Ten protokół opisuje technikę izolacji w celu uzyskania pierwotnych mezenchymalnych komórek zrębu rezydujących w płucach od szczurów, poprzez zastosowanie trawienia enzymatycznego, separacji gradientu gęstości, przylegania plastiku i selekcji kulek magnetycznych CD146+.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Izolacja mezenchymalnych komórek zrębowych płuc rezydentnych CD146 + z płuc szczura
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Mezenchymalne komórki zrębu (MSC) są coraz częściej rozpoznawane ze względu na swój potencjał terapeutyczny w szerokim zakresie chorób, w tym chorób płuc. Oprócz wykorzystania MSCs szpiku kostnego i rdzenia pępowinowego w terapii egzogennych komórek, rośnie również zainteresowanie potencjałem naprawczym i regeneracyjnym rezydujących tkanki MSC. Co więcej, prawdopodobnie odgrywają rolę w prawidłowym rozwoju narządów i przypisuje się im rolę w chorobach, szczególnie tych o charakterze zwłóknieniowym. Główną przeszkodą w badaniu tych rezydujących tkankowych MSCs jest brak wyraźnego markera do izolacji i identyfikacji tych komórek. Opisana tutaj technika izolacji wykorzystuje wiele cech MSC rezydentnych w płucach (L-MSC). Po złożeniu szczurów w ofierze płuca są usuwane i wielokrotnie płukane w celu usunięcia krwi. Po mechanicznej dysocjacji za pomocą skalpela płuca są trawione przez 2-3 godziny przy użyciu mieszanki kolagenazy typu I, neutralnej proteazy i DNazy typu I. Otrzymana zawiesina jednokomórkowa jest następnie przemywana i nakładana warstwami na podłoże o gradiencie gęstości (gęstość 1,073 g/ml). Po odwirowaniu komórki z interfazy są myte i posiewane w kolbach poddanych działaniu kultur. Komórki hoduje się przez 4-7 dni w fizjologicznych warunkach 5%O2, 5% CO2 . W celu zubożenia fibroblastów (CD146-) i zapewnienia populacji składającej się wyłącznie z L-MSC (CD146+), pozytywna selekcja komórek CD146+ odbywa się poprzez selekcję kulek magnetycznych. Podsumowując, procedura ta niezawodnie wytwarza populację pierwotnych L-MSC do dalszych badań in vitro i manipulacji. Ze względu na charakter protokołu, można go łatwo przełożyć na inne eksperymentalne modele zwierzęce.
Wprowadzenie
Mesenchymalne komórki macierzyste (MSCs) są coraz częściej uznawane ze względu na ich potencjał terapeutyczny w szerokim spektrum chorób, w tym w chorobach płuc. Poza wykorzystaniem MSCs z szpiku kostnego i pępowiny w egzogennej terapii komórkowej, rośnie zainteresowanie potencjałem naprawczym i regeneracyjnym rezydentnych MSCs tkankowych. Podczas rozwoju, w tym w płucach, mezenchyma stanowi ważne źródło sygnałów rozwojowych, a rezydentne MSCs są prawdopodobnym kandydatem do pełnienia centralnej roli w tym procesie. Ponadto pojawiają się dowody na to, że rezydentne MSCs ulegają zaburzeniom w chorobach dorosłych, w tym w nowotworach1,2 i zwłóknieniach3<....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu w Ottawie (protokół etyki zwierząt OHRI-1696). Opieka nad zwierzętami odbywała się zgodnie z wytycznymi instytucji.
1. Izolacja mezenchymalnych komórek zrębowych płuc
- Przygotować mieszaninę enzymów w probówce o pojemności 50 ml: zważyć 30 U neutralnej proteazy, 2 500 U Kolagenazy I i 500 U DNAzy I. Ilości te wystarczają dla płuc dorosłego szczeniaka myszy lub szczura. Przygotować w dniu izolacji i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia.
