Artykuł metodologiczny

Mechanizm regulacji liczby adipocytów w organizmach dorosłych poprzez różnicowanie i homeostazę apoptozy

17.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53822

⸱

3 czerwca 2016

 , 
1Department of Medicine 3, Rheumatology and Immunology, Universitätsklinikum Erlangen, 2Nikolaus Fiebiger Center of Molecular Medicine, Universitätsklinikum Erlangen

W tym artykule

Podsumowanie

Tkanka tłuszczowa (AT) może wpływać na homeostazę całego organizmu, dlatego zrozumienie molekularnych mechanizmów różnicowania i funkcji adipocytów jest ważne. Udostępniamy protokół uzyskiwania nowych informacji na temat tych procesów poprzez analizę homeostazy, różnicowania i ekspozycji na niedotlenienie adipocytów jako modelu indukowanej apoptozy adipocytów.

Streszczenie

Biorąc pod uwagę, że tkanka tłuszczowa (AT) jest organem endokrynnym, może wpływać na metabolizm całego organizmu. Nadmierne magazynowanie energii prowadzi do rozregulowania adipocytów, co z kolei indukuje nieprawidłowe wydzielanie adipokin, wywołując zespoły metaboliczne, takie jak otyłość, dyslipidemia, hiperglikemia, hiperinsulinemia, insulinooporność i cukrzyca typu 2. W związku z tym badanie mechanizmów molekularnych stojących za dysregulacją adipocytów może pomóc w opracowaniu nowych strategii terapeutycznych. Nasz protokół opisuje metody oceny mechanizmu molekularnego, na który wpływają warunki niedotlenienia AT, który koreluje z apoptozą adipocytów u dorosłych myszy. Protokół ten opisuje, jak analizować AT in vivo poprzez profilowanie ekspresji genów, a także analizę histologiczną różnicowania, proliferacji i apoptozy adipocytów podczas ekspozycji na niedotlenienie, stwierdzoną przez barwienie niedotlenionych komórek lub białka HIF-1α. Ponadto analiza in vitro różnicowania adipocytów i ich reakcji na różne bodźce uzupełnia charakterystykę szlaków molekularnych odpowiedzialnych za możliwą dysfunkcję adipocytów prowadzącą do zespołów metabolicznych.

Wprowadzenie

Według raportu Światowej Organizacji Zdrowia z 2014 roku, 39% dorosłej populacji świata ma nadwagę, a 13% jest otyłych 1. W niedalekiej przyszłości osoby z nadwagą będą stanowiły znaczną część populacji osób starszych. Ważną cechą otyłości i starzenia się jest rozregulowanie tłuszczu w stosunku do zachorowalności i śmiertelności 2. Adipokiny, białka wydzielane przez tkankę tłuszczową (AT), mogą wywoływać zespoły metaboliczne, takie jak otyłość i cukrzyca typu 2 3. Choroby metaboliczne są najczęściej spowodowane nadmiernym magazynowaniem energii w kropelkach lipidów adipocytów, co skutkuje ekspansją AT 4. W związku z tym interesujące jest określenie przyczyn i mechanizmów molekularnych ekspansji AT w celu znalezienia możliwości jej kontrolowania.

Nadmierne odżywianie prowadzi do ekspansji AT, która jest regulowana przez dwa zdarzenia: nadmierne magazynowanie energii w kropelkach lipidów adipocytów, proces prowadzący do hipertrofii (wzrost wielkości adipocytów) oraz zwiększona adipogeneza, znana również jako hiperplazja adipocytów 5. Adipogeneza to proces różnicowania się multipotencjalnych mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) w adipocyty. Po pierwsze, MSCs przekształcają się w preadipocyty w fazie zaangażowania. Po drugie, preadipocyty dalej różnicują się, aby nabyć cechy dojrzałych i funkcjonalnych adipocytów 6. Kilka czynników transkrypcyjnych zostało zidentyfikowanych jako główne regulatory do oznaczania preadipocytów, takich jak białko palca cynkowego 423 (Zfp423) i wczesny czynnik komórek B 1 (Ebf1). Podczas gdy Zfp423 indukuje wczesne zaangażowanie, Ebf1 jest niezbędny do wytwarzania komórek progenitorowych adipocytów 6. Różnicowanie końcowe jest ściśle kontrolowane przez kaskadę transkrypcyjną, w której γ receptora aktywowanego przez proliferatory peroksysomów (PPARγ) jest niezbędnym czynnikiem transkrypcyjnym 7. Innymi kluczowymi czynnikami transkrypcyjnymi są członkowie rodziny CCAAT/enhancer-binding protein (C/EBP) (tj. C/EBPα, C/EBPβ i C/EBPδ), czynniki podobne do kruppela (KLF), białko wiążące elementy reagujące na cAMP (CREB) i wczesna odpowiedź wzrostu 20 (Krox20) 6.

Ostatnio wykazano, że rodzina białek aktywatora-1 (AP-1) bierze udział w procesie różnicowania adipocytów 8,9. Rodzina AP-1 jest utworzona przez dimeryczny kompleks białkowy, złożony z członków Fos, Jun i/lub aktywującego czynnika transkrypcyjnego (ATF). Antygen 1 i 2 związany z FOS (Fra-1 i Fra-2) jest w stanie regulować różnicowanie adipocytów. Fra-1 upośledza różnicowanie adipocytów poprzez hamowanie C/EBPα 8, podczas gdy Fra-2 kontroluje obrót adipocytów 9. W ten sposób Fra-2 nie tylko zmniejsza liczbę adipocytów poprzez tłumienie ekspresji PPARγ2 podczas różnicowania adipocytów, ale także zmniejsza apoptozę adipocytów poprzez bezpośrednie tłumienie ekspresji czynników indukowanych hipoksją (HIF). Rodzina HIF to heterodimeryczny kompleks czynników transkrypcyjnych, składający się z HIF-1α, HIF-2α i HIF-1β. Heterodimery składają się z wrażliwego na tlen białka HIF-α (HIF-1α lub HIF-2α) i niewrażliwej na tlen podjednostki HIF-1β 10. Podczas normoksji białka HIF-α są poliubikwitynylowane i ostatecznie degradowane przez proteasomy 11. W warunkach niedotlenienia, występujących w AT podczas ekspansji, białka HIF-α nie są już hydroksylowane. W związku z tym stabilizują się i tworzą dimery z konstytutywnie wyrażonym HIF-1β. Aktywacja transkrypcyjna genów kontrolowanych przez elementy odpowiedzi HIF bierze udział w regulacji angiogenezy, metabolizmu i stanu zapalnego 12. Rzeczywiście, HIF-1α sprzyja dysfunkcji AT poprzez indukowanie tolerancji glukozy, hamowanie wydatku energetycznego i obwodowego wykorzystania lipidów, a także poprzez zwiększanie poziomu leptyny i stłuszczenie wątroby wywołane HFD 13. Ponadto HIF-1α reguluje apoptozę adipocytów in vivo i in vitro9.

Obecny protokół opisuje metody badania statusu AT w celu rozwikłania molekularnych cech homeostazy adipocytów u dorosłych myszy. Pokazuje, w jaki sposób apoptoza, proliferacja i różnicowanie adipocytów in vivo i in vitro może być regulowane przez hipoksję. Aby to zrobić, używamy myszy z delecją Fra-2 specyficzną dla adipocytów wygenerowaną przez skrzyżowanie myszy przenoszących floksowane allele Fra-2 z myszami Fabp4-CreERT 9. Używając myszy Fabp4-Cre ERT, delecja jest specyficzna dla adipocytów i indukowana przez wstrzyknięcie tamoksyfenu 14. W przypadku modelu dorosłego wstrzyknięcia tamoksyfenu do otrzewnowej wykonuje się przez 5 kolejnych dni, począwszy od 6 tygodnia życia. W ten sposób myszy są poddawane normalnej diecie lub diecie wysokotłuszczowej przez 6 tygodni przed wykonaniem analizy. Myszy użyte w tym badaniu były samcami opartymi na tle C57Bl6, aby uniknąć żeńskich hormonów, takich jak estrogeny, które regulują dystrybucję tkanki tłuszczowej w organizmie 15. Użycie innego tła genetycznego może również zmienić fenotyp metaboliczny ze względu na związane ze szczepem różnice w gospodarce lipidowej 16.

Ten protokół pokazuje, jak analizować AT w warunkach niedotlenienia za pomocą histologii oraz jak ilościowo określać apoptozę, proliferację i różnicowanie adipocytów in vivo za pomocą analiz immunohistochemicznych i profilowania genów. Badanie zostało zakończone eksperymentami in vitro, pokazującymi, jak analizować pierwotne różnicowanie adipocytów i apoptozę zmienioną przez ekspozycję na niedotlenienie.

