Mechanizm regulacji liczby adipocytów w organizmach dorosłych poprzez różnicowanie i homeostazę apoptozy

Według raportu Światowej Organizacji Zdrowia z 2014 roku, 39% dorosłej populacji świata ma nadwagę, a 13% jest otyłych ¹. W niedalekiej przyszłości osoby z nadwagą będą stanowiły znaczną część populacji osób starszych. Ważną cechą otyłości i starzenia się jest rozregulowanie tłuszczu w stosunku do zachorowalności i śmiertelności ². Adipokiny, białka wydzielane przez tkankę tłuszczową (AT), mogą wywoływać zespoły metaboliczne, takie jak otyłość i cukrzyca typu 2 ³. Choroby metaboliczne są najczęściej spowodowane nadmiernym magazynowaniem energii w kropelkach lipidów adipocytów, co skutkuje ekspansją AT ⁴. W związku z tym interesujące jest określenie przyczyn i mechanizmów molekularnych ekspansji AT w celu znalezienia możliwości jej kontrolowania.

Nadmierne odżywianie prowadzi do ekspansji AT, która jest regulowana przez dwa zdarzenia: nadmierne magazynowanie energii w kropelkach lipidów adipocytów, proces prowadzący do hipertrofii (wzrost wielkości adipocytów) oraz zwiększona adipogeneza, znana również jako hiperplazja adipocytów ⁵. Adipogeneza to proces różnicowania się multipotencjalnych mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) w adipocyty. Po pierwsze, MSCs przekształcają się w preadipocyty w fazie zaangażowania. Po drugie, preadipocyty dalej różnicują się, aby nabyć cechy dojrzałych i funkcjonalnych adipocytów ⁶. Kilka czynników transkrypcyjnych zostało zidentyfikowanych jako główne regulatory do oznaczania preadipocytów, takich jak białko palca cynkowego 423 (Zfp423) i wczesny czynnik komórek B 1 (Ebf1). Podczas gdy Zfp423 indukuje wczesne zaangażowanie, Ebf1 jest niezbędny do wytwarzania komórek progenitorowych adipocytów ⁶. Różnicowanie końcowe jest ściśle kontrolowane przez kaskadę transkrypcyjną, w której γ receptora aktywowanego przez proliferatory peroksysomów (PPARγ) jest niezbędnym czynnikiem transkrypcyjnym ⁷. Innymi kluczowymi czynnikami transkrypcyjnymi są członkowie rodziny CCAAT/enhancer-binding protein (C/EBP) (tj. C/EBPα, C/EBPβ i C/EBPδ), czynniki podobne do kruppela (KLF), białko wiążące elementy reagujące na cAMP (CREB) i wczesna odpowiedź wzrostu 20 (Krox20) ⁶.

Ostatnio wykazano, że rodzina białek aktywatora-1 (AP-1) bierze udział w procesie różnicowania adipocytów ^8,9. Rodzina AP-1 jest utworzona przez dimeryczny kompleks białkowy, złożony z członków Fos, Jun i/lub aktywującego czynnika transkrypcyjnego (ATF). Antygen 1 i 2 związany z FOS (Fra-1 i Fra-2) jest w stanie regulować różnicowanie adipocytów. Fra-1 upośledza różnicowanie adipocytów poprzez hamowanie C/EBPα ⁸, podczas gdy Fra-2 kontroluje obrót adipocytów ⁹. W ten sposób Fra-2 nie tylko zmniejsza liczbę adipocytów poprzez tłumienie ekspresji PPARγ2 podczas różnicowania adipocytów, ale także zmniejsza apoptozę adipocytów poprzez bezpośrednie tłumienie ekspresji czynników indukowanych hipoksją (HIF). Rodzina HIF to heterodimeryczny kompleks czynników transkrypcyjnych, składający się z HIF-1α, HIF-2α i HIF-1β. Heterodimery składają się z wrażliwego na tlen białka HIF-α (HIF-1α lub HIF-2α) i niewrażliwej na tlen podjednostki ^{HIF-1β 10}. Podczas normoksji białka HIF-α są poliubikwitynylowane i ostatecznie degradowane przez proteasomy ¹¹. W warunkach niedotlenienia, występujących w AT podczas ekspansji, białka HIF-α nie są już hydroksylowane. W związku z tym stabilizują się i tworzą dimery z konstytutywnie wyrażonym HIF-1β. Aktywacja transkrypcyjna genów kontrolowanych przez elementy odpowiedzi HIF bierze udział w regulacji angiogenezy, metabolizmu i stanu zapalnego ¹². Rzeczywiście, HIF-1α sprzyja dysfunkcji AT poprzez indukowanie tolerancji glukozy, hamowanie wydatku energetycznego i obwodowego wykorzystania lipidów, a także poprzez zwiększanie poziomu leptyny i stłuszczenie wątroby wywołane HFD ¹³. Ponadto HIF-1α reguluje apoptozę adipocytów in vivo i in vitro⁹.

