Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Sekwencjonowanie heteroksylanów ścian roślin z wykorzystaniem technik enzymatycznych, chemicznych (metylacja) i fizycznych (spektrometria mas, magnetyczny rezonans jądrowy)

7.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53748

⸱

24 marca 2016

 ,  , 
1ARC Centre of Excellence in Plant Cell Walls, School of BioSciences, University of Melbourne

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje specyficzne techniki używane do strukturalnej charakterystyki sekwencji glikozylu na końcu redukującym (RE) i obszarze wewnętrznym heteroksylanów poprzez znakowanie RE 2 aminobenzamidem przed hydrolizą enzymatyczną (endoksylanazą), a następnie analizę powstałych oligosacharydów za pomocą spektrometrii mas (MS) i magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR).

Streszczenie

Ten protokół opisuje specyficzne techniki używane do charakterystyki sekwencji glikozylu w regionie redukcyjnym (RE) i regionie wewnętrznym heteroksylanów. Odskrochmielone ściany komórkowe bielma pszenicy wyizolowano jako pozostałość nierozpuszczalną w alkoholu (AIR)1 i sekwencyjnie ekstrahowano wodą (W-sol Fr) i 1 M KOH zawierającym 1% NaBH4 (KOH-sol Fr), jak opisano przez Ratnayake i in. (2014)2. Przyjęto dwa różne podejścia (zob. podsumowanie na rys. 1). W pierwszym, nienaruszone AX W-sol są traktowane 2AB w celu znakowania oryginalnej reszty cukru w łańcuchu szkieletowym RE, a następnie traktowane endoksylanazą w celu wytworzenia mieszaniny RE znakowanego 2AB i oligosacharydów redukujących region wewnętrzny. W drugim podejściu KOH-sol Fr jest hydrolizowany endoksylanazą, aby najpierw wytworzyć mieszaninę oligosacharydów, które są następnie znakowane 2AB. Enzymatycznie uwolnione ((nie)znakowane) oligosacharydy zarówno z W, jak i KOH-sol Fr są następnie metylowane, a szczegółowa analiza strukturalna zarówno natywnych, jak i metylowanych oligosacharydów jest przeprowadzana przy użyciu kombinacji MALDI-TOF-MS, RP-HPLC-ESI-QTOF-MS i ESI-MSn. Trawiene endoksylanazą KOH-sol AX charakteryzują się również magnetycznym rezonansem jądrowym (NMR), który również dostarcza informacji o konfiguracji anomerycznej. Techniki te można zastosować do innych klas polisacharydów przy użyciu odpowiednich endohydrolaz.

Wprowadzenie

Heteroksylany to rodzina polisacharydów, które są dominującymi niecelulozowymi polisacharydami pierwotnych ścian traw i drugorzędowych ścian wszystkich roślin okrytozalążkowych3-6. Szkielety ksylanu różnią się rodzajami i wzorcami substytucji resztami glikozylu (kwas glukuronowy (GlcA), arabinoza (Araf)) i nieglikozylowo (O-acetyl, kwas ferulowy) w zależności od rodzaju tkanki, etapu rozwoju i gatunku7.

Ściany bielma pszenicy (Triticum aestivum L.) składają się głównie z arabinoksylanów (AXs) (70%) i (1→3)(1→4)-β-D-glukanów (20%) z niewielkimi ilościami celulozy i heteromannanów (po 2%)8. Szkielet ksylanu może być w różny sposób niepodstawiony i przeważnie monopodstawiony (głównie pozycja O-2 i w mniejszym stopniu pozycja O-3) oraz dwupodstawiony (pozycje O-2 i O-3) z resztami α-L-Araf 9. Koniec redukcyjny (RE) heteroksylanów z roślin dwuliściennych (na przykład Arabidopsis thaliana)10 i nagonasiennych (na przykład świerka (Picea abies))11 zawiera charakterystyczną sekwencję glikozylowo-tetrasacharydową; -β-D-Xylp-(1→3)-α-L-Rhap-(1→2)-α-D-GalpA-(1→4)-D-Xylp. Aby zrozumieć biosyntezę i funkcję heteroksylanu (biologiczną i przemysłową), ważne jest pełne zsekwencjonowanie szkieletu ksylanu, aby zrozumieć typy i wzorce substytucji, a także sekwencję końca redukującego (RE).