Protokół

OŚWIADCZENIE ETYCZNE: Zwierzęta są utrzymywane w zestandaryzowanych warunkach zgodnie z wytycznymi niemieckiej ustawy o ochronie zwierząt (German Animal Welfare Act). Zwierzęta są karmione standardową dietą i mają dostęp do wody. ad libitum i utrzymywane w 12-godzinnym cyklu dzień/noc. Wszystkie eksperymenty z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez lokalną komisję etyczną.

1. Analiza in vivo homeostazy adipocytów u dorosłych samców

  1. Aby ilościowo określić poziom hipoksji in vivo, najpierw zmierz masę ciała myszy, a następnie wstrzyknij domięśniowo 60 mg/kg masy ciała pimonidolu chlorowodorku w formie stałej (na przykład: wstrzyknij 1,5 mg myszy o masie 25 g). Pimonidol jest skutecznym markerem hipoksji, który tworzy addukty z grupami tiolowymi w białkach, peptydach i aminokwasach, a jego obecność jest wykrywana za pomocą specyficznego przeciwciała.
  2. Uśmierć myszy i usuń okołogonadalne poduszki tłuszczowe (Rysunek 1).
    1. 45 min po wstrzyknięciu uśmierć myszy poprzez uduszenie CO2, a następnie przeprowadź zwichnięcie karku.
    2. Przymocuj kończyny myszy (jak pokazano na Rysunku 1) i otwórz jamę otrzewną. Usuń lewą i prawą okołogonadalną (nadjadłodową) poduszkę tłuszczową z wnętrza jamy otrzewnej.
      Uwaga: Poduszki tłuszczowe są przytwierdzone do najądrza przez listki otrzewnej, jak pokazano na Rysunku 1 (okołogonadalne poduszki tłuszczowe wskazane są strzałkami).
    3. Zadbaj o to, aby usunąć tkanki gonadalne z poduszki tłuszczowej. Wyznacz masę poduszek tłuszczowych, aby obliczyć stosunek: masa poduszki tłuszczowej (g) do masy ciała (g).

Sekcja zwierzęcia, badanie anatomiczne organów wewnętrznych, badanie układu pokarmowego, schemat edukacyjny.
Rycina 1: Lokalizacja podotoczkowych poduszek tłuszczowych w jamie otrzewnowej myszyZdjęcie lokalizacji tłuszczu perigonadalnego u dorosłych myszy po uboju. Tkankę tłuszczową perigonadalną wskazano strzałkami. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

  1. Aby sporządzić ilościowy profil ekspresji genów, należy wykorzystać jedną podjądrzową poduszkę tłuszczową do izolacji RNA. Uwaga: Do czasu przetworzenia próbki, próbki tkanki należy przechowywać w roztworze stabilizującym RNA w temperaturze -80 °C lub w ciekłym azocie.
    1. Aby zhomogenizować tkankę tłuszczową, należy przenieść ją do 1 ml jednofazowego roztworu izotiocyjanianu guanydyny i fenolu. W celu rozdrobnienia tkanki należy użyć probówek z kuleczkami ceramicznymi (1,4 mm) i homogenizatora ustawionego na 6 50 obr./min (2 razy po 20 s, z 30-sekundową przerwą).
    2. Wyizolować RNA w następujący sposób (metoda jednokrokowa według Chomczynskiego i Sacchi) 17).
      1. Aby rozdzielić fazy, przenieś zhomogenizowaną tkankę tłuszczową do probówki do mikrowirówki, dodaj 0,2 ml chloroformu, wstrząśnij przez 15 s, inkubuj przez 5 min w temperaturze pokojowej, a następnie wiruj z prędkością 12 0 x g przez 5 min. Przenieś górną fazę wodną (około 400 µl), zawierającą RNA, do nowej probówki do mikrocentryfugi. Nie należy przenosić interfazy zawierającej DNA ani fazy fenolowej zawierającej białka.
      2. Aby wyprecypitować RNA, należy dodać 1 objętość izopropanolu, wymieszać i inkubować przez 15 min w temperaturze 4 °C (można również inkubować w temperaturze -20 °C (przez noc). Odwiruj przy 12 0 x g przez 10 min. Ostrożnie usuń nadsącz izopropanolu. Przemyj dwukrotnie 75% etanolem, odwirując za każdym razem przy 12 0 x g przez 10 min.
      3. Po suszeniu wytrąconego RNA przez około 10 min w temperaturze pokojowej, rozpuścić je w 50 µl H2O (wolna od RNaz). Aby to ułatwić, inkubować przez 2 min w 65 °C.
        Uwaga: RNA przechowywać w 75% etanolu w temperaturze -80 °C lub w ciekłym azocie do długoterminowego przechowywania.
      4. Oznacz ilościowo preparaty RNA metodą A260/280 (optymalny iloraz wynosi od 1,8 do 2,2) i obliczyć stężenie na podstawie A260:
        Wzór na stężenie DNA: conc[µg/ml]=OD260×40[µg/ml]×czynnik rozcieńczenia, obliczenie pomiaru.
    3. Aby uniknąć kontaminacji DNA, należy przeprowadzić trawienie 1 µg preparatu RNA za pomocą 1 U DNazy I przez 30 min w 37 °C w objętości 10 µlInaktywować przy 65 °C przez 10 min.
      Uwaga: ten krok jest opcjonalny.
    4. Zastosowanie 10 µl preparatu RNA zawierającego 1 µg RNA do reakcji odwrotnej transkrypcji w celu otrzymania jednoniciowego cDNA, odpowiedniego do zastosowań w ilościowej PCR. Składniki i ich ilości wymieniono w Tabela 1.
    5. Należy użyć gotowej mieszaniny PCR (PCR Master Mix) do reakcji ilościowej PCR w czasie rzeczywistym. W celu określenia zmian metabolicznych w całej tkance tłuszczowej należy zastosować specyficzne primery dla genów zaangażowanych w homeostazę tkanki tłuszczowej (Tabela 2) oraz warunki PCR wymienione w Tabela 3.
    6. Analiza danych PCR w czasie rzeczywistym.
      1. Zdefiniuj linię bazową (Rycina 2), zazwyczaj od cyklu 1 do 15, w których nie występuje zmiana sygnałów fluorescencji. Oprogramowanie do PCR w czasie rzeczywistym normalizuje specyficzne sygnały fluorescencji względem fluorescencji linii bazowej oraz wewnętrznego barwnika referencyjnego, ROX, co pozwala na wyznaczenie wartości sygnałów specyficznych dla poszczególnych starterów, określonej jako delta Rn (ΔRn).
      2. Ustaw próg w fazie wykładniczej krzywej amplifikacji. Punkt przecięcia definiuje cykl progowy (Ct). Na podstawie wartości Ct oblicz względną ekspresję (ΔCt) oraz krotność zmiany (ΔCt):
        Równanie ilościowego PCR, wzór obliczeniowy ΔCt dla analizy ekspresji genów.
        Wzór qPCR ΔΔCt do porównywania poziomów ekspresji genów, przedstawiony w formie równania matematycznego.
KomponentObjętość µl / reakcja
10x bufor RT2.0
Mieszanina dNTP 25x (10 mM)0.8
10x RT Random Primers (losowe primery do odwrotnej transkrypcji)2.0
odwrotna transkryptaza MultiScribe1.0
Woda wolna od nukleaz2O4.2
1 µg RNA10
Łącznie na jedną reakcję20

Tabela 1: Składniki wraz z odpowiednią objętością dla reakcji odwrotnej transkrypcji w celu otrzymania jednoniciowego cDNA.