Obecny protokół opisuje metody badania statusu AT w celu rozwikłania molekularnych cech homeostazy adipocytów u dorosłych myszy. Pokazuje, w jaki sposób apoptoza, proliferacja i różnicowanie adipocytów in vivo i in vitro może być regulowane przez hipoksję. Aby to zrobić, używamy myszy z delecją Fra-2 specyficzną dla adipocytów wygenerowaną przez skrzyżowanie myszy przenoszących floksowane allele Fra-2 z myszami Fabp4-CreERT ⁹. Używając myszy Fabp4-Cre ERT, delecja jest specyficzna dla adipocytów i indukowana przez wstrzyknięcie tamoksyfenu ¹⁴. W przypadku modelu dorosłego wstrzyknięcia tamoksyfenu do otrzewnowej wykonuje się przez 5 kolejnych dni, począwszy od 6 tygodnia życia. W ten sposób myszy są poddawane normalnej diecie lub diecie wysokotłuszczowej przez 6 tygodni przed wykonaniem analizy. Myszy użyte w tym badaniu były samcami opartymi na tle C57Bl6, aby uniknąć żeńskich hormonów, takich jak estrogeny, które regulują dystrybucję tkanki tłuszczowej ^{w organizmie 15}. Użycie innego tła genetycznego może również zmienić fenotyp metaboliczny ze względu na związane ze szczepem różnice w gospodarce lipidowej ¹⁶.

Ten protokół pokazuje, jak analizować AT w warunkach niedotlenienia za pomocą histologii oraz jak ilościowo określać apoptozę, proliferację i różnicowanie adipocytów in vivo za pomocą analiz immunohistochemicznych i profilowania genów. Badanie zostało zakończone eksperymentami in vitro, pokazującymi, jak analizować pierwotne różnicowanie adipocytów i apoptozę zmienioną przez ekspozycję na niedotlenienie.

OŚWIADCZENIE ETYCZNE: Zwierzęta są trzymane w standardowych warunkach zgodnie z wytycznymi niemieckiej ustawy o dobrostanie zwierząt. Zwierzęta są karmione standardową dietą i wodą ad libitum i trzymane w 12-godzinnym cyklu dnia i nocy. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach są autoryzowane przez lokalną komisję etyczną.

1. Analiza in vivo homeostazy adipocytów u dorosłych mężczyzn

1. Aby określić ilościowo niedotlenienie in vivo, najpierw oznacz masę ciała myszy, a następnie wstrzyknij 60 mg/kg masy ciała stałego chlorowodorku pimonidazolu dootrzewnowo (na przykład: wstrzyknij 1,5 mg do myszy o masie 25 g). Pimonidazol jest skutecznym markerem hipoksyjnym, który tworzy addukty z grupami tiolowymi w białkach, peptydach i aminokwasach i jest wykrywany przez specyficzne przeciwciało.
2. Złóż w ofierze myszy i usuń okołogonadalne poduszeczki tłuszczowe (ryc. 1).
   1. 45 minut po wstrzyknięciu, ufierzyć myszy przez uduszenie CO₂ i późniejsze zwichnięcie szyjki macicy.
   2. Przypnij kończyny myszy (jak pokazano na rysunku 1) i otwórz jamę otrzewnej. Usuń lewą i prawą poduszeczkę tłuszczową okołodonową (najądrza) wewnątrz jamy otrzewnej.
      Uwaga: Poduszka tłuszczowa jest związana z najądrzem za pomocą płatków otrzewnej, jak pokazano na rycinie 1 (okołogonadalne poduszeczki tłuszczowe są oznaczone strzałkami).
   3. Uważaj, aby usunąć tkanki gonad z poduszeczki tłuszczowej. Określ masę poduszeczki tłuszczowej, aby obliczyć stosunek: masa poduszeczki tłuszczowej (g) na masę ciała (g).

