Artykuł metodologiczny

Projektowanie, pakowanie i dostarczanie wysokomianowych CRISPR Retro i lentiwirusów poprzez iniekcję stereotaktyczną

18.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53783

⸱

23 maja 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology and Neurobiology, Geisel School of Medicine at Dartmouth College

W tym artykule

Podsumowanie

System CRISPR/Cas9 oferuje potencjał, aby uczynić ukierunkowaną edycję genomu dostępną i przystępną cenowo dla społeczności naukowej. Protokół ten ma na celu zademonstrowanie, jak tworzyć wirusy, które znokautują interesujący nas gen za pomocą systemu CRISPR/Cas9, a następnie wstrzykną je stereotaktycznie do mózgu dorosłej myszy.

Streszczenie

Wadliwe lentiwirusy lub retrowirusy replikacji są zdolne do stabilnej integracji transgenów z genomem zainfekowanej komórki gospodarza. Technika ta jest szeroko stosowana do kodowania białek fluorescencyjnych, opto- lub chemogenetycznych kontrolerów aktywności komórek lub heterologicznej ekspresji ludzkich genów w organizmach modelowych. Wirusy te zostały również z powodzeniem wykorzystane do dostarczania rekombinaz do odpowiednich miejsc docelowych u zwierząt transgenicznych, a nawet do dostarczania małych spinek do włosów lub mikro RNA w celu manipulowania ekspresją genów. Chociaż techniki te okazały się owocne, opierają się na zwierzętach transgenicznych (rekombinazy) lub często brakuje im wysokiej skuteczności i swoistości (shRNA/miRNA). W przeciwieństwie do tego, system CRISPR/Cas wykorzystuje egzogenną nukleazę Cas, która celuje w określone miejsca w genomie organizmu za pośrednictwem egzogennego przewodnika RNA w celu wywołania dwuniciowych pęknięć w DNA. Pęknięcia te są następnie naprawiane przez niehomologiczne łączenie końców (NHEJ), powodując mutacje insercji i delecji (indel), które mogą skutkować szkodliwymi mutacjami typu missense lub nonsense. Manuskrypt ten zawiera szczegółowe metody projektowania, produkcji, wstrzykiwania i walidacji pojedynczych cząstek wirusa lenti/retro, które mogą stabilnie transdukować neurony w celu ekspresji fluorescencyjnego reportera, Cas9 i sgRNA w celu wyeliminowania genów w organizmie modelowym.

Wprowadzenie

Aby zbadać podstawy normalnej fizjologii i patologii chorób, istnieje potrzeba precyzyjnego manipulowania ekspresją genów w organizmach modelowych. W przypadku organizmów modelowych ssaków jest to w dużej mierze skoncentrowane na tworzeniu i rozwoju transgenicznych myszy, w których element genetyczny będący przedmiotem zainteresowania jest otoczony miejscami rozpoznawanymi przez rekombinazę. Może to prowadzić do specyficznej dla miejsca manipulacji tymi flankowanymi genami. Chociaż jest to skuteczna strategia, wymaga ona dużego czasu i zasobów; na przykład stworzenie potrójnego transgenicznego zwierzęcia, które wykazywałoby ekspresję genu floksowego, rekombinazy Cre i genu reporterowego Cre, wymaga wielu krzyżowań i walidacji. W przeciwieństwie do tego, stereotaktyczne wstrzyknięcie wadliwych cząstek wirusa kodujących białko fluorescencyjne i rekombinazę do zwierzęcia z floksowanym genem nie wymaga skomplikowanego genotypowania ani strategii hodowlanych1. Ponadto, jeśli białko fluorescencyjne i wirus wykazujący ekspresję Cre są wstrzykiwane jednocześnie z drugim wirusem kodującym inne białko fluorescencyjne, zapewnia to kontrolę wewnątrztkankową dla ukierunkowanej manipulacji genetycznej. Podczas gdy strategia ta nadal wymaga wykorzystania zwierząt typu knock-in, strategie oparte na RNA za pośrednictwem wirusa omijają potrzebę stosowania zwierząt transgenicznych. Na przykład stereotaktyczne wstrzyknięcie wirusów z niedoborem replikacji, które kodują białko fluorescencyjne i krótkie RNA spinki do włosów (shRNA), może wykorzystać endogenną maszynerię RNAi komórki, aby spowodować silną redukcję transkryptu genu będącego przedmiotem zainteresowania. Jednak strategie shRNA powodują subtelne knock-downy genów, często skutkujące skromnymi fenotypami komórkowymi2. Podczas gdy knock-down może być bardziej fizjologicznie istotny dla dysfunkcji genów heterozygotycznych, jego zmniejszona odporność w porównaniu z knock-outem nie jest idealna dla fenotypowego odkrywania nowych genów.

Trzecia technika, która pojawiła się niedawno, system CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat)/Cas9 (białko związane z CRISPR 9), opiera się na ekspresji zarówno małego egzogennego RNA, jak i enzymu tnącego DNA. System CRISPR/Cas9 został zaadaptowany z prokariotycznego układu odpornościowego, który wyewoluował metodę identyfikacji obcego, inwazyjnego DNA wirusów i kierowania go do degradacji za pomocą enzymuCas9 3,4. Ta potężna technika edycji genomu może być używana do tworzenia ukierunkowanych delecji, insercji i mutacji; Poniższy protokół nakreśli, w jaki sposób dokonać delecji w genie będącym przedmiotem zainteresowania, aby wyeliminować jego ekspresję in vivo. Enzym Cas9 musi być wyrażany za pomocą przewodnika RNA homologicznego do obszaru zainteresowania i przylegającego do rusztowania RNA. Nokaut genu przy użyciu tej techniki wymaga ukierunkowania Cas9 na określony region w genomie za pomocą syntetycznych przewodników RNA (sgRNA) i wywołania dwuniciowych pęknięć (DSB) w miejscu zainteresowania. Te DSB są następnie naprawiane przez endogenną maszynerię naprawy komórek poprzez niehomologiczne łączenie końców (NHEJ), co prowadzi do indeli, które mogą powodować mutacje typu missense lub nonsense, a tym samym mogą powodować utratę funkcjonalnej ekspresji białka5. Ponieważ system ten wytwarza zmiany genomowe, wymaga jedynie przejściowej ekspresji Cas9 i sgRNA. Pożądane jest jednak, aby stabilny wskaźnik fluorescencyjny identyfikował komórki i ich potomstwo manipulowane w ten sposób.