Oficjalna pełna nazwaSymbolSekwencja 3´--> 5´
PrzedmowaOdwrócenie
Adipogenezahomolog Delta-like 1 (pref-1)Dlk1GACACTCGAAGCTCA
CCTGG		GGAAGGCTGGGACGG
GAAAT
Wczesny czynnik limfocytów B 1Ebf1CCACCATCGACTACGG
CTTC		TCCTGGTTGTTGTGGGG
CATC
Białko z motywem palca cynkowego 423Zfp423GTGCCCAGGAAGA
CGTA		GGCGACGTGGATCTGA
ATCT
Białko wiążące kwasy tłuszczowe 4 (Ap2)Fabp4TCACCTGGAAGACAGCT
CCTC		AAGCCCACTCCCACTTC
TTTC
białko wiążące element CCAAT/enhancer (C/EBP), alfaCebpaAAGCCGCGACA
AGGC		GTCAGCTCCAGCACCT
TGTG
białko wiążące element CCAAT/enhancer (C/EBP), betaCebpbTTTCGGGACTTGATGC
AATC		CCGCAGGAACATCTTT
AAGG
białko wiążące element odpowiedzi cAMP 1Creb1ACTCAGCCGGGTACT
ACCAT		TTGCTGCCTCCCTGTT
CTTC
białko wiążące element CCAAT/enhancer (C/EBP), deltaCebpdCAGCGCCTACATTGAC
TCCA		GTTGAAGAGGTCGGCG
AAGA
czynnik Kruppel-podobny 4Klf4GCAGTCACAAGTCCCC
TCTC		TAGTCACAAGTGTGGG
TGGC
Białko wczesnej odpowiedzi wzrostowej 2 (Krox20)Egr2AGGCGGTAGACAAAATC
CCAG		GATACGGGAGATCCAG
GGGT
Receptor aktywowany proliferatorem peroksysomów gammaPpargAGGTCCACAGCTG
ATTC		GATGCACTGCCTATGAGC
ACTT
LipogenezaAcetyl-CoA karboksylaza alfaAcacaTGGACCTTGTCTTCA
TCAT		ATGGGCGGAATGGTCTC
TTTC
Syntaza kwasów tłuszczowychFasnACATCCTAGGCATCC
GAGA		CCGAGTTGAGCTGGGT
TAGG
Stearoilowo-koenzym A desaturaza 1Scd1CGGGATTGAATGTTCTTG
TCGT		TTCTTGCGATACACTCTG
GTGC
LipolizaDomena zawierająca fosfolipazę podobną do patatyny 2Pnpla2AAGGACCTGATGACCA
CCCT		CCAACAAGCGGATGGT
GAAG
Pobieranie kwasów tłuszczowychLipoproteinazaLplGTATCGGGCCCAGCAA
CATTATCC		GCCTTGCTGGTTTTC
TTCATTC
antygen CD36Cd36GTCTTCCCAATAAGCATGT
CTCC		ATGGGCTGTGATCGGA
ACTG
HipoksjaCzynnik indukowany hipoksją 1, podjednostka alfaHif1aCCTGCACTGAATCAAG
GTGC		CCATCAGAAGGACTTGCT
GGCT
Białko 1 domeny PAS śródbłonka (znane również jako: HIF-2alpha)Epas1CAAGCTGAAGCTAAAG
CGGC		TTGGGTGAATTCATCG
GG
Supresor nowotworowy Von Hippel-LindauVhlACCGAGGTCATCTTTG
GCTC		TTCCGCACACTTGGGT
AGTC
Nuclearny translokator receptora węglowodorów aromatycznych (znany również jako: HIF-1beta)Są to prawdopodobnie błędy w pisowni lub niepełny tekst. Proszę o podanie pełnej treści źródłowej w języku angielskim do przetłumaczenia.TGGGTCATCTTCTCGC
GGTT		TGTCCTATCTGAGCAT
CGTG

Tabela 2: Lista genów wraz z sekwencjami odpowiednich starterów użytych do analizy homeostazy adipocytów.

KrokTemperatura (°C)Czas (min:sek)
Aktywacja polimerazyPrzytrzymać9510:00
PCR40 cykliDenaturowanie950:15
Przyłączanie/Wydłużanie601:00
Krzywa topnieniaod 60 do 950.5 °C/sek

Tabela 3: Warunki reakcji PCR w czasie rzeczywistym.

Wykres amplifikacji qPCR, ΔRn względem numeru cyklu, z zaznaczonym progiem (threshold) i wartością Ct w fazie wykładniczej.
Rycina 2: Charakterystyka krzywej amplifikacji w technice real-time PCR. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

  1. Aby przeprowadzić analizę histologiczną homeostazy adipocytów, należy użyć drugiej poduszki tłuszczowej okołogonady. Nie wysuszyć tkanki!
    1. Utrwalić tkankę tłuszczową w 3,7% formaldehydzie w buforze PBS przez noc, a następnie zalać do parafiny (postępując zgodnie z instrukcjami opisanymi w innym miejscu 18) i wyciąć zatopioną tkankę w plastry o grubości 2-5 µm przekroje grube (maksymalnie 5 µm).
    2. Wyznacz liczbę adipocytów na pole widzenia oraz wielkość adipocytów w mikroskopie światła przechodzącego po barwieniu hematoksyliną i eozyną (H&E)&E) barwienie:
      1. Odparafinizować skrawki, płucząc je 3 razy przez 5 min w ksylenie, a następnie nawodnić skrawki, płucząc je 2 razy przez 2 min w 10% etanolu oraz 2 razy przez 2 min w 96% etanolu. Na koniec wypłukać skrawki w destylowanej wodzie H2O.2inkubować przez 5 min.
      2. Barwić hematoksyliną, rozcieńczoną 1:5 wodą destylowaną H2O, przez 10 min w temperaturze pokojowej, a następnie przemyć w H2O przez 5 min. Barwić roztworem eozyny (20 ml 5% eozyny Y/210 ml destylowanej H2O)2O/25 µl kwas octowy lodowaty) przez 30 s, a następnie ponownie przemyć H2O przez 5 min.
      3. Odwodnić skrawki, używając 96% etanolu i 10% etanolu (po dwa razy, przez 2 min każdorazowo) oraz ksylenu (trzy razy, przez 5 min). Skrawki zamontować przy użyciu bezwodnego medium montażowego.
      4. Oceń preparaty pod mikroskopem w polu jasnym. Reprezentatywny przykład analizy adipocytów z użyciem oprogramowania ImageJ 1.48v 19 przedstawiono w Rys. 3liczba komórek na obszar (µm2), pola powierzchni komórki (x 103 µm2), wielkość komórki (µm).
        1. Otwórz zdjęcie przekroju w programie ImageJ 1.48v. Jeśli parametry obrazu są podane w pikselach zamiast w jednostce długości, ustaw skalę.
        2. Wybierz Linia prosta na pasku narzędzi i dostosuj linię do znanego dystansu, odwołując się do paska skali. Przejdź do Analiza -> Ustawienie skali. Odległość linii jest przedstawiona w pikselach; należy dodać znaną odległość oraz jednostkę długości, np., µmPotwierdzić za pomocą Proszę o dostarczenie tekstu źródłowego do tłumaczenia.Rozmiar obrazu oraz analiza parametrów są podane w wskazanej jednostce długości.
        3. Aby określić parametry adipocytów, należy dostosować próg. Przejdź do Obraz -> Dostosuj -> Próg aby otworzyć Próg okno. Wybierz następujące ustawienia: Metoda progowaniaDomyślne; Kolor progowyB&W; Przestrzeń barwna: HSB. Obraz jest teraz wyświetlany w czerni i bieli. Dostosuj Jasność aby uzyskać przejrzyste białe adipocyty i zamknąć czarne przestrzenie międzykomórkowe, tak jak w Ryc. 3b.
        4. Policz liczbę adipocytów na µm2 (Rysunek 3e) z wielopunktowy wybierz narzędzie zaznaczania na pasku narzędzi i oznacz każdą komórkę do policzenia.
        5. Aby określić wielkość adipocytów, należy wybrać Linia prosta ponownie na pasku narzędzi i wyznacz średnicę adipocytu (Rysunek 3c). Przejdź do Analizuj -> Pomiar i pojawi się nowe okno, w którym wpisuje się długość średnicy w µm.
        6. Aby wyznaczyć pole powierzchni adipocytów, należy wybrać Narzędzie magiczna różdżka (obrysowywanie) i kliknij wewnątrz adipocytu. Wewnętrzna ściana adipocytu zostaje zaznaczona na czerwono (Rysunek 3d). Przejdź do Analiza -> Pomiar i pojawi się nowe okno, w którym wyświetlona zostanie powierzchnia tego adypocytu w µm2.
    3. W celu przeprowadzenia immunohistochemii przygotować przekrój do barwienia przeciwciałami oraz metodą TUNEL (znakowanie końców nacięć dUTP-biotyną z wykorzystaniem TdT) w następujący sposób:
      1. Odparafinizować preparaty, myjąc je 3 razy przez 5 min w ksylenie, a następnie nawodnić preparaty 2 razy przez 2 min w 10% etanolu i 2 razy przez 2 min w 96% etanolu. Na koniec przemyć preparat w destylowanej H2O2O.
      2. W celu odmaskowania antygenów poddaj preparat tkankowy trawieniu przez 30 min w temperaturze 37 °C z roztworem roboczym proteinazy K (20 µg/ml w 10 mM Tris/HCl, pH 7,4–8), a następnie opłukać w PBS.
    4. Przeprowadzenie barwienia przeciwciałami w komorach wilgotnych:
      1. Aby zablokować endogenną peroksydazę, należy zastosować 3% nadtlenek wodoru w PBS przez 10 min, a następnie dwukrotnie przemyć próbki w PBS przez 5 min. W celu zablokowania niespecyficznego wiązania przeciwciał należy zastosować 10% surowicy w PBS. Należy użyć surowicy pochodzącej od gatunku zwierzęcia, w którym wytworzono przeciwciało wtórne – w tym przypadku kozy.
      2. Do barwienia należy użyć przeciwciał do wykrywania apoptozy, proliferacji i hipoksji (Tabela 4). Rozcieńczyć przeciwciała w PBS z 10% surowicą kozią. Inkubować w 4 °C przez noc. Pranie przekrojów należy powtórzyć 3 razy po 5 min w buforze PBS.
      3. Aby wzmocnić sygnał, należy zastosować biotynilowane przeciwciało wtórne w rozcieńczeniu wskazanym w Tabela 5Do detekcji hipoksji należy użyć przeciwciała króliczego anty-FITC sprzężonego z HRP jako przeciwciała wtórnego. Inkubować przez 1 h w temperaturze pokojowej. Pranie przekrojów przeprowadzić dwukrotnie przez 5 min w PBS.
        Uwaga: W przypadku barwienia hipoksji z użyciem FITC-MAb1 należy pominąć krok 1.4.4.4) i przejść do kroku 1.4.4.5).
      4. W przypadku każdego preparatu przeprowadzić inkubację wstępną 50 µl roztwór awidyny z 50 µl biotynilowaną peroksydazą H przez 30 min w temperaturze pokojowej (metoda ta jest również nazywana formulacją kompleksu ABC awidyna/biotyna), a następnie dodać do skrawków na kolejne 45 min. Przemyć 2 razy przez 5 min w PBS.
      5. Inkubować przekroje w roztworze podłoża dla peroksydazy, aż do momentu intensyfikacji barwienia (od 5 do 10 min). Płukać przez 5 min wodą destylowaną H2O2O.
      6. W celu przeprowadzenia kontrastowania należy barwić hematoksyliną rozcieńczoną w proporcji 1:5 wodą destylowaną H2przez 10 min w temperaturze pokojowej, a następnie przemyć w H2O przez 5 min.
      7. Odwodnić skrawki w 96% etanolu i 10% etanolu (po dwa razy przez 2 min) oraz w ksylenie (trzy razy przez 5 min). Przykryć skrawki szkiełkami podstawowymi i zastosować bezwodny środek montujący. Przeanalizować skrawki pod mikroskopem w świetle przechodzącym.
    5. Oznaczenie apoptozy metodą TUNEL zgodnie z instrukcją producenta:
      1. Dodaj 50 µl roztwór enzymu do 450 µl opatrzyć etykietą roztwór. Następnie zastosować 50 µl nałożyć mieszaninę reakcyjną TUNEL na przekroje histologiczne i inkubować przez 60 min w temperaturze +37 °C w wilgotnej atmosferze, w ciemności. Przerwy w myciu przekrojów należy przeprowadzić 3 razy w PBS przez 5 min, a następnie zamontować je w medium do montażu fluorescencyjnego zawierającym DAPI (4',6-diamidino-2-fenyloindol) do kontrastowania.
      2. Przeanalizuj przekrój pod mikroskopem fluorescencyjnym przy 10-krotnym powiększeniu. Do pomiaru fluoresceiny zastosuj długość fali wzbudzenia 48 nm i detekcję w zakresie 515-565 nm (laser zielony); DAPI wzbudza się przy około 360 nm i emituje światło przy około 460 nm po związaniu z DNA (laser niebieski).
      3. Ilościowe określenie nakładek sygnałów DAPI i fluoresceiny:
        Równanie apoptozy, wzór na % apoptotycznych adypocytów, biologia, obliczanie wskaźnika apoptozy, schemat.

