Utrzymanie klatki populacyjnej Drosophila melanogaster

Podsumowanie

Ten manuskrypt przedstawia szczegółowy protokół regularnej hodowli populacji Drosophila melanogaster przy użyciu klatki dla populacji much.

Streszczenie

Duże ilości DNA, RNA, białek i innych składników komórkowych są często wymagane do eksperymentów biochemicznych i biologii molekularnej. Krótki cykl życiowy Drosophila umożliwia pobieranie dużych ilości materiału z zarodków, larw, poczwarek i dorosłych much, w sposób zsynchronizowany, przy niskich kosztach ekonomicznych. Główną strategią rozmnażania dużej liczby much jest użycie klatki dla populacji much. To użyteczne i powszechne narzędzie w społeczności Drososphila jest skutecznym sposobem na regularne wytwarzanie miligramów do dziesiątek gramów zarodków, w zależności od pożądanej jednorodności etapu rozwoju. Podczas gdy budowa klatki populacyjnej może być czasochłonna, utrzymanie klatki przez miesiące zajmuje znacznie mniej czasu i umożliwia szybkie zebranie materiału biologicznego w krótkim czasie. W artykule opisano szczegółowy i elastyczny protokół utrzymania klatki populacji Drosophila melanogaster, rozpoczynając od 1,5 g materiału zebranego z poprzedniego cyklu.

Wprowadzenie

Zdolność do łączenia podejść genetycznych i biochemicznych sprawiła, że Drosophila jest szczególnie odpowiednim organizmem do badań biochemicznych i biologii molekularnej^1-3. Badania te często wymagają dużych ilości materiału biologicznego, nie tylko od dorosłych muszek, ale także od larw⁴, poczwarek⁵ i zarodków^6-8. Aby uzyskać duże ilości materiału, naukowcy przeprowadzili hodowlę much przy użyciu dużych pojemników znanych jako "klatki populacyjne" much. Klatki te składają się z cylindra wykonanego z tworzywa sztucznego pokrytego siatką z obu stron, aby umożliwić wprowadzenie pokarmu do środka klatki bez ucieczki much. Klatki te mogą być domowej roboty^9-11 lub zakupione w firmie (patrz tabela konkretnych materiałów/sprzętu).

Główną zaletą korzystania z tego systemu do hodowli dużej liczby much jest to, że cykl muszki owocowej¹² może być kontrolowany w taki sposób, że wszystkie muchy rozwijają się w względnie zsynchronizowany sposób. Synchronizację tę osiąga się poprzez wysiewanie nowych zarodków, karmienie larw/much i poświęcanie dorosłych much w określonym czasie. Wykorzystanie zsynchronizowanej populacji much jest szczególnie przydatne w badaniach rozwojowych¹³.

Rozpoczęcie budowy nowej klatki populacji z kilku much jest czasochłonnym procesem wymagającym wielu cykli amplifikacji ^9-11. Nawet przy użyciu większych pojemników, takich jak butelki do hodowli much lub minicage, cały proces może trwać miesiącami. Aby uniknąć tego czasochłonnego kroku, wiele laboratoriów Drosophila regularnie utrzymuje takie klatki. Najwygodniej jest rozpocząć nową klatkę, zaczynając od pobrania zarodków z już utworzonej klatki populacyjnej. Ogólnie rzecz biorąc, większość laboratoriów utrzymuje klatki populacji typu dzikiego, takie jak Oregon R lub Canton S. Niniejszy manuskrypt przedstawia szczegółowy protokół utrzymania klatek dla populacji much.

