Przedstawiono metodologię uzyskiwania wizualnych i ilościowych informacji o strukturze korzeni z danych rentgenowskiej tomografii komputerowej uzyskanych w glebie.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wyodrębnianie metryk dla trójwymiarowych systemów korzeniowych: analiza objętości i powierzchni z danych rentgenowskiej tomografii komputerowej w glebie
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Korzenie roślin odgrywają kluczową rolę w interakcjach roślina-gleba-mikroorganizmy, które zachodzą w ryzosferze, a także w procesach mających ważne implikacje dla zmian klimatycznych i zarządzania uprawami. Ilościowe informacje o wielkości korzeni w ich naturalnym środowisku są nieocenione w badaniu wzrostu korzeni i procesów środowiskowych z udziałem roślin. Wykazano, że rentgenowska tomografia komputerowa (XCT) jest skutecznym narzędziem do skanowania i analizy korzeni in situ. Naszym celem było opracowanie bezkosztowego i wydajnego narzędzia, które przybliża powierzchnię i objętość korzenia niezależnie od jego kształtu na podstawie danych z tomografii trójwymiarowej (3D). Strukturę korzeni preparatu Sporobolus heterolepis, preriowego (Sporobolus heterolepis) zobrazowano za pomocą XCT. Rdzeń został zrekonstruowany, a podstawowa struktura korzenia została wyodrębniona z danych przy użyciu kombinacji licencjonowanego i otwartego oprogramowania. Następnie utworzono siatkę wielokątną izopowierzchniową w celu ułatwienia analizy. Opracowaliśmy samodzielną aplikację imeshJ, wygenerowaną w MATLAB1, do obliczania objętości i powierzchni korzenia z siatki. Wyjściami imeshJ są pole powierzchni (w mm2) i objętość (w mm3). Opisano proces, wykorzystujący unikalną kombinację narzędzi, od obrazowania po ilościową analizę korzeni. Połączenie XCT i oprogramowania typu open source okazało się potężną kombinacją do nieinwazyjnego obrazowania próbek korzeni roślin, segmentacji danych korzeniowych i wyodrębniania informacji ilościowych z danych 3D. Ta metodologia przetwarzania danych 3D powinna mieć zastosowanie do innych systemów materiałów/próbek, w których istnieje łączność między składnikami o podobnym tłumieniu promieniowania rentgenowskiego i pojawiają się trudności z segmentacją.
Wprowadzenie
Korzenie, jako część ryzosfery2-5, reprezentują "niewidzialną" część biologii roślin, ponieważ gleba utrudnia nieinwazyjne obrazowanie korzeni 6, 7. Jednak badanie wzrostu korzeni i interakcji w środowisku glebowym ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia wzrostu korzeni/roślin i obiegu składników odżywczych, co z kolei wpływa na zalesianie, bezpieczeństwo żywnościowe i klimat. Rentgenowska tomografia komputerowa (XCT) okazała się cennym narzędziem do nieinwazyjnego obrazowania próbek korzeni roślin w ich lokalnym środowisku 8. Aby zmierzyć rozwój korzeni i zmiany wymiarowe w różnych warunkach oraz móc porównać dane z różnych zestawów danych/próbek, należy wyodrębnić informacje ilościowe z danych tomografii. Segmentacja danych korzeniowych od danych dotyczących otaczającej gleby, czyli odizolowanie obrazu korzenia od wszystkiego innego wokół niego (w tym, na przykład, sąsiedniej rośliny) jest krytycznym krokiem przed przeprowadzeniem dokładnej analizy rozmiaru. Jednak proste podejście do progowania jest często niewykonalne w przypadku danych głównych. Wyzwania związane z obrazowaniem korzeni roślin w glebie obejmują zmiany właściwości tłumienia promieniowania rentgenowskiego materiału korzeniowego oraz nakładanie się wartości tłumienia między korzeniem a glebą spowodowane przez wodę i materię organiczną. Kwestie te zostały ostatnio znakomicie poruszone przez Mairhofera i