Przezskórna ocena czynności nerek u świadomych gryzoni

Współczynnik filtracji kłębuszkowej (GFR) jest najlepszym parametrem do oceny ogólnej funkcji nerek. Złoty standard do oznaczania GFR opiera się na klirensie egzogennych markerów nerkowych z moczem lub osoczem, takich jak inulina¹. Procedury te są jednak czasochłonne i skomplikowane, wymagają seryjnego pobierania próbek krwi i/lub moczu oraz późniejszych testów laboratoryjnych w celu ich analizy. Ponadto metody te są inwazyjne i stresujące dla zwierząt, ograniczając liczbę i częstotliwość, z jaką pomiary mogą być powtarzane. Opracowano szereg alternatywnych podejść w celu uproszczenia klasycznych procedur określania GFR, ale nadal opierają się one na pobieraniu próbek moczu i osocza^2-4 i/lub wymagają głębokiego znieczulenia^5,6, o którym wiadomo, że wpływa na hemodynamikę i funkcję nerek^7,8. Produkty końcowe metabolizmu, takie jak kreatynina, są również szeroko stosowane do oceny czynności nerek. Wiadomo jednak, że dokładność tych endogennych markerów nie jest optymalna, a ponadto do ich analizy niezbędne jest również pobieranie próbek moczu lub krwi.

Tutaj opisujemy przezskórną metodologię oceny funkcji nerek u przytomnych zwierząt. Ta metoda jest prostsza i szybsza niż tradycyjne metody, a także tylko minimalnie inwazyjna. Dzięki tej technice, przy użyciu zminiaturyzowanego urządzenia optycznego i egzogennego markera nerkowego izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC)-sinistryny, możliwe jest określenie czynności nerek niemal w czasie rzeczywistym bez konieczności pobierania próbek osocza lub moczu oraz bez chirurgicznego cewnikowania w celu podania substancji. Ze względu na te cechy metoda nadaje się do wykonywania pomiarów sekwencyjnych u tego samego zwierzęcia.

FITC-sinistrin jest markerem nerkowym swobodnie filtrowanym przez kłębuszki nerkowy, bez reabsorpcji i wydzielania kanalikowego. Część optyczna zminiaturyzowanego urządzenia składa się z dwóch diod elektroluminescencyjnych (LED), które wzbudzają podawany marker oraz fotodiody wykrywającej fluorescencję emitowaną przez skórę. Zarejestrowane dane są przechowywane w pamięci wewnętrznej zintegrowanej z urządzeniem i mogą być wykorzystane do wygenerowania krzywej kinetyki eliminacji FITC-sinistrin. Zasilanie zapewnia mały akumulator litowy. Bardziej szczegółowe informacje na temat urządzenia i jego poszczególnych elementów można znaleźć w Schreiber i wsp. ⁹. Urządzenie można łatwo zamontować na ciele zwierzęcia za pomocą dwustronnej łatki samoprzylepnej z przezroczystym okienkiem dla elementów optycznych. Wyniki są łatwo dostępne po zakończeniu okresu nagrywania.

Dzięki przedstawionej tutaj metodzie i protokołowi, wprowadzamy obiecującą technologię, która mogłaby zastąpić obecny złoty standard do określania GFR, nie tylko w badaniach, ale także w dziedzinie klinicznej.

Niezbędne eksperymenty do opracowania protokołu zostały przeprowadzone zgodnie z krajowymi przepisami i zostały zatwierdzone przez lokalny komitet nauk etycznych (Regierungspräsidium Karlsruhe).

