Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Izolacja mezenchymalnych komórek zrębowych płuc rezydentnych CD146 + z płuc szczura

7.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53782

⸱

17 czerwca 2016

 ,  , 
1Sinclair Centre for Regenerative Medicine, Ottawa Hospital Research Institute, 2University of Ottawa, 3Department of Neonatology and Pediatric Critical Care Medicine, Medical Faculty and University Hospital Carl Gustav Carus, Technische Universität Dresden, 4DFG Research Center and Cluster of Excellence for Regenerative Therapies (CRTD), Technische Universität, Dresden, 5Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje technikę izolacji w celu uzyskania pierwotnych mezenchymalnych komórek zrębu rezydujących w płucach od szczurów, poprzez zastosowanie trawienia enzymatycznego, separacji gradientu gęstości, przylegania plastiku i selekcji kulek magnetycznych CD146+.

Streszczenie

Mezenchymalne komórki zrębu (MSC) są coraz częściej rozpoznawane ze względu na swój potencjał terapeutyczny w szerokim zakresie chorób, w tym chorób płuc. Oprócz wykorzystania MSCs szpiku kostnego i rdzenia pępowinowego w terapii egzogennych komórek, rośnie również zainteresowanie potencjałem naprawczym i regeneracyjnym rezydujących tkanki MSC. Co więcej, prawdopodobnie odgrywają rolę w prawidłowym rozwoju narządów i przypisuje się im rolę w chorobach, szczególnie tych o charakterze zwłóknieniowym. Główną przeszkodą w badaniu tych rezydujących tkankowych MSCs jest brak wyraźnego markera do izolacji i identyfikacji tych komórek. Opisana tutaj technika izolacji wykorzystuje wiele cech MSC rezydentnych w płucach (L-MSC). Po złożeniu szczurów w ofierze płuca są usuwane i wielokrotnie płukane w celu usunięcia krwi. Po mechanicznej dysocjacji za pomocą skalpela płuca są trawione przez 2-3 godziny przy użyciu mieszanki kolagenazy typu I, neutralnej proteazy i DNazy typu I. Otrzymana zawiesina jednokomórkowa jest następnie przemywana i nakładana warstwami na podłoże o gradiencie gęstości (gęstość 1,073 g/ml). Po odwirowaniu komórki z interfazy są myte i posiewane w kolbach poddanych działaniu kultur. Komórki hoduje się przez 4-7 dni w fizjologicznych warunkach 5%O2, 5% CO2 . W celu zubożenia fibroblastów (CD146-) i zapewnienia populacji składającej się wyłącznie z L-MSC (CD146+), pozytywna selekcja komórek CD146+ odbywa się poprzez selekcję kulek magnetycznych. Podsumowując, procedura ta niezawodnie wytwarza populację pierwotnych L-MSC do dalszych badań in vitro i manipulacji. Ze względu na charakter protokołu, można go łatwo przełożyć na inne eksperymentalne modele zwierzęce.

Wprowadzenie

Mesenchymalne komórki macierzyste (MSCs) są coraz częściej uznawane ze względu na ich potencjał terapeutyczny w szerokim spektrum chorób, w tym w chorobach płuc. Poza wykorzystaniem MSCs z szpiku kostnego i pępowiny w egzogennej terapii komórkowej, rośnie zainteresowanie potencjałem naprawczym i regeneracyjnym rezydentnych MSCs tkankowych. Podczas rozwoju, w tym w płucach, mezenchyma stanowi ważne źródło sygnałów rozwojowych, a rezydentne MSCs są prawdopodobnym kandydatem do pełnienia centralnej roli w tym procesie. Ponadto pojawiają się dowody na to, że rezydentne MSCs ulegają zaburzeniom w chorobach dorosłych, w tym w nowotworach1,2 i zwłóknieniach3. Główną przeszkodą w badaniu tych rezydentnych MSCs tkankowych jest brak jednoznacznego markera umożliwiającego izolację i identyfikację tych komórek4. Antygen komórek macierzystych-1 (Sca-1) został zidentyfikowany u myszy jako marker dla różnych tkankowych komórek macierzystych i może być stosowany do izolacji L-MSCs5, lecz niestety nie posiada znanych ortologów u innych gatunków6. Badacze opisali szereg różnych metod izolacji L-MSCs z tkanki płucnej lub płynu z płuc. Metody te obejmują zarówno techniki oparte na sortowaniu komórek aktywowanym fluorescencją (FACS), selekcjonujące komórki CD31-/CD45-/CD90+7, CD31-/CD45-/cząsteczka adhezji komórek nabłonkowych (EpCAM)-/Sca-1+8, komórki wykazujące ekspresję transportera wielolekowej oporności ATP-binding cassette G (ABCG2)9 lub wypływ barwnika Hoechst 3334210, jak i adhezję do plastiku11,12 oraz migrację z rozdrobnionej tkanki13.

