Artykuł metodologiczny

Optyczna kontrola białka neuronalnego za pomocą genetycznie kodowanego nienaturalnego aminokwasu w neuronach

DOI:

10.3791/53818

⸱

28 marca 2016

 ,  , 
1Department of Neuroscience, School of Medicine, Tufts University, 2Molecular Neurobiology Laboratory, The Salk Institute for Biological Studies, 3Department of Pharmaceutical Chemistry and the Cardiovascular Research Institute, University of California, San Francisco

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj przedstawiono procedurę selektywnej aktywacji białka neuronalnego za pomocą krótkiego impulsu światła poprzez genetyczne kodowanie fotoreaktywnego nienaturalnego aminokwasu do docelowego białka neuronalnego wyrażanego w neuronach w hodowli lub in vivo.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fotostymulacja to nieinwazyjny sposób kontrolowania zdarzeń biologicznych z doskonałą rozdzielczością przestrzenną i czasową. Pożądane są nowe metody fotoregulacji białek endogennych ulegających ekspresji w ich naturalnym środowisku. W tym miejscu przedstawiamy podejście do optycznej kontroli funkcji białka neuronalnego bezpośrednio w neuronach za pomocą genetycznie kodowanego nienaturalnego aminokwasu (Uaa). Wykorzystując ortogonalną parę syntetazy tRNA / aminoacylo-tRNA do tłumienia bursztynowego kodonu, fotoreaktywna 4,5-dimetoksy-2-nitrobenzylo-cysteina Uaa (Cmn) jest specyficznie włączona do porów białka neuronalnego Kir2.1, kanału potasowego korygującego wewnętrznie. Masywny Cmn fizycznie blokuje pory kanału, sprawiając, że Kir2.1 nie przewodzi. Oświetlenie świetlne natychmiast przekształca Cmn w mniejszy naturalny aminokwas Cys, aktywując funkcję kanału Kir2.1. Wyrażamy teindukowane iwewnętrznie rektyfikujące kanały potasowe (PIRK) w pierwotnych neuronach hipokampa szczura i wykazujemy, że aktywacja światłem PIRK zatrzymuje odpalanie neuronów z powodu odpływu prądu K + przez aktywowane kanały Kir2.1. Korzystając z elektroporacji in utero, wyrażamy również PIRK w embrionalnej korze nowej myszy in vivo, pokazując aktywację światłem PIRK w neuronach kory nowej. Genetycznie kodowane Uaa nie nakłada żadnych ograniczeń na docelowy typ białka lub lokalizację komórkową, a rodzina fotoreaktywnych Uaa jest dostępna do modulowania różnych naturalnych reszt aminokwasowych. Technika ta ma zatem potencjał do ogólnego zastosowania do wielu białek neuronalnych w celu uzyskania optycznej regulacji różnych procesów zachodzących w mózgu. Obecny protokół przedstawia przystępną procedurę skomplikowanego włączania Uaa do neuronów in vitro i in vivo w celu uzyskania fotokontroli aktywności białek neuronalnych na poziomie molekularnym.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W porównaniu do konwencjonalnej stymulacji elektrycznej, fotostymulacja oferuje większą rozdzielczość czasową i przestrzenną przy minimalnej ingerencji w fizjologiczny system próbek. Od czasu demonstracji użycia laserów do stymulacji neuronów w 1971 roku1 wynaleziono wiele kreatywnych sposobów egzogennego kontrolowania aktywności neuronalnej za pomocą światła. Optyczne uwalnianie agonistów w klatkach jest od dawna wykorzystywane do badania fizjologicznej odpowiedzi sieci neuronalnej na ligandy2,3,4. Technika ta ma ograniczoną specyficzność ze względu na dyfuzję agonistów w klatkach. Specyficzność genetyczna jest osiągana poprzez ektopową ekspresję światłoczułych kanałów opsyny i pomp5,6,7 i została z powodzeniem zastosowana do modulacji wybranych sieci neuronalnych w różnych organizmach modelowych. Jednak zastosowanie tej metody do optycznej kontroli różnych innych białek neuronalnych byłoby trudne, ponieważ przeszczepienie fotoreakcji z białek opsyny do innych białek wymagałoby intensywnej inżynierii, która może zmienić naturalne cechy badanego białka. Chemiczne wiązanie egzogennego światłoczułego liganda z białkiem wykazało inny sposób kontrolowania funkcjonalności białek kanałowych8,9,10. Ligand jest prezentowany lub usuwany z miejsca wiązania białka poprzez fotoizomeryzację ugrupowania azobenzenowego. Chemia tetheringu ogranicza aplikację głównie do zewnątrzkomórkowej strony białek błonowych, z wyłączeniem strony wewnątrzkomórkowej i białek wewnątrzkomórkowych.