Protokół

1. Rozpoczęcie cyklu: Siew zarodków

UWAGA: Cykl rozpoczyna się od 1,5 g zebranego materiału (mieszaniny złożonej z zarodków i/lub niektórych larw pierwszego stadium rozwojowego) z poprzedniego cyklu. Materiał ten zostanie umieszczony w plastikowym pojemniku (patrz tabela konkretnych materiałów/sprzętu) z aktywną mieszanką drożdży do fazy poczwarki. Pojemnik zostanie zamknięty po wprowadzeniu biologicznej mieszanki zarodków i larw z pokrywką, aby uniknąć ucieczki larw. Konieczne jest wykonanie otworów w pokrywie, aby umożliwić cyrkulację powietrza. Aby zapobiec wydostawaniu się larw przez otwory, stosuje się korki piankowe. Na koniec zaleca się noszenie rękawiczek i fartucha laboratoryjnego, nie tylko w tej sekcji, ale także w całym protokole, aby uniknąć zabrudzenia lub poplamienia ubrań wybielaczem.

1. Ustaw plastikowy pojemnik.
   1. Wykonaj trzy kwadratowe otwory żyletką w plastikowej pokrywie pojemnika o długości około 2.2 cm. Dodaj taśmę (taśmę do etykietowania 3/4 cala) w czterech rogach każdego otworu, aby zapewnić ścisłe dopasowanie do zatyczek piankowych (50 x 55 mm, d x l), a następnie umieść jedną piankową zatyczkę w każdym otworze.
   2. Przykryj wnętrze plastikowego pojemnika folią. Na tę folię dodaj warstwę bawełny, aby przykryć dno plastikowego pojemnika. Rozerwij bawełnę palcami.
2. Przygotuj pokarm dla much.
   1. Dodać 333 ml wody dejonizowanej do zlewki o pojemności 500 ml. Mieszając zlewkę z prętem magnetycznym, dodać 167 μl kwasu propionowego i 1,08 ml kwasu fosforowego z roztworów podstawowych (odpowiednio 99,96% i 85%).
   2. Powoli dodawaj 77,5 g aktywnych suchych drożdży, unikając dużych grudek. Po rozpuszczeniu suchych drożdży dodać 38,8 g sacharozy.
      UWAGA: Sacharoza powinna być ostatnim składnikiem, który należy dodać, ponieważ natychmiast po dodaniu tego składnika rozpocznie się fermentacja.
3. Natychmiast po rozpuszczeniu sacharozy wylej jedzenie na bawełnę i upewnij się, że bawełna jest równomiernie przykryta. Zamknij plastikowy pojemnik pokrywką, aby uniknąć zanieczyszczenia żywności przez muchy, które uciekły z laboratorium.
4. Zawiesić 1,5 g pobranych zarodków (bez dekorionacji) z poprzedniego cyklu w 5 ml 70% etanolu. Przeciąć na pół dwie bibuły filtracyjne i równomiernie rozprowadzić mieszaninę biologiczną na 4 kawałkach za pomocą szpatułki lub pipety transferowej z szeroką końcówką (w razie potrzeby przeciąć). Połóż bibuły filtracyjne na nasączonej bawełnie i zamknij pokrywkę. Na koniec inkubować plastikowy pojemnik w temperaturze pokojowej (24ºC) i wilgotności (35%) aż do stadium poczwarki.
   UWAGA: Plastikowego pojemnika nie należy umieszczać w wilgotnej komorze, w przeciwnym razie sprzyjać rozwojowi bakterii.

2. Kontynuacja cyklu: od zarodków do much.

UWAGA: Ta część cyklu trwa od zarodków umieszczonych w plastikowym pojemniku w dniu 1 do 9 dni później, kiedy dorosłe muchy wyłaniają się z poczwarek. W ciągu tych 8 dni nie trzeba nic robić, poza monitorowaniem, czy zarodki prawidłowo przechodzą do kolejnych etapów cyklu życiowego Drosophila, aż do ekleksji. Jeśli w tym czasie larwy zaczną umierać i czernieć, sprawdź, czy korki piankowe nie są zbyt szczelne i czy zapewniona jest odpowiednia wentylacja. Ten okres to dobry czas na oczyszczenie klatki populacji much z poprzedniego cyklu.

