Artykuł metodologiczny

Immunobarwiące fosfo-epitopy w narządach rzęskowych całych zarodków danio pręgowanego

DOI:

10.3791/53747

⸱

19 lutego 2016

 ,  , 
1Department of Biology, Virginia Commonwealth University, 2Center for Human Disease Modeling, Duke University Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisano techniki immunobarwienia fosfo-epitopów w całych zarodkach danio pręgowanego, a następnie przeprowadzania dwukolorowej fluorescencyjnej lokalizacji konfokalnej w strukturach komórkowych tak małych jak pierwotne rzęski. Techniki utrwalania i obrazowania mogą określać lokalizację i kinetykę pojawiania się lub aktywacji określonych białek.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szybka proliferacja komórek, specyficzna dla tkanek ekspresja genów i pojawienie się sieci sygnałowych charakteryzują wczesny rozwój embrionalny wszystkich kręgowców. Kinetyka i lokalizacja sygnałów - nawet w obrębie pojedynczych komórek - w rozwijającym się zarodku uzupełnia identyfikację ważnych genów rozwojowych. Opisano techniki barwienia immunologicznego, które, jak wykazano, definiują kinetykę sygnałów wewnątrzkomórkowych i całych zwierząt w strukturach tak małych, jak rzęski pierwotne. Techniki utrwalania, obrazowania i przetwarzania obrazów za pomocą skaningowego mikroskopu konfokalnego ze skaningiem mogą być wykonane w ciągu zaledwie 36 godzin.

Danio rerio) jest pożądanym organizmem dla badaczy, którzy chcą prowadzić badania na gatunku kręgowców, który jest przystępny cenowo i istotny dla chorób ludzkich. Genetyczne nokauty lub nokauty muszą być potwierdzone przez utratę rzeczywistego produktu białkowego. Takie potwierdzenie utraty białka można uzyskać za pomocą opisanych tutaj technik. Wskazówki dotyczące szlaków sygnałowych można również rozszyfrować za pomocą przeciwciał, które reagują z białkami, które zostały zmodyfikowane potranslacyjnie przez fosforylację. Zachowanie i optymalizacja stanu fosforylacji epitopu ma zatem kluczowe znaczenie dla tego oznaczania i jest osiągane przez ten protokół.

To badanie opisuje techniki utrwalania zarodków w ciągu pierwszych 72 godzin rozwoju i kolokalizacji różnych istotnych epitopów z rzęskami w pęcherzyku Kupffera (KV), nerce i uchu wewnętrznym. Techniki te są proste, nie wymagają preparacji i można je wykonać w stosunkowo krótkim czasie. Rzutowanie konfokalnych stosów obrazów na pojedynczy obraz jest użytecznym sposobem prezentowania tych danych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Techniki opisane tutaj są wynikiem badań, które miały na celu zdefiniowanie dalszych celów sygnałów Ca2+ podczas zdarzeń zachodzących we wczesnym okresie rozwoju, w tym zapłodnienia, gastrulacji, somitogenezy i formowania tułowia, oka, mózgu i narządów. 1-3 Pierwotne odkrycia embrionalnej sygnalizacji Ca2 + zależały od zastosowania naturalnych i zmodyfikowanych wskaźników Ca2 +, takich jak aequorin4 i fura-2. 5 Nawet przy obecnej technologii wykrywanie przejściowych wzrostów Ca2+ wymaga kłopotliwych narzędzi analitycznych i nie ujawnia celów takich sygnałów Ca2+.

