Transfuzja płytek krwi i hemostaza były modelowane za pomocą komór do rekonstytucji krwi i przepływu mikroprzepływowego w celu zbadania funkcji płytek krwi bankujących. Dane wskazują na wpływ zmian spichrzających płytki krwi na hemostazę in vitro.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Mikroprzepływowe komory przepływowe wykorzystujące rozpuszczoną krew do modelowania hemostazy i transfuzji płytek krwi in vitro
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Płytki krwi przygotowane do transfuzji stopniowo tracą funkcję hemostatyczną podczas przechowywania. Funkcję płytek krwi można badać za pomocą różnych (pośrednich) eksperymentów in vitro, ale żaden z nich nie jest tak wszechstronny jak komory przepływowe mikroprzepływowe. W tym protokole odtworzenie świeżej krwi małopłytkowej z zapisanymi płytkami krwi w banku krwi służy do symulacji transfuzji płytek krwi. Następnie odtworzona próbka jest perfuzjowana w mikroprzepływowych komorach przepływowych, które naśladują hemostazę na odsłoniętych białkach macierzy podśródbłonkowej. Efekty oddawania krwi, transportu, separacji składników, przechowywania i inaktywacji patogenów można mierzyć w sparowanych projektach eksperymentalnych. Pozwala to na wiarygodne porównanie wpływu każdej manipulacji w przygotowaniu składników krwi na hemostazę. Nasze wyniki pokazują wpływ cyklicznych zmian temperatury, szybkości ścinania, stężenia płytek krwi i czasu przechowywania na funkcję płytek krwi. Podsumowując, protokół ten analizuje funkcję płytek krwi w banku krwi, co ostatecznie pomaga w optymalizacji łańcucha przetwarzania, w tym upuszczania krwi, transportu, przygotowania komponentów, przechowywania i transfuzji.
Wprowadzenie
Hemostaza wymaga połączonej i regulowanej aktywności komórek, białek, jonów i tkanek w ograniczonym kontekście czasoprzestrzennym1. Niekontrolowana aktywność może prowadzić do krwotoku lub zakrzepicy oraz zachorowalności lub śmiertelności w spektrum zaburzeń związanych z krzepnięciem krwi. Eksperyment z mikroprzepływową komorą przepływową to trudna technika, która naśladuje hemostazę in vitro. Takie podejście pozwala na badanie złożonych wzajemnych oddziaływań procesów biorących udział w hemostazie z wiodącą rolą dla płytek krwi.
Po uszkodzeniu naczyniowym, płytki krwi przylegają do odsłoniętych białek (gliko)macierzy po....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Ten protokół jest zgodny z instytucjonalnymi wytycznymi etycznymi dotyczącymi badań na próbkach ludzkich i uzyskano świadomą zgodę od wszystkich zaangażowanych dawców. Zgodę na opisane tu eksperymenty uzyskano od instytucjonalnej komisji rewizyjnej Szpitala Uniwersyteckiego w Antwerpii.
Uwaga: Wskaźniki temperatury zawsze dotyczą temperatury pokojowej, chyba że określono inaczej.
1. Ustawienie komory przepływowej przygotowania
- Przygotowanie torów, rurek i sworzni
- Energicznie wymieszać zawiesinę kolagenu i rozcieńczyć w stosunku 1/20 w izotonicznym roztworze glukozy dostarczonym przez dosta....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Aby zademonstrować zmienność wewnątrzanalizy, trzy identyczne zrekonstytuowane próbki krwi pełnej perfundowano jednocześnie przez powierzchnie powlekane kolagenem (Rysunek 1). Przyniosło to współczynnik zmienności wynoszący 8,7%. Statystyka ta wskazuje na akceptowalną zmienność wewnątrzanalizy i wewnątrzlaboratoryjną, co pozwala na wiarygodne porównanie powiązanych próbek.