Wyniki mikroskopii histologicznej; analiza struktury komórkowej z pomiarami, przedstawiono szczegóły powiększenia.
Rysunek 3: Analiza charakterystyki adipocytów w przekrojach tkanki tłuszczowej. Zdjęcia przekrojów tkanki tłuszczowej okołojajczkowej samców myszy karmionych dietą wysokotłuszczową (HFD) lub dietą standardową (ND), wykonane za pomocą mikroskopu w świetle przechodzącym (a); próg jest dostosowany do skali czerni i bieli (b) oraz wielkość adipocytów (długość; Proszę o podanie tekstu źródłowego do tłumaczenia.), obszar (d) oraz liczba adipocytów na mm2 (e) są kwantyfikowane za pomocą programu ImageJ 1.48v. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Stężenie roztworu zapasuroztwór rozcieńczony
ApoptozaPrzeciwciało królicze mAb przeciwko rozszczepionej kaspazie-3 (Asp175) (5A1E)1:2,000
ProliferacjaOczyszczone przeciwciało mysie przeciwko ludzkiemu Ki-67, klon B56 (RUO)1:50
HipoksjaPrzeciwciało przeciwko HIF-1 alfa1:100
FITC-MAb11:100

Tabela 4: Przeciwciała wraz z odpowiednimi rozcieńczeniami użyte do barwienia immunohistochemicznego przekrojów AT.

Przeciwciałorozcieńczanie
biotynilowane przeciwciało anty-IgG mysie (H+L)1:200
biotynilowane przeciwciało anty-IgG mysie (H+L)1:200
konjugaty HRP z królczym przeciwciałem przeciwko FITC1:100

Tabela 5: Przeciwciała wtórne wraz z zastosowanym rozcieńczeniem do barwienia immunohistochemicznego.

2. Analiza in vitro homeostazy adipocytów pod wpływem hipoksji

  1. Uśmierć myszy i usuń tkankę tłuszczową podskórną.
    1. Uśmierć myszy poprzez uduszenie CO2, a następnie zwichnięcie karku.
    2. Przytwierdź kończyny myszy do podłoża, zgodnie z ilustracją na Rysunku 4. Oddziel skórę od górnej części nogi, lędźwi i boku, a następnie przytwierdź ją igłami, jak pokazano na Rysunku 4. Następnie usuń tkankę tłuszczową podskórną, która znajduje się z tyłu u podstawy tylnych kończyn, otaczając węzły chłonne pachwinowe (jak pokazano na Rysunku 4, lewo: podskórne poduszeczki tłuszczowe wskazane strzałkami; prawo: węzeł chłonny pachwinowy wskazany strzałką).

Schemat sekcyjny anatomii myszy z naciskiem na połączenia mięśni i skóry, edukacja biologiczna.
Rycina 4: Lokalizacja podskórnych poduszek tłuszczowychZdjęcie tkanki tłuszczowej podskórnej; strzałki po lewej stronie wskazują tkankę tłuszczową podskórną, a strzałka po prawej stronie wskazuje węzeł chłonny pachwinowy. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury, kliknij tutaj.