Przedstawiona tutaj metoda oferuje szereg zalet. Dzięki zastosowaniu łagodnego trawienia enzymatycznego oraz gradientu gęstości14, uzyskuje się wszystkie komórki z zakresu gęstości obejmującego MSC, z wyłączeniem komórek nabłonkowych lub śródbłonkowych. Następujący po tym etap adhezji do tworzywa sztucznego zapewnia, że tylko komórki mezenchymalne przylegają i pozostają w kulturze, co eliminuje leukocyty. Co najważniejsze jednak, etap selekcji CD146+ pozwala na wyeliminowanie fibroblastów, ponieważ komórki te nie wykazują ekspresji CD146. Ekspresja cząsteczki adhezyjnej komórek CD146 jest dodatnio skorelowana z wielopotencjalnością i stanowi zatem dobry marker do oddzielenia fibroblastów od populacji komórek mezenchymalnych15-19. Jest to przewaga nad stosowaniem CD90 jako markera selekcyjnego, ponieważ jest on wyrażany nie tylko w MSC, ale także w lipofibroblastach5,20. W niniejszym protokole zdecydowaliśmy się na selekcję za pomocą kulek magnetycznych, ponieważ jest ona łagodniejsza dla komórek, a cała procedura może być przeprowadzona w warunkach sterylnych. Inną istotną zaletą tej metody izolacji w porównaniu z metodą wyprowadzenia (outgrowth), jest jej względna szybkość — trwa ona od 6 do 10 dni, podczas gdy metoda wyprowadzenia wymaga miesiąca lub więcej. Od trzech do pięciu dni po wstępnej izolacji populacja mezenchymalna jest gotowa do selekcji CD146+; po kolejnych trzech do pięciu dniach komórki CD146+ są gotowe do użycia w eksperymentach lub mogą zostać zamrożone do późniejszego wykorzystania. Skrócenie czasu hodowli poprawia jakość komórek, ponieważ w przedłużonej kulturze ex vivo MSC ulegają transdyferencjacji w kierunku fibroblastów19. Wreszcie, ze względu na charakter protokołu, metodę tę można zastosować u innych gatunków, wybierając odpowiednie przeciwciała, a nawet w odniesieniu do innych układów narządowych poprzez dostosowanie doboru enzymów trawiących oraz czasu inkubacji.

Szczegółowy protokół tej metody izolacji przedstawiono poniżej, natomiast schematyczny przegląd izolacji i późniejszej selekcji subpopulacji CD146+ znajduje się odpowiednio na Rysunku 1A i 1B. Dodatkowo zamieszczono szczegółowe informacje dotyczące pasażowania, zamrażania i rozmrażania tych komórek.

Proces izolacji i znakowania komórek płucnych; schemat przedstawia trawienie, gradient gęstości i separację magnetyczną.
Rysunek 1. Schematyczny przegląd izolacji mezenchymalnych komórek płucnych (A) i następującej po niej selekcji komórek CD146+ (B). min = minuty; EDTA = kwas etylenodiaminotetraoctowy; 2nd Ab = przeciwciało wtórne; α-CD146 Ab = przeciwciało pierwotne anty-CD146; -ve cells = komórki CD146 ujemne; +ve cells = komórki CD146 dodatnie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu w Ottawie (protokół etyki zwierząt OHRI-1696). Opieka nad zwierzętami odbywała się zgodnie z wytycznymi instytucji.