1. Obserwuj, jak zarodki stają się larwami w pierwszym stadium rozwojowym około 24 godzin po tym, jak dorosła samica umieściła je w pokarmie dla much (patrz krok 3). Powstałe larwy będą żywić się pokarmem na muchy przygotowanym w kroku 1 przez 4 dni, rosnąc i liniejąc dwukrotnie w larwy w 2. i 3. stadium rozwojowym.
2. Oczyść klatkę populacji much.
   1. Umieścić klatkę w temperaturze 4 °C na co najmniej 30 minut, aby spowolnić aktywność much. Zdejmij siatkę zakrywającą jedną stronę klatki i szybkim ruchem przykryj otwartą stronę dużą plastikową torbą stanowiącą zagrożenie biologiczne. Wlej zawartość klatki do torby.
   2. Gdy worek na zagrożenie biologiczne nadal zakrywa jedną stronę klatki, umieść klatkę pionowo nad zlewem stroną z workiem na zagrożenie biologiczne skierowaną w dół. Ostrożnie wyjmij plastikową torbę, aby zapobiec ucieczce much i wyrzuć ją do pojemnika na odpady stanowiące zagrożenie biologiczne.
   3. Ostrożnie otwórz górną siatkę na tyle, aby zrobić mały otwór, spłucz wnętrze klatki wodą, która zmyje muchy do zlewu. Powoli zwiększaj rozmiar otworu i wyeliminuj wszystkie muchy wewnątrz klatki.
   4. Wyczyść klatkę i obie siatki wodą z mydłem. Gdy siatki są jeszcze mokre, zabezpiecz je po obu stronach klatki do czyszczenia na sucho, a na koniec włóż do papieru laboratoryjnego, który zapobiegnie przywieraniu do klatki folii z tworzywa sztucznego przygotowanej w kroku 1.1.2. Teraz klatka jest gotowa do następnego cyklu.
3. Cztery dni po początkowym ustawieniu obserwuj przepoczwarzanie się larw. Larwy pozostaną na tym etapie jeszcze przez 4 dni.
   UWAGA: W tej fazie poczwarki pokryją całą powierzchnię bawełny wewnątrz plastikowego pojemnika.
4. W fazie poczwarki i przed pojawieniem się pierwszych much, otwórz plastikowy pojemnik i umieść plastikową folię zawierającą bawełnę ze wszystkimi poczwarkami na bibułce laboratoryjnej do namaczania wewnątrz czystej klatki populacyjnej. Zamknij siatkę podwójnym węzłem i wyczyść plastikowy pojemnik i pokrywkę do następnego cyklu.
   UWAGA: Poczwarki przymocowane do pokrywy należy wyrzucić i zniszczyć przez autoklawowanie lub zamrażanie przed zamknięciem.

3. Dorosłe muchy.

UWAGA: Po 4 dniach fazy poczwarki z poczwarek wyłonią się pierwsze muchy. W ciągu 24 - 48 godzin wszystkie muchy powinny się zamknąć. W tej części cyklu ważne jest, aby zapewnić im pożywienie w celu stworzenia odpowiedniego środowiska do rozmnażania.