Fotoczułe Uaas, po włączeniu do białek, dostarczają ogólnej strategii manipulowania białkami za pomocą światła. We wczesnych wysiłkach tRNA chemicznie acylowane za pomocą fotoklatowanych Uaas zostały mikrowstrzyknięte do oocytów Xenopus w celu włączenia Uaas do receptorów błonowych i kanałów jonowych11, co pogłębiło zrozumienie ich zależności struktura-funkcja12,13,14. To podejście oparte na mikroiniekcjach ogranicza się głównie do dużych oocytów. Genetyczna inkorporacja Uaa omija technicznie trudną acylację tRNA i mikroiniekcję przy użyciu ortogonalnej pary tRNA / syntetazy, która włącza Uaa poprzez endogenną translację białek w żywych komórkach15,16,17,18. Wykazano włączenie Uaa do białek neuronalnych w pierwotnych neuronach i nerwowych komórkach macierzystych19,20. Niedawno światłoczułe Uaa zostały po raz pierwszy genetycznie włączone do białka neuronalnego w mózgu ssaków in vivo 21. Postępy te umożliwiają badanie białek neuronalnych za pomocą Uaa w ich naturalnym środowisku komórkowym.

Wewnętrzny kanał potasowy Kir2.1 jest silnym prostownikiem, który łatwiej przepuszcza prądy K+ do komórki niż z niej, i jest niezbędny do regulacji procesów fizjologicznych, w tym pobudliwości komórek, napięcia naczyniowego, tętna, przepływu soli nerkowej i uwalniania insuliny22. Nadekspresja Kir2.1 hiperpolaryzuje potencjał błonowy neuronu docelowego, który staje się mniej pobudliwy23,24. Aby optycznie kontrolować Kir2.1 w jego natywnych komórkach, Kang i wsp. genetycznie włączył reagujący na światło Uaa do Kir2.1 ulegający ekspresji w komórkach ssaków, neuronach i embrionalnych mózgach myszy21. Krótki impuls światła był w stanie przekształcić Uaa w naturalny aminokwas Cys, aktywując w ten sposób docelowe białko Kir2.1. Kiedy to fotoindukowane wewnętrznie korygujące białko kanału potasu (PIRK) uległo ekspresji w pierwotnych neuronach hipokampa szczura, stłumiło odpalanie neuronów w odpowiedzi na aktywację światła. Ponadto kanał PIRK uległ ekspresji w embrionalnej korze nowej myszy i zmierzono aktywowany światłem prąd PIRK w neuronach korowych. Udane wdrożenie technologii Uaa in vivo w mózgu ssaków otwiera drzwi do optycznej kontroli białek neuronalnych w ich naturalnym środowisku, co umożliwi optyczną analizę procesów i mechanizmów neuronalnych na poziomie molekularnym.

W tym protokole opisujemy procedury genetycznej inkorporacji Uaas do pierwotnych neuronów w hodowli oraz do embrionalnego mózgu myszy in vivo. Fotoczułe Uaa Cmn i Kir2.1 są używane do zilustrowania tego procesu. Przedstawiono metody oceny udanej inkorporacji Uaa i optycznej kontroli aktywności białek neuronalnych. Protokół ten stanowi jasny przewodnik po genetycznym kodowaniu Uaa w neuronach i in vivo oraz o optycznej regulacji funkcji białek neuronalnych za pomocą światłoczułego Uaa. Oczekujemy, że protokół ten ułatwi przyjęcie technologii Uaa in vivo w neuronauce i optogenetycznych badaniach biologicznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury w obecnym badaniu zostały przeprowadzone przy użyciu zatwierdzonych przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) protokołów postępowania ze zwierzętami w The Salk Institute for Biological Studies, La Jolla, CA.

