Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Hoduj pierwotne komórki nabłonka nosa od dzieci i przeprogramuj je w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste

11K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53814

⸱

10 marca 2016

 ,  ,  ,  , 
1Pyrosequencing Core, Cincinnati Children's Hospital, 2Division of Developmental Biology, Cincinnati Children's Hospital, 3Division of Pulmonary Medicine, Seattle Children's Hospital, 4Division of Asthma Research, Cincinnati Children's Hospital

W tym artykule

Podsumowanie

Ta publikacja demonstruje metody skutecznego pobierania próbek i hodowli błony śluzowej nabłonka nosa od dzieci oraz przeprogramowania tych komórek na indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC).

Streszczenie

Komórki nabłonka nosa (NEC) są częścią dróg oddechowych, które reagują na zanieczyszczenia powietrza i są pierwszymi komórkami zakażonymi wirusami układu oddechowego. Są również zaangażowane w wiele chorób dróg oddechowych poprzez ich wrodzoną odpowiedź immunologiczną i interakcję z komórkami odpornościowymi i zrębu dróg oddechowych. NEC są szczególnie interesujące w badaniach z udziałem dzieci ze względu na ich dostępność podczas wizyt klinicznych. Ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) zostały wygenerowane z wielu typów komórek i są potężnym narzędziem do modelowania rozwoju i chorób człowieka, a także do ich potencjalnych zastosowań w medycynie regeneracyjnej. Jest to pierwszy protokół, który określa metody pomyślnego generowania iPSC z NEC pochodzących od uczestników pediatrycznych do celów badawczych. Opisano, jak uzyskać komórki nabłonka nosa od dzieci, jak wygenerować pierwotne kultury NEC z tych próbek oraz jak przeprogramować pierwotne NEC w dobrze scharakteryzowane iPSC. Próbki błony śluzowej nosa są przydatne w badaniach epidemiologicznych związanych ze skutkami zanieczyszczenia powietrza u dzieci i stanowią ważne narzędzie do badania chorób dróg oddechowych. Pierwotne komórki nosa i pochodzące z nich iPSC mogą być narzędziem dostarczającym nieograniczonego materiału do badań specyficznych dla pacjenta w różnych obszarach biologii nabłonka dróg oddechowych, w tym badań nad astmą i POChP.

Wprowadzenie

Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste z ludzkich próbek (hiPSC) to szybko rozwijająca się technologia badań nad komórkami macierzystymi. Stanowią one alternatywę dla badań nad embrionalnymi komórkami macierzystymi (hESC) ze znacznie mniejszą liczbą wad etycznych i moralnych 1,2. Chociaż nie są one epigenetycznie identyczne z hESC 3-5, hiPSC oferują unikalny sposób modelowania rozwoju i fenotypów choroby, a także mogą pochodzić z tkanek istotnych dla stanu chorobowego 5-8. Nieustannie poszukuje się nowych metod generowania hiPSC w celu zidentyfikowania optymalnych typów komórek, które należy rozpocząć, jako sposobu na przygotowanie iPSC o jakości GMP odpowiednich do przeszczepienia, a także w celu zwiększenia terminowości i efektywności procesu przeprogramowania 6,9-11.