To laboratorium bada sygnały Ca2+, które działają poprzez zależne od Ca2+/kalmoduliny (wielofunkcyjne) kinazę białkową znaną jako CaMK-II, enzym wzbogacony w ośrodkowy układ nerwowy i pierwotnie zidentyfikowany jako regulator długotrwałego wzmocnienia. 6 CaMK-II nie jest specyficzny dla mózgu, jest szeroko eksprymowany i wysoce konserwatywny przez cały okres życia i ciała gatunków w całym królestwie zwierząt, w tym bezkręgowców. 7,8 CaMK-II ma unikalną zdolność do podtrzymywania własnej aktywności nawet po obniżeniu poziomu Ca2+ ze względu na zdolność do autofosforylacji w Thr287. W tym stanie autofosforylacji CaMK-II pozostaje aktywny w sposób niezależny odCa2+/CaM, aż do defosforylacji. 6 Tak więc lokalizacja fosforylowanego CaMK-II (Thr287) może zidentyfikować komórki, w których wystąpiły naturalne, istotne podwyższenia Ca2 +.

Przeciwciało przeciwko autofosforylowanemu (P-Thr287) ssakowi CaMK-II zostało dobrze scharakteryzowane i początkowo było używane do lokalizacji aktywowanego CaMK-II w tkance mózgowej. 9 Danio pręgowany (Danio rerio) ma siedem genów CaMK-II10,11, których produkty białkowe zawierają sekwencję MHRQE[pT287]VECLK w tym regionie. 10,11 Ta sekwencja jest bardzo podobna do antygenu fosfopeptydowego użytego do wytworzenia tego króliczego przeciwciała poliklonalnego (MHRQE[pT]VDCLK; Upstate/Millipore) i dlatego nie było całkowitą niespodzianką, że to przeciwciało zareagowało krzyżowo z danio pręgowanym CaMK-II. To laboratorium wykazało, że przeciwciało to reaguje z danio pręgowanym CaMK-II proporcjonalnie do autofosforylacji i aktywności niezależnej odCa2+/CaM. 12 Wykazano również, że dodatkowe panspecyficzne przeciwciała CaMK-II reagują krzyżowo z danio pręgowanym CaMK-II. 13

To przeciwciało zostało użyte do wykazania, że CaMK-II danio pręgowanego jest preferencyjnie aktywowany w komórkach po jednej stronie pęcherzyka Kupffera (KV), narządu rzęskowego niezbędnego do ustalenia asymetrii lewo/prawo. 12 Przeciwciało to wykorzystano do wykazania, że CaMK-II jest przejściowo aktywowany w czterech sąsiednich komórkach po lewej stronie KV podczas dokładnie tej samej fazy rozwojowej, w której określa się położenie narządu. 12 Oprócz pęcherzyka Kupffera (KV), autofosforylowany (P-T287) znajdował się również w określonych miejscach wewnątrzkomórkowych w innych tkankach rzęskowych, w tym w nerkach, nerkach, neuromastach i uchu wewnętrznym. 12,13 W nerce danio pręgowanego P-T287-CaMK-II jest wzbogacony wzdłuż wierzchołkowej granicy rzęskowych komórek przewodowych oraz w obrębie rzęsek kloaki, gdzie wpływa na ich składanie. 13 Wreszcie, w rozwijającym się uchu wewnętrznym, P-T287-CaMK-II jest intensywnie skoncentrowany u podstawy rzęsek i wpływa na różnicowanie komórek poprzez szlak sygnałowy Delta-Notch. 14 Podsumowując, wykrycie aktywowanego CaMK-II wskazało miejsca wewnątrzkomórkowego uwalniania Ca2 + i rzuciło światło na potencjalne nowe szlaki sygnałowe.

Te odkrycia były całkowicie zależne od opracowania czułej i dokładnej metody lokalizacji aktywowanego (P-T 287-autofosforylowanego) CaMK-II. Opisano metody utrwalania i barwienia immunologicznego danio pręgowanego, nerki i ucha wewnętrznego. Opisano również ograniczenia tej techniki. Techniki te powinny być przydatne dla każdego badacza, który chce uzyskać obrazy o wysokiej rozdzielczości w dwóch kanałach fluorescencyjnych nie tylko fosfo-epitopów, ale dowolnego epitopu, podczas wczesnego rozwoju kręgowców.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Procedury dotyczące danio pręgowanego w tym protokole zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Virginia Commonwealth University.

