Projektowanie, pakowanie i dostarczanie wysokomianowych CRISPR Retro i lentiwirusów poprzez iniekcję stereotaktyczną

Aby zbadać podstawy normalnej fizjologii i patologii chorób, istnieje potrzeba precyzyjnego manipulowania ekspresją genów w organizmach modelowych. W przypadku organizmów modelowych ssaków jest to w dużej mierze skoncentrowane na tworzeniu i rozwoju transgenicznych myszy, w których element genetyczny będący przedmiotem zainteresowania jest otoczony miejscami rozpoznawanymi przez rekombinazę. Może to prowadzić do specyficznej dla miejsca manipulacji tymi flankowanymi genami. Chociaż jest to skuteczna strategia, wymaga ona dużego czasu i zasobów; na przykład stworzenie potrójnego transgenicznego zwierzęcia, które wykazywałoby ekspresję genu floksowego, rekombinazy Cre i genu reporterowego Cre, wymaga wielu krzyżowań i walidacji. W przeciwieństwie do tego, stereotaktyczne wstrzyknięcie wadliwych cząstek wirusa kodujących białko fluorescencyjne i rekombinazę do zwierzęcia z floksowanym genem nie wymaga skomplikowanego genotypowania ani strategii hodowlanych¹. Ponadto, jeśli białko fluorescencyjne i wirus wykazujący ekspresję Cre są wstrzykiwane jednocześnie z drugim wirusem kodującym inne białko fluorescencyjne, zapewnia to kontrolę wewnątrztkankową dla ukierunkowanej manipulacji genetycznej. Podczas gdy strategia ta nadal wymaga wykorzystania zwierząt typu knock-in, strategie oparte na RNA za pośrednictwem wirusa omijają potrzebę stosowania zwierząt transgenicznych. Na przykład stereotaktyczne wstrzyknięcie wirusów z niedoborem replikacji, które kodują białko fluorescencyjne i krótkie RNA spinki do włosów (shRNA), może wykorzystać endogenną maszynerię RNAi komórki, aby spowodować silną redukcję transkryptu genu będącego przedmiotem zainteresowania. Jednak strategie shRNA powodują subtelne knock-downy genów, często skutkujące skromnymi fenotypami komórkowymi². Podczas gdy knock-down może być bardziej fizjologicznie istotny dla dysfunkcji genów heterozygotycznych, jego zmniejszona odporność w porównaniu z knock-outem nie jest idealna dla fenotypowego odkrywania nowych genów.

Trzecia technika, która pojawiła się niedawno, system CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat)/Cas9 (białko związane z CRISPR 9), opiera się na ekspresji zarówno małego egzogennego RNA, jak i enzymu tnącego DNA. System CRISPR/Cas9 został zaadaptowany z prokariotycznego układu odpornościowego, który wyewoluował metodę identyfikacji obcego, inwazyjnego DNA wirusów i kierowania go do degradacji za pomocą enzymu^{Cas9 3,4}. Ta potężna technika edycji genomu może być używana do tworzenia ukierunkowanych delecji, insercji i mutacji; Poniższy protokół nakreśli, w jaki sposób dokonać delecji w genie będącym przedmiotem zainteresowania, aby wyeliminować jego ekspresję in vivo. Enzym Cas9 musi być wyrażany za pomocą przewodnika RNA homologicznego do obszaru zainteresowania i przylegającego do rusztowania RNA. Nokaut genu przy użyciu tej techniki wymaga ukierunkowania Cas9 na określony region w genomie za pomocą syntetycznych przewodników RNA (sgRNA) i wywołania dwuniciowych pęknięć (DSB) w miejscu zainteresowania. Te DSB są następnie naprawiane przez endogenną maszynerię naprawy komórek poprzez niehomologiczne łączenie końców (NHEJ), co prowadzi do indeli, które mogą powodować mutacje typu missense lub nonsense, a tym samym mogą powodować utratę funkcjonalnej ekspresji białka⁵. Ponieważ system ten wytwarza zmiany genomowe, wymaga jedynie przejściowej ekspresji Cas9 i sgRNA. Pożądane jest jednak, aby stabilny wskaźnik fluorescencyjny identyfikował komórki i ich potomstwo manipulowane w ten sposób.