Lenti- i retrowirusy mają tę zaletę, że stabilnie integrują interesujące nas DNA z komórkami gospodarza, które utrzymują długoterminową ekspresję i są przekazywane do komórek potomnych podczas mitozy. Protokół ten opisuje projektowanie i produkcję dwóch typów retrowirusów o wysokim mianie z wadliwymi replikacjami: cząstek lentiwirusowych pochodzących z ludzkiego wirusa niedoboru odporności (lentiwirus) oraz tych opartych na mysim wirusie białaczki Maloneya (retrowirus). Podczas gdy oba te wirusy są zdolne do stabilnej ekspresji dużych transgenów, cząstki retrowirusowe mogą integrować się z genomem tylko podczas podziału komórki z degradacją otoczki jądrowej, a zatem mogą być używane jako narzędzie do oznaczania i datowania urodzeń komórek6. Podczas gdy lentiwirusy mają reputację stosunkowo niskiego miana7, ta metodologia, obejmująca stosowanie kofeiny8 podczas zbierania wirusów, rutynowo generuje miana 10,9 i 1010 cząstek/ml. Kolejną zaletą lenti- i retrowirusów jest tolerancja na bardzo duże wstawki. Poniższy zbiór protokołów przedstawia procedurę projektowania lenti lub retrowirusa kodującego fluorescencyjny reporter, sgRNA i Cas9 w celu wykorzystania systemu CRISPR / Cas9 do modyfikacji DNA, a także ekspresji białka fluorescencyjnego.

Stereotaktyczna neurochirurgia myszy jest cenną metodą wstrzykiwania wirusów in vivo w celu badania morfologii, funkcji i połączeń zainfekowanych neuronów. Infekcja wirusowa w neuronach może być wykorzystywana do manipulowania poziomami ekspresji w dłuższym okresie czasu, na przykład podczas rozwoju, a ekspresja może być precyzyjnie kontrolowana za pomocą różnych systemów indukowanych lekiem i specyficznej ekspresji sterowanej przez Cre. Ten konkretny protokół wyjaśnia, jak wstrzyknąć wirusa z ekspresją sgRNA i Cas9 w celu wyeliminowania interesującego genu w mózgu dorosłej myszy. Myszy bardzo szybko wracają do zdrowia po tej procedurze, a ekspresję transgenu wirusa można zaobserwować w ciągu 48 godzin po wstrzyknięciu. Jednak wydaje się, że ekspresja fluoroforu wzrasta w ciągu kilku tygodni, co skutkuje prawie maksymalnym poziomem w ciągu 3 tygodni po zakażeniu. Myszy, które przechodzą wstrzyknięcie stereotaktyczne wirusa, mogą być wykorzystywane do badań behawioralnych, elektrofizjologicznych lub morfologicznych. Ogólnie rzecz biorąc, celem tych procedur jest pokazanie, jak znokautować gen w mózgu dorosłej myszy za pomocą chirurgii stereotaktycznej i wirusa wyrażającego specyficzne sgRNA i Cas9.

Protokół

Oświadczenie etyczne: Wszystkie protokoły zostały zatwierdzone przez komisje rewizyjne Dartmouth Institutional Biosafety oraz Institutional Animal Care and Use Committee.

1. Protokół projektowania nici prowadzącej (sgRNA) dla retrowirusa CRISPR/Cas9

UWAGA: Istnieje wiele stron internetowych non-profit, które można wykorzystać do generowania sgRNA w celu ukierunkowania na gen będący przedmiotem zainteresowania (https://benchling.com/ i http://crispr.mit.edu/). Celem tego protokołu jest zaprojektowanie i zamówienie jednoniciowych oligonukleotydów od komercyjnego dostawcy, które są ze sobą wyżarzane. Ten wyżarzony oligo zostanie podwiązany do wektora transferu PXL. Zobacz film uzupełniający 1, aby zapoznać się z przykładem projektowania sgRNA przy użyciu Benchlinga.

  1. Skorzystaj ze strony internetowej poświęconej projektowaniu sgRNAs.
    UWAGA: Na przykład, wprowadzenie na stronę internetową sekwencji kodującej/egzonicznej z okolic początku interesującego nas genu spowoduje wygenerowanie 20-nukleotydowego sgRNA. Użyj sekwencji 20 nukleotydów sgRNA, aby zaprojektować oligonukleotydy sensowne i antysensowne, które zostaną uporządkowane w celu utworzenia sgRNA.
  2. Po wygenerowaniu sgRNA skopiuj tę sekwencję do edytora tekstu. Dodaj G (guaninę) na początku sekwencji 20 nukleotydów sgRNA w dokumencie, jeśli jeszcze się od niej nie zaczyna (tj. sekwencji sgRNA nukleotydu G-20). Jest to konieczne, aby zapewnić dobrą transkrypcję z promotora U6.
  3. Udokumentuj odwrotne dopełnienie tej sekwencji nukleotydowej składającej się obecnie z 20-21 nukleotydów. Dla oligo sensu dodaj "CACC" do końca 5' sekwencji w dokumencie (tj. sekwencji sgRNA nukleotydu CACC-G-20). Ten zwis zostanie użyty do ligacji sekwencji do wektora PXL.
  4. W przypadku oligo antysensownego dodaj AAAC do końca 5'. Użyj tego zwisu, aby podwiązać sekwencję do wektora PXL.
  5. Uzyskaj oligonukleotydy sensu i antysensu. Po otrzymaniu oligonukleotydów wykonaj 100 μM, używając wody wolnej od DNA. Zmieszać ze sobą po 10 μl oligonukleotydów 100 μM sense i antysensownych z 4 μl 10x buforu NEB 2 i 16 μl wody.
    UWAGA: Nie wymagają oczyszczania strony ani fosforylacji 5' (ponieważ zwisy BbsI są niekompatybilnymi końcami spoistymi).
    1. W zlewce o pojemności 500 ml doprowadzić 200 ml wody do wrzenia, a następnie umieścić probówkę zawierającą tę mieszaninę w piankowym uchwycie na "pływaki". Pozwól wodzie powoli ostygnąć z 95 °C przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
    2. Rozcieńczyć obecnie wyżarzoną mieszaninę oligonukleicytów w stosunku 1:1 000 w sterylnej wodzie i użyć natychmiast w następnym podwiązaniu lub przechowywać pozostałą reakcję w temperaturze -20 °C.
  6. Trawić pXL, pochodną wektora PX330, enzymem restrykcyjnym BbsI w temperaturze 37 °C przez 2 godziny. Zastosować reakcję 40 μl zawierającą 2 μg pXL, 4 μl 10x buforu NEB 2, 1 μl Bbs1 i zrównoważyć wodę. Poddaj digested-pXL rutynowemu oczyszczaniu żelu za pomocą dostępnego w handlu zestawu. Upewnij się, że wydajność wynosi ~8,5 kB produktu.
  7. Korzystając z dostępnego w handlu zestawu do ligacji, podwiązać 1 μl wyżarzonych oligonukleukleotydów w stosunku 1:1,000 z 50 ng strawionego i oczyszczonego żelem pXL. Przekształcić produkt ligacji w kompetentną grupę E. coli z niedoborem rekombinacji (NEB 5-alfa, skuteczność subklonowania). Przebadaj transformanty pod kątem obecności właściwego przewodnika za pomocą sekwencjonowania plazmidowego DNA.
  8. Trawić U6, nić prowadzącą i elementy rusztowania RNA (sgRNA) z pXL za pomocą enzymów restrykcyjnych BstB1 i Pac1 i ligować do szkieletu wirusa białka fluorescencyjnego T2A-Cas9 trawionego tymi samymi enzymami restrykcyjnymi. Przekształć produkt ligacji (NEB 5-alpha maksymalna wydajność). Plazmidy szkieletu wirusa białka fluorescencyjnego T2A-Cas9 są plazmidami o niskiej kopii, dlatego należy stosować protokoły o niskiej liczbie kopii.
    UWAGA: Drugi sgRNA może być podobnie wprowadzony przez trawienie PacI innego plazmidu nici prowadzącej pXL i zligowany do szkieletu wirusowego trawionego przez Pac1 i traktowanego fosfatazą jelitową cielęcą, który już zawiera pierwszą nić prowadzącą. Leczenie fosfatazą plazmidu przenoszącego wirusa pomoże zmniejszyć liczbę transformantów pochodzących z samoligacji plazmidów niezawierających drugiego przewodnika.
  9. Zweryfikuj sekwencję końcowego przygotowania plazmidu i maxi za pomocą zestawu przygotowawczego Nucleobond Xtra maxi i zapakuj go do wirusa przy użyciu następującego "Protokołu produkcji retro/lentiwirusowej — metoda CaPO4".