1. Włączenie Uaa do Kir2.1 i ekspresja wynikowego PIRK w pierwotnej kulturze neuronalnej

  1. Budowa DNA
    1. Wybierz docelową lokację Kir2.1 do inkorporacji Uaa. Wykorzystaj wcześniejszą wiedzę i informacje o strukturze i funkcji Kir2.1, tak aby wybrane miejsce z włączonym fotoczułym Uaa umożliwiało optyczną modulację funkcjiKir2.1 21.
    2. Skonstruuj rekombinowany DNA kodujący gen Kir2.1 z wybranym miejscem zmutowanym do bursztynowego kodonu stop TAG. Użyj standardowych technik klonowania25, aby sklonować DNA Kir2.1-TAG do plazmidu ekspresyjnego ssaków.
    3. Klonowanie genów tRNA/syntetazy, które są specyficzne dla Uaa i włączają Uaa w odpowiedzi na kodon stop TAG do innego plazmidu ekspresyjnego ssaków21,
      Uwaga: W celu optymalnego włączenia Uaa, różne promotory i kombinacje kaset genów (dla tRNA, syntetazy i Kir2.1) mogą być testowane w różnych plazmidach.
    4. Uzyskaj wysokiej jakości plazmidowe DNA za pomocą komercyjnych zestawów miniprep lub maxiprep zgodnie z protokołem producenta. Około 1,9 proporcji 260/280 jest optymalne dla oczyszczonego DNA. W razie potrzeby wykonaj elektroforezę w żelu agarozowym, aby sprawdzić czystość przygotowanego DNA25. Superskręcone plazmidowe DNA o wysokiej czystości są najlepsze do transfekcji neuronów.
  2. Kultura Szczur Hipokamp Neurony pierwotne
    1. Umieścić szklane szkiełka nakrywkowe (kółka o średnicy 12 mm) na płytkach 24-dołkowych, po jednym szkiełku nakrywkowym na każdym dołku i pokryć każdą studzienkę 250 μl 0,5 mg/ml poli-D-lizyny (w 100 mM buforze boranowym: 1,24 g kwasu borowego i 1,90 g tetraboranu sodu w 400 ml dejonizowanego destylowanegoH2OlubddH2Oo o pH 8,5) przez ponad 10 godzin w temperaturze pokojowej, Zamknięte. Przygotuj około 10-12 powlekanych szkiełek nakrywkowych na szczenię.
    2. W dniu sekcji należy pobrać mózgi noworodków od pourodzeniowych szczeniąt szczurów (1-4 dni po urodzeniu) po znieczuleniu ich izofluranem i ścięciu głowy. Znieczulenie szczeniąt należy umieścić w komorze anestezjologicznej zawierającej izofluran (2-4%). Poczekaj, aż stracą przytomność i nie będą reagować na bodźce dotykowe i szczypanie łap.
    3. Stosując standardową technikę26, wypreparuj hipokampy z mózgu w ciepłym (~37 °C) roztworze soli fizjologicznej (10 mM HEPES i 20 mM D-glukozy dodanych do zbilansowanego roztworu soli Hanka) i zbierz hipokampy w stożkowej probówce z 4,5 ml ciepłej soli fizjologicznej.
    4. Dodać 500 μl 2,5% trypsyny do hipokampa (0,25% końcowego stężenia trypsyny) i inkubować przez 10 minut w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C.
    5. Dokładnie spłucz tkankę solą fizjologiczną (3 x 10 ml) i rozetrzyj.
    6. Odzyskaj zdysocjowane neurony w 1 ml ciepłej pożywki wzrostowej zawierającej minimum niezbędne podłoże (MEM) uzupełnione 5% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 21,2 mM D-glukozy, 2 mM L-glutaminy, 2% B-27 i 0,1% przedłużacza surowicy.
      Uwaga: Dodaj L-glutaminę i B-27 w dniu sekcji, aby przygotować świeże podłoże wzrostowe.