Lenti- i retrowirusy mają tę zaletę, że stabilnie integrują interesujące nas DNA z komórkami gospodarza, które utrzymują długoterminową ekspresję i są przekazywane do komórek potomnych podczas mitozy. Protokół ten opisuje projektowanie i produkcję dwóch typów retrowirusów o wysokim mianie z wadliwymi replikacjami: cząstek lentiwirusowych pochodzących z ludzkiego wirusa niedoboru odporności (lentiwirus) oraz tych opartych na mysim wirusie białaczki Maloneya (retrowirus). Podczas gdy oba te wirusy są zdolne do stabilnej ekspresji dużych transgenów, cząstki retrowirusowe mogą integrować się z genomem tylko podczas podziału komórki z degradacją otoczki jądrowej, a zatem mogą być używane jako narzędzie do oznaczania i datowania urodzeń komórek⁶. Podczas gdy lentiwirusy mają reputację stosunkowo niskiego miana⁷, ta metodologia, obejmująca stosowanie kofeiny⁸ podczas zbierania wirusów, rutynowo generuje miana 10,⁹ i 10¹⁰ cząstek/ml. Kolejną zaletą lenti- i retrowirusów jest tolerancja na bardzo duże wstawki. Poniższy zbiór protokołów przedstawia procedurę projektowania lenti lub retrowirusa kodującego fluorescencyjny reporter, sgRNA i Cas9 w celu wykorzystania systemu CRISPR / Cas9 do modyfikacji DNA, a także ekspresji białka fluorescencyjnego.

Stereotaktyczna neurochirurgia myszy jest cenną metodą wstrzykiwania wirusów in vivo w celu badania morfologii, funkcji i połączeń zainfekowanych neuronów. Infekcja wirusowa w neuronach może być wykorzystywana do manipulowania poziomami ekspresji w dłuższym okresie czasu, na przykład podczas rozwoju, a ekspresja może być precyzyjnie kontrolowana za pomocą różnych systemów indukowanych lekiem i specyficznej ekspresji sterowanej przez Cre. Ten konkretny protokół wyjaśnia, jak wstrzyknąć wirusa z ekspresją sgRNA i Cas9 w celu wyeliminowania interesującego genu w mózgu dorosłej myszy. Myszy bardzo szybko wracają do zdrowia po tej procedurze, a ekspresję transgenu wirusa można zaobserwować w ciągu 48 godzin po wstrzyknięciu. Jednak wydaje się, że ekspresja fluoroforu wzrasta w ciągu kilku tygodni, co skutkuje prawie maksymalnym poziomem w ciągu 3 tygodni po zakażeniu. Myszy, które przechodzą wstrzyknięcie stereotaktyczne wirusa, mogą być wykorzystywane do badań behawioralnych, elektrofizjologicznych lub morfologicznych. Ogólnie rzecz biorąc, celem tych procedur jest pokazanie, jak znokautować gen w mózgu dorosłej myszy za pomocą chirurgii stereotaktycznej i wirusa wyrażającego specyficzne sgRNA i Cas9.

Oświadczenie etyczne: Wszystkie protokoły zostały zatwierdzone przez komisje rewizyjne Dartmouth Institutional Biosafety oraz Institutional Animal Care and Use Committee.

1. Protokół projektowania nici prowadzącej (sgRNA) dla retrowirusa CRISPR/Cas9

UWAGA: Istnieje wiele stron internetowych non-profit, które można wykorzystać do generowania sgRNA w celu ukierunkowania na gen będący przedmiotem zainteresowania (https://benchling.com/ i http://crispr.mit.edu/). Celem tego protokołu jest zaprojektowanie i zamówienie jednoniciowych oligonukleotydów od komercyjnego dostawcy, które są ze sobą wyżarzane. Ten wyżarzony oligo zostanie podwiązany do wektora transferu PXL. Zobacz film uzupełniający 1, aby zapoznać się z przykładem projektowania sgRNA przy użyciu Benchlinga.