  1. Wyizolować mezenchymalne komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej (ADSC) zgodnie z wcześniejszym opisem 20.
  2. Wysiać ADSC w zagęszczeniu 4 0 komórek/cm²2 w zmodyfikowanej pożywce Eagle'a Dulbecco-Ham's F-12 z dodatkiem 10% normałnego surowicy cielęcej, 1% penicyliny/streptomycyny oraz 0,5% amfoterycyny B, 16 µM biotyna, 18 µM kwas pantotenowy i 100 µM kwas askorbinowy i hodować kulturę do osiągnięcia konfluencji na poziomie około 70–80%, co następuje po 4–6 dniach hodowli.
  3. Indukcja różnicowania adipogennego.
    1. Usuń przylegające ADSC z powierzchni poprzez traktowanie trypsyną.
      1. Usunąć pożywkę, przemyć PBS i dodać 0,025% roztwór trypsyny (podgrzany do 37 °C) przez 2 min (do momentu oderwania się komórek od powierzchni). Bezzwłocznie dodać pożywkę i wypłukać komórki.
    2. Należy policzyć komórki, korzystając z komory Neubauera.
      1. Nałożyć szkiełko nakrywkę na centralną część komory Neubauera. Rozcieńczyć zawiesinę komórkową w stosunku 1:10 i nanieść do komory 10 µl rozcieńczona zawiesina komórek. Należy policzyć komórki w 4 polach znajdujących się w narożnikach, z których każde składa się z 16 mniejszych kwadratów. Obliczyć liczbę komórek na ml:
        Wzór na stężenie komórek, równanie: komórki/ml = (liczba komórek/4) * 10 * 10 0.
    3. Zasiać ADSC (zgodnie z opisem w punkcie 2.2) w 12-dołkowych płytkach hodowlanych i prowadzić hodowlę do osiągnięcia konfluencji na poziomie około 70–80% (osiąganej po 4–6 dniach).
    4. Indukować różnicowanie adipogenne poprzez dodanie 5 µg/ml insulina, 1 µM deksametazon i 5 µM dodaj 3-izobutylo-1-metyloksantynę (IBMX) do hodowli. Wymieniaj medium co 2 dni. Komórki będą w pełni zróżnicowane po 7 dniach.
  4. Aby przeanalizować różnicowanie adipogenne, należy przeprowadzić barwienie Oil Red O, które barwi triglicerydy dojrzałych adipocytów.
    Uwaga: Prace muszą być wykonywane pod dygestorium!
    1. Usunąć podłoże, delikatnie przemyć adipocyty buforem PBS i utrwalić komórki przez 60 min w 2 ml 10% formaliny.
    2. Aby przygotować roztwór barwiący Oil Red O, zmieszać 3 części roztworu zapasowego Oil Red O (30 mg proszku Oil Red O rozpuszczonego w 10 ml 9% izopropanolu) z 2 częściami destylowanej wody2O i inkubować przez 10 min w temperaturze pokojowej. Przefiltrować roztwór roboczy Oil Red O przez 0.2 µm filtr do wtrysku
      Uwaga: Roztwór roboczy jest stabilny przez 2 godz.
    3. W przypadku barwienia Oil Red O, usunąć formalinę i przemyć adipocyty H2O, inkubować z 2 ml 60% izopropanolu przez 5 min, usunąć izopropanol i dodać 2 ml gotowego roztworu Oil Red O na 5 min. Płukać komórki wodą z kranu, aż woda stanie się przejrzysta. Przebarwić hematoksyliną zgodnie z punktem 1.4.4.5).
    4. Oceń płytki pod mikroskopem fazokontrastowym przy 10-krotnym powiększeniu. Lipidy adipocytów będą miały kolor czerwony, a jądra komórkowe kolor niebieski.
  5. Krok opcjonalny: Wyciszenie genu zainteresowania poprzez transfekcję shRNA.
    1. Wymień medium i dodaj medium bezsurowicze.
    2. Do transfekcji adipocytów należy zastosować lipofekcję. Należy postępować zgodnie z instrukcjami producenta i użyć 1 µg shRNA na 12-dołkowe płytki tkankowe. Po dodaniu kompleksu lipid-DNA inkubować adipocyty przez 48 h w temperaturze 37 °C.
  6. Aby przeanalizować adipocyty poddane hipoksji, należy użyć stacji roboczej do hipoksji lub inkubatora hipoksycznego w celu utrzymania komórek w warunkach niedotlenienia. W zależności od badania hipoksja może wynosić 0,5, 1 lub 2% tlenu.
    1. Analiza apoptozy z wykorzystaniem Annexiny V znakowanej FITC oraz następujące po niej analizy metodą cytometrii przepływowej.
      1. Zebrać adiopocycie za pomocą bardzo miękkiego skrobaka do komórek, przemyć buforem PBS i dodać 1 x 106 komórki do 100 µl bufor wiążący anneksynę V (10 mM Hepes/NaOH, pH 7,4; 140 mM NaCl; 2,5 mM CaCl2)2). Dodać ilość Annexiny V-FITC zalecaną przez producenta i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 min.
      2. Do pomiaru cytometryą przepływową należy dodać 200 µl bufor wiążący anneksynę V i 1 µM barwienia jądra komórkowego. Określ fluorescencję w kanale zielonym i fioletowym. Aneksyna V+/kontrastowanie jąder komórkowych+ komórki definiuje się jako wtórnie nekrotyczne i Annexin V-dodatnie+/barwienie kontrastowe jąder komórkowych- komórki definiuje się jako komórki apoptotyczne (Rysunek 5).
    2. Ilościowa analiza poziomu RNA w adipocytach w celu określenia homeostazy w warunkach hipoksji.
      1. Do każdej studzienki należy dodać 1 ml jednofazowego roztworu izotiocyjanianu guanydyny i fenolu, a następnie wyizolować RNA [stosując metodę jednokrokową według Chomczynskiego i Sacchiego]. 17 (krok 1.3.2)] i postępować zgodnie z krokami od 1.3.2.1) do 1.3.5.2).

Wykres kropkowy cytometrii przepływowej; klasyfikacja komórek apoptotycznych/nekrotycznych, AXV-FITC względem barwnika przeciwjądrowego.
Rycina 5: Analiza apoptozy adipocytów metodą cytometrii przepływowejWykresy kropkowe (dot plot) z analizy FACS dla barwienia adipocytów Annexiną V-FITC i TO-PRO-3. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wyniki

Pokazujemy, jak określić homeostazę adipocytów in vivo i in vitro na przykładzie myszy Fra-2fl/fl Fabp4-CreERT w porównaniu do ich dzikiego typu. Nasz protokół określa, w jaki sposób zwiększona ekspresja HIF w warunkach hipoksji koreluje z dysfunkcją adipocytów, co wskazane jest przez zwiększoną apoptozę adipocytów.

Zwiększony rozmiar i powierzchnia adipocytów u myszy poddanych diecie bogatotłuszczowej (HFD)

Nadmierna podaży pokarmu, wśród innych czynników, prowadzi do hipertrofii adipocytów, spowodowanej nadmiernym magazynowaniem energii w kroplach tłuszczu. Wielkość i powierzchnia adipocytów są wskaźnikami hipertrofii. Przekroje tkanki tłuszczowej od myszy odżywianych dietą normalną (ND; Rycina 6a) i dietą bogatą w tłuszcze (HFD; Rycina 6b), a także ilościowe określenie wielkości i powierzchni adipocytów wyraźnie pokazują hipertrofię adipocytów po 6 tygodniach stosowania diety HFD, co objawia się zwiększoną wielkością adipocytów u myszy leczonych dietą HFD (Rycina 6c i d).

Zwiększona hipoksja w tkance tłuszczowej (AT) dorosłych myszy Fra-2fl/fl Fabp4-CreERT prowadzi do podwyższenia poziomu HIF-1α oraz apoptozy adipocytów

Aby określić stan hipoksji in vivo w TK, analizuje się myszy Fra-2fl/fl Fabp4-CreERT 6 tygodni po usunięciu Fra-2 w wieku 12 tygodni i porównuje z osobnikami dzikiego typu z tej samej miotki. Pimonidazol podaje się myszom dootrzewnowo jako skuteczny wskaźnik hipoksji; jest nietoksyczny i może dyfundować do TK. Hipoksyjne adipocyty w TK in vivo identyfikuje się za pomocą immunohistochemicznego barwienia przeciwciałami (Rycina 7a). Ponadto zwiększony stan hipoksji w TK u myszy wiąże się ze wzrostem liczby adipocytów dodatnich dla HIF-1α, co wskazano na podstawie barwienia immunohistochemicznego (Rycina 7b), a potwierdzono przez ilościowe oznaczenie poziomu ekspresji HIF-1α oraz jego genów docelowych9. Dodatkowo barwienie TUNEL przekrojów TK od myszy Fra-2fl/fl Fabp4-CreERT oraz kontrolnych osobników z miotki (Rycina 7c) wykazuje, że zwiększona apoptoza adipocytów koreluje z obecnością hipoksji i ekspresją HIF-1α.

