Artykuł metodologiczny

Kapsułkowanie przeciwnowotworowego środka terapeutycznego dakarbazyny za pomocą nanostrukturalnego nośnika lipidowego

DOI:

10.3791/53760

⸱

26 kwietnia 2016

 , 
1Institute of Environment, Health, Risks and Futures, Cranfield University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Najczęściej stosowana metoda syntezy nanostrukturalnych nośników lipidowych (NLC) obejmuje emulsję typu olej w wodzie, homogenizację i krzepnięcie. Zostało to tutaj zmodyfikowane poprzez zastosowanie dyspersji przy wysokim ścinaniu po zestaleniu w celu uzyskania NLC o pożądanej wielkości, ulepszonej enkapsulacji leku i wydajności ładowania leku jako potencjalnego nośnika dostarczania dakarbazyny.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jedyną formułą dakarbazyny (Dac) w klinicznym użyciu jest infuzja dożylna, prezentująca słaby profil terapeutyczny ze względu na niską dyspersję leku w roztworze wodnym. Aby temu zaradzić, opracowano nanostrukturalny nośnik lipidowy (NLC) składający się z palmitynostearynianu glicerolu i mirystynianu izopropylu do kapsułkowania DAC. NLC o kontrolowanej wielkości uzyskano przy użyciu dyspersji przy wysokim ścinaniu (HSD) po zestaleniu emulsji typu olej w wodzie. Parametry syntezy, w tym stężenie surfaktantu, szybkość i czas HSD, zoptymalizowano tak, aby uzyskać najmniejsze NLC o wielkości, wskaźniku polidyspersji i potencjale zeta wynoszącym odpowiednio 155 ± 10 nm, 0,2 ± 0,01 oraz -43,4 ± 2 mV. Optymalne parametry wykorzystano również do przygotowania NLC z obciążeniem przetwornikiem cyfrowo-analogowym. Powstały NLC obciążony Dac charakteryzował się rozmiarem, indeksem polidyspersji i potencjałem zeta wynoszącymi odpowiednio 190 ± 10 nm, 0,2 ± 0,01 oraz -43,5 ± 1,2 mV. Skuteczność kapsułkowania leku i obciążenie lekiem osiągnęły odpowiednio 98% i 14%. Jest to pierwsze doniesienie na temat enkapsulacji DAC przy użyciu NLC, co sugeruje, że NLC może być nowym potencjalnym kandydatem jako nośnik leku w celu poprawy profilu terapeutycznego DAC.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dakarbazyna (Dac) jest środkiem alkilującym, który wywiera działanie przeciwnowotworowe poprzez metylację kwasów nukleinowych lub bezpośrednie uszkodzenie DNA, prowadząc do zatrzymania cyklu komórkowego i śmierci komórki 1.

Jako chemioterapeutyk pierwszego rzutu, Dac był stosowany samodzielnie lub w połączeniu z innymi lekami chemioterapeutycznymi w leczeniu różnych nowotworów 2-6. Jest to najbardziej aktywny środek stosowany do tej pory w leczeniu czerniaka skórnego i przerzutowego, który jest najbardziej agresywną postacią raka skóry 3,7,8. Wskaźnik odpowiedzi wynosi jednak w najlepszym przypadku tylko 20%, a efektom terapeutycznym często towarzyszą poważne ogólnoustrojowe skutki uboczne.

W swojej naturalnej formie, Dac jest hydrofilowy i niestabilny ze względu na swoją światłoczułość 9. Obecnie jedyną dostępną formułą do użytku klinicznego jest jałowy proszek do stosowania w zawiesinie do infuzji dożylnej 7,8. Niski odsetek odpowiedzi i wysoki wskaźnik toksyczności ogólnoustrojowej leku można w dużej mierze przypisać jego słabej rozpuszczalności w wodzie, a tym samym niskiej dostępności w miejscu docelowym i wysokiej dystrybucji w miejscach niedocelowych, co ogranicza maksymalną dawkę leku 10. Szybka degradacja i metabolizm po przyjęciu dożylnym wraz z rozwojem lekooporności ograniczają zastosowanie kliniczne i efekt terapeutyczny leku 11. Dlatego istnieje pilna potrzeba opracowania alternatywnych preparatów DAC do leczenia czerniaka złośliwego.