1. Izolacja mezenchymalnych komórek zrębowych płuc

  1. Przygotować mieszaninę enzymów w probówce o pojemności 50 ml: zważyć 30 U neutralnej proteazy, 2 500 U Kolagenazy I i 500 U DNAzy I. Ilości te wystarczają dla płuc dorosłego szczeniaka myszy lub szczura. Przygotować w dniu izolacji i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia.
  2. Uśmierc młode szczura w dniu 13 przez dootrzewnowe wstrzyknięcie pentobarbitalu sodu (0,2 ml, 65 mg/ml). Użyj odruchu szczypania palców u stóp, aby stwierdzić utratę przytomności. Śmierć zwierzęcia zapewnia otwarcie klatki piersiowej, jak opisano poniżej.
  3. Zdezynfekuj skórę, spryskując zwierzę 70% etanolem i ostrożnie otwórz klatkę piersiową za pomocą nożyczek chirurgicznych, zaczynając od przepony i przecinając w kierunku strony rostralnej, bardzo uważając, aby nie uszkodzić płuc. Rozłóż klatkę piersiową za pomocą hemostatycznych zacisków lub alternatywnie odetnij klatkę piersiową, aby zapewnić dostęp do klatki piersiowej.
  4. Wykrwawić zwierzę, usuwając serce. Aby usunąć serce, chwyć grasicę i serce małymi kleszczami i odetnij je nożyczkami chirurgicznymi. Natychmiast po tym należy wchłonąć krew gazą, aż z przeciętej aorty i tętnicy płucnej przestanie wypływać krew.
  5. Usuń płuca z klatki piersiowej w następujący sposób: przytrzymaj tchawicę małymi kleszczami, a następnie odetnij tchawicę nożyczkami chirurgicznymi po stronie rostralnej. Delikatnie wyciągając pakiet płuc z klatki piersiowej, odetnij tkankę łączną po stronie grzbietowej wzdłuż klatki piersiowej, aby uwolnić płuca.
  6. Odetnij płuca od aorty i przełyku, przecinając wzdłuż przepony nożyczkami chirurgicznymi. Teraz, gdy płuca są całkowicie wolne od klatki piersiowej, delikatnie usuń pozostałą krew za pomocą gazy.
  7. Usunąć tchawicę i oskrzela nożyczkami chirurgicznymi i ostrożnie przenieść płaty płuc do 50 ml probówki zawierającej zimne 35 ml 30% antykoagulantu cytrynianowo-fosforanowo-dekstroadeninowego (CPDA-1) (26,30 g cytrynianu trisodowego dwuwodnego, 3,27 g jednowodnego kwasu askorbinowego, 2,22 g diwodorofosforanu sodu, 31,80 g D-glukozy, 0,275 g adeniny w 1 l oczyszczonegoH2O; sterylnie przefiltrować roztwór za pomocą filtra membranowego 0,22 μm przed użyciem) w buforowanym roztworem soli fizjologicznej (PBS) w celu usunięcia krwi i zanieczyszczeń.
  8. Po 5 minutach płukania w 30% CPDA-1/PBS, przenieś płuca do nowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej 35 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) (RT), delikatnie odwróć w celu usunięcia cytrynianu. Przenieść do probówki zawierającej 35 ml PBS + pirogronian sodu + glukoza (DPBS++) (RT) firmy Dulbecco. Każdy etap płukania powinien trwać około 5 min.
    Uwaga: DPBS++ można zamówić w handlu lub złożyć w następujący sposób21: chlorek wapnia dwuwodny 132,4 mg, chlorek magnezu sześciowodny 100 mg, chlorek potasu (bezwodny) 200 mg, fosforan potasu jednozasadowy (bezwodny) 200 mg, chlorek sodu (bezwodny) 8 000 mg, sodu fosforan dwuzasadowy (bezwodny) 1 144,5 mg, D-glukoza 1000 mg, pirogronian sodu 36 mg w 1 l oczyszczony H2O, Odczyn pH 7,3. Przed użyciem sterylnie przefiltrować roztwór za pomocą filtra membranowego 0,22 μm.
