Method Article

Mikroprzepływowe komory przepływowe wykorzystujące rozpuszczoną krew do modelowania hemostazy i transfuzji płytek krwi in vitro

DOI:

10.3791/53823

⸱

March 19th, 2016

 ,  ,  ,  , 
1Transfusion Research Center, Belgium Red Cross-Flanders, 2Blood Service, Belgium Red Cross-Flanders, 3Department of Public Health and Primary Care, Catholic University of Leuven, 4Faculty of Medicine and Health Sciences, University of Ghent

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transfuzja płytek krwi i hemostaza były modelowane za pomocą komór do rekonstytucji krwi i przepływu mikroprzepływowego w celu zbadania funkcji płytek krwi bankujących. Dane wskazują na wpływ zmian spichrzających płytki krwi na hemostazę in vitro.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Płytki krwi przygotowane do transfuzji stopniowo tracą funkcję hemostatyczną podczas przechowywania. Funkcję płytek krwi można badać za pomocą różnych (pośrednich) eksperymentów in vitro, ale żaden z nich nie jest tak wszechstronny jak komory przepływowe mikroprzepływowe. W tym protokole odtworzenie świeżej krwi małopłytkowej z zapisanymi płytkami krwi w banku krwi służy do symulacji transfuzji płytek krwi. Następnie odtworzona próbka jest perfuzjowana w mikroprzepływowych komorach przepływowych, które naśladują hemostazę na odsłoniętych białkach macierzy podśródbłonkowej. Efekty oddawania krwi, transportu, separacji składników, przechowywania i inaktywacji patogenów można mierzyć w sparowanych projektach eksperymentalnych. Pozwala to na wiarygodne porównanie wpływu każdej manipulacji w przygotowaniu składników krwi na hemostazę. Nasze wyniki pokazują wpływ cyklicznych zmian temperatury, szybkości ścinania, stężenia płytek krwi i czasu przechowywania na funkcję płytek krwi. Podsumowując, protokół ten analizuje funkcję płytek krwi w banku krwi, co ostatecznie pomaga w optymalizacji łańcucha przetwarzania, w tym upuszczania krwi, transportu, przygotowania komponentów, przechowywania i transfuzji.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hemostaza wymaga połączonej i regulowanej aktywności komórek, białek, jonów i tkanek w ograniczonym kontekście czasoprzestrzennym1. Niekontrolowana aktywność może prowadzić do krwotoku lub zakrzepicy oraz zachorowalności lub śmiertelności w spektrum zaburzeń związanych z krzepnięciem krwi. Eksperyment z mikroprzepływową komorą przepływową to trudna technika, która naśladuje hemostazę in vitro. Takie podejście pozwala na badanie złożonych wzajemnych oddziaływań procesów biorących udział w hemostazie z wiodącą rolą dla płytek krwi.

Po uszkodzeniu naczyniowym, płytki krwi przylegają do odsłoniętych białek (gliko)macierzy podśródbłonkowej, aby zapobiec utracie krwi. Po adhezji płytki krwi aktywują się i agregują w odpowiedzi na sygnalizację auto- i parakrynną, co ostatecznie prowadzi do powstania sieci płytek krwi, stabilizowanej przez fibrynę i powodującej mocną, uszczelniającą ranęskrzeplinę 2. W przeciwieństwie do większości innych testów czynnościowych płytek krwi, eksperymenty z komorami przepływowymi uwzględniają fizyczny parametr przepływu krwi, a tym samym wpływ reologii na uczestniczące komórki i biomolekuły3,4.

Eksperymenty w komorze przepływowej przyniosły przełomowe spostrzeżenia na temat hemostazy i zakrzepicy poprzez zmianę kluczowych parametrów wpływających na procesy hemostatyczne, w tym matrycę adhezyjną, profile reologii i przepływu, skład komórkowy, obecność toksyn lub leków, siłę jonową i wiele innych. W ciągu ostatnich dwóch dekad eksperymenty z komorami przepływowymi o niskiej przepustowości, wymagające dużych objętości próbek (10-100 ml), przekształciły się w komory mikroprzepływowe, często składające się z małych komór z równoległymi płytkami i zawierające nowoczesną technologię perfuzji krwi pełnej w kontrolowanych warunkach ścinania ścian5. Mikroskalowanie znacznie zwiększyło przepustowość testów, głównie dlatego, że konfiguracja sprzętu została uproszczona i wymagana jest mniejsza objętość (krwi), dzięki czemu eksperyment jest bardziej dostępny i wszechstronny. Na przykład krew pochodząca od małych zwierząt laboratoryjnych może być teraz wykorzystywana bez konieczności składania zwierząt w ofierze. Próbki krwi genetycznie zmodyfikowanych myszy pomogły zatem w identyfikacji kluczowych cząsteczek promujących lub hamujących hemostazę oraz w uzyskaniu nowych podstawowych informacji6.