1. Przygotuj tacki na melasę.
   1. Połączyć w kolbie o pojemności 1 l 556,25 ml dejonizowanego_H2O, 90 ml melasy i 22 g agaru. Autoklaw z mieszadłem przez 30 min, ostudzić i dodać 9,25 ml 10% Tegoseptu w 95% EtOH.
   2. Wlej mieszaninę do tacki na mięso o wymiarach 21 x 14,5 cm. Upewnij się, że objętość jest wystarczająca do pokrycia 15-17 tac. Odczekaj 10 - 20 minut, aby zastygła i przykryj każdą tacę folią z tworzywa sztucznego, aby uniknąć wyschnięcia. W tym samym czasie można przygotować kilka kolb o pojemności 1 l. Przechowuj tacki na melasę w temperaturze 4 ºC owinięte w folię, aż będą potrzebne.
2. Dodaj tacę na melasę pokrytą mokrymi drożdżami do klatki z dorosłymi muchami.
   1. Przed dodaniem płytki umieścić klatkę w temperaturze 4 ºC w chłodni na 30 minut.
   2. Dodać 200 ml dejonizowanego_H2Odo zlewki i powoli wlewać suche drożdże, mieszając łyżką. Przestań dodawać suche drożdże, gdy mieszanina stanie się mniej więcej konsystencji masła orzechowego, aby zapobiec utknięciu much w żywności.
      UWAGA: Ważne jest, aby nie dopuścić do zestalenia się roztworu spożywczego, w przeciwnym razie bardzo trudno będzie przykryć tackę na melasę i wyjąć jaja podczas procesu zbioru (patrz sekcja 4.3).
   3. Usuń plastikową folię z jednej tacki na melasę i przykryj ją warstwą świeżo przygotowanych mokrych drożdży za pomocą łyżki lub szpatułki. Upewnij się, że cała powierzchnia jest pokryta.
   4. Gdy klatka nadal znajduje się w chłodni, otwórz siatkę i ostrożnie dodaj do klatki tackę na melasę z mokrymi drożdżami. Zamknij siatkę i umieść klatkę w RT.
      UWAGA: Przydatne może być przykrycie talerza pustą tacą na mięso podczas wkładania, ale pamiętaj, aby nie blokować dostępu much do tacki na melasę.
3. Zmieniaj talerz na żywność co 24 - 48 godzin, aby drożdże nie wyschły. Dorosłe muchy są bardzo wrażliwe na wysuszenie.

4. Koniec cyklu: pobieranie zarodków

UWAGA: Najlepsza płodność much to 3 - 5 dni po eclosion. Dlatego zbiory w tym czasie zapewnią najlepszą wydajność zarodków. Po zakończeniu żądanych kolekcji cykl dobiega końca. Muchy powinny zostać uśmiercone, a klatka oczyszczona, jak określono w kroku 2.2.

1. Zazwyczaj, 2 dni po zamknięciu much, wprowadza się nową tackę na melasę ze świeżą mokrą karmą do klatki, jak wyjaśniono w sekcji 3.2.5. Aby zwiększyć wydajność składania jaj, za pomocą palców spraw, aby powierzchnia mokrych drożdży była jak najbardziej nieregularna. Jeśli w klatce znajduje się stara taca na żywność, przed dodaniem nowej płytki ostrożnie ją wyjmij i wyrzuć do worka na zagrożenie biologiczne. Kolejną wskazówką dotyczącą zwiększenia plonów jest usunięcie warstwy bawełny, aby wszystkie jaja zostały złożone w żywności. Utrzymuj klatkę w temperaturze pokojowej.
2. Obserwuj zarodki jako małe białe kropki.
   UWAGA: Jaja są gotowe do zbioru. Do rutynowej konserwacji klatki na muchy zalecany jest 2-dniowy czas. Kolekcja ta będzie zawierała głównie zarodki i kilka larw 1. stadium rozwojowego. Zobacz reprezentatywne wyniki dla typowych plonów pobranych zarodków dla różnych punktów czasowych pobierania.
3. Zbierz zarodki
   1. Umieść klatkę w chłodni na około 30 minut. W międzyczasie należy przygotować plastikowy pojemnik i pokarm dla much do następnego cyklu, jak wyjaśniono w sekcji 1.
   2. W tacce autoklawu o pojemności 8 l dodaj wodę do 1/4 całkowitej pojemności, a następnie dodaj 1 ml 10% Triton X-100. Gdy klatka znajduje się w chłodni, ostrożnie wyjmij płytkę melasy i umieść ją w torbie na wypadek zagrożenia biologicznego.
   3. Wyjmij tackę z torby i szybko zanurz ją (aby zapobiec ucieczce much) w roztworze detergentu w tacce autoklawu. Zamknij torbę z zagrożeniem biologicznym i włóż do pojemnika na zagrożenie biologiczne. Muchy nie utopią się w wodzie, która nie zawiera detergentu.
   4. Użyj dużego pędzla i pistoletu na wodę destylowaną, aby zmyć zarodki i drożdże z melasy. Wyrzuć płytki i melasę do pudełka z zagrożeniem biologicznym.
   5. Roztwór ostrożnie przelać przez zestaw trzech sit (najgrubsze sito 30 na górze, 40 na środku i 100 na dole). Umyj grudki na najwyższym poziomie pistoletem do wody destylowanej, aż nie pozostaną żadne grudki.
      UWAGA: Dorosłe muchy i larwy w^3. stadium rozwojowym zostaną zatrzymane na sicie 30.
      1. Wypłucz tackę autoklawu wodą destylowaną i wlej wodę do płukania przez sitka. Usuń górne sito i powtórz proces, jeśli pozostaną grudki drożdży. Większość larw 1. i wszystkich larw 2. stadium pozostanie na sicie 40.
   6. Usuń drugie sito. Żółtawy materiał na trzecim (dolnym) sicie jest mieszaniną zarodków i małych larw w 1. stadium rozwojowym. Użyj pistoletu do wody destylowanej, aby przesunąć wszystkie jajka na jedną stronę sita. Zbierz je szpatułką i zważ.
   7. Podczas tych cykli wydajność pobierania zarodków/larw waha się od 7 do 13 g. Do rozpoczęcia nowego cyklu należy użyć tylko 1,5 g tego materiału (punkt 1). Resztę zarodków należy wykorzystać do dalszej obróbki lub można je wyrzucić.