wsp. w swoim narzędziu do śledzenia wizualnego RooTrak 7, 9. Kolejnym krokiem po udanej segmentacji jest dokładne określenie objętości i powierzchni korzeni. Objętość można oszacować, licząc liczbę wokseli i mnożąc przez rozmiar wokseli w przekroju sześciennym, jak pokazano powyżej7. W celu dokładniejszego określenia powierzchni i objętości korzenia, izopowierzchnię segmentowanego systemu korzeniowego można przedstawić za pomocą siatki trójkątów, przy użyciu algorytmu znanego jako Kostki Marszowe 10. ImageJ11 o otwartym kodzie źródłowym może być wykorzystany do przybliżenia objętości głównej w oparciu o algorytm Marching Cubes. Zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, obecnie dostępna jest tylko ograniczona liczba oprogramowania typu open source dedykowanego do obliczania danych objętościowych/powierzchniowych na podstawie tomografii dla próbek korzeniowych w zakresie centymetrów i większym. Jedno z programów typu open source, którym się przyjrzeliśmy, koncentruje się na wzroście korzeni i jest ukierunkowane na funkcje komórkowe umożliwiające ilościową analizę objętości w rozdzielczości pojedynczej komórki. Niektóre programy typu open source dedykowane całym systemom korzeniowym14 są doskonałe dla rurkowatych systemów korzeniowych o małej średnicy, opierając się na przybliżeniu, że ich kształt jest w rzeczywistości rurkowaty. Jednak niektóre działają z obrazami 2D i nie są w stanie obsłużyć stosów 3D14. Ponadto przybliżenie kształtu rurowego może nie być ważne, gdy badane są systemy korzeniowe o szorstkich powierzchniach i niejednorodnych kształtach, takie jak systemy drzew. Inne podejście,15 wykorzystuje dwuwymiarowe (2D) obrotowe sekwencje obrazów, w innowacyjny sposób omijając potrzebę stosowania kosztownego tomografu komputerowego. Mierzy, rejestruje i wyświetla długości systemu korzeniowego. Oprogramowanie, które przetestowaliśmy, spośród tych dostępnych tylko na rynku16-18; jeden wydaje się nie być w stanie poradzić sobie ze stosami obrazów 3D16, drugi to narzędzie do pomiaru powierzchni liści i długości korzeni17, podczas gdy trzeci jest oparty na analizie kolorów18. Na podstawie tego badania sugerujemy, że pożądana jest bezkosztowa opcja, która przybliża powierzchnię i objętość korzenia niezależnie od jego kształtu na podstawie danych z tomografii 3D.
Opierając się na swobodnie dostępnych RooTrak i ImageJ, opracowaliśmy program o nazwie imeshJ (zobacz plik kodu uzupełniającego), który przetwarza siatkę izopowierzchniową (plik stereolitografii powierzchni) wygenerowaną z segmentowanych danych głównych i oblicza objętość i powierzchnię pierwiastka, wykonując proste obliczenia geometryczne na danych indeksu trójkąta siatki. W tym miejscu przedstawiamy metodę, która łączy w sobie wykorzystanie obrazowania XCT, rekonstrukcję i wizualizację danych (oprogramowanie CT Pro 3D i VG Studio), segmentację korzenia próbki z gleby w danych 3D (oprogramowanie open-source ImageJ i RooTrak) oraz ekstrakcję informacji o powierzchni i objętości z siatki trójkątnej (ImageJ i kod komputerowy imeshJ).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Przestroga: Obsługa skanera tomografii rentgenowskiej wymaga zarówno ogólnego szkolenia w zakresie promieniowania, jak i szkolenia w zakresie bezpieczeństwa radiacyjnego specyficznego dla danego instrumentu. Należy przestrzegać wszystkich odpowiednich procedur odnoszących się do laboratorium doświadczalnego.
1. Obrazowanie korzeni
Uwaga: W tym kroku opisano obrazowanie próbki trawy przechowywanej w pierwotnej glebie w rurowej plastikowej doniczce (plastikowa rurka o średnicy 40 mm, wysokości 210 mm i grubości ścianki około 2 mm).