Specyficzne techniki używane do strukturalnej charakterystyki końca redukującego (RE) i sekwencji glikozylu w obszarze wewnętrznym heteroksylanów są opisane w tym manuskrypcie. Techniki te polegają na znakowaniu fluoroforem (za pomocą 2 aminobenzamidu (2AB)) końca redukującego (RE) łańcucha heteroksylanowego przed hydrolizą enzymatyczną (endoksylanazą). To podejście, szczególnie w przypadku sekwencjonowania RE, zostało po raz pierwszy opisane przez laboratoriumYork 10,12-13, ale obecnie zostało rozszerzone o sekwencjonowanie regionu wewnętrznego i jest kombinacją ustalonych technik, które można w równym stopniu dostosować do wszystkich heteroksylanów, niezależnie od ich źródła izolacji. Podejście to można również zastosować do innych klas polisacharydów przy użyciu (jeśli są dostępne) odpowiednich endohydrolaz.

W obecnym badaniu, odkrochmalone ściany komórkowe bielma pszenicy zostały wyizolowane jako nierozpuszczalna w alkoholu pozostałość (AIR) i sekwencyjnie ekstrahowane wodą (W-sol Fr) i 1M KOH zawierającym 1% NaBH4 (KOH-sol Fr), jak opisano w Ratnayake et al. (2014)2. Uwolnione oligosacharydy zarówno z W-, jak i KOH-sol Fr są następnie metylowane, a szczegółowa analiza strukturalna zarówno natywnych, jak i metylowanych oligosacharydów jest przeprowadzana przy użyciu kombinacji MALDI-TOF-MS, ESI-QTOF-MS-sprzężonego z HPLC z rozdzielaniem chromatograficznym online przy użyciu kolumny RP C-18 i ESI-MSn. Trawienie endoksylanazy KOH-sol AXs charakteryzowało się również magnetycznym rezonansem jądrowym (NMR).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Etykietowanie redukującej reszty cukrowej (RE) W-sol AXs z 2-aminobenzamidem (2AB)

  1. Inkubować AX W-sol z 2AB (0,2 M) w obecności 1 M NaBH3CN (cyjanoborowodorek sodu) (pH 5,5) przez 2 godziny w temperaturze 65 °C w celu przekształcenia redukcyjnych końców łańcuchów szkieletowych polisacharydów w ich fluorescencyjne pochodne.
    UWAGA: Następujący krok należy wykonać w dygestorium, ponieważ NaBH3CN uwalnia trujący cyjanek w kontakcie z wodą.
    1. Odważyć NaBH3CN (62,8 mg) i rozpuścić w wodzie (1 ml) w probówce do mikrowirówek (1,5 ml) w celu przygotowania 1 M roztworu NaBH3CN. Rozpuścić odczynnik 2AB (27,2 mg) w 1 M roztworze NaBH3CN (1 ml) przez ogrzewanie w temperaturze 65 °C i dostosować pH mieszaniny reakcyjnej (0,2 M 2AB, 1 M NaBH3CN) do pH 5,5 za pomocą 10% kwasu octowego.
    2. Dodać 200 μl mieszaniny reakcyjnej (0,2 M 2AB, 1 M NaBH3CN) do W-sol AXs (1 mg) w szklanej probówce z nakrętką i wymieszać za pomocą mieszalnika wirowego. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 65 °C w dygestorium. Schłodzić zawiesinę do temperatury pokojowej i dodać 4 oblicze absolutnego etanolu.
    3. Umieścić zawiesinę w chłodni (4 °C) O/N w celu wytrącenia polisacharydów.
    4. Odwirować (1 500 x g, 10 min, RT) w celu usunięcia supernatantu. Dokładnie umyć granulat absolutnym etanolem (4x), acetonem (1x) i metanolem (1x), odwirowując między każdym praniem. Suszyć próżniowo w temperaturze 40 °C O/N.
      Uwaga: Intensywne mycie usuwa również resztki 2AB.