2. Przygotowanie komórek 293FT/293GP do transfekcji (produkcja retro/lentiwirusowa — metoda CaPO4)

  1. (Dzień 1) Szybko rozmrozić 1 fiolkę z komórkami na 10 cm płytkę do hodowli komórek w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Do pakowania lentiwirusa użyj ogniw 293FT. Do pakowania retrowirusowego należy użyć komórek 293GP (gag/pol).
  2. Odpipetować wszystkie rozmrożone komórki z probówki kriogenicznej do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i dodać 2 ml wstępnie podgrzanego CO2 równo kompletnego zmodyfikowanego podłoża Dulbecco firmy Iscove.
  3. Wirować komórki przez 5 minut przy 500 x g do osadzania. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 10 ml kompletnego zmodyfikowanego podłoża Dulbecco firmy Iscove. Umieść komórki na 10-centymetrowym naczyniu do hodowli komórkowych. Inkubować komórki przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla.
  4. (Dzień 2) 24 godziny po posianiu zmienić podłoże na płytce, zasysając istniejące podłoże i dodając do płytki 10 ml wstępnie podgrzanego zmodyfikowanego podłoża Dulbecco firmy Iscove.
    1. (Dzień 3-4) 24-48 godzin po zmianie pożywki i gdy komórki staną się zlewne, podziel komórki na zbieg 2,5-3,0 x 106 komórek/płytkę (płytka 10 cm).
    2. Aby podzielić komórki, należy odessać pożywkę i umyć płytkę 5 ml PBS. Dodać 1 ml 0,25% trypsyny do płytki i inkubować w temperaturze 37 °C, aż komórki oderwą się od płytki. Dodać 0,5 ml zmodyfikowanego podłoża Dulbecco firmy Iscove, aby zneutralizować reakcję 0,25% trypsyny i pipetować komórki do probówki o pojemności 1,5 ml.
    3. Wirować komórki w temperaturze 500 x g przez 5 minut. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml zmodyfikowanego podłoża Dulbecco firmy Iscove. Rozcieńczyć 10 μl komórek w 90 μl PBS. Policz komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek. Ponownie płytka 2,5-3,0 x 106 komórek/płytkę z kompletnym zmodyfikowanym Tilbecco's Medium.
      UWAGA: Komórki będą zlewać się w ~50% 24-34 godziny po posiewaniu. Transfekuj komórki, gdy są ~ 50% zlewające się.

3. (Dzień 5) Transfekcja CaPO4 i zbieranie cząstek wirusowych

  1. Zmień pożywkę na 2 godziny przed transfekcją, zasysając istniejącą pożywkę i dodając 10 ml wstępnie podgrzanego zmodyfikowanego podłoża Dulbecco firmy Iscove. Upewnij się, że na płytce o średnicy 10 cm znajduje się dokładnie 10 ml podłoża.
  2. Przygotuj odczynniki do transfekcji dla 2 naczyń za pomocą 2,5 ml probówek z polistyrenu o okrągłym dnie. Oznacz pierwszą probówkę "DNA", a drugą probówkę "2X HBS". Dostosuj stężenie DNA do 1 μg/μl w Tris-EDTA przy pH 7,4.
    1. W przypadku lentiwirusów powoli dodaj 20 μl wektora transferowego (konstrukt wirusowy będący przedmiotem zainteresowania), 13 μl CMVdelta8.9, 9 μl VSV-g, 860 μl klasyH2Oz biologii molekularnej i 100 μl 2,5 M CaCl2 do pierwszej probówki ("DNA"), ciągle stukając w probówkę, aby wymieszać.
    2. W przypadku retrowirusów należy pominąć plazmid CMVdelta8.9. Dodaj 20 μl wektora transferowego, 15 μl VSV-g, 860 μl biologii molekularnej klasy H2O i 100 μl 2,5 M CaCl2 do probówki oznaczonej "DNA".
    3. Dodaj 1 ml 2x soli fizjologicznej buforowanej przez HEPES (pH 7,0; to pH jest absolutnie krytyczne) do probówki oznaczonej "2X HBS".
    4. Powoli dodawać 1 ml zawartości probówki "DNA" do probówki "2X HBS", kropla po kropli. Ciągle stukaj w probówkę "2X HBS" palcem wskazującym lub środkowym, dodając zawartość probówki "DNA". Obserwuj widoczne pęcherzyki CaPO4 po każdej kropli. Inkubować probówkę w ciemności przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Dodać 1 ml transfekcji w postaci powolnych kropelek do każdej 10 cm płytki komórkowej, a następnie inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
  4. (Dzień 6) Zastąp pożywkę 8 ml Iscove's Modified Dulbecco's Medium + 0,5% FBS i 40 mg kofeiny/100 ml pożywki. Jeśli wektor transferowy zawiera marker fluorescencyjny, to ekspresja fluoroforu wskazuje na udaną transfekcję.
  5. (Dzień 7) Zebrać pożywkę zawierającą cząstki wirusa za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml i rozlać do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Przechowywać probówkę stożkową o pojemności 50 ml w temperaturze 4 °C. Do każdej płytki dodać 8 ml 0,5% pożywki FBS.
    1. (Dzień 8) Ponownie zebrać pożywkę zawierającą cząstki wirusa i połączyć ze zbiorem z poprzedniego dnia w stożkowej probówce o pojemności 50 ml.