1. Przygotowanie roztworu do wstrzykiwań FITC-sinistrin

1. Rozpuścić FITC-sinistrynę w soli fizjologicznej, aby przygotować roztwór podstawowy. Zalecana dawka u myszy wynosi 7,5 mg/100 g masy ciała (m.c.), natomiast u szczurów preferowana jest 5 mg/100 g m.c. FITC-sinistrin. W przypadku myszy należy przygotować roztwór podstawowy FITC-sinistrin o stężeniu 15 mg/ml, natomiast w przypadku szczurów przygotować roztwór o stężeniu 40 mg/ml.
   nuta: Roztwór podstawowy FITC-sinistrin można przygotować z wyprzedzeniem i przechowywać w temperaturze -20 °C, chroniąc przed światłem.

2. Przygotowanie zwierząt

1. Aklimatyzować zwierzęta przez co najmniej tydzień przed ich wprowadzeniem do jakiegokolwiek eksperymentu.
2. Znieczulać zwierzę za pomocą 5% izofluranu przy przepływie 5 l/min_O2 przez 2 min.
3. Upewnij się, że zwierzę jest odpowiednio znieczulone, obserwując jego oddech, który staje się wolniejszy i głębszy, i zweryfikuj brak reakcji z brakiem reakcji palca.
4. Gdy zwierzę zaśnie, zmniejsz znieczulenie do 2,5% izofluranu przy szybkości podawania 2 l/min O₂ i weź BW.
5. Usuń sierść z boku grzbietu zwierzęcia za pomocą golarki elektrycznej. Ogol obszar nieco większy niż obszar, który będzie zajmowany przez dwustronny plaster samoprzylepny o wymiarach 3 cm x 6 cm.
6. Następnie nałóż krem do depilacji na krótki czas (2-3 min), aby usunąć pozostałą sierść.
7. Dokładnie umyj obszar, aż krem zostanie całkowicie usunięty, ponieważ sam krem może być fluorescencyjny.
   nuta: Unikaj drapania skóry zwierzęcia, ponieważ może to spowodować podrażnienie/obrzęk. Jeśli depilowany obszar wykazuje pigmentację na skórze, ogol większy obszar, aż zostanie znalezione niepigmentowane miejsce na część optyczną urządzenia. Zaleca się golenie z 24-godzinnym wyprzedzeniem, aby zminimalizować ekspozycję na znieczulenie.

3. Przygotowanie urządzenia

1. Umieść przyrząd optyczny do pomiaru czynności nerek po jednej stronie dwustronnego plastra samoprzylepnego, umieszczając część optyczną nad przezroczystym okienkiem (ryc. 1), pozostawiając przeciwną część z folią ochronną.
   nuta: Podczas pracy z małymi gryzoniami zmniejsz rozmiar łaty, jak pokazano na rysunku 2.
2. Przymocuj do baterii kawałek dwustronnej łatki samoprzylepnej o odpowiednim rozmiarze, jak pokazano na rysunku 3.

4. Utrwalenie urządzenia na zwierzęciu

1. Należy obliczyć odpowiednią objętość wstrzyknięcia w zależności od masy ciała zwierzęcia.
2. Znieczulić zwierzę izofluranem, jak wskazano wcześniej w punktach 2.1-2.3.
3. Wytnij kawałek rurkowego elastycznego bandaża z gazy o długości około 1 cm dłuższej niż szerokość dwustronnego plastra samoprzylepnego, który ma być użyty.
4. Naciągnij bandaż z elastycznej gazy na głowę zwierzęcia i umieść go na grzbiecie, pozostawiając ogolony obszar odkryty.
   nuta: Alternatywnie przymocuj urządzenie za pomocą samej taśmy samoprzylepnej, ale należy pamiętać o nadmiernym nacisku na urządzenie.
5. Podłącz baterię do urządzenia, podłączając złącze baterii do odpowiedniego portu w urządzeniu. Następnie usuń folię ochronną z kawałka plastra i zamontuj baterię na górnej powierzchni urządzenia (Rysunek 4A). Upewnij się, że bateria jest prawidłowo podłączona, sprawdzając, czy urządzenie zaczyna migać.
   nuta: U szczurów baterię można również przymocować bezpośrednio na plastrze samoprzylepnym, obok urządzenia (Rysunek 4B).
6. Zdejmij osłonę ochronną z plastra z urządzeniem operacyjnym i umieść ją na ogolonym obszarze na grzbiecie zwierzęcia, trzymając jego krawędzie, aż zostanie prawidłowo zamocowana.
7. Przykryj urządzenie rurkowym bandażem z elastycznej gazy, przyklejając go do klejącej powierzchni plastra (Rysunek 5).
8. Prawidłowo rozciągnij bandaż rurkowy na brzuchu zwierzęcia, upewniając się, że kończyny mogą się swobodnie poruszać.
9. Aby uzyskać lepsze mocowanie i ochronę urządzenia, nałóż pasek taśmy klejącej zgodnie z kształtem urządzenia i zakrywający przewody akumulatora.
10. Mierz tło przez 1 do 3 minut, bez wywierania nacisku na urządzenie