- Umieść roślinę doniczkową na manipulatorze próbki instrumentu w odległości pożądanej dla docelowego powiększenia. W przypadku rośliny w uchwycie o średnicy 2 cali odległość próbki od źródła powinna wynosić około 3 cali (7 cm).
- Dostosuj ustawienia skanowania rentgenowskiego, aby uzyskać optymalny kontrast kolorów (poziom szarości) na obrazie detektora. Uwaga: Ustawienia te są dostępne w używanym oprogramowaniu sterującym przyrządem.
- Ustaw ustawienia mocy promieniowania rentgenowskiego; w tym przykładzie użyto 85 kV i 190 μA.
- Ustaw czas ekspozycji. W tym przypadku zastosowano stosunkowo długi czas naświetlania wynoszący 1 sekundę, aby uzyskać lepszy stosunek sygnału do szumu.
- Ustaw liczbę projekcji i klatek na projekcję; 4 klatki na projekcję, co daje w sumie 3 142 projekcje, jest sugerowane dla dobrych statystyk danych.
- Uruchom korekcję zacienienia, korzystając z warunków pomiaru określonych powyżej, wybierając zakładkę "Korekcja zacienienia" i klikając "Utwórz".
Uwaga: Korekcja cieniowania kompensuje zmiany w reakcji pikseli urządzenia do przetwarzania obrazu, gdy jest ono oświetlone stałym zestawem strumienia promieniowania rentgenowskiego. Proces wykonuje puste obrazy (z próbką usuniętą ze ścieżki wiązki) przy włączonej wiązce promieniowania rentgenowskiego i przy wyłączonej wiązce. Ta korekcja jest stosowana do wszystkich zebranych obrazów. - Wybierz opcję "Minimalizuj artefakty pierścieniowe" (nazywaną również "trybem wahadłowym"); próbka będzie obracana w krokach kątowych podczas pozyskiwania obrazów projekcyjnych. Prowadzi to do wolniejszego pozyskiwania danych, ale pomaga wyeliminować artefakty pierścieniowe.
- Rozpocznij skanowanie, klikając przycisk "Pobierz" w zakładce Akwizycja (przy ustawieniach opisanych powyżej, zbieranie obrazów zajmie około 4 godzin).
2. Rekonstrukcja danych
Uwaga: W tej sekcji opisano rekonstrukcję danych objętościowych 3D z surowych obrazów (zdjęcia rentgenowskie z tomografii komputerowej).
- Załaduj nieprzetworzone dane do programu.
- Porównaj pierwszy i ostatni obraz (powinny być prawie identyczne, ponieważ ostatni obraz jest wykonywany po obróceniu próbki o 360stopni), aby upewnić się, że próbka się nie poruszyła lub ustawienia skanowania nie zmieniły się podczas pozyskiwania danych.
- Oblicz środek obrotu (COR), wybierając zakładkę "Środek obrotu" i klikając "Start"; użyj opcji "Automatyczne" znajdowanie COR z dokładnością "Wysokiej jakości" oraz "Podwójny" wybór plasterka (górny i dolny) do obliczenia COR.
- Wybierz objętość próbki do zrekonstruowania: wybierz zakładkę "Objętość" i edytuj okna wyboru objętości za pomocą miniatur.
- Wykonaj rekonstrukcję, aby utworzyć plik woluminu zawierający dane 3D, klikając "Start".
3. Przetwarzanie danych / Segmentacja
Uwaga: W tej sekcji opisano kroki, które należy podjąć, aby przygotować zrekonstruowane dane do dalszego przetwarzania w programie RooTrak w celu śledzenia korzeni, gdy rozgałęziają się w glebie, i odizolowania korzeni od otaczającego materiału w celu wytworzenia stosu obrazów binarnych samego korzenia.
- Przetwarzanie danych objętościowych w ImageJ w celu przygotowania stosu obrazów do przetwarzania RooTrak:
- Załaduj plik woluminu do ImageJ.