2. Wytwarzanie ksylooligosacharydów z 2 AX znakowanych AB W-sol

  1. Rozpuścić AXs W-sol znakowane 2AB (1 mg) w 500 μl buforu octanu sodu (100 mM, pH 5) w probówce do mikrowirówek (1,5 ml). Dodać 4 jednostki endoksylanazy (GH 11, [M1]) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 16 godzin.
  2. Zniszczyć aktywność enzymatyczną przez ogrzewanie mieszaniny reakcyjnej przez 10 minut we wrzącej łaźni wodnej. Schłodzić zawiesinę do temperatury RT i przenieść do szklanej rurki z nakrętką. Dodać 4 objętości bezwzględnego alkoholu etylowego i umieścić zawiesinę w chłodni (4 °C) O/N w celu wytrącenia niestrawionych polisacharydów.
  3. Wirówka (1 500 x g, 10 min, RT) w celu oddzielenia niestrawionych polisacharydów (osadów) i ksylooligosacharydów wytworzonych przez endoksylanazę (supernatant). Zdekantować supernatant do czystej szklanej probówki i umieścić go w ciepłej łaźni wodnej (40 °C).
  4. Odparować etanol pod strumieniem azotu gazowego do objętości punktu końcowego (~500 μl). Zamrażać supernatant w temperaturze -80 °C przez 4 godziny i suszyć zamrożony supernatant w liofilizatorze w celu odzyskania ksylooligosacharydów.

3. Wytwarzanie ksylooligosacharydów z KOH-sol AXs i etykietowanie 2AB

  1. Potraktuj KOH-sol AXs endoksylanazą (GH 11, [M1]) w celu wytworzenia ksylooligosacharydów, jak opisano powyżej (sekcje 2.1-2.4).
  2. Traktować ksylooligosacharydy generowane przez endoksylanazę z KOH-sol AXs mieszaniną reakcyjną 2AB (0,2 M 2AB, 1 M NaBH3CN), jak opisano powyżej (sekcje 1.1.1-1.1.2).
  3. Zdekantować supernatant do czystej szklanej probówki i umieścić go w ciepłej łaźni wodnej (40 °C). Odparować etanol pod strumieniem azotu gazowego do objętości punktu końcowego (~500 μl). Zamrażać supernatant w temperaturze -80 °C przez 4 godziny i suszyć zamrożony supernatant w liofilizatorze w celu odzyskania ksylooligosacharydów.