5. Procedura podawania i pomiaru FITC-sinistrin

1. Jeśli to konieczne, przed wstrzyknięciem należy rozgrzać ogon zwierzęcia ciepłą wodą lub płytą grzewczą o kontrolowanej temperaturze.
2. Wstrzyknąć przez żyłę ogonową odpowiednią objętość roztworu podstawowego FITC-sinistrin. Objętość wstrzyknięcia zależy od masy ciała zwierzęcia i dlatego musi być obliczona dla każdej osoby, biorąc pod uwagę pożądaną dawkę i stężenie roztworu podstawowego, o których mowa w punkcie 1.1.
3. Upewnij się, że cały roztwór FITC-sinistrin jest podawany dożylnie, a nie podskórnie.
   nuta: Alternatywnie, FITC-sinistrin może być podawany za pomocą wstępnie wszczepionego cewnika dożylnego wyprowadzanego na kark u gryzoni lub przez wstrzyknięcie wstecz oczodołowe u myszy
.
4. Ostrożnie umieść zwierzę z powrotem w klatce domowej, unikając silnych ruchów i jakiegokolwiek nacisku na urządzenie, ponieważ wprowadziłoby to artefakty ruchowe.
5. Umieść klatkę domową w spokojnym miejscu, aby uniknąć przeszkadzania zwierzęciu.
6. Wykonuj pomiar przez co najmniej 1 godzinę w przypadku pracy z myszami i 2 godziny w przypadku korzystania ze szczurów. W tym czasie urządzenie optyczne będzie mierzyć przez skórę fluorescencję emitowaną przez FITC-sinistrin.
   nuta: W okresie rejestracji zwierzę musi być trzymane samotnie. Ponadto należy usunąć dopływ wody, a także wystające konstrukcje, takie jak druciane pokrywy, aby uniknąć uszkodzenia urządzenia elektronicznego i artefaktów ruchu w wyniku uderzeń o przedmioty.

6. Usuwanie urządzenia

1. Po upływie okresu rejestracji należy wyjąć urządzenie bez znieczulenia, jednak w razie potrzeby znieczulić zwierzę krótko pod 5% izofluranem przy szybkości podawania 5 l/min_O2 w ciągu 2 minut.
2. Ostrożnie najpierw zdejmij taśmę klejącą, a następnie bandaż rurkowy.
3. Delikatnie odczep dwustronny plaster samoprzylepny od skóry i umieść zwierzę z powrotem w normalnej klatce domowej.