    7. Policz neurony za pomocą hemocytometru i umieść je na szkiełkach nakrywkowych na 24-dołkowych płytkach o gęstości 1,0-1,5 x 105 komórek/dołków z 500 μl pożywki wzrostowej po przefiltrowaniu przez nylonową siatkę 40 μm.
    8. Inkubować kulturę neuronalną w temperaturze 35 °C w inkubatorze nawilżonym powietrzem o stężeniu 5% CO2: 95% przez 2-3 tygodnie. Aby uzyskać najlepszy wynik, unikaj w jak największym stopniu zakłócania kultury podczas inkubacji.
  3. Transfekcja fosforanu wapnia (Ca-P) pierwotnej kultury neuronalnej
    1. Sporządzać roztwory podstawowe i przechowywać w temperaturze 4 °C: 0,5 M buforu BES (kwas N,N-bis[2-hydroksy-etylo]-2-aminoetanosulfonowy) (10x); 150 mM Na2HPO4 (100x); 2,8 M NaCl (10x); sterylne ddH2O; sterylne 1 N NaOH.
    2. W dniu transfekcji przygotować świeży 2,5 M roztwór CaCl2 w ddH2O i sterylnym filtrze z filtrem 0,22 μm. Przygotuj świeży bufor soli fizjologicznej (BBS) buforowany przez BES zawierający 50 mM BES, 1,5 mM Na2HPO4 i 280 mM NaCl przy pH 7,00 (dostosuj pH z NaOH) i sterylny filtr z filtrem 0,22 μm.
      Uwaga: Obliczyć ilość roztworu CaCl2 i buforu BBS w zależności od liczby szkiełek nakrywkowych, które mają być transfekowane. Spójrz także na 1.3.4.
    3. Zastąp pożywkę hodowlaną świeżą, wstępnie ogrzaną pożywką wzrostową do transfekcji. (Pożywki transfekcyjne mogą być wykonane z MEM plus 21,2 mM D-glukozy).
      Uwaga: Nie wyrzucaj starych nośników.
    4. Obliczyć ilość ddH2O i przygotować do dodania w celu przygotowania roztworu do transfekcji (33 μl na każde szkiełko nakrywkowe) zawierającego 1,65 μl CaCl2, 0,7 μg DNA i 16,5 μl 2x BBS.
    5. Przygotuj roztwór do transfekcji bezpośrednio przed dodaniem go do kultury. Aby się przygotować, najpierw połącz CaCl2 i ddH2O, powoli mieszając probówkę. Kontynuuj mieszanie i powoli dodawaj DNA do roztworu. Na koniec dodaj kroplami 2x bufor BBS podczas mieszania.
    6. Natychmiast dodać 30 μl roztworu do transfekcji do każdego szkiełka nakrywkowego hodowli neuronalnej.
    7. Kilkakrotnie rozbujaj naczynie hodowlane, aby wymieszać roztwór i inkubować w temperaturze 35 °C w inkubatorze z wilgotnością powietrza o stężeniu 5% CO2: 95% przez 45 minut – 1 godzinę. Po inkubacji neuronów z roztworem do transfekcji, bardzo drobne osady Ca-P utworzą warstwę pokrywającą neurony.
    8. Zastąpić pożywkę transfekcyjną 500 μl wstępnie podgrzanym buforem myjącym (135 mM NaCl, 20 mM HEPES, 4 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 1 mM Na2HPO4, 10 mM glukozy o pH 7,3, sterylnie przefiltrowanym filtrem 0,22 μm) i inkubować w temperaturze 35 °C w 5% CO2: Inkubator nawilżony powietrzem w 95% przez 15-20 min. Osady Ca-P zniknęłyby po etapie mycia.
    9. Zastąp bufor myjący 500 μl świeżej pożywki wzrostowej. Ponownie zastąp nośnik wzrostu zapisanym oryginalnym nośnikiem.
    10. Dodaj Uaa Cmn (wstępnie zmieszany z 50 μl ciepłej pożywki wzrostowej) do kultury, aby osiągnąć końcowe stężenie 1 mM.