Układy koloidalne zawierające liposomy, micele lub nanostrukturalne cząstki były intensywnie badane pod kątem ich wykorzystania w dostarczaniu leków, co zostało sprawdzone przez Marilene i wsp. 12 Cząstki nanostrukturalne jako potencjalne nośniki leków przyciągają coraz większą uwagę w ciągu ostatniej dekady ze względu na ich zdolność do zwiększania efektywności ładowania leków, kontrolowania uwalniania leków, poprawy farmakokinetyki i biodystrybucji leków, a tym samym zmniejszania toksyczności ogólnoustrojowej leków 13. Do tej pory zbadano jednak tylko kilka nanopreparatów pod kątem dostarczania Dac, wykazując ochronę leku przed fotodegeneracją, zwiększoną rozpuszczalność leku i lepszy efekt terapeutyczny 10,14,15. Jednak preparaty te miały niską skuteczność kapsułkowania, a niektóre z nich wykorzystywały również syntetyczne nanocząstki polimerowe, które nie są opłacalne.

Nanostrukturalne nośniki lipidowe (NLC), wykonane z mieszaniny stałych i płynnych lipidów, zostały opracowane do dostarczania leków 16,17. Leki, które mają być kapsułkowane, są często rozpuszczalne zarówno w ciekłych lipidach, jak i w stałych fazach lipidowych 18, co skutkuje dużym obciążeniem i kontrolowanym uwalnianiem 19. Badanie to ma na celu opracowanie nowego preparatu DAC opartego na enkapsulacji NLC przy użyciu palmitynostearynianu glicerolu i mirystynianu izopropylu jako lipidów. Preparat obejmował emulsję typu olej w wodzie, odparowanie, zestalenie i homogenizację. Preparaty scharakteryzowano pod kątem wielkości, kształtu, ultrastruktury i dyspersji NLC, skuteczności kapsułkowania leku i obciążenia lekiem 20.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie emulsji typu olej w wodzie

  1. Zważyć palmitynostearynian glicerolu (120 mg), mirystynian izopropylu (60 mg), bursztynian glikolu polietylenowego d-α-tokoferylu (30 mg) i lecytynę sojową (30 mg) i dodać je do 12,5 ml rozpuszczalników organicznych (6,25 ml acetonu i 6,25 ml etanolu). Mieszaninę szybko rozpuścić w temperaturze 70 °C (5 °C powyżej temperatury topnienia stałego lipidu) w łaźni wodnej.
  2. Dodać 125, 250 lub 375 mg Poloxameru188 w 12,5 ml ddH2O, aby uzyskać 1-3% (odpowiednio) roztworu Poloxameru 188, który poddaje się ogrzewaniu w tej samej temperaturze co powyżej.
  3. Dodać kroplami roztwór fazy wodnej z kroku 1.2 do roztworu fazy olejowej z kroku 1.1, aby utworzyć emulsje pod mieszaniem magnetycznym przy 400 obr./min. Mieszać emulsję z prędkością 400 obr./min przez kolejne 4 godziny, aby umożliwić odparowanie rozpuszczalników organicznych.

2. Krzepnięcie i homogenizacja

  1. Pozostawić emulsję w chłodnym pomieszczeniu (4 °C) na 2 godziny do zestalenia/krystalizacji.
  2. Aby uzyskać NLC, należy poddać emulsję działaniu dyspersji o wysokiej przezroczystości (HSD) za pomocą homogenizatora przy 10 000-15 000 obr./min przez 10-40 min.

3. Optymalizacja przygotowania NLC

  1. Pobrać próbki z kroku 2.2 o stężeniu środka powierzchniowo czynnego 1, 2 i 3% poddawane HSD z prędkościami odpowiednio 10 000, 15 000 i 20 000 obr./min w odstępach czasu wynoszących odpowiednio 10, 20, 30 i 40 minut,
  2. Zbadaj próbki pod kątem wielkości cząstek (PS), wskaźnika polidyspersji (PDI), morfologii i ultrastruktury 20,
    Uwaga: Parametry, które wytwarzają cząstki o najmniejszym rozmiarze (155 nm) i wartości PDI (0,2), są określane jako optymalne.