Komórki nabłonka dróg oddechowych są kluczowe w rozwoju alergicznego zapalenia 12, a nabłonek jest głównym czynnikiem wywołującym reakcje alergiczne i przebudowę dróg oddechowych poprzez interakcję z komórkami odpornościowymi i zrębowymi. Nabłonek dróg oddechowych odgrywa zasadniczą rolę w powstawaniu i utrzymywaniu się chorób płuc, takich jak astma. Jednak komórki nabłonka dolnych dróg oddechowych są trudne do uzyskania w warunkach klinicznych, zwłaszcza od zdrowych pacjentów z grupy kontrolnej i dzieci. Dane z kilku badań potwierdzają założenie, że komórki nabłonkowe błony śluzowej nosa są ważnym i praktycznym wskaźnikiem zastępczym dla komórek nabłonka dolnych dróg oddechowych 13-20, zwłaszcza podczas badania reakcji na zanieczyszczenia powietrza i alergeny. Błona śluzowa nosa składa się w ponad 90% z komórek nabłonka rzęsek dróg oddechowych, a pobieranie próbek z tych komórek nabłonka nosa (NEC) można łatwo przeprowadzić u dzieci w wieku czterech lub pięciu lat, ponieważ jest mniej inwazyjne niż inne techniki pobierania próbek komórek/tkanek i wiąże się z minimalnym ryzykiem zdarzeń niepożądanych, takich jak infekcja 20-23. Oferuje szybki i prosty sposób pobierania próbek zarówno od zdrowych, jak i chorych dzieci bez długich, niepotrzebnych i często bolesnych zabiegów bronchoskopii, które wymagają sedacji. Wcześniejsze badania wykazały, że podtypy choroby związane z ciężkością astmy można rozróżnić zarówno w błonie śluzowej nosa, jak i w próbkach komórek oskrzeli pobranych od dzieci z astmą, a ekspresja genów między tymi dwoma typami tkanek była podobna w około 90% genów niewszechobecnych 22,24. Jako źródło iPSC, NEC oferują przewagę nad innymi często stosowanymi typami komórek. Fibroblasty są często używane do generowania iPSC, ale chociaż komórki te można łatwo wyhodować z biopsji skóry, proces ten zwykle wymaga znieczulenia miejscowego, nacięcia i szwów i wiąże się z pewnym ryzykiem infekcji. W związku z tym uzyskanie świadomej zgody pacjentów na ten rodzaj biopsji może być trudne 25. Jedną z alternatyw dla fibroblastów są komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC). Jednak uzyskanie wystarczającej ilości krwi do wytworzenia iPSC od pacjentów pediatrycznych może być trudne. Ponadto istnieją ograniczenia dalszych zastosowań fibroblastów i iPSC pochodzących z komórek krwi, zwłaszcza ich zdolność do różnicowania do niektórych typów komórek 5,26. W związku z tym, biorąc pod uwagę względną dostępność i niskie ryzyko wystąpienia działań niepożądanych po ich pobraniu, NEC stanowią idealne źródło komórek do wytwarzania iPSC w populacjach pediatrycznych.

iPSC cieszą się ostatnio dużym zainteresowaniem jako platforma do badania rozwoju człowieka, generowania nowych modeli chorób oraz jako potencjalne źródło komórek do spersonalizowanych terapii. Zanim będzie można w pełni wykorzystać potencjał tej technologii, należy wyjaśnić molekularne podstawy procesu przeprogramowywania, ale na razie ten protokół i przedstawione w nim procedury wyjaśnią badania naukowe skoncentrowane na narażeniu dróg oddechowych, a także zapewnią platformę do badania skutków medycyny spersonalizowanej z udziałem iPSC.

Wspólna praca kilku laboratoriów doprowadziła do stworzenia udanej techniki nie tylko pobierania próbek błony śluzowej nosa, ale także hodowli NEC i przeprogramowania tych komórek do iPSC 23. Ten artykuł zawiera zarys protokołu zapewniającego optymalne warunki pobierania próbek, hodowli i przeprogramowywania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Poniższy protokół jest zgodny z wytycznymi komisji etycznej ds. badań na ludziach.

1. Pobieranie próbek błony śluzowej nosa

UWAGA: Uzyskaj próbki od osób, które są wolne od objawów infekcji wirusowej dróg oddechowych.

  1. Przygotuj 15 ml stożkowej świeżości przed wizytą uczestnika i dodaj 2 ml BEGM (Bronchial Epithelial Cell Growth Medium) plus 20 μl sterylnego Penn/Strep/Fungizone (P/S/F) (0,01%).
  2. Otwórz szczoteczkę cytologiczną tuż przed pobraniem próbki i upewnij się, że szczoteczka jest sterylna i nie dotykaj jej żadnymi powierzchniami poza powierzchniami nosa.
  3. Poproś uczestnika, aby siedział nieruchomo i przechylił głowę w kierunku sufitu. Niech mniejsze lub bardziej niespokojne dzieci usiądą na rękach i/lub położą się, aby uniknąć odgarniania zarośli.
  4. Wyceluj pędzelkiem w tył nosa, gdzie przejście zwęża się (wygląda jak mała). Przesuń szczoteczkę w dół i przekręć nadgarstki, gdy szczoteczka jest wyjmowana z nozdrza.
  5. Umieść pędzel w stożku i zanurz w BEGM. Odetnij nadmiar szczotki i załóż nakrętkę na rurkę. NIE WIROWAĆ.
    UWAGA: Jeśli uczestnik jest chętny, zaopatrz się w drugą szczotkę w ten sam sposób, ale w drugie nozdrze. Uzyskanie szczotkowania obu nozdrzy spowoduje większe prawdopodobieństwo, że pobieranie próbek zakończy się sukcesem. Pobranie próbki z tego samego nozdrza może spowodować krwawienie i prawdopodobnie nie poprawi jakości próbki.
  6. Podczas transportu próbki należy przechowywać w temperaturze jak najbliżej 37 °C, używając zlewki z ciepłą wodą.