- Zoptymalizuj kontrast obrazu między korzeniem a glebą, dostosowując ustawienia jasności i kontrastu (Kliknij Obraz/Dostosuj/Jasność/Kontrast). Gdy obszar zainteresowania na obrazie jest widoczny i wyraźnie odróżnialny, ustawienia są uważane za zoptymalizowane.
- Zapisz jako stos obrazów w formacie jpeg, bmp lub png.
- Przetwarzanie w RooTrak w celu segmentacji korzenia:
- Załaduj stos obrazów do RooTrak (przejdź do zakładki "Narzędzia" i naciśnij "Tracker").
- Ustaw punkty początkowe wewnątrz katalogu głównego: kliknij kilka punktów wewnątrz każdej z odpowiednich sekcji głównych widocznych w górnym przekroju widoku danych woluminu.
- Ustaw parametry trackera "Gładkość" i "Podobieństwo" odpowiednio na 0,3 i 0,8.
- Uruchom funkcję śledzenia. Spowoduje to podążanie za korzeniem od górnego wycinka obrazu aż do dolnego wycinka.
- Po wyświetleniu danych objętościowych wybierz liczbę wycinków zgodnie z użyteczną objętością danych; w tym przypadku śledzenie zostało zatrzymane na 200 warstwach, co odpowiada głębokości 6,2 mm, gdzie granice korzeni stały się źle zdefiniowane (obraz śledzonego korzenia zaczął zlewać się z obrazem gleby).
Uwaga: Utworzony stos obrazów zostanie automatycznie zapisany w miejscu, w którym został utworzony katalog wyjściowy .
4. Analiza objętości i powierzchni
Uwaga: W tym kroku opisano generowanie siatki izopowierzchni ze stosu obrazów utworzonego przez RooTrak.
- Konwertuj stos obrazów z RooTrak na binarny format obrazu w ImageJ. Wybierz "Proces", następnie "Binarny", a następnie "Utwórz binarny".
- Użyj wtyczki ImageJ o otwartym kodzie źródłowym, BoneJ, aby utworzyć trójkątną siatkę; w ImageJ wybierz "Wtyczki", następnie "BoneJ", a następnie "Isosurface".
- Ustaw "Ponowne próbkowanie" i "Próg" odpowiednio na 6 i 120 (ustawienia domyślne). Zaznacz "Pokaż powierzchnię" i naciśnij przycisk "OK".
- W przeglądarce "3D" kliknij zakładkę Plik, następnie "Eksportuj powierzchnie", a następnie zapisz jako "STL (binarny)".
- Otwórz imeshJ, wybierz plik STL i wprowadź rozmiar woksela w mikronach. Kliknij "Oblicz pole powierzchni", aby uzyskać całkowitą powierzchnię korzenia próbki w mm2. Podobnie kliknij "Oblicz objętość", aby uzyskać całkowitą objętość pierwiastka próbki w mm3.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Próbka składająca się z dwóch pędów rodzimej trawy Sporobolus heterolepis (Sporobolus heterolepis) oraz oryginalnej gleby wokół niej została pobrana z obszaru mieszkalnego i umieszczona w niewielkim uchwycie w kształcie rurki, przedstawionym na Rysunku 1. Rekonstruowany rozmiar woksela danych wynosił około 31 µm x 31 µm x 31 µm. Plik zrekonstruowanej objętości posłużył do stworzenia stosu obrazów z wybranego ułożenia (widok z góry) przy użyciu otwartoźródłowego p...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Połączenie rentgenowskiej tomografii komputerowej i kilku programów typu open source okazało się potężną kombinacją do nieinwazyjnego obrazowania próbek korzeni roślin, segmentowania danych korzeniowych i wyodrębniania informacji ilościowych (powierzchni i objętości) z danych 3D. Nasza zdolność do wizualizacji i pomiaru cech jest zawsze ograniczona rozdzielczością skanowania, a także ograniczeniami oprogramowania RooTrak. Jednak rozdzielczość skanowania była wystarczająca, aby uchwycić większość cech próbki w tym badaniu...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie mamy nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca została wykonana w Laboratorium Nauk Molekularnych Środowiska, krajowym ośrodku naukowym sponsorowanym przez Biuro Badań Biologicznych i Środowiskowych Departamentu Energii i zlokalizowanym w Pacific Northwest National Laboratory.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| X-Tek/Metris XTH 320/225 kV | Skaner tomografii rentgenowskiej | firmy Nikon Metrology | |
| Inspect X | Nikon Metrology | Oprogramowanie sterujące przyrządami | |
| CT Pro 3D | metrologii | , wersja XT 2.2 | |
| VG Studio MAX | Visual Graphics GmbH | Oprogramowanie do wizualizacji objętości 3D, wersja 2.1.5 | |
| ImageJ | Open-source | Oprogramowanie do przetwarzania i analizy obrazu, wersja 1.6 | |
| RooTrak | Open-source | Oprogramowanie do segmentacji rootów, wersja 0.3.1-b1 beta | |
| imeshJ | EMSL | MATLAB skrypt opracowany przez autorów | |
| Próbka | z gruntu w obszarze mieszkalnym |
Bibliografia
- MATLAB. , The Mathworks, Inc. Available from: http://www.mathworks.com/products/matlab (2015).