5. Dalsze przetwarzanie

UWAGA: Zarodki, które nie zostały wykorzystane do kontynuacji populacji, mogą być natychmiast wykorzystane do celów doświadczalnych lub alternatywnie mogą zostać zamrożone w temperaturze -80 °C. W przypadku obu opcji może być konieczne uprzednie usunięcie zarodków.

1. W celu dechorionacji myj zarodki przez 2 minuty w 50% roztworze wybielacza i dokładnie spłucz wodą destylowaną.
2. Aby zamrozić zarodki, najpierw wysusz, mocno dociskając ręcznikiem papierowym, a następnie zważyć i umieścić je za pomocą szpatułki w stożkowej probówce o pojemności 15 lub 50 ml. Na koniec zanurz stożkową rurkę w cieczy N₂ na kilka sekund.

Wyniki

Utrzymanie populacji much w klatkach opiera się na cyklu życiowym muchy. W związku z tym, po umieszczeniu początkowej mieszanki biologicznej embrionów i larw w plastikowym pojemniku (Rysunek 1A), zapłodnione jaja w ciągu nie więcej niż 2 dni przekształcą się w larwy, a larwy będą rosły przez 4 dni, przechodząc w sposób względnie zsynchronizowany przez kolejne stadia larwalne (patrz Rysunek 1B).

Po tym, jak larwy ukończą 3.^rd stadium larwalne, po którym przejdą w stadium poczwarki i pokryją powierzchnię waty wewnątrz plastikowego pojemnika, a także wewnętrzną powierzchnię pokrywy (Rysunek 1C). Ten okres pocierpienia będzie trwał przez kolejne 4 dni, aż muchy ukończą proces metamorfozy. W tym czasie zdecydowanie zaleca się przeniesienie much do klatki. Pierwsze dorosłe osobniki zaczną się wykluwać w 9. lub 10. dniu po rozpoczęciu cyklu (Rycina 1D) i do 1. dnia wszystkie z nich wyjdą z pociorek.

Najlepszą wydajność w pozyskiwaniu embrionów uzyskuje się od 3 do 5 dni po wykluciu (dzień 13 do 15), a następnie spada ona w 17. dniu (7 dni po wykluciu). Dlatego zaleca się dodanie ostatniej tacki ze świeżą pożywką w 13. dniu i zebranie jaj w 15. dniu (Rycina 1E i F). Pozwoli to na zebranie maksymalnej liczby embrionów. Dodanie trzeciego dodatkowego dnia przed zbiorem może spowodować nadmierne wysuszenie pożywki, co w konsekwencji zmniejszy wydajność pozyskiwanych embrionów. Tabela 1 przedstawia wydajność z 6 kolejnych cykli zbiorów, przy materiale początkowym 1,5 g w każdym cyklu, a Rycina 2 prezentuje zalecany harmonogram dla pełnego cyklu zbioru.