    11. Inkubować transfekowaną kulturę w temperaturze 35 °C w inkubatorze z wilgotnością powietrza o stężeniu 5% CO2 : 95% przez 12–48 godzin przed oznaczeniami.
  4. Nagrywanie całej komórki z aktywacją światłem
    1. Przygotuj roztwory zewnątrz/wewnątrzkomórkowe. Roztwór wewnątrzkomórkowy zawiera 135 mM glukonianu potasu, 10 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 1 mM EGTA, 2,56 mM K2ATP i 0,3 mM Li2GTP przy pH 7,4. Zewnątrzkomórkowy roztwór zapisowy zawiera 150 mM NaCl, 3 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0,5 mM CaCl2, 5 mM glukozy i 10 mM HEPES o pH 7,4.
    2. Skonfiguruj stanowisko elektrofizjologiczne do zaciskania krosek całokomórkowych: mikroskop wyposażony w obiektywy 4X i 20X, różnicowy kontrast interferencyjny (DIC) i filtr mCitrine (wzbudzenie: 495/10 nm, emisja: 525/25 nm); manipulator; wzmacniacz patch-clamp; digitizer; oprogramowanie do akwizycji i analizy danych.
      1. Zainstaluj diodę elektroluminescencyjną (LED) o emisji 385 nm przez mikroskop na statywie, aby dostarczyć światło do punktu ogniskowego z odległości 1 cm pod kątem 45°. Sprawdź moc diody LED za pomocą miernika mocy światła.
    3. Wyciągnij pipety krosowe ze szklanych elektrod za pomocą dostępnego w handlu ściągacza do mikropipet, aby uzyskać rezystancję pipet 3-6 MΩ. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, aby skonfigurować ściągacz do mikropipet.
      1. Aby sprawdzić rezystancję pipety, najpierw napełnij ją roztworem wewnątrzkomórkowym i umieść ją na uchwycie elektrody. Zanurzyć pipetę w naczyniu hodowlanym o średnicy 35 mm wypełnionym roztworem zewnątrzkomórkowym, umieszczonym na platformie mikroskopu. Zanurz elektrodę uziemiającą w naczyniu, aby zakończyć obwód.
      2. Włącz wzmacniacz/digitizer i uruchom oprogramowanie do akwizycji danych. Monitoruj rezystancję pipet za pomocą protokołu testu membranowego.
    4. Wyjmij szkiełko nakrywkowe z hodowli neuronów z inkubatora i spłucz raz w roztworze zewnątrzkomórkowym. Używając tłuszczu próżniowego, przytrzymaj szkiełko nakrywkowe na środku naczynia hodowlanego o średnicy 35 mm wypełnionego świeżym roztworem zewnątrzkomórkowym.
    5. Umieść szkiełko nakrywkowe/naczynie na platformie mikroskopu elektrofizjologicznego.
    6. Korzystając ze standardowych technik zaciskania plastrów, załataj neuron fluorescencją mCitrine27. Rejestruj aktywność neuronalną za pomocą metody cęgów prądowych (I-clamp). Najpierw dostosuj potencjał spoczynkowy do około -72 mV, wstrzykując niewielki prąd. Następnie wstrzyknąć prąd krokowy (10-200 pA) w celu wywołania ciągłego wyzwalania (5-15 Hz) potencjałów czynnościowych.
    7. Ręcznie lub za pomocą oprogramowania do akwizycji danych wyślij impuls (pojedynczy impuls trwający od 100 mss do 1 sekundy) światła LED do neuronu podczas nagrywania i sprawdź, czy ma to wpływ na potencjały czynnościowe.
    8. Dodać 0,5 mM BaCl2 do kąpieli i sprawdzić, czy potencjały czynnościowe zostały odzyskane.

