Uproszczona metoda długoterminowej hodowli pierwotnych neuronów hipokampa o bardzo niskiej gęstości

Summary

Kultury o niskiej gęstości pierwotnych neuronów hipokampa zazwyczaj wymagają warstwy zasilającej glej, aby dostarczyć czynników neurotroficznych i utrzymać długowieczność. Opisujemy tutaj uproszczoną metodę hodowli neuronów o ultra niskiej gęstości na szklanych szkiełkach nakrywkowych w obecności warstwy zasilającej neurony o dużej gęstości, co ułatwia badanie specyficznych mechanizmów neuronalno-autonomicznych.

Abstract

Hodowla pierwotnych neuronów hipokampa in vitro ułatwia mechanistyczne badanie wielu aspektów rozwoju neuronów. Zdysocjowane embrionalne neurony hipokampa mogą często z powodzeniem rosnąć na szklanych szkiełkach nakrywkowych o dużej gęstości w warunkach wolnych od surowicy, ale kultury o niskiej gęstości zazwyczaj wymagają dostarczania czynników troficznych poprzez kokulturę ich z warstwą zasilającą glej, której przygotowanie może być czasochłonne i pracochłonne. Ponadto obecność gleju może zakłócić interpretację wyników i wykluczyć badania nad mechanizmami specyficznymi dla neuronów. W tym miejscu przedstawiono uproszczoną metodę dla długoterminowej (~2000 neuronów/cm 2) pierwotnej hodowli neuronów hipokampa o bardzo niskiej gęstości >(~2000 neuronów/^cm2), która odbywa się w warunkach wolnych od surowicy i bez wsparcia komórek glejowych. Neurony o niskiej gęstości są hodowane na szkiełkach nakrywkowych pokrytych poli-D-lizyną i przenoszone na neurony o dużej gęstości hodowane na 24-dołkowej płytce. Zamiast używać kropek parafinowych do tworzenia przestrzeni między dwiema warstwami neuronów, eksperymentatorzy mogą po prostu wytrawić plastikowe dno studzienki, na którym znajdują się neurony o dużej gęstości, aby stworzyć mikroprzestrzeń sprzyjającą wzrostowi neuronów o niskiej gęstości. Kokultura może być łatwo utrzymana przez >3 miesiące bez znaczącej utraty neuronów o niskiej gęstości, ułatwiając w ten sposób morfologiczne i fizjologiczne badanie tych neuronów. Aby zilustrować ten udany warunek hodowli, przedstawiono dane wskazujące na obfite tworzenie synaps w komórkach o niskiej gęstości po długotrwałej hodowli. Ten system kokultur ułatwia również przetrwanie nielicznych pojedynczych neuronów hodowanych w wyspach substratów poli-D-lizyny, a tym samym tworzenie połączeń autaptycznych.

Introduction

Hodowla neuronów hipokampa w warunkach in vitro umożliwia obserwację i eksperymentalne manipulowanie tymi neuronami, które w inny sposób nie są możliwe in vivo. To eksperymentalne podejście jest szeroko stosowane w celu ujawnienia neuronalnych mechanizmów wzrostu, polaryzacji, specyfikacji neurytów, transportu i subkomórkowej lokalizacji białek, tworzenia synaps i dojrzewania funkcjonalnego¹. Te neurony hipokampa hodowane in vitro, po pobraniu z późnych stadiów embrionalnych, są stosunkowo czystymi (>90%) komórkami glutaminergicznymi o morfologii piramidalnej². Ponieważ neurony hodowano na powierzchni 2D w warunkach in vitro, metoda ta umożliwia łatwą obserwację, taką jak obrazowanie na żywo lub barwienie immunocytochemiczne (ICC) przez pojedynczą płaszczyznę ogniskową³; lub manipulacje, takie jak leczenie farmakologiczne i transfekcje^3-6. Neurony hodowane w dużej gęstości mają zwykle wysokie wskaźniki przeżycia ze względu na wyższe stężenia wydzielanych czynników wzrostu oprócz wsparcia pokarmowego ze strony pożywki wzrostowej, a także ze względu na mechanizmy zależne od kontaktu neurytów⁷. Jednak neurony hipokampa o niskiej gęstości są pożądane w badaniach morfologicznych, w których pojedynczy neuron może być zobrazowany w całości lub wybarwiony do analizy ICC. Neurony o niskiej gęstości są trudne do utrzymania w hodowli ze względu na brak podparcia parakrynnego, a zatem często wymagają wsparcia troficznego z warstwy zasilającej glejowe (zwykle astrocyty korowe), która musi być przygotowana przed hodowlą neuronów². Podczas jednoczesnej hodowli z warstwą zasilającą komórki glejowe, neurony o niskiej gęstości są hodowane na szkiełkach nakrywkowych, a następnie odwracane na warstwę gleju tak, że neurony o niskiej gęstości i glej są zwrócone do siebie. Niewielka ograniczona przestrzeń między glejem a neuronami jest tworzona przez umieszczenie kropek wosku parafinowego na rogach szkiełek nakrywkowych, tworząc w ten sposób układ "kanapkowy"^2,8,9. Neurony o niskiej gęstości będą rosły w ograniczonej przestrzeni między glejem a szkiełkiem nakrywkowym, co tworzy permisywne mikrośrodowisko ze skoncentrowanymi czynnikami wydzielanymi przez neurony i glej. Takie podejście pozwala uzyskać w pełni rozwinięte neurony o niskiej gęstości, które są rozsądnie oddalone od siebie, co ułatwia znakowanie ICC lub badania obrazowania na żywo.