4. Zagęszczenie i oczyszczanie wirusa

  1. Przygotować 5x roztwór glikolu polietylenowego 6000, dodając 40% glikolu polietylenowego 6000 i 1,5 M NaCl do ddH2O. Roztwór należy sterylizować w autoklawie w cyklu ciekłym przez 45 minut w temperaturze 121 °C. Powoli mieszać roztwór podczas chłodzenia.
    UWAGA: Roztwór zacznie być mętny, a następnie stanie się klarowny, gdy ostygnie.
  2. Odwirować stożkową probówkę o pojemności 50 ml zawierającą oba zbiory supernatantu wirusa o stężeniu 2 000 x g przez 10 minut w celu osadzenia nierozpuszczalnego materiału. Oczyść pożywkę wirusową, filtrując przez filtr strzykawkowy o niskim poziomie wiązania białek (PES lub PVDF) o niskiej zawartości wiązania z białkami.
  3. Dodać 5x roztwór glikolu polietylenowego 6000 do pożywki (końcowe stężenie powinno wynosić 8% glikolu polietylenowego 6000 i 0,3 M NaCl). Wymieszaj, kilkakrotnie odwracając rurkę (nie wirować). Inkubować roztwór glikolu polietylenowego zawierającego wirusa w temperaturze 4 °C przez 12 lub więcej godzin, od czasu do czasu mieszając ponownie.
  4. (Dzień 9) Odwirować roztwór glikolu polietylenowego zawierający wirus o stężeniu 2 500 x g przez 45 minut. Wyjąć i wyrzucić supernatant i ponownie wirować przez 2 minuty. Ponownie usunąć i wyrzucić supernatant.
  5. Zawiesić osad przez dodanie 320 μl sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (320 μl to 1/100 pierwotnej objętości zebranej pożywki zawierającej wirusa) i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C. Opcjonalnie zawiesić osad w temperaturze pokojowej na bujaku przez 30 minut.
  6. Po ponownym zawieszeniu osadu należy podzielić na porcję wirusa (5-10 μl na probówkę 0,5 ml) i zamrozić podwielokrotności w temperaturze -80 °C (zamrażanie, rozmrażanie lub przechowywanie w temperaturze 4 °C radykalnie zmniejszy miano).
  7. Mianowanie wirusów należy wykonać przy użyciu standardowych protokołów, tj. wykonać serię rozcieńczeń na 6-dołkowej płytce HEK293T komórek i ręcznie policzyć kolonie fluorescencyjne 48 godzin później.

5. Testowanie skuteczności wirusa CRISPR

UWAGA: Sekwencjonuj klony, wykonując następujące kroki, aby przetestować produkcję pęknięć dwuniciowych naprawionych przez NHEJ przy użyciu mysich komórek Neuro2A. Ma to tę przewagę nad testami geodezyjnymi, że można je wykorzystać do określenia procentu komórek, które zostały zmodyfikowane, oraz charakteru indeli powstałych w wyniku NHEJ.

  1. Pokryć 3,5 cm naczynie do hodowli komórkowych galaretowatą mieszanką białek, taką jak matrigel, rozcieńczoną w stosunku 1:50 w zmodyfikowanym pożywce Dulbecco firmy Iscove i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Odessać galaretowatą mieszaninę białek i umieścić komórki Neuro2A na płytce.
  2. Po tym, jak komórki Neuro2A osiągną 50% konfluencji, dodaj CRISPR Lentivirus lub Retrovirus przy wielokrotności infekcji 10 (tj. 10 cząstek wirusa na komórkę).
    UWAGA: Komórki Neuro2A nie są tak przyjazne dla infekcji jak komórki HEK293, dlatego pojedyncza infekcja nie spowoduje zakażenia 100% komórek lentiwirusem. Co więcej, retrowirus infekuje tylko dzielące się komórki, a zatem nie spowoduje 100% infekcji. Aby osiągnąć prawie 100% wskaźnik infekcji, dodawanie wirusa można powtarzać przez wiele dni, dzieląc komórki w razie potrzeby. Alternatywnie, fluorescencyjne komórki dodatnie można wyizolować za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją. Najskuteczniejszym sposobem na osiągnięcie 100% wskaźnika infekcji lentiwirusem jest przeprowadzenie pojedynczej infekcji, a następnie izolacji FACS. W przypadku retrowirusa wykonaj 4 rundy infekcji w odstępie 24 godzin, a następnie izoluj FACS, aby zapewnić 100% infekcję.
  3. Po zakażeniu komórek przez 1 tydzień, rozwiń komórki do prawie zbiegu na 10 cm płytce, odessać pożywkę i umyć płytkę 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami. Dodać 1 ml 0,25% trypsyny i inkubować w temperaturze 37 °C, aż komórki oderwą się od płytki. Dodać 0,5 ml zmodyfikowanego podłoża Dulbecco firmy Iscove, aby zneutralizować 0,25% reakcję trypsyny, a następnie pipetować komórki do probówki o pojemności 1,5 ml i osadzać komórki w masie 500 x g przez 5 minut.
  4. Aby wyizolować DNA, dodać 100 μl 50 mM wodorotlenku potasu, ponownie zawiesić komórki i inkubować w temperaturze 95 °C przez 5 minut. Zneutralizować roztwór za pomocą 10 μl 1 M Tris, pH = 8,0.
  5. PCR amplifikuje region flankujący region genomowy, do którego dąży sgRNA CRISPR, przy użyciu ~ 300 ng DNA wyizolowanego w kroku 5.5 przy użyciu głównej mieszanki PCR o wysokiej wierności4.
  6. Przeprowadź reakcję PCR na 2,5% żelu agarozowym i żelu oczyść fragment o odpowiedniej wielkości za pomocą zestawu do oczyszczania żelu, takiego jak zestaw do odzyskiwania DNA w żelu. Zremisuj z wektorem klonowania PCR, takim jak pGem-t-easy i przekształć się w kompetentne komórki9.
  7. 24 godziny później dodaj 2 ml bulionu LB do 15 ml probówek okrągłodennych, a także odpowiedni antybiotyk (ampicylina, neomycyna itp.). Zaszczepić probówkę pojedynczą kolonią za pomocą sterylnej końcówki lub pętli do pipety, aby wybrać pojedynczą kolonię z płytki LB. Rozszerz i wyhoduj kolonię, potrząsając probówką z prędkością 250 obr./min i 37 °C przez 24 godziny. Powtórz dla tylu kolonii, ile chcesz.
    1. Za pomocą zestawu mini-prep wyizoluj DNA z E. coli i zsekwencjonuj je za pomocą starterów zaprojektowanych w celu amplifikacji obszaru genu, na który atakuje sgRNA, w celu analizy docelowego regionu Cas9 genomu myszy.