  9. Rozpuścić mieszaninę enzymów, dodając 10 ml DPBS++ (podgrzanego do 37 °C) i delikatnie odwracając aż do rozpuszczenia.
  10. Przenieść płuca do nowej probówki o pojemności 50 ml i posiekać płuco na ściance probówki za pomocą skalpela, aż zostaną drobno zmielone. Dodać mieszaninę enzymów do tkanki (10 ml mieszanki enzymatycznej na płuco dorosłego osobnika myszy/szczura), szczelnie zamknąć probówkę i inkubować w temperaturze 38 °C z delikatnym mieszaniem (w mieszalniku termicznym, łaźni wodnej z wytrząsaniem lub w łaźni wodnej z regularnym mieszaniem ręcznym). Czas trwania zależy od rodzaju tkanki: tkanka płodowa 60 min, tkanka młodociana/dorosła 90-120 min, zwłóknienie dorosłej tkanki 120-150 min.
  11. Zatrzymaj trawienie poprzez chelatację kationów dwuwartościowych za pomocą 200 μl kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA, 0,15 M, pH 7,4. Przed użyciem sterylnie przefiltrować roztwór za pomocą filtra membranowego 0,22 μm).
  12. Dodać 20 ml 5% płodowej surowicy bydlęcej (FBS)/PBS i przepuścić całą zawiesinę przez sitko o wielkości 100 μm do nowej probówki o pojemności 50 ml. Przepłukać probówkę i sitko komórkowe 10 ml 5% FBS/PBS, zwiększając całkowitą objętość do 40 ml.
  13. Wirować przez 5 minut przy 500 x g, RT.
  14. Usunąć sklarowany osad (osad powinien być wyraźnie widoczny), ponownie zawiesić w 40 ml 5% FBS/PBS i powtórzyć etap wirowania 1.13.
  15. Zawiesić ponownie w 4 ml 5% FBS/PBS (RT) i ostrożnie nałożyć warstwę na 3 ml gradientowej pożywki o gęstości (1,073 g/cm3) w probówceo pojemności 15 ml 14. Aby uzyskać dobrą interfazę, ważne jest, aby nakładanie warstw zawiesiny pojedynczej komórki odbywało się pod kątem >45° przy bardzo niskiej prędkości.
  16. Wirować 20 min przy 900 x g, średnie (5/10) przyspieszenie, bez zwalniania, 19 °C.
  17. Zebrać komórki obecne w interfazie i ponownie zawiesić je w 10 ml sterylnego PBS.
  18. Wirować przez 5 minut w temperaturze 500 x g, 21 °C.
  19. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 10 ml wstępnie podgrzanej, kompletnej pożywki hodowlanej L-MSC (minimalna ilość niezbędnych pożywek Eagle, modyfikacja alfa (αMEM), uzupełniona 2 mmol L-glutaminy na 500 ml αMEM, 20% obj. FBS i 1% obj. penicyliny/streptomycyny/amfoterycyny B.
  20. Powtórzyć krok wirowania 1.18. Następnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić w 10 ml wstępnie ogrzanej świeżej pożywki hodowlanej.
  21. Policz komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek i płytki o dużej gęstości, ponieważ większość komórek na tym etapie nie przylega do plastiku. Dokładna gęstość posiewu zależy od gatunku i wieku zwierzęcia, np. komórki płuca dorosłej myszy wysiewa się na 105 komórek/cm2, podczas gdy komórki z płuca młodego szczura są wystarczająco gęste przy gęstości wysiewu 1-2 x 104 komórki/cm2. Użyć 0,2 ml pożywki L-MSC/cm2.
  22. Hodowla L-MSCs w wilgotnej atmosferze 5% O2, 5 % CO2 w temperaturze 37 °C.
  23. Zmieniać podłoże 24 godziny po pierwszym wysiewie, a następnie co 3 dni po jednokrotnym spłukaniu PBS. Komórki należy hodować do 80-90% zbieżności, co trwa średnio 3-5 dni w zależności od pochodzenia zwierzęcia. Większa konfluencja będzie sprzyjać różnicowaniu w fibroblasty.