Rycina 1: Lokalizacja okołogonadalnych poduszek tłuszczowych w jamie otrzewnej myszy. Obraz lokalizacji tłuszczu okołogonadalnego u dorosłych myszy po uśmierceniu. Okołogonadalne poduszeczki tłuszczowe są oznaczone strzałkami. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Aby skompilować ilościowy profil ekspresji genów, użyj jednej okołogonadalnej poduszeczki tłuszczowej do wyizolowania RNA. Uwaga: Do czasu przetworzenia tkanki należy przechowywać próbki tkanek w roztworze stabilizującym RNA w temperaturze -80 °C lub w ciekłym azocie.
   1. Aby homogenizować poduszeczkę tłuszczową, dodaj poduszeczkę tłuszczową do 1 ml jednofazowego roztworu izotiocyjanianu guanidyny i fenolu. Za pomocą probówek zawierających kulki ceramiczne (1,4 mm) rozdrobnić tkankę w homogenizatorze z prędkością 6 500 obr./min (2 razy po 20 sekund, z 30-sekundową przerwą).
   2. Wyizoluj RNA w następujący sposób (metoda jednoetapowa Chomczyńskiego i Sacchi ¹⁷).
      1. Aby oddzielić fazy, przenieść homogenizowaną poduszkę tłuszczową do probówki mikrowirówkowej, dodać 0,2 ml objętości chloroformu, wstrząsać przez 15 sekund, inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej i odwirować 12 000 x g przez 5 minut. Przenieść górną fazę wodną (około 400 μl), która zawiera RNA, do nowej probówki do mikrowirówki. Nie należy uwzględniać interfazy zawierającej DNA ani fazy fenolowej zawierającej białko.
      2. W celu wytrącenia RNA dodać 1 objętość izopropanolu, wymieszać i inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C (możliwa jest również inkubacja w temperaturze -20 °C przez noc). Wirować przy 12 000 x g przez 10 min. Ostrożnie usunąć supernatant izopropanolu. Przemyć dwukrotnie 75% etanolem w krokach wirówki 12 000 x g przez 10 minut.
      3. Po wysuszeniu wytrąconego RNA przez około 10 minut w temperaturze pokojowej należy go rozpuścić w 50 μl_H2O (bez RNaz). Aby to ułatwić, inkubować przez 2 minuty w temperaturze 65 °C.
         Uwaga: Przechowywać RNA w 75% etanolu w temperaturze -80 °C lub w ciekłym azocie do długotrwałego przechowywania.
      4. Określić ilościowo preparaty RNA za pomocą A_260/280 (optymalny iloraz wynosi od 1,8 do 2,2) i obliczyć stężenie przez A₂₆₀:
         