1. Przygotowanie odczynników

  1. 4% PFA/PBS. Odważyć 8 g paraformaldehydu (PFA) w dygestorium. Pozostając jeszcze w dygestorium, rozpuścić suchy PFA w ~80 ml destylowanegoH2O, mieszając i podgrzewając do 50 °C. Mieszając, dodać 3 - 10 kropli świeżego 1N NaOH, aż PFA całkowicie się rozpuści i roztwór się sklaruje. Zdjąć z ognia i dodać 100 ml 2x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS). Doprowadzić objętość do 200 ml za pomocą destylowanegoH2O. Przed użyciem schłodzić do temperatury RT i potwierdzić pH 7,4. Przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C, ale zużyć w ciągu tygodnia.
  2. Używaj 100% metanolu bez żadnych suplementów. Używaj 95% etanolu bez żadnych suplementów.
  3. Przygotuj animację buforowaną fosforanami (PBT). Uzupełnij sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) 0,1% Tween-20. Dodać 0,5 ml 20% roztworu podstawowego Tween-20 do 100 ml 1x PBS. Sklep w RT.
  4. Przygotować buforowany fosforanami Triton-X (PBTx). Uzupełnij PBS o 0,1% Triton X-100. Dodać 0,5 ml bulionu 20% Triton X-100 do 100 ml PBS. Sklep w RT.
  5. Przygotuj 10% NGS/PBTx. Normalna surowica kozia (NGS) blokuje niespecyficzne miejsca wiązania. Przechowywać NGS w porcjach w temperaturze -20 °C. Aby użyć, dodaj 1 ml do 9 ml PBTx.
  6. Przygotować 50% glicerolu/PBS. Wymieszaj dokładnie równe części 2x PBS i 100% glicerolu. Sklep w RT.

2. Utrwalenie zarodka

  1. hodowla.Uzyskanie zarodków typu dzikiego (AB i WIK) lub transgenicznego (np. β-aktyna:CAAX-GFP) poprzez naturalne krzyżowanie. W razie potrzeby wstrzyknąć zarodki z konstruktami lub morfolinami, zgodnie z opisem. 15,16
  2. Hoduj zarodki.Pobrać zarodki i inkubować w temperaturze 28,5 °C w obecności 0,003% 1-fenylo-2-tiomocznika (PTU) w celu zablokowania pigmentacji zgodnie z opisem. 17
  3. naprawiać.Gdy zarodki osiągną pożądany etap rozwoju,18 należy znieczulić zarodki za pomocą MESAB, usunąć jak najwięcej wody systemowej i dodać świeże 4% PFA/PBS przez 3 - 4 godziny w temperaturze pokojowej. UWAGA: Czasami mniej niż 20 godzin po zapłodnieniu (hpf), należy utrwalić przed dechorionacją. Czasami po 20 hpf dechorionate przed utrwaleniem za pomocą dwóch par cienkich kleszczy punktowych pod mikroskopem preparacyjnym.
  4. Zmieniające się rozwiązania.Przenieść zarodki za pomocą pipety o szerokim otworze, zgodnie z opisem. 17 Zmień roztwory w probówkach do mikrowirówek z nakrętką o pojemności 1,5 ml, po prostu pozwalając zarodkom osiąść grawitacyjnie bez wirowania.
  5. Po utrwaleniu.Po 3 - 4 godzinach usuń PFA/PBS, zastąp 100% metanolem i przechowuj w temperaturze -20 °C przez co najmniej 48 godzin. UWAGA: Aby uzyskać maksymalną immunoreaktywność P-CaMK-II, ogranicz całkowity czas przechowywania metanolu do jednego tygodnia.