2. Wybór mezenchymalnych komórek zrębowych płuc CD146+

  1. Powlekanie kulek magnetycznych przeciwciałem wtórnym
    1. Pokryj kulki magnetyczne biotynylowanym przeciwciałem wtórnym w stosunku 10 μg przeciwciała wtórnego / 100 μl kulek magnetycznych w sterylnym 2 ml kriowialnym o okrągłym dnie w sterylnych warunkach. Użyj 10 μl przeciwciała drugorzędowego na oczekiwane komórki 0,5 x 106 i użyj co najmniej 100 μl kulek magnetycznych i 10 μg przeciwciała.
      Uwaga: Stosunek użytych przeciwciał na objętość kulek może się różnić w zależności od producenta, należy zapoznać się z instrukcjami producenta dotyczącymi wybranych kulek. W przypadku tego protokołu należy zapoznać się z tabelą 1, aby zapoznać się z kulkami i przeciwciałami, które zostały użyte do optymalizacji tego protokołu.
    2. Inkubować w obrotowym mieszalniku próbek przez 30 minut przy 30 obroty/min (obr./min), w temperaturze suchej schodu.
    3. Zawiesić kulki w 1,5 ml sterylnej 0,1 % albuminy surowicy bydlęcej (BSA)/PBS i przenieść do probówki o okrągłym dnie o pojemności 3 ml (probówka do cytometrii przepływowej). Przepłukać kriowial dodatkowym 1,5 ml 0,1% BSA/PBS i przenieść do probówki o pojemności 3 ml.
    4. Umieść rurkę na odpowiednim magnesie i odczekaj 2 minuty, aż wszystkie koraliki zostaną przymocowane do tylnej ścianki rurki, a roztwór pozostanie klarowny. Usunąć spływ i powtórzyć płukanie 3 ml 0,1 % BSA/PBS dwa razy.
    5. Zawiesić kulki w 3 ml 0,1 % masy ciała/PBS i przechowywać w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem. Zużyć w ciągu 5 dni.
  2. Oznakowanie CD146+ L-MSC
    1. Zbierz komórki mezenchymalne po spłukaniu PBS przy użyciu delikatnego roztworu bez trypsyny.
      Uwaga: Objętości zależą od wielkości kolby hodowlanej (0,2 ml/cm2 pożywki lub PBS).
      1. Usunąć pożywkę hodowlaną i trzykrotnie przepłukać komórki sterylnym PBS.
      2. Dodać odpowiednią objętość delikatnego roztworu niezawierającego trypsyny (patrz Tabela 1). Inkubować w inkubatorze w temperaturze 37 °C aż do oderwania się komórek, około 10 minut w przypadku stosowania roztworu z tabeli 1.
      3. Dezaktywować enzym przez dodanie pożywki hodowlanej L-MSC i wirować przez 5 minut przy 500 x g.
    2. Usunąć supernatant, zawiesić komórki w 0,1 % BSA/PBS i policzyć komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.
      Uwaga: Objętość 0,1% BSA/PBS zależy od wielkości kolby hodowlanej: należy dążyć do 5 lub 10 ml 0,1% BSA/PBS.
    3. Powtórzyć krok 2.2.2 i ponownie zawiesić odpowiednią ilość komórek w 3 ml 0,1 % BSA/PBS (blokuje niespecyficzne miejsca wiązania i utrzymuje komórki przy życiu). Utrzymuj komórki na lodzie.
    4. Przygotować probówkę o okrągłym dnie o pojemności 3 ml z pierwszorzędowym przeciwciałem anty-CD146 i przechowywać na lodzie.
      Uwaga: Stężenie przeciwciała pierwszorzędowego, które jest dodawane do przeznaczonej liczby komórek, zależy od użytego przeciwciała. Sugerowane przeciwciało anty-szczurze CD146 znajduje się w Tabeli 1.
    5. Dodać całkowitą objętość komórek z kroku 2.2.3 do probówki z przeciwciałem pierwszorzędowym. Zamknąć szczelnie i inkubować przez 30 minut na obracającym się mieszalniku do próbek przy 15 obr./min, 4 °C.
    6. Odwirować komórki przez 5 minut w temperaturze 500 x g, 4 °C, usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 3 ml 0,1 % BSA/PBS. Powtórz krok wirowania.
    7. Zawiesić komórki w 3 ml roztworze zawierającym drugorzędowe kulki pokryte przeciwciałami, przygotowanym zgodnie z instrukcją w sekcji 2.1 i inkubować przez 30 minut w obracającym się mieszalniku próbek przy 15 obr./min w temperaturze 4 °C.
  3. Wybór CD146+ L-MSC
    1. Umieść rurkę zawierającą oznaczone CD146+ L-MSC na magnesie. Komórki dodatnie zostaną przyciągnięte do tylnej części tuby. Nie przesuwając probówki ani nie dotykając kulek, należy powoli zebrać supernatant z ujemnymi komórkami za pomocą sterylnej pipety Pasteura (można je zebrać lub wyrzucić w oparciu o projekt eksperymentalny).
    2. Wyjąć probówkę z magnesu i ponownie zawiesić komórki w 3 ml 10 % BSA/PBS. Powtórzyć procedurę wyboru opisaną w kroku 2.3.1. jeszcze cztery razy (Σ 5 kroków wyboru).
    3. Ponownie zawiesić L-MSC CD146+ we wstępnie podgrzanej pożywce hodowlanej L-MSC i powrócić do magnesu.
    4. Usunąć supernatant, zawiesić ponownie w pożywce L-MSC i umieścić na płytce w kolbie hodowlanej o odpowiedniej wielkości (0,2 ml/cm2). Z reguły umieszcza się komórki w kolbie hodowlanej tej samej wielkości, z której komórki zostały wyjęte przed selekcją kulek. Liczba L-MSC CD146+, a tym samym gęstość posiewu, będzie zależeć od wieku, gatunku i rasy zwierzęcia źródłowego. Zawsze dąż do gęstości posiewu ~ 5,000 komórek / cm2,
      Uwaga: Koraliki nie będą zakłócać wzrostu komórek i będą stopniowo znikać w miarę namnażania się komórek.

3. Zamrażanie komórek

  1. Użyj następujących środków zamrażających: 60% roztwór pentaskrobi (10% pentaskrobi w 0,9% NaCl), 20% FBS, 12,5% CPDA-1, 2,5% NaCl (0,9%), 5% dimetylosulfotlenek (DMSO)22,
    Uwaga: Jeśli nie wszystkie składniki są dostępne, dobrą alternatywą jest roztwór zawierający 5% DMSO, 30% FBS i 65% αMEM.
  2. Zawiesić komórki w stężeniach 0,5 x 106 komórek/ml, porcjować w kriowiałach po 1 ml każda i zamrozić O/N w temperaturze -80 °C za pomocą pojemnika do zamrażania.
  3. Następnego dnia przenieść do zbiornika magazynującego ciekły azot.

