Metoda ukierunkowanej ewolucji u Saccharomyces cerevisiae: tworzenie i badanie przesiewowe biblioteki mutantów

Summary

Przedstawiamy szczegółowy protokół do konstruowania i sprawdzania bibliotek mutantów dla kampanii ukierunkowanej ewolucji u Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

Ukierunkowana ewolucja u Saccharomyces cerevisiae oferuje wiele atrakcyjnych korzyści podczas projektowania enzymów do zastosowań biotechnologicznych, procesu, który obejmuje budowę, klonowanie i ekspresję zmutowanych bibliotek, w połączeniu z homologiczną rekombinacją DNA o wysokiej częstotliwości in vivo. W tym miejscu przedstawiamy protokół tworzenia i badania przesiewowego zmutowanych bibliotek drożdży na przykładzie grzybowej oksydazy aryloalkoholowej (AAO) w celu zwiększenia jej całkowitej aktywności. Dwa segmenty białka poddano ukierunkowanej ewolucji poprzez mutagenezę losową i rekombinację DNA in vivo. Zwisy ~50 pz po bokach każdego segmentu pozwoliły na prawidłowe ponowne złożenie genu fuzji AAO w zlinearyzowany wektor, dając początek pełnemu autonomicznie replikującemu się plazmidowi. Biblioteki mutantów wzbogacone o funkcjonalne warianty AAO poddano badaniom przesiewowym w supernatantach S. cerevisiae za pomocą czułego wysokoprzepustowego testu opartego na reakcji Fentona. Opisany tutaj ogólny proces budowy biblioteki u S. cerevisiae może być łatwo zastosowany do ewolucji wielu innych genów eukariotycznych, unikając dodatkowych reakcji PCR, rekombinacji DNA in vitro i etapów ligacji.

Introduction

Ukierunkowana ewolucja molekularna to solidna, szybka i niezawodna metoda projektowania enzymów^{1, 2}. Poprzez iteracyjne rundy losowych mutacji, rekombinacji i badań przesiewowych można wygenerować ulepszone wersje enzymów, które działają na nowe substraty, w nowych reakcjach, w środowisku nienaturalnym, a nawet pomagają komórce osiągnąć nowe cele metaboliczne^3-5. Wśród gospodarzy wykorzystywanych w ewolucji ukierunkowanej, drożdże piwne Saccharomyces cerevisiae oferują repertuar roztworów do funkcjonalnej ekspresji złożonych białek eukariotycznych, które nie są inaczej dostępne w prokariotycznych odpowiednikach^6,7.

Używany wyczerpująco w badaniach nad biologią komórki, ten mały model eukariotyczny ma wiele zalet pod względem modyfikacji potranslacyjnych, łatwości manipulacji i efektywności transformacji, z których wszystkie są ważnymi cechami dla inżynierii enzymów przez ukierunkowaną ewolucję⁸. Co więcej, wysoka częstotliwość rekombinacji homologicznego DNA u S. cerevisiae w połączeniu z wydajnym aparatem do korekty otwiera szeroki wachlarz możliwości tworzenia bibliotek i składania genów in vivo, sprzyjając ewolucji różnych systemów, od pojedynczych enzymów do złożonych sztucznych szlaków^9-12. Nasze laboratorium poświęciło ostatnią dekadę na projektowanie narzędzi i strategii ewolucji molekularnej różnych ligninaz w drożdżach (oksydoreduktazy biorących udział w degradacji ligniny podczas naturalnego rozkładu drewna)^13-14. W niniejszym komunikacie przedstawiamy szczegółowy protokół przygotowania i badań przesiewowych zmutowanych bibliotek u S. cerevisiae pod kątem modelowej flawooksydazy, oksydazy -aryloalkoholowej (AAO¹⁵)-, którą można łatwo przetłumaczyć na wiele innych enzymów. Protokół obejmuje metodę ukierunkowanej ewolucji (MORPHING: Mutagenic Organized Recombination Process by Homologous in vivo Grouping) wspomaganą przez aparat komórkowy drożdży¹⁶ oraz bardzo czuły test przesiewowy oparty na reakcji Fentona w celu wykrycia aktywności AAO wydzielanej do bulionu hodowlanego¹⁷.