1. Skorzystaj ze strony internetowej poświęconej projektowaniu sgRNAs.
   UWAGA: Na przykład, wprowadzenie na stronę internetową sekwencji kodującej/egzonicznej z okolic początku interesującego nas genu spowoduje wygenerowanie 20-nukleotydowego sgRNA. Użyj sekwencji 20 nukleotydów sgRNA, aby zaprojektować oligonukleotydy sensowne i antysensowne, które zostaną uporządkowane w celu utworzenia sgRNA.
2. Po wygenerowaniu sgRNA skopiuj tę sekwencję do edytora tekstu. Dodaj G (guaninę) na początku sekwencji 20 nukleotydów sgRNA w dokumencie, jeśli jeszcze się od niej nie zaczyna (tj. sekwencji sgRNA nukleotydu G-20). Jest to konieczne, aby zapewnić dobrą transkrypcję z promotora U6.
3. Udokumentuj odwrotne dopełnienie tej sekwencji nukleotydowej składającej się obecnie z 20-21 nukleotydów. Dla oligo sensu dodaj "CACC" do końca 5' sekwencji w dokumencie (tj. sekwencji sgRNA nukleotydu CACC-G-20). Ten zwis zostanie użyty do ligacji sekwencji do wektora PXL.
4. W przypadku oligo antysensownego dodaj AAAC do końca 5'. Użyj tego zwisu, aby podwiązać sekwencję do wektora PXL.
5. Uzyskaj oligonukleotydy sensu i antysensu. Po otrzymaniu oligonukleotydów wykonaj 100 μM, używając wody wolnej od DNA. Zmieszać ze sobą po 10 μl oligonukleotydów 100 μM sense i antysensownych z 4 μl 10x buforu NEB 2 i 16 μl wody.
   UWAGA: Nie wymagają oczyszczania strony ani fosforylacji 5' (ponieważ zwisy BbsI są niekompatybilnymi końcami spoistymi).
   1. W zlewce o pojemności 500 ml doprowadzić 200 ml wody do wrzenia, a następnie umieścić probówkę zawierającą tę mieszaninę w piankowym uchwycie na "pływaki". Pozwól wodzie powoli ostygnąć z 95 °C przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
   2. Rozcieńczyć obecnie wyżarzoną mieszaninę oligonukleicytów w stosunku 1:1 000 w sterylnej wodzie i użyć natychmiast w następnym podwiązaniu lub przechowywać pozostałą reakcję w temperaturze -20 °C.
6. Trawić pXL, pochodną wektora PX330, enzymem restrykcyjnym BbsI w temperaturze 37 °C przez 2 godziny. Zastosować reakcję 40 μl zawierającą 2 μg pXL, 4 μl 10x buforu NEB 2, 1 μl Bbs1 i zrównoważyć wodę. Poddaj digested-pXL rutynowemu oczyszczaniu żelu za pomocą dostępnego w handlu zestawu. Upewnij się, że wydajność wynosi ~8,5 kB produktu.
7. Korzystając z dostępnego w handlu zestawu do ligacji, podwiązać 1 μl wyżarzonych oligonukleukleotydów w stosunku 1:1,000 z 50 ng strawionego i oczyszczonego żelem pXL. Przekształcić produkt ligacji w kompetentną grupę E. coli z niedoborem rekombinacji (NEB 5-alfa, skuteczność subklonowania). Przebadaj transformanty pod kątem obecności właściwego przewodnika za pomocą sekwencjonowania plazmidowego DNA.
8. Trawić U6, nić prowadzącą i elementy rusztowania RNA (sgRNA) z pXL za pomocą enzymów restrykcyjnych BstB1 i Pac1 i ligować do szkieletu wirusa białka fluorescencyjnego T2A-Cas9 trawionego tymi samymi enzymami restrykcyjnymi. Przekształć produkt ligacji (NEB 5-alpha maksymalna wydajność). Plazmidy szkieletu wirusa białka fluorescencyjnego T2A-Cas9 są plazmidami o niskiej kopii, dlatego należy stosować protokoły o niskiej liczbie kopii.
   UWAGA: Drugi sgRNA może być podobnie wprowadzony przez trawienie PacI innego plazmidu nici prowadzącej pXL i zligowany do szkieletu wirusowego trawionego przez Pac1 i traktowanego fosfatazą jelitową cielęcą, który już zawiera pierwszą nić prowadzącą. Leczenie fosfatazą plazmidu przenoszącego wirusa pomoże zmniejszyć liczbę transformantów pochodzących z samoligacji plazmidów niezawierających drugiego przewodnika.
9. Zweryfikuj sekwencję końcowego przygotowania plazmidu i maxi za pomocą zestawu przygotowawczego Nucleobond Xtra maxi i zapakuj go do wirusa przy użyciu następującego "Protokołu produkcji retro/lentiwirusowej — metoda CaPO4".

2. Przygotowanie komórek 293FT/293GP do transfekcji (produkcja retro/lentiwirusowa — metoda CaPO4)

1. (Dzień 1) Szybko rozmrozić 1 fiolkę z komórkami na 10 cm płytkę do hodowli komórek w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Do pakowania lentiwirusa użyj ogniw 293FT. Do pakowania retrowirusowego należy użyć komórek 293GP (gag/pol).
2. Odpipetować wszystkie rozmrożone komórki z probówki kriogenicznej do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i dodać 2 ml wstępnie podgrzanego CO₂ równo kompletnego zmodyfikowanego podłoża Dulbecco firmy Iscove.
3. Wirować komórki przez 5 minut przy 500 x g do osadzania. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 10 ml kompletnego zmodyfikowanego podłoża Dulbecco firmy Iscove. Umieść komórki na 10-centymetrowym naczyniu do hodowli komórkowych. Inkubować komórki przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla.
4. (Dzień 2) 24 godziny po posianiu zmienić podłoże na płytce, zasysając istniejące podłoże i dodając do płytki 10 ml wstępnie podgrzanego zmodyfikowanego podłoża Dulbecco firmy Iscove.
   1. (Dzień 3-4) 24-48 godzin po zmianie pożywki i gdy komórki staną się zlewne, podziel komórki na zbieg 2,5-3,0 x 10⁶ komórek/płytkę (płytka 10 cm).
   2. Aby podzielić komórki, należy odessać pożywkę i umyć płytkę 5 ml PBS. Dodać 1 ml 0,25% trypsyny do płytki i inkubować w temperaturze 37 °C, aż komórki oderwą się od płytki. Dodać 0,5 ml zmodyfikowanego podłoża Dulbecco firmy Iscove, aby zneutralizować reakcję 0,25% trypsyny i pipetować komórki do probówki o pojemności 1,5 ml.
   3. Wirować komórki w temperaturze 500 x g przez 5 minut. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml zmodyfikowanego podłoża Dulbecco firmy Iscove. Rozcieńczyć 10 μl komórek w 90 μl PBS. Policz komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek. Ponownie płytka 2,5-3,0 x 10⁶ komórek/płytkę z kompletnym zmodyfikowanym Tilbecco's Medium.
      UWAGA: Komórki będą zlewać się w ~50% 24-34 godziny po posiewaniu. Transfekuj komórki, gdy są ~ 50% zlewające się.