2. Włączenie Uaa do Kir2.1 i ekspresja wynikowego PIRK w embrionalnym mózgu myszy in vivo

  1. Budowa DNA
    1. Zaprojektuj plazmidowe DNA podobnie jak w kroku 1.1. Do ekspresji in vivo należy użyć silnego promotora, takiego jak CAG (promotor beta-aktyny z kurczaka ze wzmacniaczem CMV).
    2. Oczyść DNA za pomocą komercyjnego zestawu maxiprep bez endotoksyn zgodnie z protokołem producenta. Przeprowadzić ekstrakcję fenolowo-chloroformową, a następnie wytrącić etanol25, aby uzyskać wyjątkowo wysokiej jakości DNA (skondensowane do 2-5 μg/μl).
  2. Elektroporacja w macicy do embrionalnej kory nowej myszy
    Uwaga: Podstawowa technika elektroporacji in utero została opisana wcześniej28.
    1. Znieczulenie ciężarnej myszy w 14,5 (E14,5) dnia zarodkowego (E14,5) należy znieczulić pentobarbitalem sodu (wstrzyknięcie dootrzewnowe, 50 μg na gram masy ciała) lub izofluranem (inhalacja, 2-4%). Monitoruj głębokość znieczulenia, sprawdzając utratę przytomności i brak reakcji na bodźce dotykowe oraz na szczypanie łap.
    2. Wykonaj małe nacięcie na linii środkowej brzucha. Delikatnie odsłoń rogi macicy za pomocą kleszczy i opuszków palców.
    3. Wstrzyknąć około 1 μl roztworu DNA (2-5 μg/μl każdego plazmidu, w zależności od konstrukcji) do bocznej komory każdego rodzeństwa za pomocą szklanej pipety wprowadzonej przez ścianę macicy. W większości przypadków wstrzykuje się około 60-80% wszystkich zarodków.
    4. Elektroporuj zarodki za pomocą elektroporatora (33-35 V, czas trwania 50 ms, interwał 950 ms, 4-8 impulsów).
    5. Delikatnie przywróć rogi macicy do jamy brzusznej za pomocą kleszczy i opuszków palców. Zszyj ścianę mięśniową, a następnie skórę szwem chirurgicznym, aby umożliwić zarodkom dalszy rozwój.
  3. Mikroiniekcja Uaa
    1. Ponownie wykonaj małe nacięcie na linii środkowej brzucha w punkcie E16.5 i delikatnie odsłoń rogi macicy za pomocą kleszczy i opuszków palców.
    2. Wstrzyknąć około 2-5 μl Cmn-Ala (500 mM) po stronie elektroporowanej lub po obu stronach komory bocznej za pomocą szklanej pipety wprowadzonej przez ścianę macicy. Aby zwiększyć biodostępność Cmn, należy użyć dipeptydu Cmn-Ala (Cmn-alanina) w celu dostarczenia Cmn in vivo21.
    3. Ponownie delikatnie przywróć rogi macicy do jamy brzusznej za pomocą kleszczy i opuszków palców. Zszyj ścianę mięśniową, a następnie skórę szwem chirurgicznym, aby umożliwić zarodkom dalszy rozwój.
  4. Uzyskaj ostre wycinki mózgu
    1. Wykonać 1 l sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (ACSF) zawierającego 119 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,3 mM MgCl2, 2,5 mM CaCl2, 1 mM NaH2PO4, 26,2 mM NaHCO3 i 11 mM glukozy o pH 7,3.
    2. Weź 200 ml ACSF i szybko zamrażaj w temperaturze -80 °C przez 20-30 minut. Resztę ACSF zatruj 5% gazem CO2 : 95% O2 w temperaturze pokojowej.
    3. Przygotuj i wysterylizuj narzędzia chirurgiczne do pobierania mózgów z zarodków. Przygotuj również wiadro lodu.
    4. Przygotować ~ 100 ml 4% roztworu agarozy o niskiej temperaturze topnienia w kolbie, podgrzewając w kuchence mikrofalowej. Schłodzić roztwór przez około 5 minut, zanim zacznie krzepnąć.
    5. Poddaj mysz eutanazji 12-24 godziny po wstrzyknięciu Cmn-Ala przez przedawkowanie CO2. Wykonaj duże nacięcia w okolicy brzucha i wypreparuj elektroporowane/mikrowstrzyknięte zarodki z macicy za pomocą cienkich nożyczek i kleszczy.
    6. Zbierz mózgi z zarodków cienkimi nożyczkami i kleszczami.
    7. Umieść każdy mózg na 10-centymetrowym naczyniu hodowlanym umieszczonym na wiaderku z lodem. Podziel dwie półkule za pomocą ostrego ostrza i umieść każdą półkulę na naczyniu tak, aby płaszczyzna środkowa dotykała dna naczynia. Szybko zalej roztworem agarozy mózgi (około 500 μl na półkulę).
    8. Za pomocą ostrego ostrza przetnij agarozę pod kątem prostym wokół mózgu, aby uzyskać osadzony w mózgu blok agarozy.
    9. Za pomocą kleju tkankowego przyklej środkową powierzchnię płaszczyzny strzałkowej bloku agarozowego na uchwycie do wibratomu. Napełnij komorę wibratomu wstępnie schłodzonym ACSF i wytnij 200 μm strzałkowe plastry mózgu.
    10. Inkubować ostre plastry w ACSF uzupełnione 3 mM mio-inozytolem, 0,4 mM kwasem askorbinowym i 2 mM pirogronianem sodu w temperaturze 33 °C przez 42 minuty, bulgocząc 5% gazem CO2: 95%O2.