   3. Aby uniknąć zanieczyszczenia DNA, trawić 1 μg preparatu RNA za pomocą 1 U DNazy I przez 30 minut w temperaturze 37 °C w objętości 10 μl. Dezaktywować w temperaturze 65 °C przez 10 min.
      Uwaga: Ten krok jest opcjonalny.
   4. Użyj 10 μl preparatu RNA zawierającego 1 μg RNA do reakcji odwrotnej transkryptazy w celu wytworzenia jednoniciowego cDNA, odpowiedniego do ilościowego zastosowania PCR. Składniki i ich ilości są wymienione w tabeli 1.
   5. Użyj PCR Master Mix do ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym. Aby określić zmiany metaboliczne w całej poduszce tłuszczowej, należy użyć specyficznych starterów dla genów zaangażowanych w homeostazę AT (Tabela 2) i warunków PCR wymienionych w Tabeli 3.
   6. Analiza danych PCR w czasie rzeczywistym.
      1. Określ linię bazową (rysunek 2), zwykle cykl od 1 do 15, w którym nie ma zmian w sygnałach fluorescencyjnych. Oprogramowanie do PCR w czasie rzeczywistym normalizuje specyficzne sygnały fluorescencji do fluorescencji podstawowej i do wewnętrznego barwnika referencyjnego, ROX, co skutkuje wielkością określonych sygnałów przez startery, delta Rn (ΔRn).
      2. Ustaw próg w fazie wykładniczej krzywej wzmocnienia. Przecięcie określa cykl progowy (Ct). Na podstawie wartości CT oblicz wyrażenie względne (ΔCt) i zmianę krotności (ΔΔCt):
         
         

Pokazujemy, jak określić homeostazę adipocytów in vivo i in vitro na przykładzie myszy Fra-2fl/fl Fabp4-CreERT w porównaniu z dzikimi rodzeństwem. Nasz protokół określa, w jaki sposób zwiększona ekspresja HIF przez niedotlenienie jest skorelowana z dysfunkcją adipocytów, na co wskazuje zwiększona apoptoza adipocytów.

Zwiększony rozmiar i powierzchnia adipocytów u myszy leczonych dietą wysokotłuszczową (HFD)

Nadmierne odżywianie, między innymi, powoduje przerost adipocytów, spowodowany nadmiernym magazynowaniem energii w kropelkach lipidów. Wielkość i powierzchnia adipocytów jest wskaźnikiem hipertrofii. Odcinki poduszeczki tłuszczowej od normy (ND; Rysunek 6a) i dieta wysokotłuszczowa (HFD; Rysunek 6b) myszy, a także kwantyfikacje wielkości i obszaru adipocytów wyraźnie pokazują przerost adipocytów po 6 tygodniach HFD, na co wskazuje zwiększony rozmiar adipocytów u myszy leczonych HFD (Figura 6c i d).

Zwiększone niedotlenienie tkanki tłuszczowej (AT) dorosłych myszy Fra-2fl/fl Fabp4-CreERT prowadzi do podwyższonego poziomu HIF-1α i apoptozy adipocytów

Aby określić stan in vivo niedotlenienia w AT, myszy Fra-2fl/fl Fabp4-CreERT są analizowane 6 tygodni po delecji Fra-2 w wieku 12 tygodni i porównywane z dzikimi rodzeństwem. Pimonidazol podaje się myszom dootrzewnowo jako skuteczny marker niedotlenienia; jest nietoksyczny i może rozprowadzać się do AT. Niedotlenione adipocyty w AT in vivo są definiowane przez immunohistochemiczne barwienie przeciwciałami (ryc. 7a). Ponadto zwiększonemu statusowi niedotlenienia AT u myszy towarzyszy zwiększona liczba adipocytów HIF-1α dodatnich, na co wskazuje barwienie immunohistochemiczne Figura 7b), co potwierdza kwantyfikacja poziomów ekspresji HIF-1α i jego docelowych genów 9. Dodatkowo, barwienie TUNEL skrawków AT od myszy Fra-2fl / fl Fabp4-CreERT i rodzeństwa z miotu kontrolnego (Figura 7c) pokazuje, że zwiększona apoptoza adipocytów jest skorelowana z obecnością hipoksji i ekspresją HIF-1α.

Zwiększona ekspresja HIF-1α w pierwotnych adipocytach poprzez apoptozę adipocytów wywołaną niedotlenieniem