Protocol

1. Budowa biblioteki mutantów

1. Wybierz regiony, które mają zostać poddane morfingowi, za pomocą algorytmów obliczeniowych opartych na dostępnych modelach struktury krystalicznej lub homologii¹⁸.
   1. Tutaj celuj w dwa regiony AAO z Pleurotus eryngii w celu losowej mutagenezy i rekombinacji (Met[α1]-Val109, Phe392-Gln566), jednocześnie amplifikując pozostałą część genu (844 pz) za pomocą PCR o wysokiej wierności (Figura 1).
      nuta: Kilka segmentów może być badanych za pomocą MORPHING w sposób niezależny lub łączony¹⁶.
2. Wzmocnij docelowe obszary za pomocą mutagennego PCR. Twórz nakładające się obszary między segmentami (~50 pz każdy), nakładając na siebie reakcje PCR zdefiniowanych regionów.
   1. Przygotować mutagenny PCR docelowych segmentów w końcowej objętości 50 μl zawierający matrycę DNA (0,92 ng/μl), 90 nM oligo sense (RMLN dla segmentu M-I i AAO-BP dla segmentu M-II), starter antysensowny 90 nM (AAO-92C dla segmentu M-I i RMLC dla segmentu M-II), 0,3 mM dNTP (0,075 mM każdy), 3% (v/v) dimetylosulfotlenek (DMSO), 1,5 mM MgCl₂, 0,05 mM MnCl₂ i 0,05 U/μl polimerazy DNA Taq. Sekwencje starterów są szczegółowo opisane na rysunku 1.
   2. Użyj następującego programu PCR: 95 °C przez 2 minuty (1 cykl); 95 °C przez 45 sekund, 50 °C przez 45 sekund, 74 °C przez 45 sekund (28 cykli) i 74 °C przez 10 minut (1 cykl).
3. Amplifikuj regiony niemutagenne za pomocą polimerazy o ultrawysokiej wierności i uwzględnij odpowiednie obszary nakładające się na segmenty mutagenne i/lub zlinearyzowane zwisy wektorowe.
   1. Przygotować mieszaniny reakcyjne w końcowej objętości 50 μl zawierające: matrycę DNA (0,2 ng/μl), 250 nM oligo sense HFF, 250 nM oligo antisense HFR, 0,8 mM dNTP (po 0,2 mM), 3% (v/v) dimetylosulfotlenek (DMSO) i 0,02 U/μl iproof polimerazy DNA. Sekwencje starterów są szczegółowo opisane na rysunku 1.
   2. Użyj następującego programu PCR: 98 °C przez 30 sekund (1 cykl); 98 °C przez 10 sekund, 55 °C przez 25 sekund, 72 °C przez 45 sekund (28 cykli) i 72 °C przez 10 minut (1 cykl).
      nuta: Z warunkami opisanymi w 1.2 i 1.3 nakładanie się 43 pz (region plazmidu-M1); 46 pz (region M1-HF); 47 pz (region HF-M2) i 61 pz (region M2-plazmid) są zaprojektowane (ryc. 1), aby sprzyjać splicingowi in vivo w drożdżach.
   3. Oczyść wszystkie fragmenty PCR (mutagenne i niemutagenne) za pomocą dostępnego w handlu zestawu do ekstrakcji żelu zgodnie z protokołem producenta.
4. Linearyzuj wektor w taki sposób, aby powstały regiony flankujące o długości około 50 pz, które są homologiczne do końców 5' i 3' genu docelowego.
   1. Przygotować mieszaninę reakcyjną linearyzacji zawierającą 2 μg DNA, 7,5 U BamHI, 7,5 U XhoI, 20 μg BSA i 2 μl buforu BamHI 10x w końcowej objętości 20 μl.
   2. Mieszaninę reakcyjną inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 godziny i 40 minut, a następnie inaktywować w temperaturze 80 °C przez 20 minut.
5. Oczyść zlinearyzowany wektor przez ekstrakcję żelu agarozowego, aby uniknąć zanieczyszczenia resztkowym kolistym plazmidem (ryc. 2).