7. Odczyt danych

1. Odłącz akumulator od urządzenia i usuń łatkę samoprzylepną.
   nuta: Dane są przechowywane w urządzeniu do momentu rozpoczęcia nowego pomiaru. Po podłączeniu baterii zapisane dane są nadpisywane nowymi nagraniami. Dlatego nie podłączaj ponownie baterii przed pobraniem danych z urządzenia. Istnieje 10-sekundowy okres karencji przeznaczony na przypadkowe ponowne włączenie baterii.
2. Podłącz urządzenie do komputera za pomocą micro USB i pobierz dane za pomocą dostarczonego oprogramowania. Plik wyjściowy to plik .csv, który można otwierać i modyfikować za pomocą programu do obsługi arkuszy kalkulacyjnych.
3. Otwórz plik danych z odpowiednim oprogramowaniem dla urządzenia optycznego i wygeneruj krzywą kinetyki eliminacji za pomocą protokołów oprogramowania.
4. Przeanalizuj krzywą, postępując zgodnie z instrukcjami dostarczonymi z urządzeniem optycznym. Krótko, w celu oceny danych, należy ustawić sygnał tła zmierzony przed podaniem FITC-sinistrin i zaznaczyć początek fazy wykładniczego wydalania markera, która zwykle występuje 15 minut i 45 minut po wstrzyknięciu bolusa, odpowiednio u myszy i szczurów.
   nuta: Oprogramowanie automatycznie wyświetli okres półtrwania FITC-sinistryny (t_1/2) wraz z wartością R², określoną przez model 1-komorowy. t_1/2 można wykorzystać do obliczenia GFR przy użyciu współczynnika konwersji^9,10.

Konfiguracja pomiaru przezskórnego jest bardzo prosta i szybka: urządzenie umieszcza się na dwustronnym plastrze samoprzylepnym (Rysunek 1) i w razie potrzeby dostosowuje rozmiar (Rysunek 2), przygotowuje się baterię (Rysunek 3) i podłącza (Rysunek 4).

Ta metoda oceny czynności nerek została już zweryfikowana u różnych gatunków w porównaniu z tradycyjnym podejściem do klirensu osocza9,11,12. Zgodnie z przedstawionym tutaj protokołem, Schreiber i wsp. wykazały trafność tej techniki w różnych modelach mysich, wykazując wysoce porównywalne wyniki w zakresie pomiaru przezskórnego i klirensu osocza dla wszystkich badanych grup (Tabela 1)9. W niniejszej pracy uzyskany t1/2 przeliczono na GFR przy użyciu półempirycznego współczynnika konwersji specyficznego dla myszy.

Spójność przezskórnej oceny czynności nerek została również udowodniona na różnych szczepach myszy. Sekwencyjne pomiary w ciągu 3 dni u tego samego zwierzęcia wykazały współczynnik wariancji 3,0-6,2%13. W tym badaniu nie zaobserwowano konwersji do GFR, ale wyniki zostały wyrażone i zinterpretowane bezpośrednio w kategoriach t1/2.

Możliwość uzyskania wyników niemal w czasie rzeczywistym jest jedną z wielkich zalet tej metody. Po upływie okresu rejestracji wyniki są natychmiast dostępne do analizy, a dostarczone oprogramowanie natychmiast wyświetla krzywą wydalania FITC-sinistrin (ryc. 6). W tym samym oprogramowaniu można uzyskać t1/2 FITC-sinistriny, który może być bezpośrednio wykorzystany jako parametr do oceny funkcji nerek przekształconej pod względem GFR. Rycina 7 pokazuje, jak wygląda krzywa wydalania FITC-sinistrin mierzona przezskórnie u zwierzęcia z zaburzeniami czynności nerek. Gdy czynność nerek jest zaburzona, FITC-sinistrin t1/2 wzrasta z powodu zmniejszonego wydalania substancji i pojawienia się zmian krzywej. Zazwyczaj zmierzona krzywa nie wraca do poziomu tła i przedstawia zwiększony obszar pod krzywą. U tego samego zwierzęcia pomiary przed i po urazie mogą powodować wzrost maksymalnej intensywności fluorescencji ze względu na akumulację markera spowodowaną jego zmniejszonym wydalaniem. W przypadku niewydolności nerek przezskórnie mierzona krzywa FITC-sinistrin może wykazywać stan stacjonarny z powodu poważnie upośledzonej funkcji (ryc. 7B).