4. Rozmrażanie komórek

  1. Rozmrażać fiolkę z komórkami w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 5 minut.
  2. Zawiesić komórki w 10 ml wstępnie ogrzanej pożywki hodowlanej i odwirować przez 5 minut w temperaturze 500 x g, 21 °C.
  3. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 10 ml pożywki hodowlanej. Komórki nasienne w wentylowanej kolbie poddanej hodowli komórek w kapku o stężeniu 5 000 komórek/cm2 w pożywce o stężeniu 0,2 ml/cm2 (np. 15 ml dla kolby o średnicy 75cm2).
  4. Hodowla komórek w 5%O2, 5% CO2 aż do 80-90% zlewania się do zbioru i/lub stosowania doświadczalnego. Nadmierna konfluencja wywoła różnicowanie. Podczas wysiewu w ilości 5 000 komórek/cm2, L-MSC osiągną 80-90% zbiegu w ciągu 3-4 dni od hodowli.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Dwie z najbardziej wiarygodnych cech fizycznych MSC, gęstość oraz przyleganie do tworzywa sztucznego, są wykorzystywane w pierwszej części niniejszego protokołu do uzyskania frakcji komórek mezenchymalnych płuc zawierającej L-MSC. Chociaż interfaza gradientu gęstości będzie zawierać monocyty i makrofagi oprócz mezenchymalnych komórek płuc, przyleganie do tworzywa sztucznego, a następnie 3-5 dni hodowli, zapewnia, że pozostaną jedynie mezenchymalne komórki płuc. Rzeczywiście, populacja ta ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Izolacja i hodowla pierwotnych L-MSCs stanowi okazję do lepszego zrozumienia ich funkcji i interakcji z innymi populacjami komórek na poziomie komórkowym, a także ich roli w rozwoju płuc, zdrowiu i chorobie. Jest to szczególnie ważne, ponieważ brak specyficznego pojedynczego markera tych komórek sprawia, że badanie tych komórek in situ jest prawie niemożliwe. Podobnie jak w przypadku wszystkich pierwotnych populacji komórek, należy pamiętać, że komórki te są bardziej skłonne do zmiany swojego charakteru, im dłuż...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

JJPC jest wspierane przez stypendium podoktorskie Canadian Institutes of Health Research (CIHR). MAM otrzymuje stypendium naukowe Niemieckiej Narodowej Fundacji Akademickiej - Studienstiftung des Deutschen Volkes i jest wspierane przez grant EFCNI (Europejskiej Fundacji Opieki nad Noworodkiem). BT jest wspierany przez CIHR, Kanadyjskie Stowarzyszenie Chorób Płuc, Sieć Komórek Macierzystych oraz Instytut Badawczy Szpitala Dziecięcego Wschodniego Ontario.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Neutralna ProteazaWorthington Biochemical CorporationLS02104Przygotować w dniu izolacji i przechowywać w temperaturze 4 stopni C do czasu użycia
Kolagenaza IWorthington Biochemical CorporationLS004196Przygotować w dniu izolacji i przechowywać w temperaturze 4 stopni C do czasu użycia
DNAzy ISigma-AldrichD5025Przygotować w dniu izolacji i przechowywać w temperaturze 4 & st; C do czasu użycia
Pentobarbital sodowy (eutanyl)Bimeda-MTC Animal Health Inc, Dublin, Irlandia-Użyj0,2 ml dla szczeniąt szczurów o wadze od 20 do 30 g; większe zwierzęta mogą potrzebować więcej.
Dulbecco' s PBS + Pirogronian sodu + GlukozaLife Technologies14287-072Bardzo ważne jest stosowanie tego typu D-PBS, ponieważ wapń i magnez obecne w tym D-PBS ułatwiają trawienie enzymatyczne
Ficoll-Paque PREMIUM (1.073 g/cm3)GE Healthcare17-5446-52Nośniki gradientu gęstości. Aby uzyskać dobrą interfazę, ważne jest, aby warstwowanie zawiesiny pojedynczej komórki zachodziło w >45° kąta przy bardzo niskiej prędkości, a następnie odwirowanie odbywa się w temperaturze 19 stopni Celsjusza.
&alfa; MEMSigma-AldrichM8042Ciepły w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem
200 mM L-GlutaminaLife Technologies25030-164
100x Antybiotykowo-PrzeciwgrzybiczeTechnologie Życia15240-062Penicylina/Streptomycyna/Fungizona
M-280 DynabeadsLife Technologies11205DKoraliki magnetyczne
biotynylowane poliklonalne królicze anty-mysie IgGDako, Agilent TechnologiesE0464Biotynylowane przeciwciało drugorzędowe, które pasuje do przeciwciała antyszczurzego CD146 opisanego poniżej
Magnes DynaMag5-magnetLife Technologies12303D, który jest zalecany do stosowania z Dynabeads. UWAGA: magnes należy dobrać na podstawie specyfikacji producenta s instrukcje dotyczące wybranych koralików magnetycznych.
TrypLE express Life Technologies12605-028Delikatna alternatywa bez trypsyny, użyj 1 ml TrypLE express/25 cm2 powierzchni. Po oderwaniu 10 ml pożywki hodowlanej L-MSC wystarcza do inaktywacji 3 ml
przeciwciała antyszczurzego CD146Lifespan Inc.C3584112,5 μ l na 0,5 x 106
komórek Pentaspan (roztwór pentaskrobi)Bristol-Myers SquibbCanada-Możnauzyskać za pośrednictwem lokalnych służb krwiodawstwa lub oddziałów hematologicznych. Alternatywnie można użyć 20% roztworu pentaskrobi PSI (Preservation Solutions, PST001) rozcieńczonego 1:1 0,9% NaCl.
Pojemnik do zamrażania Mr. FrostyThermoFisher Scientific5100-0001Poprawia żywotność podczas zamrażania L-MSC przez noc w temperaturze -80 & deg; Z
TrypLE