4. Przygotowanie NLC z ładunkiem Dac (NLC-Dac)

  1. Przygotować roztwór fazy olejowej zgodnie z opisem w kroku 1.1 z dodatkiem Dac (70 mg) przed rozpuszczeniem mieszaniny w temperaturze 70 °C w łaźni wodnej.
  2. Przygotować roztwór fazy wodnej zgodnie z opisem w kroku 1.2 z 1% środkiem powierzchniowo czynnym i dodawać ten roztwór do roztworu przygotowanego w kroku 4.1 kroplami, aby utworzyć emulsję przy mieszaniu magnetycznym przy 400 obr./min. Mieszaj emulsję przez kolejne 4 godziny, aby odparować rozpuszczalniki organiczne.
  3. Pozostawić emulsję w chłodnym pomieszczeniu (4 °C) na 2 godziny w celu zestalenia/krystalizacji zgodnie z opisem w kroku 2, a na koniec poddać emulsję działaniu dyspersji o wysokiej przezroczystości (HSD) przy użyciu optymalnych parametrów określonych w kroku 3.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Preparaty NLC i NLC-Dac z użyciem palmitynianu glicerolu i mirystynianu izopropylu o różnych parametrach zostały scharakteryzowane dla PS, PDI, morfologii i ultrastruktury 20. PS i PDI NLC były zależne od stężenia środków powierzchniowo czynnych, szybkości HSD i czasu trwania. Jak oceniono na podstawie PS i PDI NLC, najlepsze wyniki osiągnięto przy 1% surfaktantu i samej prędkości dyspersji 15 000 obr./min przez 30 minut (ryc. 1A, B i C...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nanostrukturalne cząstki na bazie lipidów zostały wykorzystane do zapewnienia wysoce lipofilowego nośnika do dostarczania leków hydrofobowych. NLC to druga generacja stałego nośnika nanostrukturalnego lipidów, który jest stały w temperaturze pokojowej i temperaturze ciała. Włączenie stałego lipidu do ciekłego lipidu w NLC powoduje mniej doskonałą krystalizację, zwiększając w ten sposób wydajność ładowania leku, a także zmniejszając wydalanie zamkniętych w kapsułkach leków podczas przechowywania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują stypendium (I821) ufundowanemu przez Arabię Saudyjską za umożliwienie badań. Autorzy są wdzięczni dr Xianwei Liu za eksperckie wsparcie w analizie TEM na Uniwersytecie w Cranfield.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Dakarbazyna (DAC)Sigma Aldrich (Gillingham Dorset, Wielka Brytania)D2390-100MGlek używany do przesyłania
palmitynostearynianu glicerolu Gattefossé (Saint_Priest_c&ostrego; dex, Francja)85251-77-0stały lipid 
bursztynian d-α- Bursztynian glikolu polietylenowego tokoferolu (TPGS)Sigma Aldrich (Gillingham Dorset, Wielka Brytania)57668środek powierzchniowo czynny fazy lipidowej
Poloxamer 188Sigma Aldrich (Gillingham Dorset, Wielka Brytania)15759-1KGpowierzchniowo czynny w fazie płynowej
Aceton Sigma Aldrich (Gillingham Dorset, Wielka Brytania)650501-1Lrozpuszczalnik organiczny
Etanol Sigma Aldrich (Gillingham Dorset, Wielka Brytania)459836-1Lrozpuszczalnik organiczny
Lecytyna sojowa (SL)Cuisine Innovation (Dijon, Francja)SLL1402surfaktant fazy lipidowej
Podwójnie destylowana woda została pobrana w naszym laboratorium zsystemu ultraczystej wody Millipore-Q Gradient A10 (Millipore, Francja)SAS - 67120 Faza wodna 
T 25 digital ULTRA-TURRAXIKA3725000jako dyspergator o wysokim stopniu ścinania
Mieszadło magnetyczne z płytą grzejnąScientific Support, Inc1454 homogenizacja emulsji
środek