    11. Po 42 minutach wyłącz grzejnik i kontynuuj inkubację plastrów w temperaturze pokojowej z bulgotaniem. Rozpocznij nagrywanie łatek na całe komórki co najmniej 15 minut po wyłączeniu grzałki.
  5. Nagrywanie całej komórki z aktywacją światłem
    1. Przygotować roztwór wewnątrzkomórkowy zawierający 130 mM glukonianu potasu, 4 mM MgCl2, 5 mM HEPES, 1,1 mM EGTA, 3,4 mM Na2ATP, 10 mM fosforanu kreatyny sodu i 0,1 mM Na3GTP przy pH 7,3 skorygowanym KOH.
    2. Wyciągnij pipety krosowe ze szklanych elektrod za pomocą dostępnego w handlu ściągacza do mikropipet, aby uzyskać rezystancję pipet 3-6 MΩ.
    3. Skonfiguruj urządzenie do elektrofizjologii plastrów do zaciskania kropek na całe komórki i połącz komorę rejestracyjną z ACSF z szybkością 2 ml/min za pomocą pompy perfuzyjnej. Ustaw temperaturę komory na około 33 °C.
      Uwaga: Stanowisko do elektrofizjologii slice jest wyposażone w komorę perfuzyjną, obiektyw do zanurzenia w wodzie i regulator temperatury. Wymagany jest również filtr GFP (wzbudzenie: 480/30 nm, emisja: 535/40 nm) oraz filtr mCherry (wzbudzenie: 580/20 nm, emisja: 675/130 nm).
      1. Zainstaluj diodę LED o emisji 385 nm przez mikroskop na statywie, aby dostarczyć światło do punktu ogniskowego z odległości 1 cm pod kątem 45°. Sprawdź moc diody LED za pomocą miernika mocy światła.
    4. Ostrożnie podnieś plasterek mózgu szklaną pipetą i umieść go w komorze perfuzyjnej. Przytrzymaj plasterek za pomocą harfy.
    5. Łatać neuron fluorescencją mCherry/GFP z obszaru kory nowej27. Rejestruj aktywność PIRK za pomocą metody cęgów napięciowych (V-clamp). Po pierwsze, utrzymuj potencjał membranowy na poziomie -60 mV. Następnie rejestruj prądy przy stałych ujemnych potencjałach błonowych (-100 mV) lub rampach napięcia (-100 mV do +40 mV). W szczególności monitoruj prądy wewnętrzne specyficzne dla Kir2.1 przy -100 mV.
    6. Ręcznie lub za pomocą oprogramowania do akwizycji danych wyślij impuls (pojedynczy impuls trwający od 100 mss do 1 sekundy) światła LED do neuronu podczas nagrywania i sprawdź, czy białka PIRK są aktywowane. Po aktywacji PIRK prądy wewnętrzne o napięciu -100 mV znacznie wzrosną.
    7. Dodać 0,5 mM BaCl2 do kąpieli i sprawdzić, czy PIRK jest ponownie inaktywowany.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby genetycznie włączyć Uaa do białka w neuronach, pierwszym ważnym krokiem jest zaprojektowanie odpowiednich konstruktów genów, które efektywnie dostarczałyby i wyrażały geny w neuronach. Istnieją trzy składniki genetyczne do inkorporacji Uaa: (1) gen docelowy z bursztynowym kodonem stop TAG wprowadzonym w wybranym miejscu do inkorporacji Uaa, (2) ortogonalnym tRNA do rozpoznania zmutowanego kodonu stop TAG oraz (3) ortogonalną syntetazą aminoacylo-tRNA do ładowania Uaa na ortogonalny tR...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby osiągnąć skuteczną fotomodulację, ważnym początkowym krokiem jest podjęcie decyzji, gdzie włączyć światłoczułe Uaa do docelowego białka. Informacje strukturalne i funkcjonalne białka docelowego są bardzo pomocne w wyborze potencjalnych miejsc. Jednocześnie cel regulacji światła określałby, które miejsce jest najbardziej odpowiednie. Po wybraniu potencjalnych lokalizacji zalecamy przetestowanie miejsc w liniach komórkowych ssaków, takich jak ludzkie komórki embrionalne nerki (HEK) w celu łatwiejszej hodowli i manipula...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Dr. S. Szobota za pomocną dyskusję na temat hodowli neuronów i transfekcji Ca-P. L.W. dziękuje za wsparcie od The Salk Innovation Grant, California Institute for Regenerative Medicine (RN1-00577-1) oraz National Institutes of Health (1DP2OD004744).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Okulary nakrywkowe, koła, 12 mm, grubość 0,13-0,17 mmCarolina Biologicals633029
Corning BioCoat Poly-D-LizynaCorning Discovery Labware354210
Roztwór D-(+)-glukozySigma-AldrichG8769
Iris Spatula-zakrzywionado nauki o naborze10092-12
Nóż preparacyjny - końcówka o cienkimkącieFine Science Tool10056-12
GlutaMAX-I SuplementLife Technologies35050-061
MITO+ Przedłużacz surowicyBD Biosciences355006
Falcon 40 µ m Sitko do komórekCorning Life Sciences352340
BES (N,N,N-Bis(2-hydroksyetylo)-2-aminoetanosulfonowy, N,N-Bis(2-hydroksyetylo)tauryna)Sigma-AldrichB6420
ŹRÓDŁO ŚWIATŁA LED – dioda LED 385Prizmatix Sp. z o.o.
Agaroza, niska temperatura topnienia, klasa analitycznaPromegaV2111
narzędzie