   1. Załadować mieszaninę reakcyjną z mineralizacji do mega-studzienki półpreparatywnego żelu agarozowego o niskiej temperaturze topnienia (0,75%, w:v), a także podwielokrotność (5 μl) mieszaniny reakcyjnej w sąsiednim studzience jako reporter.
   2. Uruchomić elektroforezę DNA (5 V/cm między elektrodami, 4 oC) i oddzielić żel agarozowy odpowiadający mega-studzience i przechowywać go w temperaturze 4 oC w 1x TAE.
   3. Plamić pas za pomocą drabiny o masie cząsteczkowej i reportera. Wizualizuj opaski w świetle UV. Zaznacz pozycję, w której umieszcza wektor linearyzowany.
      nuta: Ponieważ jakość oczyszczonego wektora linearyzowanego jest krytycznym czynnikiem dla udanej rekombinacji i składania w drożdżach, należy unikać barwienia żelem w przypadku półpreparatywnej elektroforezy DNA. Stosowanie barwników i ekspozycji na promieniowanie UV do ekstrakcji żelu może wpływać na stabilność wektora DNA, pogarszając skuteczność rekombinacji in vivo. Jako alternatywa dla toksycznych barwników EtBr, barwniki Gel Red i SYBR są powszechnie stosowane do barwienia żelu.
   4. W przypadku braku światła UV zidentyfikuj zlinearyzowany wektor we fragmencie mega-studzienki, korzystając ze wskazówek nacięć w zabarwionym pasie reporterowym, aby można go było wyizolować.
   5. Wyekstrahuj zlinearyzowany wektor z agarozy i oczyść go za pomocą dostępnego w handlu zestawu do ekstrakcji żelu zgodnie z protokołem producenta.
      nuta: Użyj wektorów episomalnych o wysokiej kopii z markerami antybiotykowymi i auksotrofiami: W tym przykładzie zastosowaliśmy wektor pJRoC30 niezależny od uracylu i oporny na ampicylinę, pod kontrolą drożdżowego promotora GAL1.
6. Przygotuj równomolową mieszaninę fragmentów PCR i wymieszaj ją ze zlinearyzowanym wektorem w stosunku 2:1, z nie mniej niż 100 ng zlinearyzowanego plazmidu (przetestuj różne proporcje biblioteki równomolowej / wektora otwartego, aby uzyskać dobrą wydajność transformacji).
   1. Zmierzyć absorbancję fragmentów PCR i wektora linearyzowanego przy 260 nm i 280 nm, aby określić ich stężenie i czystość.
7. Przekształć kompetentne komórki drożdży za pomocą mieszaniny DNA za pomocą komercyjnego zestawu do transformacji drożdży (patrz tabela materiałów eksploatacyjnych) zgodnie z instrukcjami producenta.
   1. W tym przypadku należy użyć szczepu S. cerevisiae z niedoborem proteazy i zależnego od URA3, BJ5465. Przekształć komórki z macierzystym wektorem kołowym jako wewnętrznym wzorcem podczas badań przesiewowych (patrz poniżej). Dodatkowo sprawdź tło, przekształcając zlinearyzowany wektor w przypadku braku fragmentów PCR.
      nuta: W przypadku wykrycia początkowego niskiego poziomu wydzielania, należy użyć szczepów z niedoborem proteazy S. cerevisiae, takich jak BJ5465, aby sprzyjać akumulacji aktywnego białka w supernatantach hodowlanych. Jeśli docelowy enzym ulega hiperglikozylacji, odpowiednią opcją może być zastosowanie szczepów z niedoborem glikozylacji (np. Δkre2, który jest zdolny do przyłączania tylko mniejszych oligomerów mannozy).
8. Umieścić przekształcone komórki na płytkach SC i inkubować je w temperaturze 30 °C przez trzy dni. Płytki (na płytkach SC z dodatkiem uracylu) Komórki ^URA3-S. cerevisiae pozbawione plazmidu jako kontrola ujemna do badań przesiewowych (patrz poniżej).