4. MALDI-TOF-MS

  1. Przygotowanie roztworu MALDI-matrix
    1. Dodać małą miarkę 2,5-dihydroxbenzoesowego kwasu (DHB) do 50% acetonitrylu (500 ml) zawierającego 0,1% kwasu mrówkowego w probówce (roztwór MALDI-matrix). Wymieszaj za pomocą wiru, jeśli szybko się rozpuści, dodaj kolejną małą miarkę DHB. Uwaga: Idealne stężenie roztworu MALDI-matrix wynosi 10 μg/μl-1.
  2. Przygotowanie płytki tarczowej MALDI
    1. Wodne próbki oligosacharydów (rodzime) (5–10 μg) (W-sol i/lub KOH-sol) należy umieścić na płytce docelowej MALDI. Dodać 0,3 μl roztworu z matrycą MALDI, używając oddzielnej końcówki i mieszać, pipetując w górę i w dół. Pozostaw mieszaninę do wyschnięcia w temperaturze RT.
      Uwaga: Prawidłowo wysuszone próbki powinny składać się z długich kryształów w kształcie igieł skierowanych w stronę środka plamki. Jeżeli osad jest lepki i/lub rozmazany, próbka może być albo zbyt skoncentrowana, albo składać się z soli, jest mało prawdopodobne, aby takie osady dawały dobre widma, a próbkę należy dalej oczyszczać.
    2. Wprowadź tarczę celowniczą do źródła MS i pracuj w trybie jonów dodatnich (+ive). Ustaw napięcie akceleratora na 19,0 kV przy źródle jonów 1 i 16,3 kV przy źródle jonów 2. Dostosuj moc lasera na większą niż 70%. Wybierz miejsce próbki na tabliczce tarczy MALDI i kliknij start, aby rozpocząć strzały laserowe.
      Uwaga: Nie wszystkie obszary celu będą generować sygnały. Określone miejsce da sygnał tylko dla kilku strzałów laserowych ze względu na wyczerpanie mieszaniny próbka/matryca lub charakterystykę kryształu.
      1. Przesuń laser w różne obszary celu podczas akwizycji i uśrednij około 200 losowych widm, aby uzyskać zadowalający stosunek sygnału do szumu.

5. ESI-QTOF-MS

  1. Analiza oligosacharydów generowanych przez endoksylanazę (natywnych) przy użyciu nano-HPLC sprzężonego z kwadrupolowym czasem przelotu (QTOF) MS z jonizacją elektrorozpylania (ESI) z separacją chromatograficzną online przy użyciu kolumny RP C-18 (75 μm x 150 mm; rozmiar kulki 3,5 μm).
    1. Przenieść mieszaninę wodnych oligosacharydów wytwarzanych przez endoksylanazę do fiolki i umieścić w próbniku automatycznym HPLC. Zaprogramuj gradient elucji 5-80% z fazami ruchomymi, odpowiednio 0,1% (v/v) kwasu mrówkowego w wodzie i 0,1% (v/v) kwasu mrówkowego w acetonitrylu, przez 60 minut.
    2. Dostosuj natężenie przepływu do 0,2 μl/min. Dostosuj tryb jonów dodatnich w zakresie skanowania 300-1,600 m/z i szybkości skanowania 0,5 skanowania/sekundę, korzystając z warunków źródła ESI w następujący sposób: gaz kurtynowy 10, GS1 4, temperatura źródła 100 °C, napięcie rozpylania jonów 2 300 V i potencjał deklastrowania 50 V. Uruchom program chromatograficzny LC i eluuj oligosacharydy. Wynikowy chromatogram jonów całkowitych (TIC) jest automatycznie zapisywany przez oprogramowanie.
    3. Otwórz zapisany TIC i wybierz wyodrębnij chromatogram. Wpisz oczekiwane masy (np. 271, 403, 535, 667, 799 i 931 m/z) w wierszu polecenia. Zeskanuj chromatogram, klikając Enter. Przetwarzaj wybrane skany jonowe danych chromatogramu ESI-QTOF MS za pomocą oprogramowania zgodnie z instrukcjami producenta14.