2. Liczba komórek i cytospina

  1. Delikatnie wymieszać szczoteczkę w BEGM i pobrać 10 μl próbki do zliczania komórek za pomocą hemacytometru. Dodać 10 μl żywej/martwej plamy i policzyć pod mikroskopem tylko żywe komórki.
  2. Pobrać 50 μl próbki i rozcieńczyć do 200 μl za pomocą 1x PBS. Dodać do lejka cytospinowego przymocowanego do szkiełka i wirować z prędkością 300 obr./min przez 2 min. Pozostaw szkiełko do wyschnięcia O/N i bejca zgodnie z instrukcjami producenta. Pozostawić do wyschnięcia, najlepiej w ciemności.
  3. Szkiełko do plam z bejcą Hema 3
    1. Przenieś każdy roztwór (utrwalacz Hema, jasnoniebieski; Hema 3 Roztwór I, różowy; i Hema 3 Roztwór II, ciemnoniebieski) do naczynia barwiącego; Przechowywać pod przykryciem, gdy nie jest używane. Włóż szkiełka do łodzi do barwienia szkiełek
    2. Zanurz szkiełka w sposób ciągły w utrwalaczu przez 30 sekund, a następnie pozwól nadmiarowi spłynąć. Zanurz szkiełka w sposób ciągły w roztworze I przez 30 sekund, a następnie pozwól nadmiarowi spłynąć. Zanurz szkiełka w sposób ciągły w roztworze II przez 30 sekund, a następnie pozwól nadmiarowi spłynąć
    3. Spłucz wodą dejonizowaną, aż woda będzie czysta. Pozostawić do wyschnięcia, najlepiej w ciemności
  4. Spójrz na szkiełko pod mikroskopem i policz komórki, określ procent komórek nabłonka. Powinna wynosić 90% lub więcej, jeśli próbkowanie jest dobre.

3. Komórki wysiewające

UWAGA: Przeprowadź wszystkie procedury hodowli komórkowej w odpowiednim i certyfikowanym kapturze do hodowli tkankowej przy użyciu sterylnej techniki.

  1. Pokryć płytki z bydlęcym kolagenem skórnym (BDC), typ 1. Dodać 0,5 ml 3 mg/ml BDC rozcieńczonego w 49,5 ml 1x PBS. Przygotuj mniej, jeśli będzie używanych tylko kilka talerzy. Pokryć kolbę T25 2 ml BDC i inkubować w sterylnym kapturze O/N lub w temperaturze 37 °C przez 2 godziny, jeśli to konieczne.
  2. Po inkubacji odessać pozostały płyn. Wystaw kolby na działanie światła UV przez 30 minut w sterylnym kapturze. Kolby przechowywać przez okres do jednego miesiąca w temperaturze 4 °C, ale przed wysiewem komórek doprowadzić je do temperatury RT lub 37 °C.
  3. Przechowywać pędzel i komórki w BEGM w temperaturze 37 °C, aż będą gotowe do wysiewu. Delikatnie przetrzyj szczotkę w stożku, ale nie wiruj.
    1. Płytka 7 x 105 komórek w kolbie T25. Jeśli jest mniej, użyj mniejszego pojemnika, takiego jak jeden dołek na płytce 6-dołkowej. Ten rozmiar płytki wymaga około 3 x 105 komórek.
      UWAGA: Jeśli nie ma tak wielu komórek, nie zaleca się kontynuowania.
  4. Pod sterylnym kapturem wyjąć szczoteczkę z tubki i delikatnie obrócić szczoteczkę na powierzchni powlekanej kolby, uważając, aby nie zarysować powłoki. Wyrzuć szczotkę do odpowiedniego pojemnika na zagrożenie biologiczne.
  5. Powoli odpipetować pozostałe komórki z BEGM ze stożka do kolby T25. Obserwuj komórki pod mikroskopem. Obserwowana będzie pewna liczba pływających komórek, a z nosa mogą znajdować się pewne zanieczyszczenia, co jest dopuszczalne na tym etapie (ryc. 3A).