3. Barwienie immunologiczne całych zarodków

  1. Umieścić co najmniej 10 zarodków dla każdego warunku doświadczalnego w zakręconej 1,5 ml probówce do mikrowirówki i oznaczyć je.
  2. Pozwól zarodkom się uspokoić. Usuń i wyrzuć metanol i ponownie nawodnij za pomocą płynów do płukania progresywnego zawierających 0,5 ml alkoholu etylowego o malejących stężeniach, jak wskazano w następnym kroku. Każdy krok to 5 minutowe mycie z bujaniem.
  3. Stopniowo nawadniaj za pomocą tych 5 roztworów: 66% etanol/33% PBTx, 33% etanol/66% PBTx, 100% PBTx, 100% PBTx (jest to pierwsze powtórzenie PBTx), 100% PBTx (jest to drugie powtórzenie PBTx).
  4. Usuń ostatnie pranie PBTx. Dodać 0,5 ml 10% NGS/PBTx. Inkubować przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze pokojowej z delikatnym kołysaniem, a następnie wyjąć i wyrzucić roztwór.
  5. Przygotować pierwszorzędowy roztwór przeciwciała, rozcieńczając go w 10% NGS/PBTx. W przypadku barwienia koimmunologicznego należy najpierw użyć przeciwciała o wyższym powinowactwie. W tym badaniu należy inkubować z mysim przeciwciałem monoklonalnym antyacetylowanej tubuliny rozcieńczonym w stosunku 1:500. Na przykład, jeśli jest 10 próbek, połącz 6 μl podstawowego roztworu przeciwciała z 3 ml 10% NGS/PBTx, a następnie rozprowadź 0,3 ml tego roztworu do każdej probówki.
  6. Dodać 0,2 - 0,5 ml rozcieńczonego przeciwciała pierwszorzędowego do każdej probówki, aby zanurzyć wszystkie zarodki. Inkubować z delikatnym kołysaniem O/N przy RT.
  7. Rano usuń i wyrzuć roztwór przeciwciał. Dodać 0,5 ml 2% NGS/PBTx, aby zmyć nadmiar przeciwciał pierwszorzędowych. Delikatnie kołysz przez 5 min. Usuń i wyrzuć roztwór. Powtórz dwa razy.
  8. Przyciemnij górne światła i rozcieńcz odpowiednie fluorescencyjnie sprzężone przeciwciało drugorzędowe w 10% NGS/PBTx, tak aby każdy warunek zawierał co najmniej 0,5 ml. Z mysim przeciwciałem pierwszorzędowym przeciwko acetylowanej tubulinie użyj zielono-fluorescencyjnego barwnika koziego anty-mysiego IgG w rozcieńczeniu 1: 500.
  9. Inkubować przeciwciało drugorzędowe przez 4 godziny, delikatnie kołysząc w temperaturze pokojowej w ciemności. Od teraz przetwarzaj próbki pod przyciemnionym światłem i inkubuj w ciemnym pojemniku lub zawijając w folię aluminiową.
  10. Pod koniec inkubacji należy usunąć i wyrzucić drugorzędowy roztwór przeciwciała. Dodaj 0,5 ml 2% NGS/PBTx do przemycia. Delikatnie kołysz przez 5 min. Usuń i wyrzuć roztwór. Powtórz dwa razy.
  11. W przypadku współbarwienia immunologicznego należy uzyskać drugie przeciwciało pierwszorzędowe od innego gatunku niż pierwsze przeciwciało pierwszorzędowe. W tych badaniach po królickim przeciwciałie anty-fosfo CaMK-II należy zastosować kozie przeciwciało anty-królicze IgG sprzężone z czerwonym fluorescencyjnym barwnikiem.
  12. Rozcieńczyć królicze przeciwciało anty-fosfo CaMK-II w stosunku 1:20. Dla każdej probówki z zarodkami zawiesić w 0,3 ml 10% NGS/PBTx, a następnie dodać 15 μl podstawowego roztworu przeciwciała.
  13. Upewnij się, że zarodki są zanurzone, a światła przyciemnione. Inkubuj z delikatnym kołysaniem O/N przy RT w ciemności.
  14. Rano, przy przyćmionym świetle, wyjmij i wyrzuć roztwór przeciwciał. Dodać 0,5 ml 2% NGS/PBTx. Delikatnie kołysać przez 5 min. Usuń i wyrzuć roztwór. Powtórz dwa razy.
  15. Utrzymuj światła górne przyciemnione i wystarczająco rozcieńczone odpowiednim fluorescencyjnie sprzężonym przeciwciałem drugorzędowym, tak aby każdy warunek zawierał co najmniej 0,5 ml. W tym badaniu rozcieńczyć sprzężone z czerwonym barwnikiem kozie przeciwciało anty-królicze IgG (kanał czerwony) w stosunku 1:500 w 10% NGS / PBTx.
  16. Inkubować drugie przeciwciało drugorzędowe przez 4 godziny, delikatnie kołysząc w temperaturze pokojowej w ciemności.
  17. Pod koniec tej inkubacji i przy słabym oświetleniu usunąć i wyrzucić drugorzędowy roztwór przeciwciała. Dodać 0,5 ml PBTx. Delikatnie kołysać przez 5 min. Usuń i wyrzuć roztwór. Powtórz dwa razy. Przechowywać w PBTx lub 50% glicerolu/PBS, w zależności od procedury obrazowania.