Oczywistą wadą koterapii neuronów i glejów, oprócz tego, że jest czasochłonna i pracochłonna, jest to, że uniemożliwia ona badanie mechanizmów specyficznych dla neuronów lub autonomicznych komórek. Chociaż system ten jest znacznie mniej złożony niż tkanka nerwowa in vivo, wpływ gleju na rozwój neuronów poprzez wydzielane, jeszcze nie w pełni zdefiniowane czynniki może zakłócić eksperymenty¹⁰. Dlatego w eksperymentach, które wymagają zbadania mechanizmów specyficznych dla neuronów, konieczne są określone warunki hodowli, które usuwają surowicę i warstwę nośną gleju. Poprzednie badanie zakończyło się sukcesem w hodowli niskich stężeń neuronów (~9 000 komórek/cm²) przy użyciu trójwymiarowej matrycy hydrożelowej¹¹. Ponieważ stosunkowo czysta populacja neuronów może być hodowana w dużej gęstości w warunkach wolnych od surowicy bez wsparcia glejowego, stawiamy hipotezę, że ultra-niska gęstość neuronów hipokampa może być hodowana w pożywce hodowlanej wolnej od surowicy poprzez kokulturę z neuronami o dużej gęstości, w sposób analogiczny do konwencjonalnie przyjętej kokultury neuron-glej. Rzeczywiście, hodowle neuronów hipokampa o dużej gęstości w konfiguracji "kanapkowej" zostały ostatnio wykorzystane do wspierania niewielkiej liczby wyspecjalizowanych magnokomórkowych neuronów endokrynnych¹².