- Uśmierc młode szczura w dniu 13 przez dootrzewnowe wstrzyknięcie pentobarbitalu ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Dwie z najbardziej wiarygodnych cech fizycznych MSC, gęstość oraz przyleganie do tworzywa sztucznego, są wykorzystywane w pierwszej części niniejszego protokołu do uzyskania frakcji komórek mezenchymalnych płuc zawierającej L-MSC. Chociaż interfaza gradientu gęstości będzie zawierać monocyty i makrofagi oprócz mezenchymalnych komórek płuc, przyleganie do tworzywa sztucznego, a następnie 3-5 dni hodowli, zapewnia, że pozostaną jedynie mezenchymalne komórki płuc. Rzeczywiście, populacja ta .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Izolacja i hodowla pierwotnych L-MSCs stanowi okazję do lepszego zrozumienia ich funkcji i interakcji z innymi populacjami komórek na poziomie komórkowym, a także ich roli w rozwoju płuc, zdrowiu i chorobie. Jest to szczególnie ważne, ponieważ brak specyficznego pojedynczego markera tych komórek sprawia, że badanie tych komórek in situ jest prawie niemożliwe. Podobnie jak w przypadku wszystkich pierwotnych populacji komórek, należy pamiętać, że komórki te są bardziej skłonne do zmiany swojego charakteru, im dłuż.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
JJPC jest wspierane przez stypendium podoktorskie Canadian Institutes of Health Research (CIHR). MAM otrzymuje stypendium naukowe Niemieckiej Narodowej Fundacji Akademickiej - Studienstiftung des Deutschen Volkes i jest wspierane przez grant EFCNI (Europejskiej Fundacji Opieki nad Noworodkiem). BT jest wspierany przez CIHR, Kanadyjskie Stowarzyszenie Chorób Płuc, Sieć Komórek Macierzystych oraz Instytut Badawczy Szpitala Dziecięcego Wschodniego Ontario.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Neutralna Proteaza | Worthington Biochemical Corporation | LS02104 | Przygotować w dniu izolacji i przechowywać w temperaturze 4 stopni C do czasu użycia |
| Kolagenaza I | Worthington Biochemical Corporation | LS004196 | Przygotować w dniu izolacji i przechowywać w temperaturze 4 stopni C do czasu użycia |
| DNAzy I | Sigma-Aldrich | D5025 | Przygotować w dniu izolacji i przechowywać w temperaturze 4 & st; C do czasu użycia |
| Pentobarbital sodowy (eutanyl) | Bimeda-MTC Animal Health Inc, Dublin, Irlandia-Użyj | 0,2 ml dla szczeniąt szczurów o wadze od 20 do 30 g; większe zwierzęta mogą potrzebować więcej. | |
| Dulbecco' s PBS + Pirogronian sodu + Glukoza | Life Technologies | 14287-072 | Bardzo ważne jest stosowanie tego typu D-PBS, ponieważ wapń i magnez obecne w tym D-PBS ułatwiają trawienie enzymatyczne |
| Ficoll-Paque PREMIUM (1.073 g/cm3) | GE Healthcare | 17-5446-52 | Nośniki gradientu gęstości. Aby uzyskać dobrą interfazę, ważne jest, aby warstwowanie zawiesiny pojedynczej komórki zachodziło w >45° kąta przy bardzo niskiej prędkości, a następnie odwirowanie odbywa się w temperaturze 19 stopni Celsjusza. |
| &alfa; MEM | Sigma-Aldrich | M8042 | Ciepły w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem |
| 200 mM L-Glutamina | Life Technologies | 25030-164 | |
| 100x Antybiotykowo-Przeciwgrzybicze | Technologie Życia | 15240-062 | Penicylina/Streptomycyna/Fungizona |
| M-280 Dynabeads | Life Technologies | 11205D | Koraliki magnetyczne |
| biotynylowane poliklonalne królicze anty-mysie IgG | Dako, Agilent Technologies | E0464 | Biotynylowane przeciwciało drugorzędowe, które pasuje do przeciwciała antyszczurzego CD146 opisanego poniżej |
| Magnes DynaMag5-magnet | Life Technologies | 12303D | , który jest zalecany do stosowania z Dynabeads. UWAGA: magnes należy dobrać na podstawie specyfikacji producenta s instrukcje dotyczące wybranych koralików magnetycznych. |
| TrypLE express | Life Technologies | 12605-028 | Delikatna alternatywa bez trypsyny, użyj 1 ml TrypLE express/25 cm2 powierzchni. Po oderwaniu 10 ml pożywki hodowlanej L-MSC wystarcza do inaktywacji 3 ml |
| przeciwciała antyszczurzego CD146 | Lifespan Inc. | C35841 | 12,5 μ l na 0,5 x 106 |
| komórek Pentaspan (roztwór pentaskrobi) | Bristol-Myers Squibb | Canada-Można | uzyskać za pośrednictwem lokalnych służb krwiodawstwa lub oddziałów hematologicznych. Alternatywnie można użyć 20% roztworu pentaskrobi PSI (Preservation Solutions, PST001) rozcieńczonego 1:1 0,9% NaCl. |
| Pojemnik do zamrażania Mr. Frosty | ThermoFisher Scientific | 5100-0001 | Poprawia żywotność podczas zamrażania L-MSC przez noc w temperaturze -80 & deg; Z |
Bibliografia
- Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression. Nature. 432, 332-337 (2004).
- Wei, H. J., et al. FOXF1 mediates mesenchymal stem cell fusion-induced reprogramming of lung cancer cells. Oncotarget. 5....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