Specjalistyczne laboratoria badawcze często nadal używają specjalnie wykonanych komór przepływowych, na przykład z polidimetylosiloksanu (PDMS)7, który polimeryzuje na litografowanych formach, które mogą być drukowane przez oprogramowanie. Powstała w ten sposób komora jest niedroga, jednorazowa i można ją łatwo zdemontować w celu analizy post hoc. Co więcej, w zasadzie każdy projekt statku, w tym bifurkacje lub ostre zakręty, może być zbudowany na rozkaz. Ta zaleta jest również jego wadą, ponieważ standaryzacja była już głównym problemem w eksperymentach z komorami przepływowymi, a komory wykonane na zamówienie PDMS nie pomogły w tym. Na domiar złego, powłoka (warunki), sondy fluorescencyjne, antykoagulant, temperatura i czas między pobraniem próbki a analizą są słabo ustandaryzowane8. Standaryzacja tych zmiennych jest trudna, ale mimo to wymagana, aby umożliwić porównanie wyników między laboratoriami. Temat ten jest głównym tematem podkomitetu Międzynarodowego Towarzystwa Zakrzepicy i Hemostazy w Podkomitecie Naukowym i Normalizacyjnym ds. Bioreologii9,10.

Koncentraty płytek krwi (PC) są przetaczane pacjentom cierpiącym na różne choroby, które powodują małopłytkowość i/lub krwawienie. Wiadomo jednak, że płytki krwi w PC odczulają, zwłaszcza w zależności od czasu przechowywania11, co jest procesem degradacji związanym ze starzeniem się i powszechnie nazywanym zmianą spichrzania płytek krwi. Czasami twierdzi się, że takie płytki krwi przywracają krążenie po przetoczeniu12, ale dowody na to są nieliczne. Ponadto funkcjonalność płytek krwi tworzących PC nie jest rutynowo badana, ponieważ związek między takimi testami a skutecznością terapeutyczną lub profilaktyczną jest niejasny13. Mikroprzepływowe komory przepływowe oferują środki do badania funkcji płytek krwi w PC w celu optymalizacji łańcucha manipulacji między pobraniem a wydaniem. Jest to potężne narzędzie badawcze do bezpośrednich (sparowanych) porównań komputerów PC, ponieważ wcześniej opublikowaliśmy14,15 i jest opisane tutaj.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół jest zgodny z instytucjonalnymi wytycznymi etycznymi dotyczącymi badań na próbkach ludzkich i uzyskano świadomą zgodę od wszystkich zaangażowanych dawców. Zgodę na opisane tu eksperymenty uzyskano od instytucjonalnej komisji rewizyjnej Szpitala Uniwersyteckiego w Antwerpii.

Uwaga: Wskaźniki temperatury zawsze dotyczą temperatury pokojowej, chyba że określono inaczej.