6. ESI-MSn

  1. Wprowadzić od 1 do 2 μl per-O-metylowanego oligosacharydu (metylowanego zgodnie z opisem Pettolino i wsp.1) Pobrać próbkę w 50% acetonitrylu do końcówki nanosprayu za pomocą strzykawki. Przytnij końcówkę nano-sprayu za pomocą noża do szkła, aby pasowała do dyskretnego uchwytu nano-sprayu dołączonego do MS.
  2. Ustaw masę zgodnie z oczekiwanym zakresem mas (200-1 500 m/z) i kurtynę gazową na 10, napięcie jonowe natrysku na 1 900 V i polaryzację na dodatnią.
  3. Naciśnij przycisk pozyskiwania, aby otworzyć odpowiednie okno, wprowadź nazwę pliku danych, aby uzyskać całkowity skan jonowy (ESI-MS1). Następnie naciśnij przycisk STOP.
  4. Zmień typ skanowania z jonów produktu na fragmentację piku zainteresowania. Wprowadź masę zainteresowania (np. 885 m/z), aby rozdrobnić i dostosować zakres mas (200-900 m/z). Naciśnij przycisk akwizycji i dostosuj energię zderzenia (w górę i/lub w dół w zakładce związku), aby osiągnąć całkowitą fragmentację jonu macierzystego (885 m/z) i uzyskać skan jonów fragmentacyjnych (ESI-MS2).
  5. Wprowadź masę interesującego nas jonu fragmentacyjnego (np. 711 m/z) i dostosuj zakres mas (200-720 m/z). Naciśnij przycisk namierzania i dostosuj energię zderzenia, aby osiągnąć całkowitą fragmentację jonu prekursorowego (711 m/z) i uzyskać skan jonów fragmentacyjnych (ESI-MS3).