3. (Dzień 5) Transfekcja CaPO4 i zbieranie cząstek wirusowych

1. Zmień pożywkę na 2 godziny przed transfekcją, zasysając istniejącą pożywkę i dodając 10 ml wstępnie podgrzanego zmodyfikowanego podłoża Dulbecco firmy Iscove. Upewnij się, że na płytce o średnicy 10 cm znajduje się dokładnie 10 ml podłoża.
2. Przygotuj odczynniki do transfekcji dla 2 naczyń za pomocą 2,5 ml probówek z polistyrenu o okrągłym dnie. Oznacz pierwszą probówkę "DNA", a drugą probówkę "2X HBS". Dostosuj stężenie DNA do 1 μg/μl w Tris-EDTA przy pH 7,4.
   1. W przypadku lentiwirusów powoli dodaj 20 μl wektora transferowego (konstrukt wirusowy będący przedmiotem zainteresowania), 13 μl CMVdelta8.9, 9 μl VSV-g, 860 μl klasy_H2Oz biologii molekularnej i 100 μl 2,5 M CaCl₂ do pierwszej probówki ("DNA"), ciągle stukając w probówkę, aby wymieszać.
   2. W przypadku retrowirusów należy pominąć plazmid CMVdelta8.9. Dodaj 20 μl wektora transferowego, 15 μl VSV-g, 860 μl biologii molekularnej klasy H₂O i 100 μl 2,5 M CaCl₂ do probówki oznaczonej "DNA".
   3. Dodaj 1 ml 2x soli fizjologicznej buforowanej przez HEPES (pH 7,0; to pH jest absolutnie krytyczne) do probówki oznaczonej "2X HBS".
   4. Powoli dodawać 1 ml zawartości probówki "DNA" do probówki "2X HBS", kropla po kropli. Ciągle stukaj w probówkę "2X HBS" palcem wskazującym lub środkowym, dodając zawartość probówki "DNA". Obserwuj widoczne pęcherzyki CaPO₄ po każdej kropli. Inkubować probówkę w ciemności przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
3. Dodać 1 ml transfekcji w postaci powolnych kropelek do każdej 10 cm płytki komórkowej, a następnie inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
4. (Dzień 6) Zastąp pożywkę 8 ml Iscove's Modified Dulbecco's Medium + 0,5% FBS i 40 mg kofeiny/100 ml pożywki. Jeśli wektor transferowy zawiera marker fluorescencyjny, to ekspresja fluoroforu wskazuje na udaną transfekcję.
5. (Dzień 7) Zebrać pożywkę zawierającą cząstki wirusa za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml i rozlać do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Przechowywać probówkę stożkową o pojemności 50 ml w temperaturze 4 °C. Do każdej płytki dodać 8 ml 0,5% pożywki FBS.
   1. (Dzień 8) Ponownie zebrać pożywkę zawierającą cząstki wirusa i połączyć ze zbiorem z poprzedniego dnia w stożkowej probówce o pojemności 50 ml.