- McKenzie, B. M. The Rhizosphere: An Ecological Perspective. Eur. J. Soil Sci. 59 (2), 416-417 (2008).
- Farrar, J., Hawes, M., Jones, D., Lindow, S. How roots control the flux of carbon to the rhizosphere. Ecology. 84 (4), 827-837 (2003).
- Gregory, P. J. Roots rhizosphere and soil: the route to a better understanding of soil science? Eur. J. Soil Sci. 57 (1), 2-12 (2006).
- Philippot, L., Raaijmakers, J. M., Lemanceau, P., van der Putten, W. H. Going back to the roots: the microbial ecology of the rhizosphere. Nat. Rev. Microbiol. 11 (11), 789-799 (2013).
- Gregory, P. J., Hutchison, D. J., Read, D. B., Jenneson, P. M., Gilboy, W. B., Morton, E. J. Non-invasive imaging of roots with high resolution X-ray micro-tomography. Plant and Soil. 255 (1), 351-359 (2003).
- Mairhofer, S., et al. RooTrak: Automated Recovery of Three-Dimensional Plant Root Architecture in Soil from X-Ray Microcomputed Tomography Images Using Visual Tracking. Plant Physiol. 158 (2), 561-569 (2012).
- Soil-Water-Root Processes: Advances in Tomography and Imaging. Anderson, S. H., Hopmans, J. W. , Soil Science Society of America. United States. (2013).
- Mairhofer, S., et al. Recovering complete plant root system architectures from soil via X-ray mu-Computed Tomography. Plant Methods. 9, 8(2013).
- Lorensen, W. E., Cline, H. E. Marching cubes: a high resolution 3D surface construction algorithm. Comput. Graph. 21 (4), 163-169 (1987).
- ImageJ: Image Processing and Analysis in Java. , Available from: http://imagej.nih.gov/ij (2014).
- Lobet, G., Draye, X., Perilleux, C. An online database for plant image analysis software tools. Plant Methods. 9 (38), (2013).
- Schmidt, T., et al. The iRoCS Toolbox - 3D analysis of the plant root apical meristem at cellular resolution. Plant J. 77 (5), 806-814 (2014).
- Galkovskyi, T., et al. GiA Roots: software for the high throughput analysis of plant root system architecture. BMC Plant Biol. 12, 116(2012).
- Clark, R., et al. 3-Dimensional Root Phenotyping with a Novel Imaging and Software Platform. Plant Physiol. 156, 455-465 (2011).
- RootSnap!. , CID Bio-Science. Available from: https://www.cid-inc.com (2013).
- Skye Leaf Area and Analysis Systems and Root Length Measurement System. , Skye Instruments Limited. Available from: http://www.skyeinstruments.com/products/plant-analysis-systems/leaf-arearoot-length-systems (2014).
- Arsenault, J. L., Pouleur, S., Messier, C., Guay, R. WinRHIZO™ a root-measuring system with a unique overlap correction method. HortSci. 30, 906-906 (1995).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