Zwiększona ekspresja HIF-1α w adipocytach pierwotnych poprzez indukowaną hipoksją apoptozę adipocytów

Aby przeanalizować apoptozę adipocytów in vitro, wykorzystujemy adipocyty wytworzone z podskórnych płytek tłuszczowych, jak opisano wcześniej20. Zgodnie z oczekiwaniami, ekspresja HIF-1α w adipocytach wzrasta po 24 godzinach hipoksji (Ryc. 8a). Aby dalej przeanalizować aktywność HIF-1α, poziomy RNA genów docelowych HIF, takich jak Inos (indukowalna syntaza tlenku azotu), są ilościowo oznaczane metodą qPCR. Ryc. 8b pokazuje, że zwiększone stężenie HIF-1α w warunkach hipoksji prowadzi do podwyższonego poziomu mRNA Inos. Ponieważ wcześniej wykazaliśmy in vivo (Ryc. 8), że zwiększona ekspresja HIF-1α w adipocytach koreluje ze zwiększoną apoptozą adipocytów, apoptozę ilościowo oznacza się również w kulturach in vitro za pomocą barwienia Annexiną V w warunkach hipoksji. Zgodnie z danymi in vivo (Ryc. 7), zwiększony poziom HIF-1α towarzyszy zwiększonej apoptozie adipocytów wywołanej warunkami hipoksjowymi (Ryc. 8b). Ponadto, aby udowodnić, że indukowana hipoksją apoptoza zależy od HIF, HIF-1α lub HIF-2α są wyciszane za pomocą interferencji RNA w adipocytach pochodzących od myszy typu dzikiego lub pozbawionych Fra-2. Zwiększona apoptoza adipocytów jest przywracana poprzez wyciszenie HIF-1α lub HIF-2α, co pokazano metodą barwienia Annexiną V na Ryc. 8b, co dowodzi, że czujnik hipoksji HIF-α reguluje apoptozę adipocytów.

Histologia adipocytów i analiza ich wielkości; obrazy mikroskopowe z wykresami porównującymi wpływ dieety o standardowym zawartości tłuszczu (ND) i dieety bogatotłuszczowej (HFD)
Rycina 6: Zwiększony rozmiar i powierzchnia adipocytów u myszy odżywianych dietą bogatotłuszczową (HFD). (a, b) H&Barwienie E przekrojów tkanki tłuszczowej otaczającej jądra u samców myszy typu dzikiego odżywianych dietą standardową (ND) (a) lub diecie bogatej w tłuszcze (HFD) (b) przez 6 tygodni. Słupki reprezentują 500 μm. (c, d) Pomiar wielkości adipocytów (c) oraz powierzchnia (d) z tkanki tłuszczowej otaczającej jajniki u myszy typu dzikiego odżywianych standardową dietą (ND)a) lub dieta o wysokiej zawartości tłuszczu (HFDb) przez 6 tygodni. n = 10. Dane przedstawiono jako średnie wartości ± SEM. Analizę statystyczną przeprowadzono za pomocą testu t Studenta t-test. ***p <0.0001.Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Schematy przedstawiające działanie niedotlenienia, HIF1α i testu TUNEL pokazujące efekty Fra-2 ΔAdip; mikroskopia w powiększeniach 20x, 40x.
Rycina 7: Zwiększony poziom HIF-1α oraz apoptoza w adipocytach dorosłych myszy Fra-2fl/fl Fabp4-CreERT. Barwienie na niedotlenienie (a) oraz HIF-1α (b) w TK samców myszy Fra-2fl/fl Fabp4-creERT i samców z grupy kontrolnej 6 tygodni po wstrzyknięciu tamoksyfenu. Powiększenie 20X, wstawka 40X. Czarne strzałki wskazują obszary niedotlenienia oraz komórki dodatnie dla HIF-1α. (c) Barwienie TUNEL w TK myszy Fra-2fl/fl Fabp4-CreERT i ich kontrolnych towarzyszy 6 tygodni po wstrzyknięciu tamoksyfenu. Powiększenie 20X, wstawka 40X. Czarne strzałki wskazują komórki dodatnie w teście TUNEL. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Luther et al. 9. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykresy słupkowe ekspresji Hif1α i Inos; wyniki testu apoptozy Annexin V, zmienność stężenia tlenu.
Rycina 8: Zwiększona ekspresja HIF-1α i apoptoza adipocytów w pierwotnych adipocytach wywołana hipoksją. (a) Analiza metodą PCR w czasie rzeczywistym poziomów mRNA HIF-1α oraz mRNA INOS, genu docelowego HIF, w pierwotnych adipocytach umieszczonych w komorach hipoksyjnych, analizowanych w wskazanych punktach czasowych.b) Identyfikacja ilościowa apoptozy metodą barwienia Annexiną V z zastosowaniem cytometrii przepływowej w pierwotnych adipocytach wyizolowanych z Fra-2fl/fl Myszy Fabp4-CreERT lub kontrolnych typu dzikiego transfekowanych plazmidem kontrolnym sh lub plazmidem sh skierowanym przeciw HIF-1α lub HIF-2α umieszczono w warunkach hipoksji (1% O₂)2) przez 24 godz. Obraz zmodyfikowano w stosunku do Luther i inni 9. Dane przedstawiono jako wartości średnie ± odchylenie standardowe (SD). Analizę statystyczną przeprowadzono za pomocą testu t Studenta t-test. *P <0,05 i **P <0,01 uznano za istotne. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Adipocyty charakteryzują się fenotypowo ich wielkością, liczbą i powierzchnią, ujawniając przerost i przerost adipocytów, wywołany nadmiernym magazynowaniem energii z powodu nadmiernego odżywiania 5. Te zdarzenia prowadzące do rozregulowania kwasów tłuszczowych i późniejszych zespołów metabolicznych są również stanami zwiększonej masy tłuszczowej z zachowanym metabolizmem, co jest również określane jako "zdrowa" ekspansja tłuszczu. Na przykład Kusminski i wsp. 21 wykazało, że myszy z masywną ekspansją tłuszczu pozostają metabolicznie zdrowe, co sugeruje, że ekspansja tłuszczu niekoniecznie jest związana z zespołami metabolicznymi i musi być dokładnie określona, aby ocenić cechy adipocytów. Tkanka tłuszczowa (AT) odgrywa kluczową rolę w regulacji metabolizmu organizmu. AT jest największym narządem endokrynnym, który może wpływać na dyslipidemię, miażdżycę, hiperinsulinemię i hiperglikemię 3. Ocena homeostazy AT i mechanizmów molekularnych ją regulujących może pozwolić na lepsze zrozumienie zaburzeń układu metabolicznego. W związku z tym odkrycie mechanizmów regulujących różnicowanie adipocytów, wielkość adipocytów i masę poduszeczek tłuszczowych pomogłoby w opracowaniu nowej metody leczenia zaburzeń otyłości. Za pomocą metod in vivo i in vitro możliwe jest określenie roli wpływu żywności i ekspresji genów na różnicowanie i aktywność adipocytów. Aby określić homeostazę AT, określenie równowagi między różnicowaniem adipocytów, proliferacją i apoptozą, jak sugeruje nasz protokół, jest równie ważne, jak analiza odpowiedzi metabolicznej glukozy i insuliny 22-24.

Analizy profilowania ekspresji genów zaangażowanych w adipogenezę, lipogenezę, lipolizę, wychwyt kwasów tłuszczowych, niedotlenienie, apoptozę i proliferację w adipocytach pierwotnych i trzewnym AT jest wysokoprzepustową metodą uzyskiwania przeglądu homeostazy adipocytów i ich możliwej dysfunkcji. Interesujący kandydaci powinni być dalej analizowani na poziomie białka za pomocą western blot lub barwienia immunohistologicznego. Aby uzyskać optymalne wyniki za pomocą systemu real-time PCR przy użyciu niesymetrycznych barwników cyjaninowych, należy przetestować stężenia cDNA w zakresie od 1 do 10 ng oraz optymalne stężenia starterów w zakresie od 50 do 900 nM w celu zminimalizowania niespecyficznej amplifikacji. Krytycznymi składnikami są podkłady; Dla każdego przebiegu krzywe topnienia muszą być ściśle kontrolowane, aby zapewnić specyficzność i wykluczyć tworzenie się dimerów starterów. Dlatego zaleca się stosowanie kontroli ujemnej zH2Ozamiast cDNA. Ponadto dostępne na rynku niesymetryczne barwniki cyjaninowe są dostarczane jako mieszanki główne, które zawierają pasywny barwnik referencyjny (taki jak ROX) w celu zapewnienia wewnętrznego sygnału odniesienia. Sygnał cDNA jest normalizowany podczas analizy danych do sygnałów ROX w celu skorygowania wahań sygnału między studniami. Kolejną kwestią, którą należy wziąć pod uwagę w celu stworzenia dobrego systemu qPCR, jest wybór genu sprzątania. Dla każdego schorzenia stosuje się kilka genów porządkowych, np. HPRT, β-aktyna, GAPDH, β-2-MG lub HSP90.