7. Spektroskopia H1 NMR

  1. Rozpuść mieszaninę oligosacharydów wytworzonych przez endoksylanazę (KOH-sol, forma natywna) (~500 μg) w D2O (1,0 ml, 99,9%) w plastikowej probówce (15 ml). Zamrozić zawiesinę w temperaturze -80 °C przez 4 godziny i wysuszyć zamrożoną zawiesinę w liofilizatorze w celu odzyskania ksylooligosacharydów.
  2. Powtórzyć czynności 7.1 dwukrotnie, aby w pełni wymienićH2OnaD2O.
  3. Wysuszone oligosacharydy rozpuścić w D2O (0,6 ml, 99,9%) i dodać 0,5 μl acetonu (5% w D2O) jako wzorzec wewnętrzny. Przenieś zdeuterowane oligosacharydy do probówki z próbką NMR.
  4. Trzymaj probówkę NMR zawierającą próbkę za górę i włóż probówkę z próbką do plastikowego wirownika. Umieść kołpak w przykładowym mierniku głębokości. Popchnij lub pociągnij probówkę z próbką, aby wyregulować głębokość próbki, aby upewnić się, że linia środkowa górnych i dolnych mierników głębokości próbki jest równa.
  5. Wyjąć ogranicznik głębokości i włożyć próbkę do automatycznego próbnika podłączonego do spektrometru NMR 600 MHz wyposażonego w sondę kriogeniczną.
  6. Zaloguj się i otwórz oprogramowanie sterujące spektrometrem. Wprowadź nazwę przykładowego pliku. Otwórz istniejący zestaw danych, a następnie użyj polecenia "edc", aby zapisać go pod nową nazwą. Wpisz numer pozycji próbki w automatycznym próbniku i naciśnij "ENTER".
    Uwaga: Naciśnięcie przycisku "ENTER" spowoduje delikatne upuszczenie probówki z próbką do otworu magnesu, gdzie zostanie umieszczona w górnej części sondy.
  7. Ustaw żądaną temperaturę próbki, wpisując "edte" w wierszu poleceń. Poczekaj, aż temperatura próbki osiągnie żądaną wartość, zanim przejdziesz do następnego kroku. Wpisz " lock" w wierszu poleceń i wybierz odpowiedni rozpuszczalnik (D2O). Poczekaj, aż u dołu okna pojawi się komunikat "blokada zakończona".
  8. Wpisz "atmm" w wierszu poleceń i kliknij "optymalizuj" u góry paska menu atmm. Wybierz start do strojenia i dopasowania sondy do wybranego kanału (w tym przypadku 1H).
  9. Wpisz "topshim" w wierszu polecenia dla procesu podkładkowania, w którym dokonuje się drobnych korekt pola magnetycznego, aż do uzyskania jednolitego pola magnetycznego wokół próbki. Uzyskaj sygnał, wpisując "zg" w wierszu poleceń i wprowadź.
  10. Analizować widma za pomocą oprogramowania15 zgodnie z instrukcjami producenta z przesunięciem chemicznym 1H odniesionym do wewnętrznego wzorca acetonu przy 2,225 ppm.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Trawienie endoksylanazą AX-ów rozpuszczalnych w wodzie (W-sol) znakowanych 2AB generuje mieszaninę oligosacharydów RE znakowanych 2AB oraz szereg oligosacharydów nieznakowanych (bez znacznika 2AB) pochodzących z wewnętrznych regionów łańcucha ksylanu (Rysunek 1; na podstawie pracy Ratnayake et al.2). Następnie stosuje się szereg metod chromatograficznych w celu frakcjonowania złożonej mieszaniny izomerów. W końcowym etapie wykorzystuje się techniki MS ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Większość polisacharydów ściany komórkowej w fazie macierzowej ma pozornie losowo podstawione szkielety (zarówno z resztami glikozylowymi, jak i nieglikozylowymi), które są bardzo zmienne w zależności od gatunku rośliny, etapu rozwoju i typutkanki 3. Ponieważ polisacharydy są wtórnymi produktami genów, ich sekwencja nie jest pochodząca z matrycy, a zatem nie ma jednego podejścia analitycznego, takiego jak w przypadku kwasów nukleinowych i białek, do ich sekwencjonowania. Dostępność oczyszczonych, specyficznych...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie mamy nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ten projekt był wspierany przez fundusze z Commonwealth Scientific and Research Organisation Flagship Collaborative Research Program, przekazane Klastrowi Zboża o Wysokiej Zawartości Błonnika za pośrednictwem Food Futures Flagship. AB potwierdza również wsparcie w postaci grantu Australijskiej Rady ds. Badań Naukowych (ARC) dla Centrum Doskonałości ARC w zakresie Roślinnych Ścian Komórkowych (CE110001007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2 aminobenzamid (2AB)Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)A89804
borowodorek sodu (NaBH4)Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)247677Niebezpieczne, należy obchodzić się z
cyjanoborowodorkiem sodu (NaBH3CN)Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)156159Niebezpieczne, należy obchodzić się z nim ostrożnie
endo-1,4-β-ksylanaza M1 (z Trichoderma viride) (120101a)Megazym (www.megazyme.com)E-XYTR1
Tlenek deuteru (D2O)Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)151882
Liofilizator (CHRIST-ALPHA 1-4 LD plus)
RP C18 Kolumna Zorbax eclipse plus Agilent (2,1 razy; 100 mm; 1,8 &mikro; m rozmiar koralików) 
MicroFlex MALDI-TOF MS    (Model - MicroFlex LR)(Bruker Daltonics, Niemcy)
(ESI) -(QTOF) MS    (Model # 6520)(Agilent, Palo Alto, CA )
ESI-MSn  - pułapka jonowa  (Model # 1100 HCT)(Agilent, Palo Alto, Kalifornia).
Bruker Avance III 600 MHz -NMRBruker Daltonics, Niemcy
Topspin (wersja 3.0)-Biospin- oprogramowanie Bruker 
GC-MS (Model # 7890B)Agilent 