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Loo, T. L., Housholder, G. E., Gerulath, A. H., Saunders, P. H., Farquhar, D. Mechanism of action and pharmacology studies with DTIC (NSC 45388). Cancer Treat Rep. 60 (2), 149-152 (1976).
  2. Behringer, K., et al. Omission of dacarbazine or bleomycin, or both, from the ABVD regimen in treatment of early-stage favourable Hodgkin's lymphoma (GHSG HD13): An open-label, randomised, non-inferiority trial. The Lancet. 385 (9976), 1418-1427 (2014).
  3. Carvajal, R. D., et al. A phase 2 randomised study of ramucirumab (IMC-1121B) with or without dacarbazine in patients with metastatic melanoma. Eur J Cancer. 50 (12), 2099-2107 (2014).
  4. Jiang, G., Li, R., Sun, C., Liu, Y., Zheng, J. Dacarbazine combined targeted therapy versus dacarbazine alone in patients with malignant melanoma: A meta-analysis. PLoS ONE. 9 (12), (2014).
  5. Lazar, V., et al. Sorafenib plus dacarbazine in solid tumors: A phase i study with dynamic contrast-enhanced ultrasonography and genomic analysis of sequential tumor biopsy samples. Invest New Drugs. 32 (2), 312-322 (2014).
  6. Niemeijer, N. D., Alblas, G., Van Hulsteijn, L. T., Dekkers, O. M., Corssmit, E. P. M. Chemotherapy with cyclophosphamide, vincristine and dacarbazine for malignant paraganglioma and pheochromocytoma: Systematic review and meta-analysis. Clin Endocrinol (Oxf). 81 (5), 642-651 (2014).
  7. Bedikian, A. Y., Garbe, C., Conry, R., Lebbe, C., Grob, J. J. Dacarbazine with or without oblimersen (a Bcl-2 antisense oligonucleotide) in chemotherapy-naive patients with advanced melanoma and low-normal serum lactate dehydrogenase: 'The AGENDA trial'. Melanoma Res. 24 (3), 237-243 (2014).
  8. Daponte, A., et al. Phase III randomized study of fotemustine and dacarbazine versus dacarbazine with or without interferon-a in advanced malignant melanoma. J Trans Med. 11 (1), (2013).
  9. Jiao, J., Rhodes, D. G., Burgess, D. J. Multiple Emulsion Stability: Pressure Balance and Interfacial Film Strength. J Colloid Interface Sci. 250 (2), 444-450 (2002).
  10. Kakumanu, S., Tagne, J. B., Wilson, T. A., Nicolosi, R. J. A nanoemulsion formulation of dacarbazine reduces tumor size in a xenograft mouse epidermoid carcinoma model compared to dacarbazine suspension. Nanomedicine. 7 (3), 277-283 (2011).
  11. Xie, T., Nguyen, T., Hupe, M., Wei, M. L. Multidrug resistance decreases with mutations of melanosomal regulatory genes. Cancer Res. 69 (3), 992-999 (2009).
  12. Estanqueiro, M., Amaral, M. H., Conceição, J., Lobo, J. M. S. Nanotechnological carriers for cancer chemotherapy: the state of the art. Colloids Surf., B. 126, 631-648 (2015).
  13. Koziara, J. M., Whisman, T. R., Tseng, M. T., Mumper, R. J. In-vivo efficacy of novel paclitaxel nanoparticles in paclitaxel-resistant human colorectal tumors. J Controlled Release. 112 (3), 312-319 (2006).
  14. Ding, B., et al. Biodegradable methoxy poly (ethylene glycol)-poly (lactide) nanoparticles for controlled delivery of dacarbazine: Preparation, characterization and anticancer activity evaluation. Afr J Pharm Pharacol. 5 (11), 1369-1377 (2011).
  15. Ding, B., et al. Anti-DR5 monoclonal antibody-mediated DTIC-loaded nanoparticles combining chemotherapy and immunotherapy for malignant melanoma: target formulation development and in vitro anticancer activity. Int J Nanomedicine. 6, 1991-2005 (2011).
  16. Jenning, V., Thünemann, A. F., Gohla, S. H. Characterisation of a novel solid lipid nanoparticle carrier system based on binary mixtures of liquid and solid lipids. Int J Pharm. 199 (2), 167-177 (2000).