Białka HIF stabilizowane w warunkach niedotlenienia są głównymi regulatorami warunkującymi nie tylko przeżycie adipocytów, ale także przemian metabolicznych, takich jak glukoza, tolerancja insuliny i metabolizm lipidów 11,25,26. Aby ustalić niedotlenione obszary w poduszce tłuszczowej, HIF-1α jest oznaczany w sekcjach AT za pomocą immunohistochemii. Ponieważ białka HIF ulegają szybkiej degradacji w ciągu 5 do 10 minut w warunkach normoksycznych, procedura i utrwalanie poduszeczki tłuszczowej do analizy histologicznej powinny być ściśle kontrolowane, aby uniknąć czasu utajenia. Dlatego, aby zapewnić niedotlenienie nie tylko poprzez barwienie HIF, pimonidazol stosuje się do określania obszarów niedotlenienia w AT. Pimonidazol jest zdolny do rozprowadzania się w tkankach, jak to już wykazano w kościach 27, i skutecznie zaznacza obszary niedotlenione poprzez wiązanie się z białkami zawierającymi tiol specyficznie w niedotlenionych komórkach, co jest dalej wykrywane w odcinkach histologicznych przez specyficzne wiązanie przeciwciał 28. Jednak do analizy szlaku niedotlenienia można zastosować inne markery i metody. Na przykład udział enzymu hydroksylazy prolilowej (PHD), który indukuje hydroksylację reszt proliny w normoksji, a także białka von Hippel-Lindau (VHL), które rozpoznaje hydroksylowane proliny i indukuje poliubikwitynację w celu pośredniczenia w proteasomalnej degradacji HIF, musi być analizowane w celu uzyskania pełnego przeglądu szlaku 29,30. Co więcej, wszechobecne wykrywanie HIF określiłoby również stabilność i degradację białek, które mogą być zmienione 31,32.

Ponadto proliferację przez Ki67 i apoptozę przez barwienie TUNEL określa się in vivo poprzez barwienie skrawków histologicznych AT. Przeprowadza się również kwantyfikację proliferacji przez Ki67 i apoptozę za pomocą barwienia TUNEL lub aneksyny V za pomocą analizy cytometrii przepływowej 33. Proliferację można oczywiście zmierzyć za pomocą innych technik, takich jak analiza cyklu komórkowego adipocytów, który nie jest uwzględniony w pomiarze komórek Ki67 dodatnich. Co więcej, badanie apoptozy za pomocą TUNEL może być uzupełnione analizami FACS Aneksyny V i TOP-PR-3, które określą poziomy martwicy w porównaniu z procesem apoptozy śmierci komórki. Apoptoza jest podstawowym procesem dla programu śmierci komórki, co jest ważne dla homeostazy AT. Rzeczywiście, rozregulowanie apoptozy adipocytów było wcześniej związane z procesami przyczyniającymi się do otyłości i lipodystrofii 34. Co więcej, w 2011 roku Keuper i wsp. powiązali zapalenie tkanki tłuszczowej z apoptozą adipocytów. Wykazali, że makrofagi indukują apoptozę w preadipocytach i adipocytach, które z kolei przyciągają makrofagi. Rekrutacja makrofagów przyspiesza stan zapalny, co przyczynia się do zespołów metabolicznych, takich jak tolerancja glukozy i insuliny 35. Jednak apoptoza adipocytów jest nadal słabo zbadanym zjawiskiem, pomimo hipotezy, że indukowana apoptoza adipocytów może prowadzić do zmniejszenia masy ciała.

Niniejszy protokół wykorzystuje podejścia immunohistochemiczne do badania różnych zjawisk, takich jak proliferacja, apoptoza i niedotlenienie in vivo. Dlatego tkanka została utrwalona za pomocą 4% formaldehydu, co jest krytycznym krokiem. Wydłużony czas wiązania tkanek prowadzi do zmiany epitopów, które stają się niedostępne dla przeciwciała. Natomiast krótki czas utrwalania zwiększa wrażliwość epitopów na odczynniki. Zalecany optymalny czas utrwalenia to 24 godziny. Co więcej, grubość skrawków wpływa również na przeciwciała wiążące się z ich epitopami; Optymalna grubość wynosi od 2 do 5 μm. Sekcje grubsze niż 5 μm dadzą fałszywie dodatnie wyniki ze względu na zwiększone miejsca wiązania. Natomiast odcinki cieńsze niż 2 μm zawierają mniej miejsc wiązania, a obszary dodatnie nie są dobrze zdefiniowane. Kolejnymi krytycznymi czynnikami są samo przeciwciało, czas inkubacji, stężenie, a nawet temperatura, które wpływają na jakość specyficznego wiązania z epitopami. Dlatego walidacja stężenia przeciwciał i czasu inkubacji jest konieczna dla każdego stanu.

Aby uzupełnić badanie, przedstawiamy protokół różnicowania adipocytów in vitro , który może być rozszerzony o różne zabiegi, stymulację lub kohodowle. Dzięki zastosowaniu hodowli adipocytów in vitro możliwe jest określenie defektów w różnicowaniu i funkcjach adipocytów. Aby uzyskać wiarygodne wyniki, podobnie jak w przypadku wszystkich komórek pierwotnych, bardzo ważne jest zdrowe zachowanie i wygląd ADSC i adipocytów. Ziarnistość, wakuolacje cytoplazmatyczne i/lub oderwanie są oznakami pogorszenia, wskazującymi na nieodpowiednią pożywkę, zanieczyszczenie mikrobiologiczne lub starzenie się komórek pierwotnych. W protokole tym wykorzystuje się wyizolowane adipocyty z tkanki poduszeczki tłuszczowej, podczas gdy równie dobrze możliwe jest użycie mezenchymalnych komórek macierzystych wyizolowanych ze szpiku kostnego, jak opisano w innych protokołach 36. Najnowszy z nich obejmuje zrębowe komórki progenitorowe, które mogą odzwierciedlać dodatkowe problemy z różnicowaniem występujące na bardzo wczesnym etapie różnicowania adipocytów, co może zostać pominięte w naszym obecnym protokole. Co więcej, ADSC mogą być szybko rozrastane (ponad 10 razy w ciągu jednego tygodnia), a długotrwale hodowane ADSC po niektórych pasażach nadal zachowują swoją mezenchymalną pluripotencję 37,38. Kolejną zaletą stosowania ADSC jest to, że można łatwo przełączyć się na człowieka, ponieważ ADSC można pobrać od pacjentów za pomocą liposukcji, która jest prostą i mało inwazyjną metodą.

Ponieważ AT wpływa na kilka innych narządów w sposób endokrynologiczny, protokół powinien zostać rozszerzony na adipokiny. Wiadomo, że adipokiny, takie jak leptyna, adiponektyna, czynnik α martwicy nowotworu (TNF) i rezystyna, wydzielane przez adipocyty, wpływają na choroby metaboliczne poprzez kontrolowanie metabolizmu tłuszczów, homeostazy energetycznej i wrażliwości na insulinę 39. W związku z tym należy wykonać analizę sekretomu w surowicy i adipocytach. W przypadku dysfunkcji AT adipokiny i cytokiny prozapalne, takie jak IL-6, mogą prowadzić do rozregulowania narządów, takich jak wątroba i trzustka, oraz funkcji mięśni 4. Aby wykluczyć ogólnoustrojową dysfunkcję narządów, można przetestować modele zwierzęce lub hodowle komórkowe pod kątem ich reakcji na stymulację i wychwyt glukozy.

W tym miejscu przedstawiamy protokół analizy podstawowego stanu AT i adipocytów in vivo i in vitro w celu ujawnienia molekularnych mechanizmów homeostazy i funkcjonalności adipocytów.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy uprzejmie dziękują Dr. J. Lutherowi i K. Ubiecie za przygotowanie danych oraz Dr. B. Grötschowi za korektę manuskryptu. Prace te były wspierane przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (BO3811/1-1-Emmy Noether).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Roztwór RNAlaterstabilizujący RNAAmbionAM7021
Zestaw do odwrotnej transkrypcji cDNA o dużej pojemnościApplied Biosystems4368813
SYBR Select Master Mix4472908
Oczyszczony mysz Anty-ludzki Ki-67BD Biosciences550609Klon B56 (RUO)
Oczyszczony mysz anty-ludzki klon Ki-67 B56 (RUO)550609proliferacji
FITC Aneksyna VBioLegend640906
Rozszczepiona kaspaza-3 MAb królikaSygnalizacja komórkowa9664SKlon 5A1E
Rozszczepiona kaspaza-3 (Asp175) (5A1E) MAb królika9664Marker
Lipofectamina2000 Odczynnik Invitrogen11668-027
TO-PRO-3 JodekT3605Przeciwbarwienie jądrowe, Monomeryczne barwienie kwasem nukleinowym cyjaniny, Wzbudzenie i frasl; Emisja: 642⁄ 661 nm
Mayer' s hemaluz,Merck109249hematoksylin
pegGOLD TriFastPeqlab30-2030TRIzol, jednofazowy roztwór izotiocyjanianu guanidyny i fenolu
Percellys Ceramic Kit 1.4  mm91-PCS-CK14probówki zawierające kulki ceramiczne (1,4 mm)
HomogenizatorPrecellys 2491-PCS24
Przeciwciało alfa HIF-1PiercePA1-16601
Przeciwciało alfa HIF-1, 16H4L13700505Marker
Zestaw do wykrywania śmierci komórkowej In Situ/em, FluoresceinaRoche11 684 795 001Znakowanie końcówek dUTP-biotyna za pośrednictwem TdT (TUNEL) 
EosinSigma318906
Roztwór DNazy I (1  jednostka/&mikro; l)Thermo ScientificEN0525
biotynylowany anty mysi IgG (H + L)Vector LaboratoriesBA-9200
biotynylowany anty mysz IgG (H + L)BA-1000
Vectastain ABC KitPK-4000
VECTASHIELD Medium montażowe z DAPIH-1200
Roztwór Marker apoptozy hipoksji