Materiał pobrany w odstępach 2-dniowych składa się głównie z embrionów. Obecna jest jednak niewielka liczba larw. W przypadku utrzymania klatek larwy te nie stanowią problemu, ponieważ pewien stopień asynchroniczności jest oczekiwany. Niemniej jednak, w niektórych eksperymentach biochemicznych czystość tych embrionów jest bardzo ważna, a jednocześnie niezbędne jest zebranie dużych ilości jaj w celu przeprowadzenia tych doświadczeń. Z tego powodu wykonano kilka krótkich, następujących po sobie zbiór, w odstępach 1 h i 3 h, po szybkim dodaniu w temperaturze RT nowej płytki z pożywką, aby oszacować wydajność i czystość uzyskiwanej tą metodą (Tabela 2 i Rysunek 3). Zbiory następujące po sobie w odstępach 1 h rozpoczęły się przy bardzo niskiej wydajności (14,5 mg), lecz następnie ilość embrionów zwiększała się przy każdym kolejnym pobraniu, z wyjątkiem ostatniego. Niska wydajność na początku może wynikać ze stresu much podczas procesu wymiany pożywki i ich późniejszej aklimatyzacji. Z drugiej strony, w pięciu sekwencyjnych zbiorach nie zaobserwowano larw (Rysunek 3A), co pokazuje, że krótsze okresy zbiorów zapewniają wyższą czystość. Jeśli wata nie zostanie usunięta z klatki, wzrasta prawdopodobieństwo, że larwy z wcześniejszych punktów czasowych pozostaną wewnątrz i przedostaną się do nowej płytki. Nawet po usunięciu waty, larwy mogą czasami przemieszczać się po ściankach klatki i dostać się do pożywki podczas zbioru.

W przypadku kolekcji prowadzonych seryjnie przez 3 h, wydajność wyniosła od 840 do 1250 mg, co stanowi około 10-krotność wydajności uzyskanej podczas kolekcji 1-godzinnych. Czystość tych embrionów wynosiła blisko 10% (Rysunek 3B). Sporadycznie obserwowano larwy. Niektóre badania rozwojowe wymagają bardzo ścisłej synchronizacji zbieranych embrionów. Aby zwiększyć czystość synchronizacji, zaleca się odrzucenie pierwszej płytki do kolekcji, ponieważ w nieidealnych warunkach samice mogą zatrzymywać dojrzalsze jaja i składać je po poprawie warunków, np. po wprowadzeniu nowej płytki. Należy również wiedzieć, że starsze dorosłe muchy (>6 dni) produkują mniej zsynchronizowane embriony. W celu precyzyjnej weryfikacji stopnia synchronizacji zaleca się barwienie DAPI zebranych embrionów.

Rycina 1. Drosophila melanogaster Cykl życiowy w klatce populacyjnej much. (A) Rozpoczęcie cyklu poprzez wysianie 1,5 g embrionów do plastikowego pojemnika. Dla odniesienia, w dolnym panelu długość papieru filtracyjnego wynosi 8,5 cm. (B) Larwy rosnące w sposób względnie zsynchronizowany 5 dni po rozpoczęciu cyklu. (C) W 8. dniu większość much znajduje się w stadium poczwarki. Dolne panele w B (B') i C (C') przedstawiają powiększenia zaznaczonych obszarów na górnych panelach. (DDorosłe muchy wykluły się z poczwarek 10 dni po rozpoczęciu cyklu.E) Dorosłe muchy w klatce populacyjnej przed rozpoczęciem procesu zbierania embrionów, w 15. dniu. Żółtawy materiał na pożywce dla much to zapłodnione jaja. (F) Zarodki (oraz kilka larw) zebrane z dna sita o najgrubszym oczku (100 μm) po pełnym cyklu klatkowym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Rycina 2. Harmonogram pobierania próbek z pełnego cyklu. Rycina 2 przedstawia zalecany harmonogram pełnego cyklu pobierania próbek. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej figury.