  17. Müller, R. H., Radtke, M., Wissing, S. A. Nanostructured lipid matrices for improved microencapsulation of drugs. Int J Pharm. 242 (1-2), 121-128 (2002).
  18. Pouton, C. W. Lipid formulations for oral administration of drugs: Non-emulsifying, self-emulsifying and 'self-microemulsifying' drug delivery systems. Eur. J. Pharm. Sci. 11 (Suppl. 2), S93-S98 (2000).
  19. Jores, K., Mehnert, W., Drechsler, M., Bunjes, H., Johann, C., Mäder, K. Investigations on the structure of solid lipid nanoparticles (SLN) and oil-loaded solid lipid nanoparticles by photon correlation spectroscopy, field-flow fractionation and transmission electron microscopy. J Controlled Release. 95 (2), 217-227 (2004).
  20. Almousallam, M., Zhu, H. Encapsulation of cancer therapeutic agent dacarbazine using nanostructured lipid carrier. Int nano lett. , (2015).
  21. Ng, W. K., et al. Thymoquinone-loaded nanostructured lipid carrier exhibited cytotoxicity towards breast cancer cell lines (MDA-MB-231 and MCF-7) and cervical cancer cell lines (HeLa and SiHa). BioMed Research International. , (2015).
  22. Sun, M., et al. Quercetin-nanostructured lipid carriers: Characteristics and anti-breast cancer activities in vitro. Colloids Surf., B. 113, 15-24 (2014).
  23. Savla, R., Garbuzenko, O. B., Chen, S., Rodriguez-Rodriguez, L., Minko, T. Tumor-Targeted Responsive Nanoparticle-Based Systems for Magnetic Resonance Imaging and Therapy. Pharm Res. 31 (12), 3487-3502 (2014).
  24. Chen, Y., et al. Formulation, characterization, and evaluation of in vitro skin permeation and in vivo pharmacodynamics of surface-charged tripterine-loaded nanostructured lipid carriers. Int J Nanomedicine. 7, 3023(2012).
  25. Sanna, V., Caria, G., Mariani, A. Effect of lipid nanoparticles containing fatty alcohols having different chain length on the ex vivo skin permeability of Econazole nitrate. Powder Technol. 201 (1), 32-36 (2010).
  26. Brigger, I., Dubernet, C., Couvreur, P. Nanoparticles in cancer therapy and diagnosis. Adv Drug Deliv Rev. 54 (5), 631-651 (2002).
  27. Visaria, R. K., et al. Enhancement of tumor thermal therapy using gold nanoparticle-assisted tumor necrosis factor-a delivery. Mol Cancer Ther. 5 (4), 1014-1020 (2006).
  28. Tripathi, A., Gupta, R., Saraf, S. A. PLGA nanoparticles of anti tubercular drug: Drug loading and release studies of a water in-soluble drug. Int J PharmTech Res. 2 (3), 2116-2123 (2010).
  29. Joshi, M., Patravale, V. Nanostructured lipid carrier (NLC) based gel of celecoxib. Int J Pharm. 346 (1-2), 124-132 (2008).
  30. Lim, W. M., Rajinikanth, P. S., Mallikarjun, C., Kang, Y. B. Formulation and delivery of itraconazole to the brain using a nanolipid carrier system. Int J Nanomedicine. 9 (1), 2117-2126 (2014).
  31. Bei, D., Zhang, T., Murowchick, J. B., Youan, B. C. Formulation of dacarbazine-loaded cubosomes. Part III. physicochemical characterization. AAPS PharmSciTech. 11 (3), 1243-1249 (2010).
  32. Lei, M., et al. Dual drug encapsulation in a novel nano-vesicular carrier for the treatment of cutaneous melanoma: Characterization and in vitro/in vivo evaluation. RSC Advances. 5 (26), (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Enkapsulacja dacarbazynydyspersja wysokoprzeci eniowaanaliza wielko ci cz stekindeks polidyspersyjno cipomiar potencja u zetaefektywno enkapsulacji lekutransmisyjna mikroskopia elektronowadynamiczne rozpraszanie wiat aoptymalizacja st enia surfaktantu

Powiązane artykuły