6. Protokół iniekcji stereotaktycznej dla dorosłej myszy

  1. Przygotuj się do operacji
    UWAGA: Ważne jest, aby zachować sterylne warunki podczas operacji przeżycia. W tym protokole osiąga się to poprzez sterylizację termiczną narzędzi chirurgicznych, użycie betadyny do sterylizacji miejsca wstrzyknięcia i dodanie maści antybiotykowej do miejsca nacięcia po jego zamknięciu. Ważne jest również stosowanie sterylnych rękawiczek, a także dokładnie wysterylizowanego, dedykowanego obszaru operacyjnego.
    1. Sterylizuj na gorąco narzędzia chirurgiczne przed użyciem w autoklawie lub przy użyciu sterylizatora z gorącymi kulkami. Przygotuj salę pooperacyjną i obszar operacji, włączając poduszki grzewcze, aby utrzymać temperaturę ciała podczas operacji i rekonwalescencji. Zmontuj wiertło używane do tworzenia otworów w czaszce do wstrzykiwań.
    2. Załadować 4 μl wirusa do igły iniekcyjnej, pobierając wirusa bezpośrednio ze sterylnej probówki do PCR. Na krótko usunąć podwielokrotność wirusa z lodu. Wirus należy utrzymywać w strzykawce w temperaturze pokojowej nie dłużej niż 1 godzinę przed wstrzyknięciem.

7. Stereotaktyczny wtrysk

  1. Upewnij się, że wentylacja sali operacyjnej jest otwarta, aby zapewnić prawidłowy przepływ powietrza. Przygotuj mysz do zabiegu poprzez znieczulenie 4% izofluranem w komorze indukcyjnej. Po znieczuleniu należy ogolić głowę, aby przygotować miejsce wstrzyknięcia.
    1. Umieść mysz w instrumencie stereotaktycznym za pomocą pęsety, aby przesunąć język w dół i na bok. Włóż pręt do gryzienia do ust, aż zęby wpadną do szczeliny, a następnie zabezpiecz nauszniki. Upewnij się, że korpus myszy znajduje się na poduszce grzewczej, a nos znajduje się w stożku nosowym. Skierować 4% izofluranu do stożka nosowego. Potwierdź znieczulenie, szczypiąc stopę pęsetą i upewniając się, że nie ma odruchu zaskoczenia.
    2. Zastosuj sztuczne łzy, aby nawilżyć oczy. Przygotowanie miejsca wstrzyknięcia należy zakończyć, pobierając z ogolonej głowy wymaz z naprzemiennymi rundami jodu powidonu i lidokainy.
  2. Za pomocą skalpela wytnij małe nacięcie wzdłuż środka skóry głowy. Osusz czaszkę wacikiem i wodą utlenioną, jeśli to konieczne, aby pomóc w wizualizacji bregmy.
    1. Za pomocą lunety preparacyjnej zlokalizuj bregmę na czaszce i umieść końcówkę wiertła na bregmie. Wyzeruj (lub zapisz) cyfrowe współrzędne stereotaktyczne na płaszczyznach x, y i z.
    2. Aby upewnić się, że głowica jest wypoziomowana na osi y rostralnej do ogonowej, umieść wiertło na lambda i wypoziomuj głowicę tak, aby współrzędna z była mniej więcej równa zarówno przy bregmie, jak i lambdzie.
    3. Aby upewnić się, że głowica jest wypoziomowana na osi x, ustaw wiertło na y = 1/2 lambda. Upewnij się, że współrzędna z jest równa 1 mm z każdej strony (x = +/- 1 mm) szwu strzałkowego. Wyreguluj czaszkę, jeśli występuje różnica we współrzędnej z w odległości 1 mm po lewej i prawej stronie lambda.
  3. Umieść wiertło nad żądanymi współrzędnymi. Dla zakrętu zębatego użyj współrzędnych y = -1.9 z bregma i x = +/- 1.1. Przed wierceniem obniż izofluran do 2%, a następnie powoli i ostrożnie przewiercić czaszkę.
    1. Po wywierceniu wszystkich otworów przymocuj wypełnioną strzykawkę do instrumentu stereotaktycznego. Wizualnie wyśrodkuj strzykawkę nad otworem i wyzeruj współrzędną z na czaszce.
    2. Powoli opuścić strzykawkę do najgłębszej głębokości z. W przypadku zakrętu zębatego głębokości z wynoszą -2,5, -2,4 i -2,3. Rozpocząć wstrzykiwanie z szybkością 0,25 μl/min za pomocą wtryskiwacza stereotaktycznego.
      1. Po zakończeniu wstrzykiwania na najmniejszej głębokości Z, odczekać 1 minutę, a następnie podnieść do następnej współrzędnej i ponownie rozpocząć wstrzykiwanie. Kontynuuj ten wzór, aż wszystkie współrzędne wtrysku z zostaną wstrzyknięte. Należy odczekać 2 minuty przed wyjęciem strzykawki po ostatnim wstrzyknięciu.
        UWAGA: Nie zaobserwowano żadnych niepożądanych skutków dla tkanki po wstrzyknięciu do 2 μl wirusa na półkulę do mózgu myszy.
    3. Powtórz iniekcję dla innych otworów.
  4. Po wstrzyknięciu wyjmij mysz z instrumentu stereotaktycznego i zszyj skórę głowy jedwabnymi szwami 6-0. Nałóż lidokainę i krem antybakteryjny na ranę.
    1. Wstrzyknąć 0,8-1,0 ml soli fizjologicznej + ketoprofenu (3-5 mg / kg) drogą I.P. w celu opanowania bólu. Następnie umieść mysz w podgrzewanej komorze odzyskiwania. Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą w mostku. Nie należy zwracać zwierzęcia do towarzystwa innych zwierząt, dopóki w pełni nie wyzdrowieje.
  5. W ciągu kilku dni po operacji codziennie waż mysz i podawaj jej miękkie jedzenie i smakołyki. Sprawdź ranę i zwróć uwagę na ogólny stan/zachowanie.
  6. Po wstrzyknięciu stereotaktycznym myszy mogą zostać poddane eutanazji w celu elektrofizjologii przygotowania plastrów1 lub perfuzji, a ich mózgi usunięte, pokrojone i wybarwione za pomocą immunohistochemiido analizy 10.