Bibliografia

  1. Pettolino, F. A., Walsh, C., Fincher, G. B., Bacic, A. Determining the polysaccharide composition of plant cell walls. Nature Protocols. 7, 1590-1607 (2012).
  2. Ratnayake, S., Beahan, C. T., Callahan, D. L., Bacic, A. The reducing end sequence of wheat endosperm cell wall arabinoxylans. Carbohydr. Res. 386, 23-32 (2014).
  3. Bacic, A., Harris, P. J., Stone, B. A. The Biochemistry of Plants, Vol. 14, Carbohydrates. Preiss, J. 14, Academic Press. San Diego. 297-371 (1988).
  4. York, W. S., O'Neill, M. A. Biochemical control of xylan biosynthesis - which end is up? Plant Biol. 11, 258-265 (2008).
  5. Fincher, G. B. Revolutionary times in our understanding of cell wall biosynthesis and remodeling in the grasses. Plant Physiol. 149, 27-37 (2009).
  6. Faik, A. Xylan Biosynthesis: News from the Grass. Plant Physiol. 153, 396-402 (2010).
  7. Scheller, H. V., Ulskov, P. Hemicelluloses. Annu. Rev. Plant Biol. 61, 263-289 (2010).
  8. Bacic, A., Stone, B. A (1→3)- and (1→4)-linked β-D-glucan in the endosperm cell-wall of wheat. Carbohydr. Res. 82 (13), 372-377 (1980).
  9. Comino, P., Collins, H., Lahnstein, J., Beahan, C., Gidley, M. J. Characterisation of soluble and insoluble cell wall fractions from rye, wheat and hull-less barley endosperm flours. Food Hydrocolloids. 41, 219-226 (2014).
  10. Pena, M. J., et al. Arabidopsis irregular xylem8 and irregular xylem9: Implicationsfor the Complexity of Glucuronoxylan Biosynthesis. Plant Cell. 19, 549-563 (2007).
  11. Andersson, S. I., Samuelson, O., Ishihara, M., Shimizu, K. Structure of the reducing end-groups in Spruce xylan. Carbohydr. Res. 111, 283-288 (1983).
  12. Mazumder, K., York, W. S. Structural analysis of arabinoxylans isolated from ball-milled switchgrass biomass. Carbohydr. Res. 345, 2183-2193 (2010).
  13. Kulkarni, A. R., et al. The ability of land plants to synthesize glucuronoxylans predates the evolution of tracheophytes. Glycobiol. 22 (2012), 439-451 (2012).
  14. Agilent MassHunter Workstation Software - Quantitative Analysis Familiarization Guide. , Agilent Technologies. Available from: http://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G3335_90061_Quant_Familiarization-EN.pdf (2010).
  15. Topspin User Manual. , Bruker. Available from: http://www.nmr.ucdavis.edu/docs/user_manual_topspin_ts30.pdf (2010).
  16. Domon, B., Costello, C. E. A systematic nomenclature for carbohydrate fragmentation in FAB-MS/MS spectra of glycoconjugates. Glycoconjugate. J. 5, 397-409 (1988).
  17. Hoffmann, R. A., Leeflang, B. R., De Barse, M. M. J., Kamerling, J. P., Vliegenthart, J. F. Characterisation by 1H-n.m.r. spectroscopy of oligosaccharides, derived from arabinoxylans of white endosperm of wheat, that contain the elements ----4)[alpha-L-Araf-(1----3)]-beta-D-Xylp-(1---- or ----4)[alpha- L-Araf-(1----2)][alpha-L-Araf-(1----3)]-beta-D-Xylp-(1----. Carbohydr. Res. 221, 63-81 (1991).
  18. Gruppen, H., Hoffmann, R. A., Kormelink, F. J. M., Voragen, A. G. J., Kamerling, J. P., Vliegenthart, J. F. Characterisation by 1H NMR spectroscopy of enzymically derived oligosaccharides from alkali-extractable wheat-flour arabinoxylan. Carbohydr. Res. 233, 45-64 (1992).
  19. Kosik, O., Bromley, J. R., Busse-Wicher, M., Zhang, Z., Dupree, P. Studies of enzymatic cleavage of cellulose using polysaccharide analysis by carbohydrate gel electrophoresis (PACE). Methods Enzymol. 510, 51-67 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Sekwencjonowanie heteroksylan wtraktowanie endoksylanazznakowanie 2ABanaliza MALDI TOF MSRP HPLC ESI QTOF MSanaliza ESI MSnspektroskopia NMRmetylacja oligosacharyd wcharakterystyka polisacharyd wsekwencjonowanie glikan w
Sekwencjonowanie heteroksylanów ścian roślin z wykorzystaniem technik enzymatycznych, chemicznych (metylacja) i fizycznych (spektrometria mas, magnetyczny rezonans jądrowy)
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.