Rysunek 3. Czystość kolejnych próbek pobieranych w odstępach 1 h i 3 h. Reprezentatywny obraz zarodków pobranych w 1. godzinie (A) oraz 3 h (B) po dodaniu nowej tacki z pożywką. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Numer cyklu	Wydajność (g)
1	10.3
2	9.5
3	10.3
4	12.7
5	10
6	7.1

Tabela 1. Wydajność kilku serii cykli. Tabela 1 przedstawia wydajność z 6 kolejnych serii cykli, przy zastosowaniu 1,5 g materiału wyjściowego. W każdym cyklu ostatnią tackę z pożywką dodano w 13. dniu, a zbiór przeprowadzono w 15. dniu.

Kolekcja nr	Czas trwania pobierania (godz.)	Wydajność (mg)
1	1	14.5
2	1	21.6
3	1	56.1
4	1	160.1
5	1	106.1
1	3	960
2	3	840
3	3	1250

Tabela 2. Wydajność przy 1-godzinnych i 3-godzinnych kolekcjach następujących. Tabela 2 przedstawia wydajność z 5 kolejnych kolekcji przeprowadzonych 1 h po dodaniu nowej pożywki oraz z 3 kolejnych kolekcji przeprowadzonych 3 h po umieszczeniu nowej płytki z melasą.

Dyskusja

Już od 1,5 g materiału można uzyskać plon pobranych zarodków od 7 do 13 g na cykl. Aby uzyskać taką ilość materiału, kluczowe jest utrzymanie odpowiednich warunków hodowli na wszystkich etapach cyklu muchowego.

Najważniejszymi parametrami są temperatura i wilgotność, które powinny wynosić odpowiednio 24 ºC i 35%. Jeśli te dwa parametry nie mogą być utrzymane na stałym poziomie w normalnym środowisku laboratoryjnym, jedną z możliwości byłoby umieszczenie klatki na muchy w inkubatorze lub komorze środowiskowej. Inne protokoły zalecają wilgotność 70%, a także stały 24-godzinny cykl światło-ciemność, aby zwiększyć wydajność produkowanych jaj^9,10. Jednak utrzymanie wilgotności na poziomie około 35% pozwala uniknąć skażenia bakteryjnego, a ponieważ celem tego protokołu jest jedynie utrzymanie klatki populacyjnej, muchy są trzymane w normalnym środowisku świetlnym laboratorium.

Kolejną ważną kwestią jest utrzymanie zakłóceń dla dorosłych much tak nisko, jak to możliwe. Wskazane może być trzymanie klatki w miejscu oddzielonym od pomieszczenia dla much, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego przez inne muchy.

Nie zaleca się hodowli dużych populacji much transgenicznych i zmutowanych, ponieważ bardzo trudno jest utrzymać ich czystość i mogą one wykazywać wyraźne nienormalne zachowania godowe w klatkach o dużej populacji¹⁴.

Jednym z możliwych problemów podczas hodowli Drosophila w dużych ilościach jest obecność innych organizmów, takich jak roztocza i/lub pleśń, które będą konkurować o pożywienie, a tym samym zmniejszać wydajność produkowanych jaj. Aby tego uniknąć, bardzo ważne jest, aby utrzymywać cały sprzęt w czystości, myjąc klatkę, siatki i skrzynki na muchy wodą z mydłem oraz wyrzucając jednorazowy materiał (zatyczki piankowe) po każdym cyklu. Aby ograniczyć rozwój pleśni, kwas propionowy i fosforowy dodaje się do mokrych drożdży podczas przygotowywania pokarmu dla much w kroku 1.2 i Tegosept podczas przygotowywania tacki z melasą w kroku 3.1. Czasami pomocne jest umieszczenie materiałów, takich jak plastikowe pudełko lub sita, w temperaturze -20 °C, gdy czas jest krótki i materiałów nie można od razu wyczyścić.