1. Ustawienie komory przepływowej przygotowania

  1. Przygotowanie torów, rurek i sworzni
    1. Energicznie wymieszać zawiesinę kolagenu i rozcieńczyć w stosunku 1/20 w izotonicznym roztworze glukozy dostarczonym przez dostawcę do końcowego stężenia 50 μg/ml.
      Uwaga: Używamy kolagenu ścięgien koni, składającego się głównie z włókien typu I. Kolagen koni typu I jest często określany jako kolagen "Horm" i jest złotym standardem dla tego typu testu9 zarówno z powodów historycznych, jak i biologicznych. Można również stosować kolagen ludzki typu III, ale włókna słabiej się pokrywają, a odpowiedź płytek krwi nie jest tak silna. Można również stosować inne powierzchnie powłokowe, na przykład czynnik von Willebranda (VWF), fibrynogen, fibronektynę, lamininę, witronektynę, trombospondynę-1 lub kombinacje tych16.
    2. Weź nowy jednorazowy biochip z pojemnika dostawcy. Wymiary użytych tutaj biochipów to 0,4 szer. x 0,1 wys. x 20 dł. w mm3.
    3. Odpipetować 0,8 μl do pasa (pasów) mikroprzepływowego biochipa na jednym końcu chipa i oznaczyć jako wylot. Upewnij się, że pas jest wypełniony w 5/6 roztworem powlekającym zawierającym kolagen przygotowanym w 1.1.1. Upewnij się, że nie ma pęcherzyków powietrza.
      Uwaga: Kanały są częściowo powlekane, aby uniknąć gromadzenia się włókien kolagenowych przy wejściu do kanału (patrz dyskusja).
    4. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 4 godziny lub przez noc w wilgotnym i zamkniętym pojemniku.
    5. Zatkać powleczone kanały, pipetując bufor blokujący (1,0% (w/v) albuminy surowicy bydlęcej i 0,1% (w/v) glukozy w 10 mM roztworze soli fizjologicznej buforowanym kwasem 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowym (HEPES) (HBS; 0,9% (w/v) NaCl, pH 7,4) na drugim końcu i oznaczyć jako wlot. Upewnij się, że pas ruchu jest całkowicie wypełniony buforem blokującym, unikając pęcherzyków powietrza.
    6. Przyciąć rurkę na równą długość (12 cm). Użyj jednego na linię i połącz każdą rurkę za pomocą kołka. Na przykład eksperyment porównujący dwa warunki, przebieg w duplikacie będzie wymagał przygotowania czterech odcinków rurek i czterech kołków.
    7. Przepłukać rurkę wodą destylowaną za pomocą strzykawki i igły 26 G lub dołączonych łączników.
    8. Nasycić rurkę buforem blokującym. Przechowywać w zamkniętym i wilgotnym pojemniku przez minimum 1 godzinę.
  2. Przygotowanie pompy i kolektora
    1. Przepłukać pompę i kolektor wodą destylowaną, usunąć pęcherzyki powietrza.
    2. Odessać bufor blokujący z linii (linii) biochipa za pomocą zamocowanej końcówki 10 μl na wylocie. Oczyść powierzchnię biochipa precyzyjną chusteczką bezpyłową i denaturowanym alkoholem, aby usunąć odciski i kurz.
    3. Zamocuj biochip na zautomatyzowanym stoliku mikroskopowym. Jeśli w jednym przebiegu używany jest jednocześnie więcej niż jeden tor, podłącz rozdzielacz rozdzielacza ośmiopasmowego do gniazda biochipa.
      Uwaga: Rozdzielacz kolektora ośmiopasmowego to element sprzętowy (rysunek S1) podłączony do pompy i biochipa. Umożliwia obsługę wszystkich dostępnych (ośmiu) torów na biochipie lub kombinacji pasów, które mogą być zdefiniowane przez operatora w dołączonym oprogramowaniu.
    4. Użyj kołków w wężyku, aby zamocować je we wlocie biochipa. Umieść drugi koniec rurki (bez szpilki) w stożkowej probówce o pojemności 1,5 ml wypełnionej HBS. Przepłukać wszystkie rurki i ich połączone tory 1 ml HBS za pomocą pompy, aby usunąć resztki buforu blokującego i słabo przylegający kolagen.