4. Obrazowanie i przetwarzanie konfokalne

  1. Zamontuj zarodki do obrazowania. Umieść 1 - 5 zarodków na szklanym szkiełku. Stwórz komorę między szkiełkiem nakrywkowym a szkiełkiem nakrywkowym, używając fragmentów szkiełka nakrywkowego po obu stronach komory. Zazwyczaj cztery szkiełka nakrywkowe #1 są używane do wykonania tych stosów dystansowych bez uszczelniania.
    UWAGA: Nie jest wymagane żadne medium montażowe.
  2. Użyj obiektywu zanurzającego się w olejku 100X, aby ustawić ostrość pojedynczego zarodka za pomocą światła przechodzącego. Wyłącz światło. Włącz mikroskop konfokalny. Upewnij się, że odpowiednie lasery (zielony i/lub czerwony) są włączone i włączone jest akcesorium do zdalnego ustawiania ostrości.
  3. Włącz program konfokalny. Na pasku "Zdobywanie" wybierz odpowiedni cel. Na pasku "XY Basic" ustaw rozmiar obrazu na 1,024, klikając przycisk 1,024.
  4. Na pasku "Laser i detektor" kliknij czerwone pole 488 i zielone pole 568, aby włączyć laser i detektor dla każdego kanału. Ustaw otwór na średni i dostosuj wzmocnienie na pasku "Wzmocnienie" każdego kanału, aby uzyskać wizualizację.
  5. Na pasku "Ustawienia pobierania" kliknij "Na żywo", aby rozpocząć pobieranie obrazów. Na pasku "Ustawienia widoku" odznacz pole "Wymuś integralne powiększenie", aby wyśrodkować okno "Na żywo".
  6. Na pasku "Uzyskaj ustawienia", w zakładce "Z", przejdź przez warstwy obrazu. Po wybraniu liczby sekcji optycznych do włączenia do obrazu, przejdź do pewnego punktu w "środku" płaszczyzny z.
  7. Na karcie "Z" kliknij małe czerwone pole "Odniesienie". Spowoduje to wyzerowanie RFA w punkcie wybranym jako "środek". W polu oznaczonym "Rozmiar kroku" wybierz grubość warstw (idealna jest od 0,25 μm do 2,0 μm). Zwróć uwagę na pole "Rozmiar pliku" i spróbuj ograniczyć do 1 GB.
    UWAGA: Zazwyczaj uzyskuje się do 40 przekrojów optycznych o wielkości 0,5 - 1,0 μm, ale liczbę przekrojów można określić empirycznie.
  8. Aby znaleźć górną krawędź obrazu, kliknij kółko obok "Góra" i przejdź przez warstwy z. Teraz kliknij kółko obok "Na dole", komputer przeniesie obraz z powrotem do warstwy jako środka. Ponownie przejdź przez warstwy, aby znaleźć dolną krawędź obrazu.
  9. Kliknij ponownie "Na żywo" w polu "Ustawienia pozyskiwania", aby zatrzymać akwizycję lasera. W tym panelu kliknij czerwone pola oznaczone jako Średnia i Stos Z. Te pola zmienią kolor na zielony.
  10. W polu "Acquire Settings" (Ustawienia pobierania) kliknij "Pojedyncze", aby pobrać całą serię obrazów. Możesz monitorować postęp skanowania w obu kanałach i przez cały stos z.
  11. Aby zapisać, kliknij okno woluminu i kliknij "zapisz jako" i nazwij plik. Zapisz jako plik ".ids". Aby renderować plik woluminowo, gdy stos z jest nadal otwarty, wybierz menu rozwijane Dane i kliknij "renderowanie woluminu". Zapisz renderowany plik jako plik TIFF. Jest to wyświetlany obraz, który jest pokazany w tej publikacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Optymalne warunki do wizualizacji fosfo-epitopów