4. Hodowla komórkowa

  1. Po wysianiu komórek pozwól im osiąść przez 48 godzin bez zakłóceń (ryc. 3). Po 48 godzinach powoli i delikatnie dodać 2 ml ciepłego BEGM i 20 μl sterylnego Penicilin/Streptomycyny/Fungizonu (P/S/F).
    UWAGA: NIE zasysaj oryginalnych 2 ml podłoża.
  2. W 4 dniu po wysiewie ostrożnie odessać cały płyn i zastąpić 4 ml świeżego, podgrzanego BEGM plus 1x Pen/Strep (fungizon nie jest już potrzebny). Zmieniaj pożywkę co dwa dni i oceniaj komórki pod kątem przyczepienia, wzrostu i zbiegu. Kiedy komórki osiągną ~80% konfluencji, zwykle w ciągu 2-3 tygodni, są gotowe do przejścia.
  3. Jedna kolba T25 (około 2,5 x 106 komórek w przypadku zlewania się) może być przepuszczona do trzech kolb T25 lub jednej kolby T75. Po pierwszym pasażu komórki powinny być mocne i zdrowe, osiągając zbieg mniej więcej co trzy dni.

5. Komórki pasujące

  1. Delikatnie zassać podłoże z płytki. Dodać 1 ml 0,05% roztworu trypsyny na kolbę T25 do płytki i umieścić w inkubatorze na około 4 minuty lub do momentu, gdy komórki oderwą się od płytki. Sprawdzaj poziom odklejania się komórek co 2 minuty i nie pozostawiaj Trypsyny włączonej dłużej niż 10 minut.
  2. Dodaj 5 ml roztworu neutralizującego trypsynę (TNS) lub pożywki zawierającej surowicę, aby zneutralizować enzym. Usunąć cały płyn i komórki z kolby i umieścić w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
  3. Wirować przy 200 x g (przyspieszenie 0 opóźnienie 0) przez 5 minut w celu uzyskania osadu komórkowego. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w BEGM + P/S w objętości wymaganej dla nowych kolb (4 ml dla kolby T25, 10 ml dla kolby T75)
  4. Przeprowadzić zliczanie komórek za pomocą żywej/martwej plamy, jak opisano powyżej (2.1). Dodać odpowiednią ilość BEGM i komórek do kolb powlekanych i powrócić do inkubatora. Przechowywać zgodnie z powyższymi opisami lub kriokonserwować w pożywce zamrażającej (70% BEGM, 20% FBS i 10% DMSO) w stężeniu 0,5-2 x 106 komórek na ml.

6. Przeprogramowanie na iPSC

UWAGA: Zanim zaczniesz tworzyć iPSC, upewnij się, że przestrzegasz wszystkich przepisów instytucjonalnych regulujących generowanie i używanie ludzkich iPSC. Sterylna technika jest szczególnie ważna w przypadku hodowli iPSC, ponieważ pożywka hodowlana nie zawiera rutynowo antybiotyków. Bardzo ważne jest, aby NEC wydawały się zdrowe i silnie proliferacyjne dla pomyślnego przeprogramowania.