Cały cykl pobierania odbywa się w ciągu 14 - 15 dni, rozpoczynając się w momencie wysiewu zarodków do pudełka na muchy, a kończąc na ostatnim dniu pobrania. W tym okresie zaleca się uporządkowanie harmonogramu, aby zapamiętać wszystkie niezbędne kroki do utrzymania klatki dla much populacyjnych (ryc. 2), szczegółowo opisane w rozdziale protokołu. Od dnia wysiania jaj, aż do pojawienia się dorosłych much, konieczne jest jedynie sprawdzenie plastikowego pudełka, a gdy nastąpi przepoczwarzenie, umieszczenie ich w klatce. Następnie muchy muszą być karmione co 2-3 dni, aż zarodki zostaną wysiane do nowego cyklu. W całym protokole najdłuższy dzień przypada na pobranie i wysiewanie zarodków w celu rozpoczęcia nowego cyklu. Jak skomentowano w protokole, najlepsza wydajność jaj wynosi 3-5 dni po eklacji dorosłego osobnika, a ostatecznie spada 2 dni później. Daje nam to pewną elastyczność w wyborze dnia, w którym odbędzie się zbiór jaj.

Jeśli z jakiegokolwiek powodu wydajność pobranych zarodków jest mniejsza niż pożądana ilość początkowa (1,5 g), zawsze można dodać nową tackę na melasę i zebrać więcej jaj następnego dnia. W przypadku stałych zbiorów zaleca się utrzymywanie 2 klatek równolegle, a jeśli wymagane są większe ilości zarodków, możliwe jest również użycie większych klatek. W przypadku zbiorów krótkoterminowych jednym ze sposobów na zwiększenie plonów jest skorzystanie z porannego okresu składania jaj.

Gromadzenie dużych ilości produktów w różnych stadiach rozwojowych ma wiele zalet. Na przykład pobrane zarodki z klatek populacyjnych zostały z powodzeniem wykorzystane w testach immunoprecypitacji ^6-8, masowe pobieranie tkanek larwalnych od zdysocjowanych larw okazało się być bardzo dobrym źródłem dla eksperymentów 3C⁴ i preparatów RNA¹⁵, a głowy dorosłych much zostały wykorzystane w eksperymentach ChIP¹⁶. Ponadto dorosłe osobniki są często potrzebne do wytwarzania ekstraktów z much do hodowli tkankowej¹⁷.

Jednym z najbardziej obiecujących zastosowań klatki jest dostarczenie materiału do wysokoprzepustowych testów, które umożliwiają analizę i badania przesiewowe genów, transkryptów, białek i metabolitów w odpowiedzi na ekspozycję na patogeny, cząsteczki biologiczne, substancje chemiczne i promieniowanie jonizujące. W tych testach na dużą skalę wymagana jest duża liczba osobników, a opisana tutaj klatka populacji much może być bardzo pomocna w uzyskaniu dużych ilości materiału w różnych fazach cyklu życiowego Drosophila do ich analizy i badań przesiewowych¹⁸.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Bacto-Agar	Beckton Dickinson	214010
Curity praktyczna bawełniana rolka	Kendall	2287
Suche drożdże	Affymetrix	23540
Bibuła filtracyjna	GE Healthcare Life Science	1001-085
Zatyczki do rurek piankowych	Jaece	L800-D2	50 mm Średnica x 55 mm Długość
Klatka populacji much	Flystuff	59-116	9″ Średnica x 14,4 i podstawa; Długość. Zawiera siatki do klatki.
Taca na mięso	Genpak	1002S (#2S)	8,25 x 5,75 x 0,5 cala
Melasa	Babcia´ s
Plastikowy pojemnik	Rubbermaid	4022-00
Folia z tworzywa sztucznego	Glad
Kwas fosforowy	Fisher Scientific	S 93326	Toksyczny. Uchwyt w kapturze chemicznym
Kwas propionowy	Fisher Scientific	A258-500	Toxic. Uchwyt w kapturze chemicznym
Stal nierdzewna  sito #100	VWR	57324-400
Stal nierdzewna  sito #40	VWR	57324-272
Stal nierdzewna  sito #30	VWR	57324-240
Sacharoza	MP	152584
Tegasept	LabScientific	FLY5501
Triton-X100	Fisher Scientific	BP151-500