4. Zagęszczenie i oczyszczanie wirusa

1. Przygotować 5x roztwór glikolu polietylenowego 6000, dodając 40% glikolu polietylenowego 6000 i 1,5 M NaCl do ddH₂O. Roztwór należy sterylizować w autoklawie w cyklu ciekłym przez 45 minut w temperaturze 121 °C. Powoli mieszać roztwór podczas chłodzenia.
   UWAGA: Roztwór zacznie być mętny, a następnie stanie się klarowny, gdy ostygnie.
2. Odwirować stożkową probówkę o pojemności 50 ml zawierającą oba zbiory supernatantu wirusa o stężeniu 2 000 x g przez 10 minut w celu osadzenia nierozpuszczalnego materiału. Oczyść pożywkę wirusową, filtrując przez filtr strzykawkowy o niskim poziomie wiązania białek (PES lub PVDF) o niskiej zawartości wiązania z białkami.
3. Dodać 5x roztwór glikolu polietylenowego 6000 do pożywki (końcowe stężenie powinno wynosić 8% glikolu polietylenowego 6000 i 0,3 M NaCl). Wymieszaj, kilkakrotnie odwracając rurkę (nie wirować). Inkubować roztwór glikolu polietylenowego zawierającego wirusa w temperaturze 4 °C przez 12 lub więcej godzin, od czasu do czasu mieszając ponownie.
4. (Dzień 9) Odwirować roztwór glikolu polietylenowego zawierający wirus o stężeniu 2 500 x g przez 45 minut. Wyjąć i wyrzucić supernatant i ponownie wirować przez 2 minuty. Ponownie usunąć i wyrzucić supernatant.
5. Zawiesić osad przez dodanie 320 μl sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (320 μl to 1/100 pierwotnej objętości zebranej pożywki zawierającej wirusa) i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C. Opcjonalnie zawiesić osad w temperaturze pokojowej na bujaku przez 30 minut.
6. Po ponownym zawieszeniu osadu należy podzielić na porcję wirusa (5-10 μl na probówkę 0,5 ml) i zamrozić podwielokrotności w temperaturze -80 °C (zamrażanie, rozmrażanie lub przechowywanie w temperaturze 4 °C radykalnie zmniejszy miano).
7. Mianowanie wirusów należy wykonać przy użyciu standardowych protokołów, tj. wykonać serię rozcieńczeń na 6-dołkowej płytce HEK293T komórek i ręcznie policzyć kolonie fluorescencyjne 48 godzin później.

5. Testowanie skuteczności wirusa CRISPR

UWAGA: Sekwencjonuj klony, wykonując następujące kroki, aby przetestować produkcję pęknięć dwuniciowych naprawionych przez NHEJ przy użyciu mysich komórek Neuro2A. Ma to tę przewagę nad testami geodezyjnymi, że można je wykorzystać do określenia procentu komórek, które zostały zmodyfikowane, oraz charakteru indeli powstałych w wyniku NHEJ.

1. Pokryć 3,5 cm naczynie do hodowli komórkowych galaretowatą mieszanką białek, taką jak matrigel, rozcieńczoną w stosunku 1:50 w zmodyfikowanym pożywce Dulbecco firmy Iscove i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Odessać galaretowatą mieszaninę białek i umieścić komórki Neuro2A na płytce.
2. Po tym, jak komórki Neuro2A osiągną 50% konfluencji, dodaj CRISPR Lentivirus lub Retrovirus przy wielokrotności infekcji 10 (tj. 10 cząstek wirusa na komórkę).
   UWAGA: Komórki Neuro2A nie są tak przyjazne dla infekcji jak komórki HEK293, dlatego pojedyncza infekcja nie spowoduje zakażenia 100% komórek lentiwirusem. Co więcej, retrowirus infekuje tylko dzielące się komórki, a zatem nie spowoduje 100% infekcji. Aby osiągnąć prawie 100% wskaźnik infekcji, dodawanie wirusa można powtarzać przez wiele dni, dzieląc komórki w razie potrzeby. Alternatywnie, fluorescencyjne komórki dodatnie można wyizolować za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją. Najskuteczniejszym sposobem na osiągnięcie 100% wskaźnika infekcji lentiwirusem jest przeprowadzenie pojedynczej infekcji, a następnie izolacji FACS. W przypadku retrowirusa wykonaj 4 rundy infekcji w odstępie 24 godzin, a następnie izoluj FACS, aby zapewnić 100% infekcję.
3. Po zakażeniu komórek przez 1 tydzień, rozwiń komórki do prawie zbiegu na 10 cm płytce, odessać pożywkę i umyć płytkę 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami. Dodać 1 ml 0,25% trypsyny i inkubować w temperaturze 37 °C, aż komórki oderwą się od płytki. Dodać 0,5 ml zmodyfikowanego podłoża Dulbecco firmy Iscove, aby zneutralizować 0,25% reakcję trypsyny, a następnie pipetować komórki do probówki o pojemności 1,5 ml i osadzać komórki w masie 500 x g przez 5 minut.
4. Aby wyizolować DNA, dodać 100 μl 50 mM wodorotlenku potasu, ponownie zawiesić komórki i inkubować w temperaturze 95 °C przez 5 minut. Zneutralizować roztwór za pomocą 10 μl 1 M Tris, pH = 8,0.
5. PCR amplifikuje region flankujący region genomowy, do którego dąży sgRNA CRISPR, przy użyciu ~ 300 ng DNA wyizolowanego w kroku 5.5 przy użyciu głównej mieszanki PCR o wysokiej wierności⁴.
6. Przeprowadź reakcję PCR na 2,5% żelu agarozowym i żelu oczyść fragment o odpowiedniej wielkości za pomocą zestawu do oczyszczania żelu, takiego jak zestaw do odzyskiwania DNA w żelu. Zremisuj z wektorem klonowania PCR, takim jak pGem-t-easy i przekształć się w kompetentne komórki⁹.
7. 24 godziny później dodaj 2 ml bulionu LB do 15 ml probówek okrągłodennych, a także odpowiedni antybiotyk (ampicylina, neomycyna itp.). Zaszczepić probówkę pojedynczą kolonią za pomocą sterylnej końcówki lub pętli do pipety, aby wybrać pojedynczą kolonię z płytki LB. Rozszerz i wyhoduj kolonię, potrząsając probówką z prędkością 250 obr./min i 37 °C przez 24 godziny. Powtórz dla tylu kolonii, ile chcesz.
   1. Za pomocą zestawu mini-prep wyizoluj DNA z E. coli i zsekwencjonuj je za pomocą starterów zaprojektowanych w celu amplifikacji obszaru genu, na który atakuje sgRNA, w celu analizy docelowego regionu Cas9 genomu myszy.