  1. Płytka: 5 x 105 NEC na basenik z 6-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. Po 24 godzinach dodać polibren do BEGM do końcowego stężenia 8 μg/ml i przeprowadzić NEC poprzez dodanie do pożywki cząstek lentiwirusowych eksprymujących Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc. Dąż do osiągnięcia wielokrotności infekcji (MOI) wynoszącej ~527.
    1. Aby określić MOI, należy przygotować seryjne rozcieńczenia skoncentrowanego lentiwirusa i przeprowadzić transdukcję komórek HT1080 tymi rozcieńczeniami. Po pierwszym jednoznacznym wykryciu ekspresji dTomato w komórkach HT1080, oblicz liczbę "jednostek transdukcyjnych/ml", oceniając liczbę komórek dTomato-dodatnich/małych skupisk komórek w każdym rozcieńczeniu.
      UWAGA: Zazwyczaj będą rozcieńczenia, które są zbyt wysokie (wszystko jest dodatnie dTomato) i zbyt niskie (brak lub tylko kilka dodatnich komórek).
    2. Przeprowadzić punktację z rozcieńczeń, w których zidentyfikowano dyskretnie dodatnie komórki/małe skupiska komórek. Oznaczyć miano, korygując liczbę jednostek kroczących/ml za pomocą odpowiedniego współczynnika rozcieńczenia. MOI jest wtedy stosunkiem liczby transdukowanych komórek do liczby cząstek wirusa 27,
      UWAGA: Zakłada się, że każda komórka/mała grudka dTomato dodatnia powstaje z pojedynczej cząsteczki wirusa.
  2. Około 3 godziny po transdukcji usuń pożywkę i zastąp ją świeżym BEGM. Należy odrzucić pożywki zawierające lentiwirusa przy użyciu procedur zatwierdzonych przez instytucję. Zwróć transdukowane NEC do inkubatora na 3 dni.
  3. W 3 dniu zastąp pożywkę świeżym BEGM, a następnie inkubuj przez kolejne 3 dni. Odessać zużytą pożywkę, przemyć komórki 1x PBS i dodać 1 ml 0,05% roztworu trypsyny do studzienki. Pasaż komórek z trypsyną, jak opisano powyżej (sekcja 5). Ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 4 ml BEGM + P/S. Komórki można przenieść do nowego dołka na 6-dołkowej płytce pokrytej BDC lub dodać do kultur MEF, jeśli są gotowe (patrz następny krok).
  4. Przygotuj płyty pokryte MEF. W dniu 4 dodać 0,1% roztwór żelatyny (1 ml / basenik) do 2 dołków z 6 dołkami (aby wykonać +/- tiazowiwinę (SPT), patrz krok 6.6). Następnego dnia rozmrozić fiolkę z inaktywowanymi MEFami 28.
  5. Umieścić MEF w 10 ml pożywki MEF (DMEM + 1x NEAA + 10% dFCS). Wirować w 200 x g przez 5 minut, aby opluć. Ponowne zawieszanie na nośniku MEF. Odessać żelatynę z płytki 6-dołkowej i dodać 1,87 x 105 MEF na dołek z pokrytej żelatyną płytki 6-dołkowej. Inkubować O/N w temperaturze 37 °C lub przez minimum 24 godziny.
  6. Przenieść 2 ml BEGM zawierającego transdukowane komórki na studzienkę do 2 dołków uprzednio pokrytej płytki 6-dołkowej i inkubować O/N. Następnego dnia zastąpić BEGM 2,5 ml na studzienkę standardowej pożywki hESC zawierającej 4 ng/ml zasadowego czynnika wzrostu fibroblastów. Karmić komórki świeżą pożywką hESC +/- SPT codziennie przez 10 dni
    UWAGA: Możliwe jest dodanie koktajlu małych cząsteczek (SB431542, PD0325901 i koktajlu tiazowiwinów (SPT)) w celu zwiększenia wydajności i kinetyki przeprogramowania dla NEC 23.
  7. Po dziesięciu dniach kontynuuj codzienne karmienie przy użyciu pożywek hESC bez SPT. Codziennie podawaj kultury, aż pojawią się kolonie podobne do hESC (Figura 5A, kolonia P0). Zidentyfikuj kolonie zawierające przypuszczalne iPSC na podstawie ich wysokiego stosunku jądra do cytoplazmy i wydatnych jąderek.
  8. Ręczne wycinanie i przenoszenie kolonii o morfologii podobnej do hESC w celu oddzielenia studzienek do hodowli i ekspansji jako oddzielnych linii w systemie bez karmienia. Wycięte rodziny powinny szybko przystosować się do tych warunków.
    1. Po posianiu wyciętych kolonii te dyskretne przypuszczalne linie iPSC są teraz uważane za przejście 1 (p1). Codziennie podawaj kultury bakterii za pomocą mTeSR1. Przechodzenie i rozszerzanie linii iPSC przy użyciu standardowych procedur. Może minąć od kilku dni do tygodnia, zanim kolonie p1 osiągną rozmiar, przy którym powinny być przepasywane.