Metody opisujące immunolokalizację epitopów białkowych w zarodkach danio pręgowanego były stosunkowo rzadkie w porównaniu do metod lokalizacji mRNA poprzez hybrydyzację in situ. Utrwalacze stosowane do lokalizacji epitopów białkowych w orzęsionych komórkach zarodków danio pręgowanego obejmowały 4% PFA/PBS i utrwalacz Denta, który jest mieszaniną metanolu ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metoda PFA/metanol została opracowana w tym laboratorium, a jej głównym celem była optymalizacja immunolokalizacji epitopu fosfo-T287-CaMK-II podczas rozwoju danio pręgowanego. Metoda ta z powodzeniem zlokalizowała P-CaMK-II podczas tworzenia kilku narządów rzęskowych, w tym danio pręgowanego KV,12 ucha wewnętrznego14 i nerki. 13 Technika ta była konieczna, zwłaszcza na etapie KW. Sukces tej metody wynika prawdopodobnie z połączenia a) minimalizacji autofluorescencji, b) zachow...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez grant Narodowej Fundacji Nauki IOS-0817658.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1-fenylo-2-tiomocznik (PTU)SigmaP-76290,12% roztwór podstawowy. Rozcieńczyć w stosunku 1:40 w wodzie systemowej
Alexa488 anty-mysia IgGLife TechnologiesA11001Koza poliklonalna, stosować w stosunku 1:500
Alexa488 anty-królicza IgGLife TechnologiesA11008Koza poliklonalna, stosować w stosunku 1:500
Alexa488 falloidynaLife TechnologiesA12379Ppreferencyjnie wiąże się z F-aktyną
Alexa568 anty-mysia IgGLife TechnologiesA11004Koza poliklonalna, stosować w 1:500
Alexa568 anty-królicza IgGLife TechnologiesA11011Koza poliklonalna, stosować w 1:500
anty-acetylowana α-tubulinaSigmaT7451Mysi monoklonalny, stosować w 1:500
anty-fosfo-T287 CaMK-IIEMD Millipore06-881Królik poliklonalny, stosować w 1:20
anty-total CaMK-IIBD Biosciences611292Mysz monoklonalna, stosować w stosunku 1:20
EtanolFisherS96857Klasa laboratoryjna, 95% denaturacja
KleszczeNarzędzia do nauki11252-20Dumont #5
Szkiełka nakrywkowe szklaneVWR16004-330#1  grubość
Szkiełka szklaneFisher12-550-15Szkiełka standardowe
MetanolFisherA411Przechowywać w zamrażarce
Probówki do mikrowirówekVWR20170-038nakrętką, niesterylne
Normalna surowica koziaLife Technologies16210-064Probówki z podwielokrotnością 1 ml, przechowywać w zamrażarce
ParaformaldehydSigmaP-6148Klasa odczynnika, krystaliczna
fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)Jakość Biologiczna119-069-13110x roztwór podstawowy lub wyprodukowany w laboratorium
Triton X-100SigmaBP-15110% roztwór w wodzie, przechowywać w RT
Tween-20Life Technologies8511310% roztwór w wodzie, przechowywać w mikroskopie
RT CompoundNikonE-600Montaż na stole bez wibracji
C1 Plus dwulaserowy skaningowy konfokalnyNikonC1 PlusUruchamiany przez program EZ-C1, ale aktualizacje używają " Elementy"
precyzyjnej z sól

