MLUltra czysty gatunek do iniekcji dożylnej
styropianowaBędzie używana jako deska do rozwarstwiania
Cienkie nożyczki ostre Fine Science Tools14060-11
KleszczeSklep chirurgiczny RobozRS-5135
Sterylizator gorących koralikówFine Science Tools18000-45Włącz 30 minut przed użyciem
PowietrzeUCSF
TlenUCSF
Dwutlenek węglaUCSF
1 ml strzykawka bez igły Igła BD309659
27 G x 1/2   BD305109do iniekcji dożylnej
20 G x 1 igła, krótki skoś   BD305178
Agaroza niskotemperaturowa Lonza50111Aby przygotować 10 ml roztworu, odważyć 0,2 g agarozy, dodać do 10 ml 1 x PBS i podgrzać do rozpuszczenia. Agaroza zestala się w temperaturze pokojowej, więc utrzymuj w temperaturze 37 &stopni; C kąpiel wodna do momentu użycia do napompowania.
RPMI-1640 pożywka bez czerwieni fenolowejLife Technologies11835-030
24-dołkowa płytka obrazowa E& K scientificEK-42892
Szkiełka szklane, 15 mm Fisher Scientific22-031-144
Cyfrowy regulator CO2 i temperaturyOkolabDGTCO2BXhttp://www.oko-lab.com
Komora klimatycznaOkolabhttp://www.oko-lab.com
Cell Observer mikroskop konfokalny z wirującym dyskiemOprogramowanie Zeiss
Zen
Carl Zeiss IncZeiss Axiovert 200M
Kamera ICCDStanford PhotonicsXR-Mega-10EX S-30
Konfokalna głowica skanująca z wirującym dyskiemYokogawa CorporationCSU-10b
ImarisBitplane
mManagerVale lab, UCSFOprogramowanie open-source
komórki do hodowli komórkowychPlatforma Mikroskop odwrócony Zeiss

Bibliografia

  1. Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331 (6024), 1559-1564 (2011).
  2. Plaks, V., Kong, N., Werb, Z. The cancer stem cell niche: how essential is the niche in regulating stemness of tumor cells. Cell stem cell. 16 (3), 225-238 (2015).
  3. Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
  4. Egeblad, M., Ewald, A. J., et al. Visualizing stromal cell dynamics in different tumor microenvironments by spinning disk confocal microscopy. Dis Model Mech. 1 (2-3), 155-167 (2008).
  5. Ellenbroek, S. I. J., van Rheenen, J. Imaging hallmarks of cancer in living mice. Nat Rev Cancer. 14 (6), 406-418 (2014).
  6. Looney, M. R., Thornton, E. E., Sen, D., Lamm, W. J., Glenny, R. W., Krummel, M. F. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat Methods. 8 (1), 91-96 (2011).
  7. Thornton, E. E., Krummel, M. F., Looney, M. R. Live imaging of the lung. Cur Protoc Cytom. , (2012).
  8. Thornton, E. E., Looney, M. R., et al. Spatiotemporally separated antigen uptake by alveolar dendritic cells and airway presentation to T cells in the lung. J Exp Med. 209 (6), 1183-1199 (2012).
  9. Mendoza, A., Hong, S. -H., et al. Modeling metastasis biology and therapy in real time in the mouse lung. J Clin Invest. 120 (8), 2979-2988 (2010).
  10. Lelkes, E., Headley, M. B., Thornton, E. E., Looney, M. R., Krummel, M. F. The spatiotemporal cellular dynamics of lung immunity. Trends Immunol. 35 (8), 379-386 (2014).
  11. Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Mol Cell Biol. 12 (3), 954-961 (1992).
  12. Hadjantonakis, A. -K., Macmaster, S., Nagy, A. Embryonic stem cells and mice expressing different GFP variants for multiple non-invasive reporter usage within a single animal. BMC Biotechnol. 2, (2002).
  13. Casbon, A. -J., Reynaud, D., et al. Invasive breast cancer reprograms early myeloid differentiation in the bone marrow to generate immunosuppressive neutrophils. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (6), 566-575 (2015).
  14. Donovan, J., Brown, P. Parenteral injections. Curr Protoc Immunol. , (2006).
  15. Halpern, J., Lynch, C. C., et al. The application of a murine bone bioreactor as a model of tumor: bone interaction. Clin Exp Metastas. 23 (7-8), 345-356 (2006).
  16. Sasmono, R. T., Oceandy, D., et al. A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse. Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).
  17. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Dynamic, long-term in vivo imaging of tumor-stroma interactions in mouse models of breast cancer using spinning-disk confocal microscopy. Cold Spring Harb Protoc. (2), (2011).
  18. Bonnans, C., Lohela, M., Werb, Z. Real-time imaging of myeloid cells dynamics in ApcMin/+ intestinal tumors by spinning disk confocal microscopy. J Vis Exp. (92), (2014).
  19. Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., et al. Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance. Cancer cell. 21 (4), (2012).
  20. Cheng, N., Lambert, D. L. Mammary transplantation of stromal cells and carcinoma cells in C57BL/6J mice. J Vis Exp. (54), (2011).
  21. Al-Mehdi, A. B., Tozawa, K., Fisher, A. B., Shientag, L., Lee, A., Muschel, R. J. Intravascular origin of metastasis from the proliferation of endothelium-attached tumor cells: a new model for metastasis. Nat Med. 6 (1), 100-102 (2000).
  22. Wong, C. W., Song, C., et al. Intravascular location of breast cancer cells after spontaneous metastasis to the lung. Am J Pathol. 161 (3), 749-753 (2002).
  23. Liang, C. -C., Park, A. Y., Guan, J. -L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat protoc. 2 (2), 329-333 (2007).
  24. Nelson, K., Bobba, C., Ghadiali, S., Hayes, D. J., Black, S. M., Whitson, B. A. Animal models of ex vivo lung perfusion as a platform for transplantation research. World J Exp Med. 4 (2), (2014).
  25. Magness, S. T., Bataller, R., Yang, L., Brenner, D. A. A dual reporter gene transgenic mouse demonstrates heterogeneity in hepatic fibrogenic cell populations. Hepatology. 40 (5), 1151-1159 (2004).
  26. Motoike, T., Loughna, S., et al. Universal GFP reporter for the study of vascular development. Genesis. 28 (2), (2000).
  27. Srivastava, M. K., Andersson, A., et al. Myeloid suppressor cells and immune modulation in lung cancer. Immunotherapy. 4 (3), (2012).
  28. Craig, A., Mai, J., Cai, S., Jeyaseelan, S. Neutrophil recruitment to the lungs during bacterial pneumonia. Infect Immun. 77 (2), 568-575 (2009).
  29. Kreisel, D., Nava, R. G., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (42), 18073-18078 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Interakcje między guzami a zrąbemkonfokalna mikroskopia dysku obrotowegomyszy z reporterem fluorescencyjnymobrazowanie time-lapseruchliwość komórek nowotworowychinterakcje komórek odpornościowychinflacja płuc w agaroziewizualizacja mikrośrodowiska
Ex vivo Obrazowanie na żywo przerzutów do płuc i ich mikrośrodowiska
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.