7. Utrzymanie iPSC w kulturze

  1. Codziennie karm i oceniaj kultury. Ręczne wycinanie obszarów wykazujących wyraźne zróżnicowanie poprzez skrobanie sterylną szklaną pipetą lub końcówką mikropipety. Zmień nośnik po codziennym zbieraniu.
  2. Komórki pasażujące mniej więcej co cztery dni: Delikatnie odessać pożywkę, dodać 1 ml ciepłej pożywki (1 mg/ml) do dołka na płytce 6-dołkowej (połowa objętości karmienia), a następnie inkubować w temperaturze 37 °C przez około 4 minuty. Krawędzie kolonii zaczną się podnosić, co wygląda jak biały kontur wokół kolonii. Delikatnie zassać Dispase i przemyć 3x podgrzanym DMEM/F12.
  3. Dodać 2 ml mTeSR1 i użyć podnośnika komórkowego, aby podnieść kolonie z płytki. Użyj pipety serologicznej o pojemności 5 ml lub mikropipety P1000, aby delikatnie rozdzielić komórki, aż kolonie zostaną rozbite na mniejsze skupiska.
    1. Unikaj wytwarzania bardzo małych klastrów lub pojedynczych komórek, ponieważ przeżycie i późniejsza proliferacja będą nieoptymalne. Podczas ponownego posiewania kolonii, podział 1:4 do 1:6 pozwoli utrzymać optymalną gęstość kolonii. Delikatnie usuń kolonie i pożywkę z płytki i dodaj do nowych, pokrytych matriżelem studzienek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Początkowa część nosa, nazywana przedsionkiem nosa, jest obszarem otoczonym chrząstką 29. Pędzel musi gładko przejść przez ten obszar nosa, poza zastawką nosową (ostium internum, czyli „czarną dziurą” widoczną z tyłu nozdrza), a próbkę pobiera się z małżowiny dolnej (Rycina 1). Małżowiny nosowe to struktury kostne, które zwiększają powierzchnię nosa 29, co czyni je idealnym miejscem do pobierania próbek. Obszar ten jest również wyścielony unaczynioną...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Komórki nabłonka nosa (NEC) są dostępną platformą do badania chorób dróg oddechowych, a NEC-iPSC oferują ekscytującą drogę do badania rozwoju, leczenia i terapii chorób 1,31,32. NEC można łatwo uzyskać bez stresujących lub potencjalnie szkodliwych procedur 6,23. Z naszego doświadczenia wynika, że pobieranie próbek błony śluzowej nosa opisane w tym protokole wydaje się być mniej stresujące i lepiej postrzegane niż pobieranie krwi u dzieci. Dlatego metoda ta może być szczególnie przydatna w populacjac...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Pluripotentnemu Ośrodkowi Komórek Macierzystych oraz Rdzeniowi Obrazowania Konfokalnego w Szpitalu Dziecięcym w Cincinnati. Prace te były wspierane przez R21AI119236 (HJ), R21AI101375 (HJ), NIH/NCATS 8UL1TR000077-04 (HJ), U19 AI070412 (HJ) i 2U19AI70235 (GKKH).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
15 ml stożkowyFisher Scientific14-959-49DProtokół Krok 1.1.
Protokół BEGMLonzaCC-3170Krok 1.1.
Penn/Strep/FungicideLife Technologies15240-062Protokół Krok 1.1.
Penn/StrepLife Technologies15140-122Protokół Krok 4.a.
cytomiękka szczoteczka cytologicznaFisher Scientific22-263-357Protokół Krok 1.2.
błękit trypanowyFisher ScientificMT-25-900-CIProtokół Krok 2.1.
hemytometrFisher Scientific02-671-54Protokół Krok 2.1.
PBSFisher ScientificBP2438-4Protokół Krok 2.2.
Klipsy do lejka cytologicznegoFisher Scientific10-357Protokół Krok 2.2.
lejek cytospinowyFisher Scientific23-640-320Protokół Krok 2.2.
Cytospin 4Protokół A78300003 Fishera ScientificKrok 2.2.
pusty slajdFisher ScientificS95933Protokół Krok 2.2.
Zestaw plam hema 3Fisher Scientific22-122-911Protokół Krok 2.2.
Bydlęcy kolagen skórny, typ 1Life TechnologiesA1064401Protokół Krok 3.2.
Kolba T25Fisher Scientific08-772-45Protokół Krok 3.3.
TrypsynaLonzaCC-5012Protokół Krok 5.2.
Roztwór neutralizujący trypsynęLonzaCC-5002Protokół Krok 5.2.
Płodowa surowica bydlęca (FBS), sterylizowana termicznie w temperaturze 65 & stopni; C przez 30 minProtokół Sigma-AldrichF2442Krok 5.5.
Dimetylosulftlenek Hybri-Max™, sterylnie filtrowany, BioReagent, odpowiedni dla hybrydoma, ≥ 99.7%Sigma-AldrichD2650Protokół Krok 5.5.
lentiwirus policystonowy*np. Protokół MilliporeSCR511Krok 6.4. 
Wymienione jest komercyjne źródło wektora przeprogramowania. Rutynowo używamy plazmidu 4 w 1 opisanego przez Voelkela i innych (PMID: 20385817) do generowania we własnym zakresie policistronicznego lentiwirusa przeprogramowanego pseudotypem VSV-G. Ten plazmid można uzyskać, kontaktując się z 
polybreneSanta Cruz Biotechnologysc-134220Protokół Krok 6.4.
Napromieniowane CF1 MEFGlobalStem Protokół GSC-6301Gkrok 6.4.
Pożywki z hESCPatrz przepis zawarty w protokoleKrok 6.11.
SB431542Protokół Stemgent04-0010Krok 6.11.
PD0325901Protokół Stemgent04-0006Krok 6.11.
Tiazowiwina Protokół Stemgent04-0017Krok 6.11.
354277BD Bioscienceskwalifikacją hESC, krok 6.13.
Płytka Corning, 6-dołkowaFisher Scientific08-772-1BProtokół Krok 6.13.
Protokół mTeSR1StemCell5850Krok 6.13.
Jednorazowa kolba filtrująca o pojemności 250 ml (0,22 &mikro; m)FisherSCGP-U02-RE 
dispaseStemCell7923Protokół Krok 7.3.
DMEM/F12Life Technologies11320-033Protokół Krok 7.3.
podnośnik komórkowyFisher Scientific08-100-240Protokół Krok 7.4.
hESC Media**Protokół Krok 6.11.
składniki należy wymieszać, a następnie wysterylizować filtrem. Nośnik można przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C przez okres do dwóch tygodni. Podczas podgrzewania mediów nie pozostawiaj w temperaturze 37 & stopni; C dłużej niż 15 min
DMEM-F12 50/50 mediaInvitrogen  11330-032Stężenie końcowe
Serum zastępcze KO (KO-SR)Invitrogen10828-0280,2
200 mM L-glutaminaInvitrogen25030-0811 mM
55 mM ß-merkaptoetanolInvitrogen21985-0230,1 mM
100x aminokwasy endogenneInvitrogen11140-0501x
2 &mikro; g/ml Zasadowy czynnik wzrostu fibroblastów (b-FGF)Invitrogen13256-0294 ng/ml
, Protokół Matrigel z