Wyniki

Zgodnie z „Protokołem projektowania nici przewodniej (sgRNA) dla retrowirusa CRISPR/Cas9”, oligonukleotydy nakierowane na konkretną sekwencję są wstawiane do wektora klonującego PXL poniżej promotora hU6 oraz poniżej rusztowania sgRNA, wykorzystując miejsca klonowania BbsI (Rysunek 1, krok 1). Następnie sgRNA jest wycinane z PXL i wstawiane do szkieletu pRubi przy użyciu miejsc BstBI i PacI (Rysunek 1, krok 2). W koniec, inna sgRNA sklonowana do PXL może zostać umieszczona poniżej pierwszej sekwencji przewodniej w pRubi-Guide1 (Rysunek 1, krok 3), celując w inny obszar genu i zwiększając szanse na knockout poprzez NHEJ. Weryfikacja poprawności konstruktów powinna zostać przeprowadzona za pomocą analizy sekwencji. Po przygotowaniu konstruktu można go zapakować do wirusa zgodnie z „Protokołem produkcji retrowirusów/lentiwirusów – metoda CaPO4”. Pomyślne pakowanie potwierdza się poprzez infekcję wirusem komórek HEK293 w celu wyznaczenia miana wirusa. Brak ekspresji fluoroforu prawdopodobnie wskazuje na błąd podczas pakowania wirusa.

Rycina 2 przedstawia reprezentatywny wynik współiniekcji dwóch retrowirusów, jednego wykazującego ekspresję GFP, a drugiego mCherry, do zakrętu zębatego noworodka myszy (7. dzień życia), obrazowanych 21 dni po iniekcji. Znakowanie neuronów mCherry lub GFP umożliwia ocenę morfologiczną różnych manipulacji genetycznych w tej samej tkance, gdzie jeden wirus może wprowadzać KO za pośrednictwem CRISPR/Cas9, a drugi być wirusem kontrolnym, wykazującym ekspresję wyłącznie fluoroforu. Iniekcja stereotaktyczna pozwala na precyzyjną selektywność anatomiczną, co potwierdza dyskretna infekcja w zamierzonych współrzędnych, czyli w zakręcie zębatym. Podczas analizy infekcji w przekrojach mózgu ważne jest zachowanie otaczającej tkanki do momentu ustalenia, że zainfekowano prawidłowy region anatomiczny. W przypadku braku oznak infekcji istnieje możliwość, że iniekcja nastąpiła w sąsiednim obszarze, co można zidentyfikować w okolicznych przekrojach. Pomocne może być również zlokalizowanie toru igły w celu znalezienia dokładnego miejsca iniekcji. Wirusy pseudotypowane VSVg rzadko rozprzestrzeniają się poza granice zakrętu zębatego po iniekcji in vivo i mają tendencję do rozprzestrzeniania się wzdłuż osi rostralno-kaudalnej, infekując komórki w całym zakręcie zębatym, co wykazano w analizie rekonstrukcji 3D (Rycina 3).

Schemat procesu klonowania CRISPR z mapami wektorów, wstawianiem gRNA i etapami trawienia PacI.
Rycina 1: Strategia klonowania retrowirusowego plazmidu pRubi-Guide1-Guide2-CRISPR. Strategia ta jest identyczna dla lentiwirulowych plazmidów opartych na FU. Oligonukleotydy sgRNA są hybrydyzowane i wstawiane do PXL przy użyciu miejsc klonowania BsbI. Po sekwencjonowaniu w celu potwierdzenia prawidłowego wstawienia sgRNA do PXL, plazmid należy poddać trawieniu enzymami BstBI oraz PacI. Wycięty insert (czarna ramka) jest następnie klonowany do wirusowego szkieletu (czarne linie przerywane) pRubi-Guide1 CRISPR. Drugie sgRNA może być również wstawione do PXL i wycięte przy użyciu enzymu PacI. Jest ono następnie klonowane do wektora pRubi-Guide1 CRISPR (czerwone linie przerywane) przy użyciu miejsca PacI. Powstały plazmid zawiera obie nici przewodnie oraz niezbędne elementy wirusowe, promotory i fluorofory. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Mikroskopia konfokalna wykazująca fluorescencję GFP i mCherry w tkance neuronalnej; ko-lokalizacja białek.
Rysunek 2: Iniekcja retrowirusowa do zakrętu zębatego myszy. Retrowirusy wykazujące ekspresję mCherry (czerwony) lub GFP (zielony) wstrzyknięto do zakrętu zębatego myszy w wieku p7. Po 21 dniach myszy poddano perfuzji, a mózgi pocięto na sekcje i zabarwiono pod kątem GFP i mCherry. (A) Obraz fluorescencyjny w szerokim polu (5X) pokazuje precyzję iniekcji do zakrętu zębatego oraz specyficzność znakowania neuronów ziarnistych zakrętu zębatego. Morfologia hipokampa jest widoczna dzięki barwieniu Dapi (niebieski). Pasek skali odpowiada 200 µm. (B) Obraz fluorescencyjny w szerokim polu (10X) demonstruje, że te lentiwirusy o wysokim mianie infekują dużą liczbę komórek, których morfologię można ocenić dzięki ekspresji fluoroforu. Pasek skali odpowiada 100 µm. (C) Wirusy wykazujące ekspresję GFP lub mCherry wstrzyknięto wspólnie do zakrętu zębatego. Wykorzystując system retrowirusów, można użyć jednego wirusa do przeprowadzenia manipulacji genetycznej znakowanej GFP, a innego do manipulacji znakowanej mCherry, a następnie ocenić pojedyncze lub addytywne zmiany wywołane przez każdy z wirusów. Pasek skali odpowiada 10 µm.

Rekonstrukcja 3D struktury neuronalnej, obraz mikroskopowy, analiza przekroju mózgu, od strony rostralnej do caudalnej.
Rycina 3: Rozprzestrzenienie anatomiczne iniekcji lentiwirusowej. Stereotaktyczna coiniekcja wirusa GFP-shPten oraz kontrolnego wirusa mCherry do mózgu dorosłej myszy Ptenloxp/+ doprowadziła do rozprzestrzenienia się wirusa wzdłuż całej osi rostralno-caudalnej zakrętu zębatego hipokampa. Przedstawiono to na rekonstrukcji 3D zakresu iniekcji, w której zamknięte kontury rozprzestrzenienia wirusa zostały wyrysowane na 21 przekrojach seryjnych (Z = 50 μm/przekrój) przy użyciu oprogramowania do rekonstrukcji. Następnie obrysy konturów zostały wyrównane w celu wygenerowania obrazów 3D do kwantyfikacji objętości. Całkowite rozprzestrzenienie wirusa pokazano na kolor zielony (objętość = 54 730 800 μm3), a rozprzestrzenienie zlokalizowane w zakręcie zębatym na kolor fioletowy (objętość = 27 275 200 μm3). Wirus rozprzestrzenia się wzdłuż toru igły oraz w obrębie ciała modzelowatego w miejscu przecięcia z torem igły, oprócz wypełniania osi rostralno-caudalnej zakrętu zębatego. Pasek skali oznacza 200 µm.