Dlatego też współkultura z neuronami o dużej gęstości może pozwolić neuronom o niskiej gęstości na otrzymywanie wsparcia czynników troficznych, które jest wystarczające do umożliwienia długoterminowego przetrwania. W ten sposób sformułowano i zatwierdzono ten protokół hodowli neuronów o bardzo niskiej gęstości. Protokół można wdrożyć w ramach jednego eksperymentu, najpierw przygotowując zdysocjowane neurony hipokampa o dużej gęstości (~250 000 komórek/ml), a następnie rozcieńczając w celu uzyskania gęstości ~10 000 neuronów/ml (~3000 neuronów/szkiełko nakrywkowe lub ~2000 neuronów/cm²), która jest znacznie niższa niż w większości zgłoszonych kultur o niskiej gęstości^2,3,9,11,13. Ten warunek hodowli jest luźno określany jako kultura "o bardzo niskiej gęstości" i używany zamiennie z "niską gęstością". Neurony o dużej gęstości są posiane na 24-dołkowych płytkach pokrytych poli-D-lizyną; podczas gdy neurony o niskiej gęstości są wysiewane na 12-milimetrowych szklanych szkiełkach nakrywkowych pokrytych poli-D-lizyną, które umieszcza się w innej 24-dołkowej płytce. Szkiełka nakrywkowe z przylegającymi neuronami o niskiej gęstości są odwracane na neurony o dużej gęstości 2 godziny później po zejściu neuronów i przymocowaniu do szkiełek nakrywkowych. Ponadto, zamiast używać kropek wosku parafinowego do podniesienia szkiełek nakrywkowych ponad warstwę neuronów o dużej gęstości, użyto igły strzykawkowej o strzykawce 18 G do wytrawienia dna 24-dołkowych płytek za pomocą dwóch równoległych pasków. Powstałe w ten sposób przemieszczone, przylegające do siebie tworzywa sztuczne stanowią podwyższone podparcie dla szklanych szkiełek nakrywkowych. Przestrzeń ta jest konsekwentnie mierzona na poziomie 150-200 μm, co pozwala na wystarczającą wymianę tlenu i pożywki hodowlanej, zapewniając jednocześnie mikrośrodowisko ze skoncentrowanymi czynnikami troficznymi. W tych warunkach neurony o niskiej gęstości rosną intensywnie i mogą przetrwać w hodowli dłużej niż trzy miesiące. Kiedy te neurony są transfekowane plazmidem GFP po trzech tygodniach hodowli, dendryty są obficie nabijane kolcami dendrytycznymi. Jako dowód zasadniczy przedstawiono dane pokazujące, że ten system kokultur obsługuje kultury neuronów hipokampa o bardzo niskiej gęstości osadzonych na "mikrowyspach" poli-D-lizyny, gdzie neurony tworzą połączenia autaptyczne, które mogą ułatwić badanie autonomicznych komórkowych, niezależnych od sieci mechanizmów.

Protocol

Wszystkie procedury eksperymentalne z udziałem myszy zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Arizony i były zgodne z wytycznymi NIH.

1. Źródło tkanki do hodowli neuronów hipokampa

1. Aby wygenerować prenatalne młode myszy do hodowli neuronów hipokampa, użyj myszy w ciąży (C57Bl6 / J), które są hodowane w domu¹⁷. Dzień, w którym wykryto czop dopochwowy, jest oznaczony jako E0,5. Planowany czas zbiorów dla upraw to E16.5-E17.5.
   Uwaga: Protokół ten opisuje hodowle dwóch 24-dołkowych płytek dwóch neuronów o wysokiej gęstości współhodowanych z neuronami o niskiej gęstości (łącznie 48 szkiełek nakrywkowych). Aby uzyskać więcej płytek, materiały i odczynniki można odpowiednio skalować.

2. Przygotowanie płytek 24-dołkowych do hodowli neuronów o dużej gęstości

Uwaga: Wykonaj następujące kroki (2-3) dzień przed planowanym pobraniem zarodków.

1. Włożyć dwie 24-dołkowe płytki do kaptura do hodowli komórkowych, otworzyć opakowanie indywidualne.
2. Połączyć igłę ze strzykawką 18 G z plastikową strzykawką jednorazowego użytku o pojemności 1 ml.
3. Trzymać strzykawkę i skierować końcówkę igły na ~1 mm w lewo do środka dna studzienki. Zastosuj umiarkowaną siłę (~250 g), aby wytrawić dno studzienki (o długości ~1 mm). Zostanie utworzony rowek, a przemieszczone tworzywa sztuczne utworzą podwyższoną podporę nad powierzchnią studni z płaskim dnem. W podobny sposób wytrawić kolejny równoległy rowek o długości ~1 mm na prawo od środka dna.
4. Powtórz ten krok dla wszystkich dołków dwóch 24-dołkowych płytek. Dwie 24-dołkowe płytki używane do hodowli o wysokiej gęstości są teraz gotowe do pokrycia poli-D-lizyną (patrz krok 3.8 poniżej).

3. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych do hodowli neuronów o niskiej gęstości

1. Użyj okrągłego szkła o średnicy 12 mm #1.
2. Umieść 50 szkiełek nakrywkowych w sterylnej plastikowej szalce Petriego o średnicy 100 mm i zanurz szkiełka nakrywkowe w 20 ml 70% roztworu etanolu. Umieść tę szalkę Petriego na obrotowej platformie z umiarkowaną (70 obr./min) prędkością obrotową na godzinę. Usuń 70% etanolu, a następnie zastąp świeżą partią 70% etanolu. Obróć i pierz przez kolejną godzinę.
3. Wyrzuć 70% etanolowy roztwór czyszczący. Dodaj sterylną wodę (przefiltrowaną przez jednostkę filtrującą 0,2 μm). Dokładnie opłucz szkiełka nakrywkowe, obracając ręcznie szalkę Petriego. Spłucz trzy razy, za każdym razem zastępując świeżą sterylną wodą.
4. Umieść szalkę Petriego ze szkiełkami nakrywkowymi w sterylnym kapturze do hodowli komórkowych z przepływem laminarnym. Zassać wodę płuczącą przez przewód próżniowy i dodać 10 ml przefiltrowanej sterylnej wody, aby zanurzyć szkiełka nakrywkowe. Szkiełka nakrywkowe powinny być sterylne, a powierzchnia powinna być wystarczająco czysta, aby można było ją pokryć poli-D-lizyną.
5. Otwórz dwie 24-dołkowe płytki z ich indywidualnego opakowania i umieść je w kapturze.
6. Włącz przewód podciśnieniowy w okapie. Podłącz końcówkę do pipety o pojemności 200 μl do przewodu podciśnieniowego i użyj nożyczek, aby przeciąć końcówkę, aby utworzyć większy otwór.
7. Użyj pęsety #5 z cienką końcówką, aby zebrać szkiełka nakrywkowe z szalki Petriego, pojedynczo, i użyj linii próżniowej, aby całkowicie wysuszyć szkiełko nakrywkowe. Następnie umieść po jednym szkiełku nakrywkowym w każdym z dołków 24-dołkowej płytki. 50 oczyszczonych szkiełek nakrywkowych powinno wystarczyć do wypełnienia każdej z dołków dwóch płytek 24-dołkowych.
8. Rozcieńczyć roztwór podstawowy poli-D-lizyny (1 mg/ml) w roztworze roboczym (0,1 mg/ml) buforem boranowym (pH 8,5). Dla czterech płytek 24-dołkowych (w tym dwóch płytek o dużej gęstości z wytrawionym dnem) należy przygotować 30 ml całkowitego roztworu roboczego.
9. Dodać 300 μl 0,1 mg/ml roztworu roboczego poli-D-lizyny do każdej studzienki ze szklanymi szkiełkami nakrywkowymi. Upewnij się, że szkiełka nakrywkowe są całkowicie zanurzone w roztworze. Jeśli nie, użyj końcówki pęsety #5, aby docisnąć szkiełka nakrywkowe do dna studzienki i użyj końcówki do prowadzenia roztworu poli-D-lizyny, aby pokryć całą powierzchnię szkiełek nakrywkowych. Sprawdź wzrokowo wszystkie szkiełka nakrywkowe, aby upewnić się, że między płytką a szkiełkami nakrywkowymi nie zostało uwięzione powietrze.
10. Dodać 300 μl 0,1 mg/ml roztworu roboczego poli-D-lizyny do każdego dołka płytki hodowlanej o wysokiej gęstości z wytrawionym dnem. Obróć ręcznie, aby rozprowadzić roztwór, aby pokryć całe dno studzienki.
11. Umieścić wszystkie cztery płytki z poli-D-lizyną z powrotem w inkubatorze hodowli i inkubować O/N.

4. Mycie i wstępne kondycjonowanie płyt dla kultury

Uwaga: Następujące kroki (4-9) są wykonywane w dniu pobrania tkanki.

1. Po inkubacji/pokryciu szkiełkami nakrywkowymi i 24-dołkowymi płytkami O/N, wprowadzić wszystkie cztery płytki (dwie z szkiełkami nakrywkowymi dawcy, dwie akceptorowe płytki o wysokiej gęstości z wytrawionym plastikowym dnem) do kaptura hodowlanego. Użyj przewodu próżniowego, aby usunąć roztwór poli-D-lizyny.
2. Natychmiast po usunięciu roztworu poli-D-lizyny dodać ~1 ml sterylnej wody do każdej studzienki za pomocą plastikowej pipety transferowej. Po napełnieniu wszystkich studni wodą odstaw na 10 minut. Usunąć wodę za pomocą próżni, a następnie dodać 300 μl pożywki myjącej do każdej studzienki, aby przykryć dno studzienki (ze szklanymi szkiełkami nakrywkowymi lub bez). Nie dopuścić do wyschnięcia powłoki poli-D-lizyny.
3. Umieścić wszystkie cztery płytki z powrotem w inkubatorze komórkowym. Płytki są gotowe do użycia po przygotowaniu rozproszonych neuronów hipokampa.