Bibliografia

  1. Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell stem cell. 10 (6), 678-684 (2012).
  2. Boulting, G. L., et al. A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells. Nature biotechnology. 29 (3), 279-286 (2011).
  3. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  4. Guenther, M. G., et al. Chromatin structure and gene expression programs of human embryonic and induced pluripotent stem cells. Cell stem cell. 7 (2), 249-257 (2010).
  5. Polo, J. M., et al. Cell type of origin influences the molecular and functional properties of mouse induced pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 28 (8), 848-855 (2010).
  6. Ono, M., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human nasal epithelial cells using a Sendai virus vector. PloS one. 7 (8), e42855(2012).
  7. Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (11), 2667-2674 (2009).
  8. Brennand, K. J., et al. Modelling schizophrenia using human induced pluripotent stem cells. Nature. 473 (7346), 221-225 (2011).
  9. Mou, H., et al. Generation of multipotent lung and airway progenitors from mouse ESCs and patient-specific cystic fibrosis iPSCs. Cell stem cell. 10 (4), 385-397 (2012).
  10. Stadtfeld, M., Nagaya, M., Utikal, J., Weir, G., Hochedlinger, K. Induced pluripotent stem cells generated without viral integration. Science. 322 (5903), 945-949 (2008).
  11. Huangfu, D., et al. Induction of pluripotent stem cells by defined factors is greatly improved by small-molecule compounds. Nat Biotechnol. 26 (7), 795-797 (2008).
  12. Kuperman, D. A., et al. Direct effects of interleukin-13 on epithelial cells cause airway hyperreactivity and mucus overproduction in asthma. Nat Med. 8 (8), 885-889 (2002).
  13. Braunstahl, G. J., et al. Segmental bronchoprovocation in allergic rhinitis patients affects mast cell and basophil numbers in nasal and bronchial mucosa. American journal of respiratory and critical care medicine. 164 (5), 858-865 (2001).
  14. Compalati, E., et al. The link between allergic rhinitis and asthma: the united airways disease. Expert review of clinical immunology. 6 (3), 413-423 (2010).
  15. Crimi, E., et al. Inflammatory and mechanical factors of allergen-induced bronchoconstriction in mild asthma and rhinitis. Journal of applied physiology. 91 (3), 1029-1034 (2001).
  16. Djukanovic, R., et al. Bronchial mucosal manifestations of atopy: a comparison of markers of inflammation between atopic asthmatics, atopic nonasthmatics and healthy controls. The European respiratory journal : official journal of the European Society for Clinical Respiratory Physiology. 5 (5), 538-544 (1992).
  17. Gaga, M., et al. Eosinophils are a feature of upper and lower airway pathology in non-atopic asthma, irrespective of the presence of rhinitis. Clinical and experimental allergy : journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology. 30 (5), 663-669 (2000).
  18. Hurst, J. R., Wilkinson, T. M., Perera, W. R., Donaldson, G. C., Wedzicha, J. A. Relationships among bacteria, upper airway, lower airway, and systemic inflammation in COPD. Chest. 127 (4), 1219-1226 (2005).
  19. Gaga, M., V, A. M., Chanez, P. Upper and lower airways: similarities and differences. European respiratory monograph. 18, 1-15 (2001).
  20. Lopez-Guisa, J. M., et al. Airway epithelial cells from asthmatic children differentially express proremodeling factors. J Allergy Clin Immunol. 129 (4), 990-997 (2012).
  21. Doi, A., et al. Differential methylation of tissue- and cancer-specific CpG island shores distinguishes human induced pluripotent stem cells, embryonic stem cells and fibroblasts. Nature genetics. 41 (12), 1350-1353 (2009).
  22. Poole, A., et al. Dissecting childhood asthma with nasal transcriptomics distinguishes subphenotypes of disease. J Allergy Clin Immunol. , (2014).