Bibliografia

  1. Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression. Nature. 432, 332-337 (2004).
  2. Wei, H. J., et al. FOXF1 mediates mesenchymal stem cell fusion-induced reprogramming of lung cancer cells. Oncotarget. 5, 9514-9529 (2014).
  3. Marriott, S., et al. ABCG2pos lung mesenchymal stem cells are a novel pericyte subpopulation that contributes to fibrotic remodeling. Am J Physiol Cell Physiol. 307, 684-698 (2014).
  4. Collins, J. J., Thebaud, B. Lung mesenchymal stromal cells in development and disease: to serve and protect. Antioxid Redox Signal. 21, 1849-1862 (2014).
  5. McQualter, J. L., et al. Endogenous fibroblastic progenitor cells in the adult mouse lung are highly enriched in the sca-1 positive cell fraction. Stem Cells. 27, 623-633 (2009).
  6. Holmes, C., Stanford, W. L. Concise review: stem cell antigen-1: expression, function, and enigma. Stem Cells. 25, 1339-1347 (2007).
  7. Gottschling, S., et al. Mesenchymal stem cells in non-small cell lung cancer--different from others? Insights from comparative molecular and functional analyses. Lung Cancer. 80, 19-29 (2013).
  8. Bertoncello, I., McQualter, J. Isolation and clonal assay of adult lung epithelial stem/progenitor cells. Current protocols in stem cell biology. , Chapter 2, Unit 2G 1 (2011).
  9. Jun, D., et al. The pathology of bleomycin-induced fibrosis is associated with loss of resident lung mesenchymal stem cells that regulate effector T-cell proliferation. Stem Cells. 29, 725-735 (2011).
  10. Majka, S. M., et al. Identification of novel resident pulmonary stem cells: form and function of the lung side population. Stem Cells. 23, 1073-1081 (2005).
  11. Hennrick, K. T., et al. Lung cells from neonates show a mesenchymal stem cell phenotype. Am J Respir Crit Care Med. 175, 1158-1164 (2007).
  12. Salama, M., et al. Endothelin-1 governs proliferation and migration of bronchoalveolar lavage-derived lung mesenchymal stem cells in bronchiolitis obliterans syndrome. Transplantation. 92, 155-162 (2011).
  13. Hoffman, A. M., et al. Lung-derived mesenchymal stromal cell post-transplantation survival, persistence, paracrine expression, and repair of elastase-injured lung. Stem Cells Dev. 20, 1779-1792 (2011).
  14. Grisendi, G., et al. GMP-manufactured density gradient media for optimized mesenchymal stromal/stem cell isolation and expansion. Cytotherapy. 12, 466-477 (2010).
  15. Bardin, N., et al. S-Endo 1, a pan-endothelial monoclonal antibody recognizing a novel human endothelial antigen. Tissue antigens. 48, 531-539 (1996).
  16. Covas, D. T., et al. Multipotent mesenchymal stromal cells obtained from diverse human tissues share functional properties and gene-expression profile with CD146+ perivascular cells and fibroblasts. Exp Hematol. 36, 642-654 (2008).
  17. Russell, K. C., et al. In vitro high-capacity assay to quantify the clonal heterogeneity in trilineage potential of mesenchymal stem cells reveals a complex hierarchy of lineage commitment. Stem Cells. 28, 788-798 (2010).
  18. Sorrentino, A., et al. Isolation and characterization of CD146+ multipotent mesenchymal stromal cells. Exp Hematol. 36, 1035-1046 (2008).
  19. Halfon, S., Abramov, N., Grinblat, B., Ginis, I. Markers distinguishing mesenchymal stem cells from fibroblasts are downregulated with passaging. Stem Cells Dev. 20, 53-66 (2011).
  20. McGowan, S. E., Torday, J. S. The pulmonary lipofibroblast (lipid interstitial cell) and its contributions to alveolar development. Annu Rev Physiol. 59, 43-62 (1997).
  21. Dulbecco, R., Vogt, M. Plaque formation and isolation of pure lines with poliomyelitis viruses. The Journal of experimental medicine. 99, 167-182 (1954).
  22. Hayakawa, J., et al. 5% dimethyl sulfoxide (DMSO) and pentastarch improves cryopreservation of cord blood cells over 10% DMSO. Transfusion. 50, 2158-2166 (2010).
  23. Sarugaser, R., Hanoun, L., Keating, A., Stanford, W. L., Davies, J. E. Human mesenchymal stem cells self-renew and differentiate according to a deterministic hierarchy. PLoS One. 4, 6498(2009).
  24. Prockop, D. J. Repair of tissues by adult stem/progenitor cells (MSCs): controversies, myths, and changing paradigms. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 17, 939-946 (2009).