Mapa sekwencji edycji genów z miejscami restrykcyjnymi; interfejs oprogramowania do analizy DNA; adnotacja sekwencji.
Film uzupełniający 1. Projektowanie sgRNA do klonowania do szkieletu retrowirusowego i lentiwirusowego.
W tym przykładzie projektowania syntetycznego przewodzącego RNA (sgRNA) sekwencja genomowa mysiego CHD8 zostaje pobrana z NCBI. Następnie kodon start oraz struktura eksonów są wizualizowane w programie Vector NTI. Pozwala to na skopiowanie regionu genomowego wokół pierwszego eksonu kodującego i wprowadzenie tej sekwencji do programu Benchling. Benchling umożliwia wizualizację wszystkich potencjalnych sgRNA w tym regionie. Ponadto, po wskazaniu wprowadzonego regionu genomowego, Benchling wyświetli wyniki on-target i off-target dla każdego przewodzącego RNA. Użytkownik może następnie wybrać sgRNA z najwyższymi wynikami on- i off-target. Kliknij tutaj, aby obejrzeć ten film. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać.)

Dyskusja

Istnieje kilka krytycznych kroków, które są ważne dla udanego pakowania wirusa. Zdrowie komórek ma kluczowe znaczenie przed i podczas transfekcji, ponieważ niezdrowe komórki znacznie zmniejszą ilość produkowanego wirusa. Jeśli transfekcja i pakowanie zakończą się sukcesem, wówczas 100% komórek powinno wyrażać fluorofor, a komórki powinny utworzyć funkcjonalne syncytium. W kroku 3.2.4 stukanie w probówkę jest konieczne do efektywnej transfekcji o wysokim mianie, a pH soli fizjologicznej buforowanej przez HEPES musi być dokładne. Maxi-prepy, które wytwarzają plazmidy niezbędne do pakowania wirusa, muszą być niezwykle czyste. Do tego momentu pomocne jest wytrącenie etanolu końcowej elucji DNA i ponowne zawieszenie w buforze Tris-EDTA. Bardzo ważne jest również zmniejszenie ilości surowicy do 2% lub mniej w pożywce, do której dodaje się kofeinę w dniu 6 (krok 3.4) przed pobraniem wirusa. Jeśli surowica nie zostanie zmniejszona, wówczas końcowy oczyszczony wirus będzie zawierał niepożądaną ilość białka surowicy. Zastosowanie glikolu polietylenowego 6000 do wytrącania cząstek wirusa wyklucza konieczność ultrawirowania. Ważne jest również, aby pamiętać, że wirusy zawierające Cas9 CRISPR mają zazwyczaj miano około 10 razy mniejsze niż wirusy zawierające wyłącznie fluorofor.

W przypadku chirurgii stereotaktycznej zastosowanie znieczulenia wziewnego umożliwia szybką i precyzyjną kontrolę świadomości zwierzęcia w porównaniu ze środkami znieczulającymi do wstrzykiwań i umożliwia znieczulenie w większym przedziale wiekowym. Bardzo ważne jest, aby narzędzia chirurgiczne były czyste i sterylne, a powtarzalne celowanie wymaga precyzyjnego ustawienia głowy. Upewnij się, że w instrumencie stereotaktycznym nie ma kołysania ani przewracania głowy i że czaszka jest mocno osadzona. Przydatne może być pozostawienie czaszki do wyschnięcia w celu znalezienia szwów w celu określenia współrzędnych stereotaktycznych. Ponadto szybkość i objętość dla każdej współrzędnej stereotaktycznej powinny być określone empirycznie.

Technika ta jest ograniczona, ponieważ rozprzestrzenianie się lenti- lub retrowirusa jest ograniczone, zwłaszcza w porównaniu z wirusami związanymi z adenowirusami (AAV). Dlatego wirusy te są cenne, gdy infekują dyskretny region mózgu, ale nie dla ogólnej infekcji związanej z AAV używanymi do analizy behawioralnej u zwierząt. Zastosowanie kofeiny w tym protokole znacznie zwiększa miano tych wirusów, ale nadal nie jest ono tak wysokie, jak miana osiągane w opakowaniach AAV. Ponadto, stabilna integracja jest tylko zaletą ekspresji fluoroforu, ponieważ CRISPR/Cas9 tworzy stabilne edycje genomu nawet w przypadku przejściowej transfekcji i możliwe jest, że trwająca ekspresja Cas9 i sgRNA może ostatecznie wywołać efekty poza celem. Przejściowa ekspresja systemu CRISPR/Cas9 z AAV jest wystarczająca do wytworzenia zmian genomowych, które są propagowane przez podziały komórkowe, jednak ekspresja fluoroforu nie zostanie utrzymana.

Stworzenie lenti- i retrowirusów wykorzystujących system CRISPR/Cas9 zapewni możliwość celowania w dowolny nowy gen w wielu różnych organizmach. Efektywność edycji genów wydaje się być zależna od sekwencji przewodnika RNA ukierunkowanego na rozszczepienie Cas9. Ustalono empirycznie, że od 10% do 80% klonów zawiera indele po sekwencjonowaniu zakażonych komórek Neuro2A. Obecnie nie wiadomo, czy częstości indel obliczone w komórkach Neuro2A odzwierciedlają te w neuronach. Oprogramowanie do projektowania RNA, takie jak Benchling, zawiera teraz wynik "na celu", który może być w stanie przewidzieć wydajność danej sekwencji docelowej. Do jakiego stopnia takie "celowe" wyniki są wiarygodne, musi zostać empirycznie określone w neuronach i innych typach komórek, w miarę jak system CRISPR-Cas9 będzie coraz powszechniej wdrażany.