  23. Ji, H., et al. Dynamic transcriptional and epigenomic reprogramming from pediatric nasal epithelial cells to induced pluripotent stem cells. J Allergy Clin Immunol. 135 (1), 236-244 (2015).
  24. Guajardo, J. R., et al. Altered gene expression profiles in nasal respiratory epithelium reflect stable versus acute childhood asthma. The Journal of allergy and clinical immunology. 115 (2), 243-251 (2005).
  25. Yamanaka, S. Patient-specific pluripotent stem cells become even more accessible. Cell Stem Cell. 7 (1), 1-2 (2010).
  26. Kim, K., et al. Donor cell type can influence the epigenome and differentiation potential of human induced pluripotent stem cells. Nature. 29 (12), 1117-1119 (2011).
  27. Warlich, E., et al. Lentiviral vector design and imaging approaches to visualize the early stages of cellular reprogramming. Mol Ther. 19 (4), 782-789 (2011).
  28. Wicell. Wicell Feeder Based (MEF) Pluripotent Stem Cell Protocols. , (2003).
  29. Harkema, J. R., Carey, S. A., Wagner, J. G. The nose revisited: a brief review of the comparative structure, function, and toxicologic pathology of the nasal epithelium. Toxicol Pathol. 34 (3), 252-269 (2006).
  30. Allegrucci, C., Young, L. E. Differences between human embryonic stem cell lines. Hum Reprod Update. 13 (2), 103-120 (2007).
  31. Yoshida, Y., Yamanaka, S. Recent stem cell advances: induced pluripotent stem cells for disease modeling and stem cell-based regeneration. Circulation. 122 (1), 80-87 (2010).
  32. Pasca, S. P., et al. Using iPSC-derived neurons to uncover cellular phenotypes associated with Timothy syndrome. Nature medicine. 17 (12), 1657-1662 (2011).
  33. Lai, P. S., et al. Alternate methods of nasal epithelial cell sampling for airway genomic studies. J Allergy Clin Immunol. , (2015).
  34. Shi, Y., et al. A combined chemical and genetic approach for the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 2 (6), 525-528 (2008).
  35. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature. 8 (5), 409-412 (2011).
  36. Dye, B. R., et al. In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids. Elife. 4, (2015).
  37. Huang, S. X., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 32 (1), 84-91 (2014).
  38. Wong, A. P., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into mature airway epithelia expressing functional CFTR protein. Nature biotechnology. 30 (9), 876-882 (2012).
  39. Marchetto, M. C., et al. Transcriptional signature and memory retention of human-induced pluripotent stem cells. PloS one. 4 (9), e7076(2009).
  40. Nukaya, D., Minami, K., Hoshikawa, R., Yokoi, N., Seino, S. Preferential gene expression and epigenetic memory of induced pluripotent stem cells derived from mouse pancreas. Genes Cells. 20 (5), 367-381 (2015).
  41. Vaskova, E. A., Stekleneva, A. E., Medvedev, S. P., Zakian, S. M. 'Epigenetic memory' phenomenon in induced pluripotent stem cells. Acta Naturae. 5 (4), 15-21 (2013).
  42. Bar-Nur, O., Russ, H. A., Efrat, S., Benvenisty, N. Epigenetic memory and preferential lineage-specific differentiation in induced pluripotent stem cells derived from human pancreatic islet beta cells. Cell Stem Cell. 9 (1), 17-23 (2011).
  43. Jandial, R., Levy, M. L. Cellular alchemy: induced pluripotent stem cells retain epigenetic memory. World Neurosurg. 75 (1), 5-6 (2011).
  44. Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
  45. Ohi, Y., et al. Incomplete DNA methylation underlies a transcriptional memory of somatic cells in human iPS cells. Nat Cell Biol. 13 (5), 541-549 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Pierwotna hodowla kom rektransdukcja lentiwirusowaprotok reprogramowaniapobieranie pr bek z dr g oddechowych u dziecipo ywka dla hESCpowlekanie MEFekspansja koloniisystem bez kom rek karmia cracks
Hoduj pierwotne komórki nabłonka nosa od dzieci i przeprogramuj je w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.