Bibliografia

  1. Obesity and Overweight. Fact Sheet °113. WHO. , (Jan 2014) (2014).
  2. Gong, Z., Muzumdar, R. H. Pancreatic function, type 2 diabetes, and metabolism in aging. Int J Endocrinol. , 320482(2012).
  3. Deng, Y., Scherer, P. E. Adipokines as novel biomarkers and regulators of the metabolic syndrome. Ann N Y Acad Sci. 1212, 1-19 (2010).
  4. Rezaee, F., Dashty, M. Role of Adipose Tissue in Metabolic System Disorders Adipose Tissue is the Initiator of Metabolic Diseases. J Diabetes Metab. , 008(2013).
  5. Rutkowski, J. M., Stern, J. H., Scherer, P. E. The cell biology of fat expansion. J Cell Biol. 208, 501-512 (2015).
  6. Ma, X., Lee, P., Chisholm, D. J., James, D. E. Control of adipocyte differentiation in different fat depots; implications for pathophysiology or therapy. Front Endocrinol (Lausanne). 6, 1(2015).
  7. Farmer, S. R. Transcriptional control of adipocyte formation. Cell Metab. 4, 263-273 (2006).
  8. Luther, J., et al. Elevated Fra-1 expression causes severe lipodystrophy. J Cell Sci. 124, 1465-1476 (2011).
  9. Luther, J., et al. Fra-2/AP-1 controls adipocyte differentiation and survival by regulating PPARgamma and hypoxia. Cell Death Differ. , (2014).
  10. Semenza, G. L. Regulation of mammalian O2 homeostasis by hypoxia-inducible factor 1. Annu Rev Cell Dev Biol. 15, 551-578 (1999).
  11. Kim, W., Kaelin, W. G. The von Hippel-Lindau tumor suppressor protein: new insights into oxygen sensing and cancer. Curr Opin Genet Dev. 13, 55-60 (2003).
  12. Aragones, J., Fraisl, P., Baes, M., Carmeliet, P. Oxygen sensors at the crossroad of metabolism. Cell Metab. 9, 11-22 (2009).
  13. Sun, K., Halberg, N., Khan, M., Magalang, U. J., Scherer, P. E. Selective inhibition of hypoxia-inducible factor 1alpha ameliorates adipose tissue dysfunction. Mol Cell Biol. 33, 904-917 (2013).
  14. Imai, T., Jiang, M., Chambon, P., Metzger, D. Impaired adipogenesis and lipolysis in the mouse upon selective ablation of the retinoid X receptor alpha mediated by a tamoxifen-inducible chimeric Cre recombinase (Cre-ERT2) in adipocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 224-228 (2001).
  15. Clegg, D. J., Brown, L. M., Woods, S. C., Benoit, S. C. Gonadal hormones determine sensitivity to central leptin and insulin. Diabetes. 55, 978-987 (2006).
  16. Haluzik, M., et al. Genetic background (C57BL/6J versus FVB/N) strongly influences the severity of diabetes and insulin resistance in ob/ob mice. Endocrinology. 145, 3258-3264 (2004).
  17. Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical biochemistry. 162, 156-159 (1987).
  18. Paraffin Processing of Tissue. Protocolsonline. , Available from: http://protocolsonline.com/histology/sample-preparation/paraffin-processing-of-tissue/ (2012).
  19. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
  20. Planat-Benard, V., et al. Plasticity of human adipose lineage cells toward endothelial cells: physiological and therapeutic perspectives. Circulation. 109, 656-663 (2004).
  21. Kusminski, C. M., et al. MitoNEET-driven alterations in adipocyte mitochondrial activity reveal a crucial adaptive process that preserves insulin sensitivity in obesity. Nat Med. 18, 1539-1549 (2012).
  22. Trajcevski, K. E., et al. Enhanced lipid oxidation and maintenance of muscle insulin sensitivity despite glucose intolerance in a diet-induced obesity mouse model. PLoS One. 8, 71747(2013).
  23. Montgomery, M. K., et al. Mouse strain-dependent variation in obesity and glucose homeostasis in response to high-fat feeding. Diabetologia. 56, 1129-1139 (2013).
  24. de Queiroz, K. B., et al. Molecular mechanism driving retroperitoneal adipocyte hypertrophy and hyperplasia in response to a high-sugar diet. Mol Nutr Food Res. 58, 2331-2341 (2014).
  25. Ye, J. Emerging role of adipose tissue hypoxia in obesity and insulin resistance. Int J Obes (Lond). 33, 54-66 (2009).
  26. Xiong, Y., et al. The local corticotropin-releasing hormone receptor 2 signalling pathway partly mediates hypoxia-induced increases in lipolysis via the cAMP-protein kinase A signalling pathway in white adipose tissue. Mol Cell Endocrinol. 392, 106-114 (2014).
  27. Bozec, A., et al. Osteoclast size is controlled by Fra-2 through LIF/LIF-receptor signalling and hypoxia. Nature. 454, 221-225 (2008).
  28. Varia, M. A., et al. Pimonidazole: a novel hypoxia marker for complementary study of tumor hypoxia and cell proliferation in cervical carcinoma. Gynecol Oncol. 71, 270-277 (1998).
  29. Park, M. H., Choi, K. Y., Jung, Y., Min do, S. Phospholipase D1 protein coordinates dynamic assembly of HIF-1alpha-PHD-VHL to regulate HIF-1alpha stability. Oncotarget. 5, 11857-11872 (2014).
  30. Tennant, D. A., et al. Reactivating HIF prolyl hydroxylases under hypoxia results in metabolic catastrophe and cell death. Oncogene. 28, 4009-4021 (2009).
  31. Kim, J., So, D., Shin, H. W., Chun, Y. S., Park, J. W. HIF-1alpha Upregulation due to Depletion of the Free Ubiquitin Pool. Journal of Korean medical science. 30, 1388-1395 (2015).
  32. Amelio, I., et al. TAp73 opposes tumor angiogenesis by promoting hypoxia-inducible factor 1alpha degradation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 226-231 (2015).
  33. Suga, H., et al. Adipose tissue remodeling under ischemia: death of adipocytes and activation of stem/progenitor cells. Plast Reconstr Surg. 126, 1911-1923 (2010).
  34. Moreno-Indias, I., Tinahones, F. J. Impaired adipose tissue expandability and lipogenic capacities as ones of the main causes of metabolic disorders. J Diabetes Res. 2015, 970375(2015).
  35. Keuper, M., et al. An inflammatory micro-environment promotes human adipocyte apoptosis. Mol Cell Endocrinol. 339, 105-113 (2011).
  36. Sera, Y., et al. Hematopoietic stem cell origin of adipocytes. Experimental hematology. 37, 1108-1120 (2009).
  37. Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue engineering. 7, 211-228 (2001).
  38. Zuk, P. A., et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Molecular biology of the cell. 13, 4279-4295 (2002).
  39. Scherer, P. E. Adipose tissue: from lipid storage compartment to endocrine organ. Diabetes. 55, 1537-1545 (2006).

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Różnicowanie adipocytówapoptoza adipocytówekspozycja na hipoksjęanaliza histologicznaprofilowanie ekspresji genówbarwienie pimonidazolemHIF-1 alfainterferencja RNAtkanka tłuszczowazespół metaboliczny
Mechanizm regulacji liczby adipocytów w organizmach dorosłych poprzez różnicowanie i homeostazę apoptozy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.