Hoduj pierwotne komórki nabłonka nosa od dzieci i przeprogramuj je w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste

Podsumowanie

Ta publikacja demonstruje metody skutecznego pobierania próbek i hodowli błony śluzowej nabłonka nosa od dzieci oraz przeprogramowania tych komórek na indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC).

Streszczenie

Komórki nabłonka nosa (NEC) są częścią dróg oddechowych, które reagują na zanieczyszczenia powietrza i są pierwszymi komórkami zakażonymi wirusami układu oddechowego. Są również zaangażowane w wiele chorób dróg oddechowych poprzez ich wrodzoną odpowiedź immunologiczną i interakcję z komórkami odpornościowymi i zrębu dróg oddechowych. NEC są szczególnie interesujące w badaniach z udziałem dzieci ze względu na ich dostępność podczas wizyt klinicznych. Ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) zostały wygenerowane z wielu typów komórek i są potężnym narzędziem do modelowania rozwoju i chorób człowieka, a także do ich potencjalnych zastosowań w medycynie regeneracyjnej. Jest to pierwszy protokół, który określa metody pomyślnego generowania iPSC z NEC pochodzących od uczestników pediatrycznych do celów badawczych. Opisano, jak uzyskać komórki nabłonka nosa od dzieci, jak wygenerować pierwotne kultury NEC z tych próbek oraz jak przeprogramować pierwotne NEC w dobrze scharakteryzowane iPSC. Próbki błony śluzowej nosa są przydatne w badaniach epidemiologicznych związanych ze skutkami zanieczyszczenia powietrza u dzieci i stanowią ważne narzędzie do badania chorób dróg oddechowych. Pierwotne komórki nosa i pochodzące z nich iPSC mogą być narzędziem dostarczającym nieograniczonego materiału do badań specyficznych dla pacjenta w różnych obszarach biologii nabłonka dróg oddechowych, w tym badań nad astmą i POChP.

Wprowadzenie

Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste z ludzkich próbek (hiPSC) to szybko rozwijająca się technologia badań nad komórkami macierzystymi. Stanowią one alternatywę dla badań nad embrionalnymi komórkami macierzystymi (hESC) ze znacznie mniejszą liczbą wad etycznych i moralnych ^1,2. Chociaż nie są one epigenetycznie identyczne z hESC ^3-5, hiPSC oferują unikalny sposób modelowania rozwoju i fenotypów choroby, a także mogą pochodzić z tkanek istotnych dla stanu chorobowego ^5-8. Nieustannie poszukuje się nowych metod generowania hiPSC w celu zidentyfikowania optymalnych typów komórek, które należy rozpocząć, jako sposobu na przygoto....

Protokół

Poniższy protokół jest zgodny z wytycznymi komisji etycznej ds. badań na ludziach.

1. Pobieranie próbek błony śluzowej nosa

UWAGA: Uzyskaj próbki od osób, które są wolne od objawów infekcji wirusowej dróg oddechowych.

1. Przygotuj 15 ml stożkowej świeżości przed wizytą uczestnika i dodaj 2 ml BEGM (Bronchial Epithelial Cell Growth Medium) plus 20 μl sterylnego Penn/Strep/Fungizone (P/S/F) (0,01%).
2. Otwórz szczoteczkę cytologiczną tuż przed pobraniem próbki i upewnij się, że szczoteczka jest sterylna i nie dotykaj jej żadnymi powierzchniami poza powierzchniami nosa.
3. Poproś uczestnika, a....

Wyniki

Początkowa część nosa, nazywana przedsionkiem nosa, jest obszarem otoczonym chrząstką ²⁹. Pędzel musi gładko przejść przez ten obszar nosa, poza zastawką nosową (ostium internum, czyli „czarną dziurą” widoczną z tyłu nozdrza), a próbkę pobiera się z małżowiny dolnej (Rycina 1). Małżowiny nosowe to struktury kostne, które zwiększają powierzchnię nosa ²⁹, co czyni je idealnym miejscem do pobierania próbek. Obszar ten jest również wyścielony unaczynioną.......