5. Przygotowanie kompletnej pożywki hodowlanej i roztworu trypsyny do trawienia enzymatycznego

1. Przygotować 60 ml kompletnej pożywki hodowlanej, mieszając składniki (patrz Materiały). Za pomocą strzykawki o pojemności 50 ml połączonej z filtrem strzykawkowym o porach 0,2 μm przefiltrować pożywkę Complete Culture do dwóch stożkowych probówek o pojemności 50 ml. Każda probówka zawiera 30 ml kompletnej pożywki do hodowli.
2. Do oddzielnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml dodać ~30 ml pożywki myjącej (patrz Materiały) i podgrzać ją do temperatury 37 °C. Zostanie to wykorzystane do przemycia tkanki po trawieniu enzymatycznym.
3. Przygotować pożywkę do trawienia enzymatycznego. W stożkowej probówce o pojemności 15 ml dodaj 4,5 ml pożywki myjącej i 0,5 ml 2,5% roztworu trypsyny oraz 50 μl 100X DNazy I.
4. Umieścić kompletną pożywkę hodowlaną, pożywkę płuczącą i pożywkę do mineralizacji enzymatycznej w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.

6. Przygotowanie narzędzi chirurgicznych

1. Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne w woreczku do sterylizacji: dwie małe nożyczki, parę kleszczy i dwie pęsety #5.

7. Usunięcie mózgów z embrionów myszy E16.5-E17.5 i sekcja hipokampów

1. Przygotuj dwie 10-centymetrowe szalki Petriego wypełnione lodowatym, sterylnym zrównoważonym roztworem soli Hanka (HBSS).
2. Poddać matkę myszy eutanazji za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia fenobarbitalu sodu (100 mg/kg w objętości ~ 0,5 ml). Po wstrzyknięciu, gdy tama straci odpowiedź na uszczypnięcie palca, ofiara ze zwichnięciem szyjki macicy.
3. Spryskaj okolice brzucha koniczy 70% etanolem i wykonaj 2-centymetrowe nacięcie wzdłuż linii środkowej brzucha, aby odsłonić macicę.
4. Usuń zarodki i umieść pojedyncze na szalce Petriego o średnicy 10 cm z zimnym buforem HBSS do preparowania.
5. Przytrzymaj zarodek za szyję za pomocą kleszczy i użyj małych nożyczek, aby wykonać pierwsze cięcie w linii środkowej poniżej poziomu móżdżku i przeciąć tkankę mózgową. Nie odcinaj głowy zarodkowi.
   1. Włóż prawą boczną końcówkę małego nożyczki z okolicy ogona, która jest rozcięta, aż do rostralnej części mózgu embrionalnego (nie przekraczaj linii środkowej) i wykonaj nacięcie po lewej stronie na poziomie podstawy czaszki.
   2. Włóż ponownie końcówkę nożyczek po lewej stronie, aby wykonać cięcie po prawej stronie. Pozostaw wąski pas nieprzeciętej kości czaszki i tkanki skórnej na końcu rostralnym, tak aby cały mózg można było odwrócić na bok w celu łatwej ekstrakcji.
   3. Użyj końcówki nożyczek, aby zgarnąć embrionalny mózg do roztworu HBSS. Zbadaj mózg pod mikroskopem preparacyjnym. Mózg powinien być nienaruszony, bez grubych obszarów odcięcia.
   4. Powtórz te kroki, aby zebrać wszystkie zarodki mózgu.
6. Zebrać wszystkie nienaruszone mózgi na nowej szalce Petriego zawierającej 20 ml zimnego buforu HBSS. Umieść szalkę Petriego pod mikroskopem preparacyjnym
.
7. Zobacz mózg od strony brzusznej. Przytrzymując mózg kleszczami na końcu ogonowym, włóż ostrą pęsetę #5 po przekątnej, aby wykonać cięcie między środkowym punktem rostralnym a obszarem ogonowo-skroniowym. Powtórz to dla drugiej półkuli. Po przecięciu oddziel dwie półkule z nienaruszonym hipokampem od reszty tkanek pnia mózgu.
   1. Powtórz to dla każdego z mózgów.
8. Zbierz wszystkie wypreparowane półkule i usuń opony mózgowe za pomocą dwóch par pęsety #5.
9. Zidentyfikuj rozwijający się hipokamp jako zakrzywioną strukturę, która jest złożona wewnątrz płata skroniowego. Naprzemiennie dwie pary pęsety, aby oddzielić hipokamp od sąsiednich tkanek korowych. Zbierz i zgromadź całą tkankę hipokampa (patrz ryc. 1).