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fork, R. L. Laser Stimulation of Nerve Cells in Aplysia. Science. 171 (3974), 907-908 (1971).
  2. Callaway, E. M., Katz, L. C. Photostimulation using caged glutamate reveals functional circuitry in living brain slices. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90 (16), 7661-7665 (1993).
  3. Cambridge, S. B., et al. Doxycycline-dependent photoactivated gene expression in eukaryotic systems. Nat. Methods. 6 (7), 527-531 (2009).
  4. Yoshimura, Y., Dantzker, J. L., Callaway, E. M. Excitatory cortical neurons form fine-scale functional networks. Nature. 433 (7028), 868-873 (2005).
  5. Bernstein, J. G., Boyden, E. S. Optogenetic tools for analyzing the neural circuits of behavior. Trends Cogn. Sci. 15 (12), 592-600 (2011).
  6. Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annu. Rev. Neurosci. 34 (1), 389-412 (2011).
  7. Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
  8. Banghart, M., Borges, K., Isacoff, E., Trauner, D., Kramer, R. H. Light-activated ion channels for remote control of neuronal firing. Nat. Neurosci. 7 (12), 1381-1386 (2004).
  9. Volgraf, M., et al. Allosteric control of an ionotropic glutamate receptor with an optical switch. Nat. Chem. Biol. 2 (1), 47-52 (2006).
  10. Szobota, S., Isacoff, E. Y. Optical control of neuronal activity. Annu. Rev. Biophys. 39 (1), 329-348 (2010).
  11. England, P. M., Lester, H. A., Davidson, N., Dougherty, D. A. Site-specific, photochemical proteolysis applied to ion channels in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94 (20), 11025-11030 (1997).
  12. England, P. M., Lester, H. A., Dougherty, D. A. Mapping disulfide connectivity using backbone ester hydrolysis. Biochemistry. 38 (43), 14409-14415 (1999).
  13. Philipson, K. D., Gallivan, J. P., Brandt, G. S., Dougherty, D. A., Lester, H. A. Incorporation of caged cysteine and caged tyrosine into a transmembrane segment of the nicotinic ACh receptor. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 281 (1), C195-C206 (2001).
  14. Tong, Y., et al. Tyrosine decaging leads to substantial membrane trafficking during modulation of an inward rectifier potassium channel. J. Gen. Physiol. 117 (2), 103-118 (2001).
  15. Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu. Rev. Biochem. 79 (1), 413-444 (2010).
  16. Wang, L., Brock, A., Herberich, B., Schultz, P. G. Expanding the genetic code of Escherichia coli. Science. 292 (5516), 498-500 (2001).
  17. Wang, L., Xie, J., Schultz, P. G. Expanding the genetic code. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35 (1), 225-249 (2006).
  18. Wang, Q., Parrish, A. R., Wang, L. Expanding the genetic code for biological studies. Chem. Biol. 16 (3), 323-336 (2009).
  19. Shen, B., et al. Genetically encoding unnatural amino acids in neural stem cells and optically reporting voltage-sensitive domain changes in differentiated neurons. Stem Cells. 29 (8), 1231-1240 (2011).
  20. Wang, W., et al. Genetically encoding unnatural amino acids for cellular and neuronal studies. Nat. Neurosci. 10 (8), 1063-1072 (2007).
  21. Kang, J. Y., et al. In vivo expression of a light-activatable potassium channel using unnatural amino acids. Neuron. 80 (2), 358-370 (2013).
  22. Bichet, D., Haass, F. A., Jan, L. Y. Merging functional studies with structures of inward-rectifier K(+) channels. Nat. Rev. Neurosci. 4 (12), 957-967 (2003).
  23. Burrone, J., O'Byrne, M., Murthy, V. N. Multiple forms of synaptic plasticity triggered by selective suppression of activity in individual neurons. Nature. 420 (6914), 414-418 (2002).
  24. Johns, D. C., Marx, R., Mains, R. E., O'Rourke, B., Marban, E. Inducible genetic suppression of neuronal excitability. J. Neurosci. 19 (5), 1691-1697 (1999).
  25. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A laboratory manual. , 3rd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2001).
  26. Beaudoin, G. M. III, et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nat. Protoc. 7 (9), 1741-1754 (2012).
  27. Molleman, A. Patch Clamping: An Introductory Guide To Patch Clamp Electrophysiology. , John Wiley & Sons, Ltd. (2003).
  28. Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J. Vis. Exp. (6), e239(2007).
  29. Lemke, E. A., Summerer, D., Geierstanger, B. H., Brittain, S. M., Schultz, P. G. Control of protein phosphorylation with a genetically encoded photocaged amino acid. Nat. Chem. Biol. 3 (12), 769-772 (2007).
  30. Coin, I., et al. Genetically encoded chemical probes in cells reveal the binding path of urocortin-I to CRF class B GPCR. Cell. 155 (6), 1258-1269 (2013).
  31. Takimoto, J. K., Xiang, Z., Kang, J. Y., Wang, L. Esterification of an unnatural amino acid structurally deviating from canonical amino acids promotes its uptake and incorporation into proteins in mammalian cells. Chembiochem. 11 (16), 2268-2272 (2010).
  32. Parrish, A. R., et al. Expanding the Genetic Code of Caenorhabditis elegans Using Bacterial Aminoacyl-tRNA Synthetase/tRNA Pairs. ACS Chem. Biol. 7 (7), 1292-1302 (2012).
  33. Lu, H., Klaassen, C. Tissue distribution and thyroid hormone regulation of Pept1 and Pept2 mRNA in rodents. Peptides. 27 (4), 850-857 (2006).
  34. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
  35. Plaster, N. M., et al. Mutations in Kir2.1 cause the developmental and episodic electrical phenotypes of Andersen's syndrome. Cell. 105 (4), 511-519 (2001).
  36. Priori, S. G., et al. A novel form of short QT syndrome (SQT3) is caused by a mutation in the KCNJ2 gene. Circ. Res. 96 (7), 800-807 (2005).
  37. Beene, D. L., Dougherty, D. A., Lester, H. A. Unnatural amino acid mutagenesis in mapping ion channel function. Curr Opin Neurobiol. 13 (3), 264-270 (2003).
  38. Hoppmann, C., et al. Genetically encoding photoswitchable click amino acids in Escherichia coli and mammalian cells. Angew Chem Int Ed Engl. 53 (15), 3932-3936 (2014).
  39. Hoppmann, C., et al. In Situ Formation of an Azo Bridge on Proteins Controllable by Visible Light. J Am Chem Soc. 137 (35), 11218-11221 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

kana Kir2 1fotoindukowalny PIRKneurony hipokampaelektroporacja in uterotransfekcja fosforanem wapniaaktywacja wiat em

Powiązane artykuły