Użycie zminiaturyzowanego urządzenia u kilku szczepów gryzoni o różnym statusie zdrowotnym pokazało, że technika ta jest wystarczająco odpowiednia i czuła, aby wykryć zmiany spowodowane chorobą nerek i starzeniem się. Tabela 2 przedstawia podsumowanie modeli mysich przebadanych do tej pory tą metodą.

Rysunek 1. Umieszczenie urządzenia na dwustronnej łatce samoprzylepnej. Urządzenie montowane jest na plastrze samoprzylepnym, umieszczając jego część optyczną w przezroczystym okienku.

Rysunek 2. Dostosowanie łatki klejącej do małych gryzoni. Do stosowania u małych zwierząt zaleca się zmniejszenie rozmiaru plastra. O: Użyj urządzenia jako przewodnika, aby prawidłowo przyciąć łatkę. B: Po uzyskaniu pożądanego rozmiaru urządzenie można umieścić na lepkiej powierzchni plastra. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Przygotowanie akumulatora. Aby przymocować baterię do urządzenia, odetnij mały kawałek dwustronnej łatki samoprzylepnej (A i B) i umieść ją na powierzchni baterii (C). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4. Podłączenie i umieszczenie akumulatora podczas pomiaru.(A) W przypadku małych gryzoni, takich jak myszy, ze względu na ograniczoną przestrzeń, baterię należy umieścić na urządzeniu. (B) U większych zwierząt baterię można umieścić obok urządzenia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ryc. 5. Umieszczenie rurkowego bandaża z elastycznej gazy u szczura. Bandaż rurkowy powinien zakrywać dwustronny plaster samoprzylepny, nie zakłócając swobodnego ruchu kończyn dla wygody zwierzęcia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6. Reprezentatywny obraz krzywej eliminacji FITC-sinistrin. Sygnał generowany przez FITC-sinistrin jest wykrywany przezskórnie i przechowywany w pamięci wewnętrznej urządzenia. Po pobraniu zarejestrowanych danych na komputer, oprogramowanie generuje krzywą porównywalną do tej przedstawionej na obrazie. Oś Y przedstawia zarejestrowaną intensywność fluorescencji [AU], emitowaną przez wstrzyknięty marker FITC-sinistrin, natomiast oś X reprezentuje czas trwania pomiaru w czasie [min]. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 7. Reprezentatywny obraz krzywej eliminacji FITC-sinistryny u zwierząt z zaburzeniami czynności nerek.(A) Krzywa eliminacji FITC-sinistryny u zwierząt z upośledzoną czynnością nerek zazwyczaj wykazuje zwiększoną powierzchnię pod krzywą i niezdolność do osiągnięcia linii podstawowej w normalnym okresie pomiaru. (B) U zwierząt z poważnymi zaburzeniami zdolności pomiarowych krzywa mierzona przezskórnie może wykazywać stan stacjonarny, który wskazuje na niewydolność nerek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1. Walidacja pomiaru przezskórnego poprzez porównanie z tradycyjnym klirensem osocza. Przezskórny pomiar czynności nerek został zwalidowany w różnych modelach mysich (zdrowe i jednostronnie nefrektomizowane (UNX) myszy C57BL/6-129 SV oraz mysi model zapalenia nefronoftozy (pcy)) w porównaniu z klirensem osocza. Wartości są średnimi ± SD. GFR, współczynnik filtracji kłębuszkowej9.

Tabela 2. Modele mysie badane przy użyciu pomiaru przezskórnego. UNX, jednostronnie nefrektomizowany; ACE, enzym konwertujący angiotensynę; Tgumodwt/wt, transgeniczny nokaut uromodulinowy, SD, szczur Sprague Dawley; PKD, wielotorbielowatość nerek.

NG posiada patent na produkcję FITC-sinistrin.