Dyskusja

Komórki nabłonka nosa (NEC) są dostępną platformą do badania chorób dróg oddechowych, a NEC-iPSC oferują ekscytującą drogę do badania rozwoju, leczenia i terapii chorób ^1,31,32. NEC można łatwo uzyskać bez stresujących lub potencjalnie szkodliwych procedur ^6,23. Z naszego doświadczenia wynika, że pobieranie próbek błony śluzowej nosa opisane w tym protokole wydaje się być mniej stresujące i lepiej postrzegane niż pobieranie krwi u dzieci. Dlatego metoda ta może być szczególnie przydatna w populacjac.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
15 ml stożkowy	Fisher Scientific	14-959-49D	Protokół Krok 1.1.
Protokół BEGM	Lonza	CC-3170	Krok 1.1.
Penn/Strep/Fungicide	Life Technologies	15240-062	Protokół Krok 1.1.
Penn/Strep	Life Technologies	15140-122	Protokół Krok 4.a.
cytomiękka szczoteczka cytologiczna	Fisher Scientific	22-263-357	Protokół Krok 1.2.
błękit trypanowy	Fisher Scientific	MT-25-900-CI	Protokół Krok 2.1.
hemytometr	Fisher Scientific	02-671-54	Protokół Krok 2.1.
PBS	Fisher Scientific	BP2438-4	Protokół Krok 2.2.
Klipsy do lejka cytologicznego	Fisher Scientific	10-357	Protokół Krok 2.2.
lejek cytospinowy	Fisher Scientific	23-640-320	Protokół Krok 2.2.
Cytospin 4	Protokół A78300003 Fishera Scientific		Krok 2.2.
pusty slajd	Fisher Scientific	S95933	Protokół Krok 2.2.
Zestaw plam hema 3	Fisher Scientific	22-122-911	Protokół Krok 2.2.
Bydlęcy kolagen skórny, typ 1	Life Technologies	A1064401	Protokół Krok 3.2.
Kolba T25	Fisher Scientific	08-772-45	Protokół Krok 3.3.
Trypsyna	Lonza	CC-5012	Protokół Krok 5.2.
Roztwór neutralizujący trypsynę	Lonza	CC-5002	Protokół Krok 5.2.
Płodowa surowica bydlęca (FBS), sterylizowana termicznie w temperaturze 65 & stopni; C przez 30 min	Protokół Sigma-Aldrich	F2442	Krok 5.5.
Dimetylosulftlenek Hybri-Max™, sterylnie filtrowany, BioReagent, odpowiedni dla hybrydoma, ≥ 99.7%	Sigma-Aldrich	D2650	Protokół Krok 5.5.
lentiwirus policystonowy*	np. Protokół Millipore	SCR511	Krok 6.4.  Wymienione jest komercyjne źródło wektora przeprogramowania. Rutynowo używamy plazmidu 4 w 1 opisanego przez Voelkela i innych (PMID: 20385817) do generowania we własnym zakresie policistronicznego lentiwirusa przeprogramowanego pseudotypem VSV-G. Ten plazmid można uzyskać, kontaktując się z
polybrene	Santa Cruz Biotechnology	sc-134220	Protokół Krok 6.4.
Napromieniowane CF1 MEF	GlobalStem	Protokół GSC-6301G	krok 6.4.
Pożywki z hESC	Patrz przepis zawarty w protokole		Krok 6.11.
SB431542	Protokół Stemgent	04-0010	Krok 6.11.
PD0325901	Protokół Stemgent	04-0006	Krok 6.11.
Tiazowiwina	Protokół Stemgent	04-0017	Krok 6.11.
354277	BD Biosciences	kwalifikacją hESC	, krok 6.13.
Płytka Corning, 6-dołkowa	Fisher Scientific	08-772-1B	Protokół Krok 6.13.
Protokół mTeSR1	StemCell	5850	Krok 6.13.
Jednorazowa kolba filtrująca o pojemności 250 ml (0,22 &mikro; m)	Fisher	SCGP-U02-RE
dispase	StemCell	7923	Protokół Krok 7.3.
DMEM/F12	Life Technologies	11320-033	Protokół Krok 7.3.
podnośnik komórkowy	Fisher Scientific	08-100-240	Protokół Krok 7.4.
hESC Media**			Protokół Krok 6.11. składniki należy wymieszać, a następnie wysterylizować filtrem. Nośnik można przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C przez okres do dwóch tygodni. Podczas podgrzewania mediów nie pozostawiaj w temperaturze 37 & stopni; C dłużej niż 15 min
DMEM-F12 50/50 media	Invitrogen	11330-032	Stężenie końcowe
Serum zastępcze KO (KO-SR)	Invitrogen	10828-028	0,2
200 mM L-glutamina	Invitrogen	25030-081	1 mM
55 mM ß-merkaptoetanol	Invitrogen	21985-023	0,1 mM
100x aminokwasy endogenne	Invitrogen	11140-050	1x
2 &mikro; g/ml Zasadowy czynnik wzrostu fibroblastów (b-FGF)	Invitrogen	13256-029	4 ng/ml

, Protokół Matrigel z