  25. Respiratory Physiology. UCL. , Available from: https://www.ucl.ac.uk/anesthesia/people/RespPhysiolLong.pdf (2015).
  26. Boron, W. F., Boulpaep, E. L. Medical Physiology. 2nd edn. , Saunders Elsevier. (2009).
  27. Carreau, A., El Hafny-Rahbi, B., Matejuk, A., Grillon, C., Kieda, C. Why is the partial oxygen pressure of human tissues a crucial parameter? Small molecules and hypoxia. J Cell Mol Med. 15, 1239-1253 (2011).
  28. Heller, H., Brandt, S., Schuster, K. D. Determination of alveolar-capillary O2 partial pressure gradient by using 15NO. Nitric oxide : biology and chemistry / official journal of the Nitric Oxide Society. 12, 127-128 (2005).
  29. Mohyeldin, A., Garzon-Muvdi, T., Quinones-Hinojosa, A. Oxygen in stem cell biology: a critical component of the stem cell niche. Cell stem cell. 7, 150-161 (2010).
  30. Simon, M. C., Keith, B. The role of oxygen availability in embryonic development and stem cell function. Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 285-296 (2008).
  31. Le, Q. T., et al. An evaluation of tumor oxygenation and gene expression in patients with early stage non-small cell lung cancers. Clin Cancer Res. 12, 1507-1514 (2006).
  32. Krampera, M., et al. Immunological characterization of multipotent mesenchymal stromal cells-The International Society for Cellular Therapy (ISCT) working proposal. Cytotherapy. , (2013).
  33. Corselli, M., et al. Identification of perivascular mesenchymal stromal/stem cells by flow cytometry. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 83, 714-720 (2013).
  34. Russell, K. C., et al. Cell-Surface Expression of Neuron-Glial Antigen 2 (NG2)and Melanoma Cell Adhesion Molecule (CD146) in Heterogeneous Cultures of Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells. Tissue engineering. Part A. , (2013).
  35. Lv, F. J., Tuan, R. S., Cheung, K. M., Leung, V. Y. Concise review: the surface markers and identity of human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 32, 1408-1419 (2014).
  36. Dagur, P. K., et al. Secretion of interleukin-17 by CD8+ T cells expressing CD146 (MCAM). Clinical immunology. 152, 36-47 (2014).
  37. Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell stem cell. 3, 301-313 (2008).
  38. da Silva Meirelles, L., et al. Cultured human adipose tissue pericytes and mesenchymal stromal cells display a very similar gene expression profile. Stem Cells Dev. , (2015).
  39. Caplan, A. I. All MSCs are pericytes. Cell stem cell. 3, 229-230 (2008).
  40. Barkauskas, C. E., et al. Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung. J Clin Invest. 123, 3025-3036 (2013).
  41. McGowan, S. E., McCoy, D. M. Regulation of fibroblast lipid storage and myofibroblast phenotypes during alveolar septation in mice. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 307, 618-631 (2014).
  42. Chen, L., Acciani, T., Le Cras, T., Lutzko, C., Perl, A. K. Dynamic regulation of platelet-derived growth factor receptor alpha expression in alveolar fibroblasts during realveolarization. Am J Respir Cell Mol Biol. 47, 517-527 (2012).
  43. Zhou, S., et al. The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype. Nat Med. 7, 1028-1034 (2001).
  44. Bonyadi, M., et al. Mesenchymal progenitor self-renewal deficiency leads to age-dependent osteoporosis in Sca-1/Ly-6A null mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 5840-5845 (2003).
  45. Ito, C. Y., Li, C. Y., Bernstein, A., Dick, J. E., Stanford, W. L. Hematopoietic stem cell and progenitor defects in Sca-1/Ly-6A-null mice. Blood. 101, 517-523 (2003).
  46. Chow, K., et al. Dysfunctional resident lung mesenchymal stem cells contribute to pulmonary microvascular remodeling. Pulmonary circulation. 3, 31-49 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

kom rki CD146 dodatnietrawienie enzymatyczneseparacja w gradiencie g sto ciselekcja za pomoc kulek magnetycznychadhezja do tworzywa sztucznegoizolacja p uc szczuraprotok hodowli kom rkowejmarkery powierzchniowe MSCtrawienie tkanek
Izolacja mezenchymalnych komórek zrębowych płuc rezydentnych CD146 + z płuc szczura
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.