6. Protokół iniekcji stereotaktycznej dla dorosłej myszy

1. Przygotuj się do operacji
   UWAGA: Ważne jest, aby zachować sterylne warunki podczas operacji przeżycia. W tym protokole osiąga się to poprzez sterylizację termiczną narzędzi chirurgicznych, użycie betadyny do sterylizacji miejsca wstrzyknięcia i dodanie maści antybiotykowej do miejsca nacięcia po jego zamknięciu. Ważne jest również stosowanie sterylnych rękawiczek, a także dokładnie wysterylizowanego, dedykowanego obszaru operacyjnego.
   1. Sterylizuj na gorąco narzędzia chirurgiczne przed użyciem w autoklawie lub przy użyciu sterylizatora z gorącymi kulkami. Przygotuj salę pooperacyjną i obszar operacji, włączając poduszki grzewcze, aby utrzymać temperaturę ciała podczas operacji i rekonwalescencji. Zmontuj wiertło używane do tworzenia otworów w czaszce do wstrzykiwań.
   2. Załadować 4 μl wirusa do igły iniekcyjnej, pobierając wirusa bezpośrednio ze sterylnej probówki do PCR. Na krótko usunąć podwielokrotność wirusa z lodu. Wirus należy utrzymywać w strzykawce w temperaturze pokojowej nie dłużej niż 1 godzinę przed wstrzyknięciem.

7. Stereotaktyczny wtrysk

1. Upewnij się, że wentylacja sali operacyjnej jest otwarta, aby zapewnić prawidłowy przepływ powietrza. Przygotuj mysz do zabiegu poprzez znieczulenie 4% izofluranem w komorze indukcyjnej. Po znieczuleniu należy ogolić głowę, aby przygotować miejsce wstrzyknięcia.
   1. Umieść mysz w instrumencie stereotaktycznym za pomocą pęsety, aby przesunąć język w dół i na bok. Włóż pręt do gryzienia do ust, aż zęby wpadną do szczeliny, a następnie zabezpiecz nauszniki. Upewnij się, że korpus myszy znajduje się na poduszce grzewczej, a nos znajduje się w stożku nosowym. Skierować 4% izofluranu do stożka nosowego. Potwierdź znieczulenie, szczypiąc stopę pęsetą i upewniając się, że nie ma odruchu zaskoczenia.
   2. Zastosuj sztuczne łzy, aby nawilżyć oczy. Przygotowanie miejsca wstrzyknięcia należy zakończyć, pobierając z ogolonej głowy wymaz z naprzemiennymi rundami jodu powidonu i lidokainy.
2. Za pomocą skalpela wytnij małe nacięcie wzdłuż środka skóry głowy. Osusz czaszkę wacikiem i wodą utlenioną, jeśli to konieczne, aby pomóc w wizualizacji bregmy.
   1. Za pomocą lunety preparacyjnej zlokalizuj bregmę na czaszce i umieść końcówkę wiertła na bregmie. Wyzeruj (lub zapisz) cyfrowe współrzędne stereotaktyczne na płaszczyznach x, y i z.
   2. Aby upewnić się, że głowica jest wypoziomowana na osi y rostralnej do ogonowej, umieść wiertło na lambda i wypoziomuj głowicę tak, aby współrzędna z była mniej więcej równa zarówno przy bregmie, jak i lambdzie.
   3. Aby upewnić się, że głowica jest wypoziomowana na osi x, ustaw wiertło na y = 1/2 lambda. Upewnij się, że współrzędna z jest równa 1 mm z każdej strony (x = +/- 1 mm) szwu strzałkowego. Wyreguluj czaszkę, jeśli występuje różnica we współrzędnej z w odległości 1 mm po lewej i prawej stronie lambda.
3. Umieść wiertło nad żądanymi współrzędnymi. Dla zakrętu zębatego użyj współrzędnych y = -1.9 z bregma i x = +/- 1.1. Przed wierceniem obniż izofluran do 2%, a następnie powoli i ostrożnie przewiercić czaszkę.
   1. Po wywierceniu wszystkich otworów przymocuj wypełnioną strzykawkę do instrumentu stereotaktycznego. Wizualnie wyśrodkuj strzykawkę nad otworem i wyzeruj współrzędną z na czaszce.
   2. Powoli opuścić strzykawkę do najgłębszej głębokości z. W przypadku zakrętu zębatego głębokości z wynoszą -2,5, -2,4 i -2,3. Rozpocząć wstrzykiwanie z szybkością 0,25 μl/min za pomocą wtryskiwacza stereotaktycznego.
      1. Po zakończeniu wstrzykiwania na najmniejszej głębokości Z, odczekać 1 minutę, a następnie podnieść do następnej współrzędnej i ponownie rozpocząć wstrzykiwanie. Kontynuuj ten wzór, aż wszystkie współrzędne wtrysku z zostaną wstrzyknięte. Należy odczekać 2 minuty przed wyjęciem strzykawki po ostatnim wstrzyknięciu.
         UWAGA: Nie zaobserwowano żadnych niepożądanych skutków dla tkanki po wstrzyknięciu do 2 μl wirusa na półkulę do mózgu myszy.
   3. Powtórz iniekcję dla innych otworów.
4. Po wstrzyknięciu wyjmij mysz z instrumentu stereotaktycznego i zszyj skórę głowy jedwabnymi szwami 6-0. Nałóż lidokainę i krem antybakteryjny na ranę.
   1. Wstrzyknąć 0,8-1,0 ml soli fizjologicznej + ketoprofenu (3-5 mg / kg) drogą I.P. w celu opanowania bólu. Następnie umieść mysz w podgrzewanej komorze odzyskiwania. Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą w mostku. Nie należy zwracać zwierzęcia do towarzystwa innych zwierząt, dopóki w pełni nie wyzdrowieje.
5. W ciągu kilku dni po operacji codziennie waż mysz i podawaj jej miękkie jedzenie i smakołyki. Sprawdź ranę i zwróć uwagę na ogólny stan/zachowanie.
6. Po wstrzyknięciu stereotaktycznym myszy mogą zostać poddane eutanazji w celu elektrofizjologii przygotowania plastrów¹ lub perfuzji, a ich mózgi usunięte, pokrojone i wybarwione za pomocą immunohistochemii^{do analizy 10}.