Do analizy apoptozy adipocytów in vitro, używamy adipocytów generowanych z podskórnych poduszeczek tłuszczowych, jak opisano w innym miejscu 20. Zgodnie z oczekiwaniami ekspresja HIF-1α w adipocytach zwiększa się po 24 godzinach niedotlenienia (ryc. 8a). Aby dalej analizować aktywność HIF-1α, poziomy RNA docelowych genów HIF, takich jak Inos (indukowalna syntaza tlenku azotu) są oznaczane ilościowo za pomocą qPCR. Figura 8b pokazuje, że zwiększona ekspresja HIF-1α w warunkach niedotlenienia prowadzi do zwiększonego poziomu mRNA Inos. Ponieważ wykazaliśmy już in vivo (ryc. 8), że zwiększona ekspresja HIF-1α w adipocytach koreluje ze zwiększoną apoptozą adipocytów, apoptozę określa się również ilościowo w kulturach in vitro przez barwienie aneksyną V w warunkach niedotlenienia. Zgodnie z danymi in vivo (ryc. 7), zwiększonemu poziomowi HIF-1α towarzyszy zwiększona apoptoza adipocytów wywołana warunkami niedotlenienia (ryc. 8b). Ponadto, aby udowodnić, że apoptoza wywołana hipoksyjnością jest zależna od HIF; HIF-1α lub HIF-2α jest wyciszany przez interferencję RNA w adipocytach pochodzących od myszy typu dzikiego lub myszy z niedoborem Fra-2. Zwiększona apoptoza adipocytów jest przywracana przez wyciszenie HIF-1α lub HIF-2α, jak pokazano w barwieniu aneksyny V na rycinie 8b, co dowodzi, że czujnik niedotlenienia HIF-α reguluje apoptozę adipocytów.

Rycina 6: Zwiększony rozmiar i powierzchnia adipocytów u myszy z dietą wysokotłuszczową (HFD). a, b) Barwienie H&E skrawków z okołogonadalnej poduszeczki tłuszczowej samców myszy typu dzikiego karmionych normalną dietą (ND) (a) lub dietą wysokotłuszczową (HFD) (b) przez 6 tygodni. Pręty reprezentują 500 μm. (c, d) Kwantyfikacja wielkości adipocytów (c) i obszaru (d) z okołodomięśniowej poduszeczki tłuszczowej myszy typu dzikiego karmionych ND (a) lub HFD (b) przez 6 tygodni. n = 10. Dane są przedstawiane jako wartości średnie ± SEM. Analizę statystyczną przeprowadzono za pomocą testu t-Studenta. p <0,0001. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 7: Zwiększony poziom HIF-1α i apoptoza w adipocytach dorosłych myszy Fra-2fl / fl Fabp4-CreERT. Barwienie hipoksją (a) i HIF-1α (b) w AT samców myszy Fra-2fl / fl Fabp4-creERT i samców miotu kontrolnego 6 tygodni po wstrzyknięciu tamoksyfenu. Powiększenie 20X, wkładka 40X. Czarne strzałki wskazują obszary niedotlenione i komórki HIF-1α dodatnie. (c) Barwienie TUNEL u myszy Fra-2fl/fl Fabp4-CreERT i kontrolnych rodzeństwa z miotu po 6 tygodniach od wstrzyknięcia tamoksyfenu. Powiększenie 20X, wkładka 40X. Czarne strzałki wskazują komórki dodatnie TUNEL. Rysunek ten został zmodyfikowany na podstawie Luther et al. 9. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 8: Zwiększona ekspresja HIF-1α i apoptoza adipocytów w adipocytach pierwotnych wywołana niedotlenieniem. (a) Analiza PCR w czasie rzeczywistym HIF-1α i HIF docelowych poziomów mRNA Inos w pierwotnych adipocytach umieszczonych w komorach hipoksyjnych analizowanych we wskazanych punktach czasowych. (b) Kwantyfikacja apoptozy przez barwienie FACS załącznikyną V w pierwszorzędowych adipocytach wyizolowanych od myszy Fra-2fl / fl Fabp4-CreERT lub kontroli typu dzikiego transfekowanych kontrolą sh lub plazmidem sh przeciwko HIF-1α lub HIF-2α i umieszczonych w hipoksji (1% O2) przez 24 godziny. Rysunek ten został zmodyfikowany na podstawie Luther et al. 9. Dane przedstawiono jako wartości średnie ± S.D. Analizę statystyczną przeprowadzono za pomocą testu t-Studenta. *P <0,05 i **P <0,01 zostały zaakceptowane jako istotne. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.