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Webb, S. E., Miller, A. L. Calcium signalling during embryonic development. Nat Rev Mol Cell Biol. 4, 539-551 (2003).
  2. Webb, S. E., Miller, A. L. Ca2+ signalling and early embryonic patterning during zebrafish development. Clin Exp Pharmacol Physiol. 34, 897-904 (2007).
  3. Whitaker, M. Calcium at fertilization and in early development. Physiol. Rev. 86, 25-88 (2006).
  4. Yuen, M. Y., et al. Characterization of Ca(2+) signaling in the external yolk syncytial layer during the late blastula and early gastrula periods of zebrafish development. Biochim Biophys Acta. 1833, 1641-1656 (2013).
  5. Tombes, R. M., Borisy, G. G. Intracellular free calcium and mitosis in mammalian cells: anaphase onset is calcium modulated, but is not triggered by a brief transient. J. Cell Biol. 109, 627-636 (1989).
  6. Hudmon, A., Schulman, H. Neuronal Ca2+/Calmodulin-Dependent Protein Kinase II: The Role of Structure and Autoregulation in Cellular Function. Annu. Rev. Biochem. 71, 473-510 (2002).
  7. Tombes, R. M., Faison, M. O., Turbeville, C. Organization and Evolution of Multifunctional Ca2+/CaM-dependent Protein Kinase (CaMK-II). Gene. 322, 17-31 (2003).
  8. Braun, A. P., Schulman, H. The Multifunctional Calcium/Calmodulin-Dependent Protein Kinase: From Form to Function. Annu. Rev. Physiol. 57, 417-445 (1995).
  9. Rich, R. C., Schulman, H. Substrate-directed function of calmodulin in autophosphorylation of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II. J Biol Chem. 273, 28424-28429 (1998).
  10. Rothschild, S. C., et al. Tbx5-mediated expression of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II is necessary for zebrafish cardiac and pectoral fin morphogenesis. Dev Biol. 330, 175-184 (2009).
  11. Rothschild, S. C., Lister, J. A., Tombes, R. M. Differential expression of CaMK-II genes during early zebrafish embryogenesis. Dev Dyn. 236, 295-305 (2007).
  12. Francescatto, L., Rothschild, S. C., Myers, A. L., Tombes, R. M. The activation of membrane targeted CaMK-II in the zebrafish Kupffer's vesicle is required for left-right asymmetry. Development. 137, 2753-2762 (2010).
  13. Rothschild, S. C., Francescatto, L., Drummond, I. A., Tombes, R. M. CaMK-II is a PKD2 target that promotes pronephric kidney development and stabilizes cilia. Development. 138, 3387-3397 (2011).
  14. Rothschild, S. C., et al. CaMK-II activation is essential for zebrafish inner ear development and acts through Delta-Notch signaling. Dev Biol. 381, 179-188 (2013).
  15. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J Vis Exp. , e1113(2009).
  16. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. , e1115(2009).
  17. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). , University of Oregon Press. (1993).
  18. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
  19. Obara, T., et al. Polycystin-2 immunolocalization and function in zebrafish. J Am Soc Nephrol. 17, 2706-2718 (2006).
  20. Chitramuthu, B. P., Bennett, H. P. High resolution whole mount in situ hybridization within zebrafish embryos to study gene expression and function. J Vis Exp. , e50644(2013).
  21. Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature. 3, 59-69 (2008).
  22. Harris, P., Osborn, M., Weber, K. Distribution of tubulin-containing structures in the egg of the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus from fertilization through first cleavage. J Cell Biol. 84, 668-679 (1980).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mikroskopia konfokalnafiksacja PFA metanolemacetylowana tubulinafosfo CaMKIIp cherzyk Kupfferaobrazowanie ca ych preparat wskanowanie laserowe

Powiązane artykuły