8. Trawienie enzymatyczne, rozdzielone na pojedyncze neurony

1. Za pomocą plastikowej pipety transferowej przenieś wszystkie wypreparowane hipokampy do roztworu do trawienia enzymatycznego zawierającego 5 ml pożywki do przemywania z 0,25% trypsyną + 1X DNazy I w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
2. Umieścić probówkę w łaźni wodnej i inkubować w temperaturze 37 °C przez 25 minut, z przerywanym delikatnym odwracaniem probówki raz na 5 minut.
3. Po 25 minutach ostrożnie usunąć roztwór enzymu za pomocą ręcznej pipety z tworzywa sztucznego przez aspirację. Dodaj ciepły Wash medium do 10 ml i delikatnie umyj chusteczkę, powoli odwracając probówkę 5 razy. Usuń medium do mycia i ponownie dodaj 10 ml medium do mycia w celu dodatkowego umycia.
4. Usuń medium myjące i ponownie dodaj 3 ml świeżego, ciepłego medium do mycia. Potrząśnij rurką ręcznie rygorystycznie 15 razy, aby usunąć strawione neurony z tkanki. Pożywka powinna stać się mętna po oddzieleniu komórek od tkanki do pożywki myjącej. Zebrać zawiesinę komórek do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml, pozostawiając pozostałą tkankę w probówce.
5. Dodaj kolejne 2 ml pożywki do płukania do chusteczki i delikatnie oddziel pozostałą tkankę, przecierając ją plastikową pipetą ~15 razy. Odstaw na 5 minut. Umieścić zawiesinę komórek w nowej stożkowej probówce o pojemności 15 ml, która zawiera zebrane komórki "strząśnięte".
6. Policz gęstość neuronów za pomocą hemocytometru. Zazwyczaj można uzyskać 3 000-5 000 komórek na mikrolitr w zależności od liczby wypreparowanych zarodków. Średnią liczbę neuronów 2,5 x 10⁷ szacuje się, jeśli założymy, że wypreparowanych zostanie sześć zarodków.
7. Oblicz objętość potrzebną do uzyskania gęstości 250 000 neuronów/ml po dodaniu do 30 ml pożywki Complete Culture. Dodać tę objętość do jednej z dwóch stożkowych probówek zawierających 30 ml pożywki Complete Culture, aby uzyskać pożywkę do posiewu neuronów o dużej gęstości.
8. Przenieś 1,2 ml tego roztworu neuronów o wysokiej gęstości do innego 30 ml pożywki Complete Culture, aby uzyskać stężenie ~10 000 neuronów/ml. Użyj tego rozcieńczenia do wysiewu szkiełek nakrywkowych o niskiej gęstości.

9. Poszycie neuronów i długotrwała współkultura

1. Umieść dwie 24-dołkowe płytki z wytrawionym dnem dla neuronów o dużej gęstości do kaptura hodowli komórkowej. Usunąć 300 μl pożywki kondycjonującej za pomocą próżni. Płytka 0,6 ml zawiesiny komórek o dużej gęstości przy 250 000 neuronów/ml.
2. Wprowadzić pozostałe dwie 24-dołkowe płytki ze szkiełkami nakrywkowymi do okapu hodowlanego i usunąć 300 μl pożywki kondycjonującej za pomocą próżni. Płytka 0,6 ml zawiesiny komórek o niskiej gęstości w stężeniu 10 000 neuronów/ml na szkiełkach nakrywkowych wewnątrz dwóch 24-dołkowych płytek.
3. Umieścić wszystkie cztery płytki 24-dołkowe z powrotem w inkubatorze. Odstawić na 2 godziny.
4. Odwróć szkiełka nakrywkowe o niskiej gęstości z przylegającymi neuronami do kultury o wysokiej gęstości. Upewnij się, że neurony są zwrócone do siebie (tj. nie są oddzielone szklanym szkiełkiem nakrywkowym). Następnie zwróć dwie płytki z kokulturą do inkubatora.