Zgodnie z "Protokołem projektowania nici prowadzącej (sgRNA) dla retrowirusa CRISPR/Cas9", oligonukleotydy ukierunkowane na określoną sekwencję są wprowadzane do wektora klonowania PXL za promotorem hU6 i za rusztowaniem przewodnika RNA przy użyciu miejsc klonowania BbsI (Rysunek 1, krok 1). Ten sgRNA jest następnie wycinany z PXL i wprowadzany do szkieletu pRubi za pomocą miejsc BstBI i PacI (Rysunek 1, Krok 2). Wreszcie, kolejny sgRNA sklonowany do PXL można umieścić poniżej pierwszego przewodnika w pRubi-Guide1 (Figura 1, Krok 3), celując w inny obszar genu i zwiększając szanse na nokaut przez NHEJ. Weryfikacja poprawności konstruktów powinna być określona za pomocą analizy sekwencji. Po stworzeniu tego konstruktu, można go spakować do wirusa zgodnie z "Protokołem Produkcji Retro/Lentiviral - Metoda CaPO4". Udane pakowanie potwierdza się poprzez zakażenie wirusem komórek HEK293 w celu mianowania wirusa. Jeśli nie ma ekspresji fluoroforu, prawdopodobnie wystąpił błąd podczas pakowania wirusa.

Rycina 2 jest reprezentatywnym wynikiem 2 retrowirusów, jednego eksprymującego GFP, a drugiego eksprymującego mCherry, wstrzykniętych jednocześnie do zakrętu zębatego noworodka myszy (7 dni) i zobrazowanego 21 dni po wstrzyknięciu. Znakowanie neuronów za pomocą mCherry lub GFP umożliwia morfologiczną ocenę różnych manipulacji genetycznych w tej samej tkance, gdzie jeden wirus może wyrażać KO za pośrednictwem CRISPR/Cas9, a drugi wirusa kontrolnego, wyrażając wyłącznie fluorofor. Iniekcja stereotaktyczna pozwala na precyzyjną selektywność anatomiczną, o czym świadczy dyskretne zakażenie zamierzonych współrzędnych, zakrętu zębatego. Podczas analizowania wycinków mózgu pod kątem infekcji ważne jest, aby zachować otaczającą tkankę, dopóki nie zostanie ustalone, że zainfekowany został właściwy obszar anatomiczny. Jeśli nie ma oznak infekcji, możliwe, że wstrzyknięcie nastąpiło w sąsiednim regionie i można je zidentyfikować w sąsiednich sekcjach. Pomocne może być również zlokalizowanie ścieżki igły w celu znalezienia dokładnego obszaru wstrzyknięcia. Wirusy pseudotypowane VSVg rzadko rozprzestrzeniają się poza brzegi zakrętu zębatego po wstrzyknięciu in vivo i mają tendencję do rozprzestrzeniania się wzdłuż osi rostralnej / ogonowej, infekując komórki wzdłuż całego zakrętu zębatego, jak analizowano za pomocą rekonstrukcji 3D (Figura 3).