Wlot komercyjnej komory przepływowej, k.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Eksperymenty w komorze przepływowej mikroprzepływowej są doskonałym narzędziem do badania funkcji płytek krwi w przepływającej krwi i są wykorzystywane do oceny hemostazy in vitro w różnych kontekstach eksperymentalnych. Pomimo słabej standaryzacji międzylaboratoryjnej9 wykazaliśmy, że w naszym laboratorium zmienność doświadczalna jest akceptowalna. Pozwala to na wiarygodne porównanie (sparowanych) próbek w ramach danego badania. Zostało to potwierdzone za pomocą dobrze udokumentowanego zjawiska zmian.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy nie mają żadnych podziękowań.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Rurka próżniowa BD z EDTA | Becton, Dickinson and Company | 368856 | |
| Rurka próżniowa BD z heparyną | Becton, Dickinson and Company | 368480 | |
| Rurka próżniowa BD z cytrynianem sodu | Becton, Dickinson and Company | 366575 | |
| Hirudin Probówka do krwi | Roche | 6675751 001 | |
| Odkurzacz BD Eclipse | Becton, Dickinson i Spółka | 368650 | Igła do pobierania krwi z fabrycznie przymocowanym uchwytem |
| Końcówki do pipet 100-1 000 | Greiner bio-one | 740290 | |
| Końcówki do pipet 2-200 | Greiner bio-one | 739280 | |
| Końcówki do pipet 1-10 | Eppendorf | A08928 | |
| Tubka 5 ml | Simport | 11691380 | |
| Rurka stożkowa 15 ml | Greiner bio-one | 1888271 | |
| Tubka stożkowa 50 ml | Greiner bio-one | 227261 | |
| 10 ml Strzykawka | BD | 309604 | |
| Chusteczki precyzyjne | Kimtech | 5511 | |
| Vena8 Fluoro+ Biochips | Cellix | 188V8CF-400-100-02P10 | Nazwany w Rysunek S1 A jako 'Biochip'Vena8 |
| Rurka | Cellix | TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F | Nazwany w Rysunek S1 B jako "Jednorazowe rurki" |
| Igły Vena8 | Cellix | SS-P-B1IC-B1OC-PACK200 | Nazwane w Rysunek S1 B jako 'Pin'Złącza |
| do jednowejściowych biochipów | Cellix | CONNECTORS-B1IC-PACK100 | |
| Multiflow8 connect | Cellix | MF8-CONNECT-BIC3-N-THROMBOSIS | Nazwany w Rysunek S1 B jako "Rurki wielokrotnego użytku" i "Splitter" |
| Pudełko nawilżane | Cellix | HUMID-BOX | |
| Oprogramowanie pompa mikroprzepływowa | Cellix | N/A | Venaflux Assay |
| Horm | Collagen Takeda/Nycomed | 1130630 | Natywny kolagen ścięgien koni (typ I) Uzupełnia się izotoniczny roztwór glukozy do rozcieńczania kolagenu |
| Sól fizjologiczna buforowana HEPES (HBS) | w przygotowaniu domowym | 10 | mM sól fizjologiczna buforowana kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES) (0,9% (w/v) NaCl, pH 7,4) |
| Bufor blokujący | w domu przygotowanie | w przygotowaniu domowym | 1,0% (w/v) albumina surowicy bydlęcej i 0,1% (w/v) glukoza w HBS |
| Calcein AM | Sondy molekularne | C1430 | |
| Wybielacz 10% | w domu przygotowanie | w domu | |
| przygotowanie 0,1 M NaOH | w domu przygotowanie | w domu | |
| przygotowanie Alkohol denaturowany | Fiers | T0011.5 | |
| Mirus Evo Nanopump | Cellix | 188-MIRUS-PUMP-EVO | z Multiflow8. Nazwany w Rysunek S1 A jako "Pompa" i "Kolektor" |
| Mikroskop | Zeiss | Axio Observer Z1 | wyposażony w kamerę colibri-LED i CCD o wysokiej rozdzielczości |
| Mikroskop programowy | Zeiss | N/A | ZEN 2012 |
| Sysmex | N/A | ||
| Wirówka stołowa | Eppendorf | 521-0095 | |
| Inkubator płytek | krwi Helmer | PF-48i | |
| Kąpiel wodna do inkubacji | GFL | 1013 | |
| Marka pipet | A03429 | ||
| Wałek rurowy | Ratek | BTR5-12V | |
| Sterylne urządzenie dokujące | Terumo BCT | TSCD | |
| Zgrzewarka do rur | Terumo BCT | AC-155 | |
| Vortex | VWR | 58816-121 |
Bibliografia
- Broos, K., Feys, H. B., De Meyer, S. F., Vanhoorelbeke, K., Deckmyn, H. Platelets at work in primary hemostasis. Blood Rev. 25, 155-167 (2011).
- Stalker, T. J., et al. Hierarchical organization in the hemostatic response and its relationship to the platelet-signaling netwo....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