10. Podtrzymywanie współkultury

1. Podawać kokultury paszowe, dodając 300 μl świeżej pożywki paszowej (patrz Materiały) w ciągu dnia in vitro (DIV) 5. Nie ma potrzeby usuwania 50% oryginalnej pożywki Complete Culture, jak wynika z wielu innych badań. Pożywka zawiera również 15 μM arabinozydu cytozyny (Ara-C, aby uzyskać końcowe stężenie 5 μM), aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia i namnażania się gleju.
2. Po tym wstępnym karmieniu co tydzień dodawaj do studzienki 300 μl świeżej pożywki bez Ara-C. Jeśli kultura jest przechowywana dłużej niż jeden miesiąc, należy zastąpić połowę pożywki świeżą pożywką co tydzień po upływie jednego miesiąca (z pierwszą połową wymianą pożywki przy DIV33). Morfologicznie zarówno neurony o wysokiej, jak i niskiej gęstości wyglądają zdrowo do trzech miesięcy (najdłuższy czas zaobserwowany przez eksperymentatorów).

11. Ilustracja eksperymentalnej manipulacji - transfekcja neuronów o niskiej gęstości

Uwaga: Gdy pożądana jest transfekcja w neuronach o niskiej gęstości, można zastosować prosty protokół fosforanu wapnia. Odkryliśmy, że kultury o niskiej gęstości mają lepszą wydajność transfekcji z protokołem fosforanu wapnia przed DIV12, ale mogą być transfekowane ze znacznie niższą wydajnością przy DIV21 lub starszych, w którym to czasie widoczne są kolce dendrytyczne. Wykonalność transfekcji hodowanego neuronu o niskiej gęstości ilustruje transfekcja neuronów plazmidem pEGFP-C3 (patrz poniżej).

1. W DIV21 usunąć 600 μl kondycjonowanej pożywki z każdej studzienki kokultury i przenieść ją na nową 24-dołkową płytkę. Następnie dodaj 600 μl świeżej pożywki paszowej do kokultury, aby przywrócić jej pierwotną objętość.
   1. Przenieść szkiełka nakrywkowe do nowej 24-dołkowej płytki z kondycjonowanym 600 μl pożywki. Upewnij się, że neurony o niskiej gęstości są skierowane do góry. Umieść płytki o dużej gęstości i nowe płytki z szkiełkami nakrywkowymi z powrotem w inkubatorze.
2. Przygotuj dwie sterylne probówki o pojemności 1,5 ml. W jednej probówce dodaj 600 μl 2X buforowanego roztworu soli fizjologicznej (HBS) HEPES. Obliczyć objętość 12 μg DNA pEGFP-C3 na podstawie stężenia plazmidu. Do drugiej probówki dodać 74 μl CaCl₂ (2 M zapasu) i objętość wody, która po dodaniu plazmidu wyniesie 600 μl. Dobrze wymieszaj przez pipetowanie, a następnie dodaj plazmidowe DNA. Powoli dobrze wymieszaj. Pozostaw obie rurki na 5 minut w temperaturze RT.
3. Trzymając w ręku probówkę 2X HBS i umiarkowanie mieszając roztwór na mieszalniku, dodaj całość 600 μl roztworu DNA-CaCl₂ kropla po kropli do probówki 2X HBS o pojemności 600 μl. Bardzo ważne jest, aby powstały osad miał postać "drobnych granulek piasku". Zbyt mocne i zbyt szybkie mieszanie nie jest pożądane, ponieważ z większym prawdopodobieństwem spowoduje powstanie dużych osadów przypominających płatki śniegu, co ma znacznie niższą wydajność transfekcji w oparciu o nasze obserwacje.
4. Pozwól osadowi nadal tworzyć się w ciemności przy temperaturze pokojowej przez 30 minut.
5. Dodaj 100 μl osadu do każdej studzienki, która zawiera neuron o niskiej gęstości na szkiełkach nakrywkowych, kropla po kropli i równomiernie. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze i inkubować przez 2 godziny. Zakładając, że większość CaCl₂ jest w postaci wolnej, daje to stężenie ~17,6 mM Ca²⁺, które może być toksyczne dla neuronów po długotrwałej inkubacji.
6. Przygotować stożkową probówkę o pojemności 50 ml z ~50 ml pożywki do mycia, podgrzać do 37 °C.
7. Pod koniec 2 godzin przynieś neuron o niskiej gęstości z osadami DNA-fosforan wapnia do kaptura. Podnieś każde szkiełko nakrywkowe za pomocą ostrej pęsety #5 i zanurz je trzy razy w 50 ml medium do mycia, aby krótko je umyć. Następnie zwróć go do neuronów o wysokiej gęstości na oryginalnych płytkach kokulturowych, z neuronami o niskiej gęstości skierowanymi w dół.
8. Kontynuuj hodowlę, aż neurony hodowlane o niskiej gęstości na szkiełkach nakrywkowych zostaną pobrane do badań.