Rycina 1: Strategia klonowania retrowirusowego plazmidu pRubi-Guide1-Guide2-CRISPR. Strategia ta jest identyczna w przypadku plazmidów lentiwirusowych opartych na FU. Oligonukleotydy sgRNA są wyżarzane i wprowadzane do PXL za pomocą miejsc klonowania BsbI. Po sekwencjonowaniu, aby upewnić się, że sgRNA zostanie pomyślnie wstawione do PXL, trawić plazmid za pomocą BstBI i PacI. Wkładka, która wypada (skrzynka), jest następnie klonowana do wirusowej kości kręgosłupa (czarne przerywane linie) pRubi-Guide1 CRISPR. Drugi sgRNA może być również wstawiony do PXL i wytrawiony za pomocą enzymu PacI. Jest on następnie klonowany do wektora CRISPR pRubi-Guide1 (czerwone przerywane linie) za pomocą strony PacI. Powstały plazmid zawiera następnie zarówno nici prowadzące, jak i niezbędne elementy wirusowe, promotory i fluorofory. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 2: Retrowirusowe wstrzyknięcie zakrętu zębatego myszy. Retrowirusy wykazujące ekspresję mCherry (czerwony) lub GFP (zielony) wstrzyknięto do zakrętu zębatego myszy p7. 21 dni później myszy poddano perfuzji, a mózgi pocięto i zabarwiono na obecność GFP i mCherry. (A) 5-krotny obraz fluorescencyjny o szerokim polu widzenia pokazuje precyzję iniekcji zakrętu zębatego i specyfikę znakowania neuronów ziarnistych zakrętu zębatego. Morfologię hipokampa można zobaczyć za pomocą barwienia Dapi (niebieskiego). Podziałka mierzy 200 μm. (B) 10-krotny obraz fluorescencyjny o szerokim polu widzenia pokazuje, że te lentiwirusy o wysokim mianie infekują dużą liczbę komórek, do których morfologii można uzyskać dostęp poprzez ekspresję fluoroforu. Podziałka mierzy 100 μm. (C) Wirusy wykazujące ekspresję GFP lub mCherry zostały wstrzyknięte do zakrętu zębatego. Korzystając z systemu retrowirusów, można użyć jednego wirusa do wykonania jednej manipulacji genetycznej oznaczonej GFP i innej manipulacji oznaczonej mCherry, a następnie ocenić pojedyncze lub addytywne zmiany spowodowane każdym wirusem. Podziałka mierzy 10 μm.

Rycina 3: Anatomiczny rozkład wstrzyknięcia lentiwirusa. Stereotaktyczne jednoczesne wstrzyknięcie wirusa GFP-shPten i wirusa kontrolnego mCherry do mózgu dorosłej myszyPten loxp/+ spowodowało rozprzestrzenienie się wirusa wzdłuż całej osi rostralnej/ogonowej zakrętu zębatego hipokampa. Widać to w rekonstrukcji 3D zakresu iniekcji, w której za pomocą oprogramowania do rekonstrukcji prześledzono zamknięte kontury rozprzestrzeniania się wirusa na 21 seryjnych odcinkach (Z = 50 μm/sekcję). Ślady konturów zostały następnie wyrównane w celu wygenerowania obrazów 3D w celu ilościowego określenia objętości. Całkowity rozprzestrzenianie się wirusa jest pokazane na zielono (objętość = 54 730 800 μm3), a rozprzestrzenianie się zlokalizowane w ząbkach jest pokazane na fioletowo (objętość = 27 275 200 μm3). Wirus rozprzestrzenia się wzdłuż toru igły i ciała modzelowatego na przecięciu toru igły, a także wypełnia oś rostralną/ogonową zakrętu zębatego. Podziałka mierzy 200 μm.

Film uzupełniający 1. Projektowanie sgRNA do klonowania do szkieletu retrowirusowego i lentiwirusowego.
W tym przykładzie projektu syntetycznego przewodnika RNA (sgRNA) sekwencja genomowa mysiego CHD8 jest pobierana z NCBI. Kodon start i struktura eksonu są następnie wizualizowane w wektorze NTI. To pozwala nam skopiować region genomu wokół pierwszego eksonu kodującego i wprowadzić tę sekwencję do Benchlinga. Benchling pozwala nam na wizualizację wszystkich potencjalnych sgRNA w regionie. Ponadto, po wskazaniu regionu genomu, który mamy wprowadzony, Benchling pokaże nam wyniki on-target i off-target dla każdego przewodnika RNA. Użytkownik może następnie wybrać przewodnik RNA z najwyższymi wynikami on- i off-target. Kliknij tutaj, aby obejrzeć ten film. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać.)

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.