2. Wysokoprzepustowy test przesiewowy (Rysunek 3)

1. Napełnij odpowiednią liczbę sterylnych 96-dołkowych płytek (23 płytki do analizy biblioteki 2000 klonów) minimalną ilością 50 μl pożywki na dołek za pomocą robota pipetującego.
2. Zbierz poszczególne kolonie z płytek SC-drop out i przenieś je do płytek 96-dołkowych.
   1. Na każdej płytce zaszczepić kolumnę nr 6 typem rodzicielskim jako wzorcem wewnętrznym i dobrze H1 komórkami ^URA3-S. cerevisiae (w pożywce SC uzupełnionej uracylem) bez plazmidu jako kontroli ujemnej.
      nuta: Studnia H1 jest wypełniona specjalnie pożywką drop-out uzupełnioną uracylem. Ślepa studzienka zawierająca pożywkę bez komórek może być również przygotowana jako dodatkowa kontrola sterylności.
3. Przykryj talerze pokrywkami i zawiń je w Parafilm. Inkubować płytki przez 48 godzin w temperaturze 30 °C, 225 obr./min i wilgotności względnej 80% w wilgotnym wytrząsarce.
4. Usuń Parafilm, dodaj 160 μl pożywki do każdego dołka za pomocą robota pipetującego, ponownie uszczelnij płytki i inkubuj je przez kolejne 24 godziny.
   nuta: Pożywkę minimalną i pożywkę do wyrażania przygotowuje się zgodnie z opisem w innym miejscu¹⁹. Poziomy wydzielania mogą się różnić w zależności od badanego genu i w związku z tym czas inkubacji musi być zoptymalizowany w każdym przypadku, aby zsynchronizować wzrost komórek we wszystkich studzienkach.
5. Odwirować płytki (płytki wzorcowe) przy 2 800 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
6. Przenieść 20 μl supernatantu z dołków w płytce głównej na płytkę repliki za pomocą wielofunkcyjnej stacji do obsługi cieczy.
   nuta: Aby sprzyjać wydzielaniu enzymów, zaleca się zastąpienie natywnego peptydu sygnałowego białka docelowego peptydami sygnałowymi powszechnie stosowanymi do ekspresji heterologicznej w drożdżach (np. α czynnik prepro-lider, lider toksyny K₁ Killer z S. cerevisiae, a nawet chimeryczne wersje obu peptydów¹³). Alternatywnie, natywny peptyd sygnałowy może być ewoluowany wyłącznie do wydzielania w drożdżach.
7. Za pomocą robota pipetującego dodać 20 μl 2 mM alkoholu p-metoksybenzylowego do 100 mM buforu fosforanowego o pH 6,0. Krótko wymieszać płytki w 96-dołkowym mieszadle płytkowym i inkubować je przez 30 minut w temperaturze suchej masy.
8. Za pomocą robota pipetującego dodać 160 μl odczynnika FOX do każdej płytki repliki i krótko wymieszać z mieszalnikiem (końcowe stężenie mieszaniny FOX w studzince: 100 μM oranżu ksylenolowego, 250 μM Fe(NH₄)₂(SO₄)₂ i 25 mM H₂SO₄).
   1. Dodaj kilka dodatków do odczynnika, aby zwiększyć czułość, takich jak współrozpuszczalniki organiczne (DMSO, etanol, metanol) lub sorbitol¹⁷. W tym przypadku wzmocnij odpowiedź, dodając sorbitol do końcowego stężenia 100 mM (ryc. 4).
9. Odczyt tabliczek (tryb punktu końcowego, t₀) przy długości fali 560 nm na czytniku płytek.
10. Inkubować płytki w temperaturze pokojowej, aż do uzyskania koloru i ponownie zmierzyć absorpcję (t₁).
    1. Obliczyć względną aktywność na podstawie różnicy między wartością Abs po inkubacji a wartością początkowego pomiaru znormalizowanego do typu rodzicielskiego dla każdej płytki (Δt₁ - t₀).
11. Poddaj najlepsze trafienia mutantów dwóm kolejnym ponownym badaniom przesiewowym, aby wykluczyć fałszywe alarmy.
    nuta: Zazwyczaj ponowne badania przesiewowe obejmują izolację plazmidu od drożdży, amplifikację i oczyszczanie w Escherichia coli, a następnie transformację świeżych komórek drożdży z plazmidem¹⁹. Każdy wybrany klon jest ponownie przesiewany w pentaplikacie.

Results

AAO z P. eryngii to zewnątrzkomórkowa flawooksydaza, która dostarcza peroksydazy grzybowej z_H2O2, aby mogły zacząć atakować ligninę. Dwa segmenty AAO poddano ukierunkowanej ewolucji za pomocą projektu MORPHING w celu zwiększenia jego aktywności i ekspresji w S. cerevisiae ¹⁹. Niezależnie od obcych enzymów przenoszonych przez S. cerevisiae, najbardziej krytycznym problemem podczas konstruowania zmutowanych bibliotek w drożdżach je...

Discussion

W tym artykule podsumowaliśmy większość wskazówek i sztuczek stosowanych w naszym laboratorium w celu inżynierii enzymów poprzez ukierunkowaną ewolucję u S. cerevisiae (na przykładzie AAO), tak aby można je było dostosować do użytku z wieloma innymi systemami enzymów eukariotycznych, po prostu postępując zgodnie z powszechnym podejściem opisanym tutaj.