Transgeniczna produkcja zwierzęca oparta na lentiwirusach odnosiła różne sukcesy, z doniesieniami, że transgeny dostarczane przez lentiwirusa zostają wyciszone11. Edycja genów DNA za pośrednictwem CRISPR może być przekazywana przez linię zarodkową w celu wygenerowania całych modeli zwierzęcych. W związku z tym stabilna edycja genomu może być osiągalna pomimo wyciszenia fluoroforów dostarczanych przez wirusa i transgenów Cas9. Może to stanowić skuteczną platformę dla ukierunkowanych zmian genomowych. Dostarczanie wirusa za pomocą systemu CRISPR/Cas9, choć nie wymaga organizmów transgenicznych, jest komplementarne z tymi technikami. Na przykład, wstrzyknięcie takich cząstek wirusa do transgenicznego zwierzęcia, które indukuje ekspresję Cre i zależnych od Cre transgenów opto- lub chemogenetycznych, powinno ułatwić złożone badania nad związkiem między manipulacjami genetycznymi a aktywnością neuronalną. Drugim przykładem jest dostarczenie tych cząstek wirusa Cas9 / sgRNA do warunkowego nokautu w celu przeprowadzenia badań przesiewowych pod kątem interakcji gen-gen. Wreszcie, kolejnym ekscytującym kierunkiem tych badań jest badanie przesiewowe fenotypów i związków terapeutycznych w komórkach pochodzących od pacjentów, które można wykorzystać do walidacji i odkrycia sieci genetycznych, które są zakłócone w różnych chorobach.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez R01MH097949 grantu NINH oraz Autism Speaks Pilot Grant 7359 dla BWL oraz Norris Cotton Cancer Center Optical Imaging Shared Instrumentation Grant P30CA023108.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Lista odczynników do hodowli komórkowych
>293FT linia komórkowaLife TechnologiesR700-07Lentivirus
293GPClontech631458
modyfikacji DMEM (IMDM) Retrowirusa Iscove'a (IMDM)Corning 10-016-CVKompletny IMDM z 10% FBS, 1% NEAA, 1% L-Gln i  1% P/S
Surowica bydlęca (FBS)Corning35-011-CV
MEM Aminokwasy endogenne (NEAA)Corning25-025-CI
Roztwór L-glutaminy, 100x (L-Gln)Corning25-005-CI
Roztwór pennicyliny/streptomycyny, 100x (P/S)Corning30-002-CI
Polistyren 10  cm talerzUSA ScientificCC7682-3394
Trypsyna EDTA 1xCorning25-053-CI
Lista odczynników do transfekcji
5  ml rurki polistyrenoweFisher Scientific352054
Dwuwodny chlorek wapnia (CaCl2)Fisher Scientific C69-500Przygotować 2,5 M roztwór w ddH2O
Chlorek sodu (NaCl)Fisher Scientific S271-3
HEPESFisher Naukowy BP2939-100
Fosforan sodu dwuzasadowy (Na2HPO4)Fisher Scientific S369-500
2x HEPES Sól fizjologiczna buforowana (HBS)500 ml: 8,2 g NaCl, 5,95  g HEPES, 0,106 g Na2HPO4, pH 7,01 (dokładnie!)
KofeinaSigma-AldrichC0750-5G
0,22 &mikro; Filtr strzykawkowy MEMD Millipore 
0,45 &mikro; Filtr strzykawkowy MEMD Millipore 
Strzykawka 60 ml L/LMed-Vet InternationalMV60CCLL
50 ml Tubka stożkowaCorning352098
glikolu polietylenowego    6000 (PEG 6000)Milipore528877
(10x) Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)National DiagnosticsCL-253
0,5 ml probówki do mikrowirówekUSA Scientific1605-0000
MatrigelFisher ScientificCB-40230A 6-dołkowa
płytkaFisher Scientific353046
ParaformaldehydFisher ScientificAC41678-5000
Dawca Serum KońskiegoCellgro35-030-CV
TritonX-100Sigma-AldrichX100-500ML
10 ml pipeta serologicznaFisher Scientific357551
anty-GFP, królik, 488 koniugatInvitrogenA21311
Stereotaktyczne odczynniki chirurgiczne
Vet-Strzykawka weterynaryjna tylko strzykawka T.B. 1 cc Luer slip T.B. 100/bxMed-Vet International1CCVLS Ostrza skalpela
Isoflurane
, #10, 100-pkMed-Vet InternationalJOR580S
maść na sztuczne łzyMed-Vet InternationalRXPARALUBE-O
PVP PrepSolution Med-Vet InternationalHPIV108208H
sól fizjologiczna Med-Vet InternationalDYND500MLSH
aplikatory z bawełnianą końcówkąMed-Vet InternationalCTA6
Potrójna maść antybiotykowa Med-Vet InternationalRXTRIP-OI15
MONOJECT® Igły Soft Pack 25 g x 5/8"Med-Vet International25058
6-0 nici jedwabneMed-Vet InternationalMV-711
Dla linii komórkowej Dla SLGV033RSSLHP033RS ze stali nierdzewnej

Bibliografia

  1. Williams, M. R., DeSpenza, T. Jr, Li, M., Gulledge, A. T., Luikart, B. W. Hyperactivity of newborn Pten knock-out neurons results from increased excitatory synaptic drive. J Neurosci. 35 (3), 943-959 (2015).
  2. Luikart, B. W., et al. Pten knockdown in vivo increases excitatory drive onto dentate granule cells. J Neurosci. 31 (11), 4345-4354 (2011).
  3. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  4. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  5. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 32 (4), 347-355 (2014).
  6. Luikart, B. W., et al. miR-132 mediates the integration of newborn neurons into the adult dentate gyrus. PLoS One. 6 (5), e19077(2011).
  7. Nasri, M., Karimi, A., Allahbakhshian Farsani, M. Production, purification and titration of a lentivirus-based vector for gene delivery purposes. Cytotechnology. 66 (6), 1031-1038 (2014).
  8. Ellis, B. L., Potts, P. R., Porteus, M. H. Creating higher titer lentivirus with caffeine. Hum Gene Ther. 22 (1), 93-100 (2011).
  9. Bacterial Transformation: The Heat Shock Method. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5059/bacterial-transformation-the-heat-shock-method (2015).
  10. Fricano, C. J., et al. Fatty acids increase neuronal hypertrophy of Pten knockdown neurons. Front Mol Neurosci. 7, 30(2014).
  11. Park, F. Lentiviral vectors: are they the future of animal transgenesis? Physiol Genomics. 31 (2), 159-173 (2007).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

retrowirus CRISPRpakowanie lentiwirusówmiano wirusatransdukcja neuronówknockout genuprojektowanie plazmidówtransfekcja fosforanem wapniawytrącanie glikolem polietylenowymreporter fluorescencyjny
Projektowanie, pakowanie i dostarczanie wysokomianowych CRISPR Retro i lentiwirusów poprzez iniekcję stereotaktyczną
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.