Results

Opisany tutaj protokół umożliwia udaną długoterminową hodowlę czystych neuronów glutaminergicznym o bardzo niskiej gęstości bez potrzeby stosowania komórek glejowych jako warstwy zasilającej. Protokół przedstawiono na rysunku 1, który obejmuje oddzielnie przygotowanie neuronów o wysokiej gęstości (na 24 dołkach pokrytych poli-D-lizyną) i o niskiej gęstości (na szkiełkach nakrywkowych pokrytych poli-D-lizyną), a następnie wspólną hodowlę, która może być utrzymywana do trze...

Discussion

Przedstawiamy szczegółowy protokół długotrwałej hodowli neuronów glutaminergalnych w hipokampie o ultraniskiej gęstości w warunkach wolnych od surowicy. Przy ~ 2000 neuronów / cm² gęstość jest co najmniej dwukrotnie niższa niż w przypadku większości preparatów hodowlanych o "niskiej gęstości" z lub bez wsparcia gleju zgłoszonego w istniejącej literaturze^2,3,11,13,14. Oprócz tego, że ma bardzo niską gęstość, protokół ten jest nowatorski i istotny pod dwoma innymi względami. Po pierwsze, nie jest potr...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Podłoże neuropodstawowe	Life Technologies	21103-049	Chronić przed światłem
B27 suplement	Life Technologies	17504-044	porcja, przechowywać w rozmiarze 0,6 ml
GlutaMAX-I	Life Technologies	35050-061	rozcieńczony 100X
antybiotykowo-przeciwgrzybiczy (AA)	Life Technologies	15240-096	rozcieńczony 100X
Kompletna pożywka			Pożywka neurobazalna z 1X B27, 1X AA, 1X GlutaMAX-I
Pożywka			taka sama jak "Pożywka neuropodstawowa"
Pożywka			Neurobazalna z 1X suplementem B27
DNAza I	Sigma-Aldrich	D5025	przygotuj 100X zapas w 0,6 mg / ml
poli-D-lizyny	Sigma-Aldrich	P6407	MW. 70000-150000
bufor boranowy	Sigma-Aldrich	B6768 (kwas borowy); 71997 (boraks)	1,24 g kwasu borowego i 1,9 g boraksu w 400 ml H2O, pH do 8,5 użyj
szkiełek nakrywkowych HCl 12 mm okrągłych	Glasswarenfabrik Karl Hecht GmbH	1001/12	Szkło nr 1, zakup od Carolina Biological Supply
zestaw do transfekcji Promega		E1200	szczegóły w protokole
2X Sól fizjologiczna buforowana HEPES (HBS)	Promega	E1200	zobacz  protokół w celu uzyskania szczegółowych informacji
Filtr strzykawkowy	Pall Corporation	4192	Wielkość porów 0,2um
Zestaw do przygotowania endofree plasmidu	Qiagen	12362	do przygotowania plazmidu DNA anty-MAP2 klasy transfekcyjnej
	Przeciwciało myszy Millipore	MAB3418
anty-p-Tau	poliklonalne	Millipore	AB10417
Przeciwciało anty-NR1 Przeciwciało	Millipore	MAB1586	, klon Przeciwciało
anty-GluR1	Przeciwciało poliklonalne królika	Millipore	AB1504
Zbilansowany roztwór soli Hanka	ThermoFisher	14025092	rozmiar 500ml