Jeśli chodzi o tworzenie bibliotek, MORPHING jest szybką, jednoetapową metodą wprowadzania i rekombinacji losowych mutacji w małych od...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. Pożywki hodowlane
Ampicillin sól sodowa	Sigma-Aldrich	A0166	CAS Nº 69-52-3 M.W. 371.39
Bacto Agar	Difco	214010
Cloramphenicol	Sigma-Aldrich	C0378	CAS Nº 56-75-7 M.W. 323.13
D-(+)-Galactose	Sigma-Aldrich	G0750	CAS Nº 59-23-4 M.W. 180.16
D-(+)-Glukoza	Sigma-Aldrich	G5767	CAS Nº 50-99-7 M.W. 180.16
D-(+)-rafinoza pentahydrat	Sigma-Aldrich	83400	CAS Nº 17629-30-0 M.W. 594.51
Pepton	Difco	211677
Fosforan potasu jednozasadowy	Sigma-Aldrich	P0662	CAS Nº 7778-77-0 M.W. 136.09
Uracyl	Sigma Aldrich	U1128
Ekstrakt drożdżowy	Difco	212750
Drożdżowa baza azotowa bez aminokwasów	Difco	291940
Syntetyczne suplementy drożdżowe bez uracylu	Sigma-Aldrich	Y1501
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
2. Reakcje PCR
dNTP Mix	Agilent genomics	200415-51	25 mM każdy
iProof Polimeraza DNA o wysokiej wierności	Bio-rad	172-5301
Tetrahydrat chlorku manganu(II)	Sigma-Aldrich	M8054	CAS Nº 13446-34-9 MWW 197.91
Taq DNA Polimeraza	Sigma-Aldrich	D4545	Dla błędu podatny PCR
Nazwa<	silny>Firma	Numer katalogowy	Komentarze
3. Linearyzacja plazmidu
Enzym restrykcyjny BamHI	New England Biolabs	R0136S
Albumina surowicy bydlęcej	New England Biolabs	B9001S
Enzym restrykcyjny XhoI	New England Biolabs	R0146S
Enzym restrykcyjny Not I	England Biolabs	R0189S
Gel Red	Biotium	41003	Do barwienia DNA
strong>Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
>4. Testy FOX
Ammonium siarczan żelaza(II)	sześciowodny Sigma-Aldrich	F3754	CAS Nº 7783-85-9 M.W. 392.14
Anysil Alcohol	Sigma Aldrich	W209902	CAS Nº 105-13-5 M.W. 138.16
D-Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876	CAS Nº 50-70-4 M.W. 182.17
Nadtlenek wodoru 30%	Merck Millipore	1072090250	FOX krzywa standardowa
Ksylenol Pomarańczowa sól disodowa	Sigma-Aldrich	52097	CAS Nº 1611-35-4 M.W. 716.62
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
5. Żel agarozowy stuff
Agarose	Norgen	28035	CAS Nº 9012-36-6
Gel Red	Biotium	41003	Barwnik do analizy DNA
GeneRuler 1kb Ladder	Thermo Scientific	SM0311	DNA M.W. standard
Barwnik ładujący 6x	Thermo Scientific	R0611
Agaroza o niskiej temperaturze topnienia	Bio-rad	161-3112	CAS Nº 39346-81-1
Nazwa	Company	Numer katalogowy	Komentarze
6. Zestawy i komórki
S. cerevisiae szczep BJ5465	LGC Promochem	ATTC 208289	Szczep z niedoborem proteazy o genotypie: MATα ura3-52 trp1 leu2-delta1 his3-delta200 pep4::HIS3 prb1-delta1.6R can1 GAL
E. coli XL2-Blue kompetentne komórki	Agilent genomics	200150	Do oczyszczania i amplifikacji plazmidu
NucleoSpin Gel i zestaw	do czyszczenia PCRMacherey-Nagel	740,609,250	Ekstrakcja żelu DNA
Zestaw plazmidów NucleoSpin	Macherey-Nagel	740,588,250	Zestaw miniprep kolumny
Zestaw do transformacji drożdży	Sigma-Aldrich	YEAST1-1KT	W zestawie nośnik DNA (jądra łososia)
Zymoprep miniprep plazmidu drożdżowego I	Badania Zymo	D2001	Ekstrakcja plazmidu z drożdży
Nazwa	Company<	strong>Numer katalogowy	Komentarze
7. Płytki
96-dołkowe	Greiner Bio-One	655101	Przezroczyste, niesterylne, polistyrenowe (do pomiarów aktywności)
Płytki 96-dołkowe	Greiner Bio-One	655161	Przezroczyste, sterylne, polistyrenowe (do mikrofermentacji)
Pokrywka płytki 96-dołkowej	Greiner Bio-One	656171	Clear, sterylna, polistyren (do mikrofermentacji)