2. Przygotowanie próbek krwi

  1. Pobranie i oddzielenie świeżej krwi pełnej od zdrowego ochotnika. 17
    1. Zebrać pierwsze mililitry krwi do opróżnionej probówki zawierającej kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) jako antykoagulant i używać wyłącznie tej próbki do pełnej morfologii krwi (CBC) za pomocą automatycznego analizatora hematologicznego.
    2. Zebrać objętość krwi w odpowiednim antykoagulantu za pomocą opróżnionych rurek. Standardowymi antykoagulantami do eksperymentów w komorze przepływowej są heparyna lub hirudyna, gdy tworzenie fibryny nie jest częścią protokołu badania, oraz cytrynian sodu, gdy jest.
      Uwaga: Heparyna była stosowana jako antykoagulant we wszystkich eksperymentach opisanych w wynikach.
      Uwaga: Ilość krwi zależy od liczby eksperymentów, które mają być wykonane. Około 1 probówka (7 ml) na 3 pasy.
    3. Umieść rurki na rotatorze w oczekiwaniu na rozpuszczenie krwi.
      Uwaga: Test należy zakończyć w ciągu 3 godzin od upuszczania krwi.
    4. Wirować przez 15 minut przy 250 g w celu przygotowania osocza bogatopłytkowego (PRP). Nie używaj przerwy wirówki, aby zapobiec zakłóceniu luźno upakowanego granulatu.
      1. Gdy zebrano więcej niż jedną probówkę, zebrać krew w jednej stożkowej probówce wirówkowej.
        Uwaga: Wirowanie może odbywać się wolniej lub krócej, w zależności od preferowanej wydajności PRP i różnicowego "zanieczyszczenia" komórek.
    5. Usuń i wyrzuć PRP i kożuchową sierść, w wyniku której powstają upakowane czerwone krwinki z niewielką liczbą płytek krwi.
      Uwaga: Liczba płytek krwi w upakowanej frakcji krwinek czerwonych wynosi średnio 13 ±5 x 103 na μl (średnia ±SD, n = 12) w naszych rękach.
  2. Rekonstytucja krwi
    1. Rozmrażać osocze grupy krwi AB (Rh D ujemne) w temperaturze 37 °C przez 5 minut i 20 sekund na 4 ml.
    2. Oznaczyć hematokryt upakowanych krwinek czerwonych przygotowanych w 2.1.5 za pomocą automatycznego analizatora hematologicznego.
    3. Określić stężenie płytek krwi w przygotowanym przez bank krwi koncentracie płytek krwi, który zostanie użyty do odtworzenia powyższej frakcji krwinek czerwonych.
    4. Oblicz objętość upakowanych krwinek czerwonych i koncentratu płytek krwi, która da 40% hematokrytu i 250 x 10³ płytek krwi/μl w próbce o objętości 1 ml.
      Uwaga: Inne docelowe miana komórek można ustawić dowolnie, w zależności od protokołu badania.
    5. Przenieść wypełnione krwinki czerwone i osocze do świeżej probówki za pomocą zaciśniętej końcówki pipety i dodawać koncentrat płytek krwi aż do osiągnięcia objętości próbki 1 ml.
      Uwaga: W zależności od badanych zmiennych, frakcja osocza powinna być równa we wszystkich próbkach po odtworzeniu, ponieważ osocze ma znaczący wpływ na szybkość tworzenia się skrzeplin. Na przykład wielokrotne zamrażanie i rozmrażanie lub osocze pobrane od różnych dawców lub na różnych antykoagulantach może mieć wpływ na wynik.
    6. Delikatnie wymieszać rozpuszczoną krew przez odwrócenie i wykonać morfologię.
    7. Przygotować "ślepą" próbkę kontrolną, w której objętość frakcji płytek krwi jest zastąpiona tą samą objętością 0,9% (m/v) chlorku sodu w wodzie, w celu oznaczenia stężenia endogennych płytek krwi (tj. płytek krwi niepochodzących z banku krwi) w odtworzonej krwi przy użyciu morfologii krwi.
  3. Etykietowania
    1. Odmierzyć pipetą 1 ml odtworzonej krwi do probówki zawierającej 1 μl 5 mM kalceiny AM (5 μM stężenie końcowe).
      Uwaga: Można stosować inne barwniki komórkowe14.
    2. Delikatnie wymieszaj, odwracając światło.
    3. Przed użyciem inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C.

3. Test perfuzji

  1. Skoncentruj cel na włóknach kolagenowych przylegających do dolnej części pasów. Najlepiej użyć ustawień kontrastu fazowego lub różnicowego kontrastu interferencyjnego (DIC) dla tej strategii ustawiania ostrości. Wybierz opcję "Ustaw bieżące Z dla wybranych regionów kafelków" w oprogramowaniu eksperymentalnym, aby cyfrowo ustalić wybrane pozycje Z.
  2. Wybierz obszar zainteresowania (ROI) na pasie (xy) w oprogramowaniu eksperymentu mikroskopu, który będzie rejestrowany podczas eksperymentu.
    Uwaga: Zwrot z inwestycji może być dowolnym obszarem powierzchni dowolnie wybranym w obrębie pasa perfuzji. Zaleca się, aby nie analizować powstawania skrzepliny w pobliżu wlotu i wylotu pasa ruchu, aby uniknąć skutków ubocznych zmiennego profilu przepływu w tym obszarze, nawet jeśli jest on stosunkowo niewielki. Obszar ROI powinien zawierać znaczną liczbę płytek krwi lub skrzeplin, aby umożliwić wyrównanie sygnału. W tym protokole ROI jest cyfrowo zszytym agregatem trzech obrazów o jednakowej wielkości obok siebie, w wyniku czego na środku pasa o długości 2 cm znajduje się 0,62 mm2.
  3. Delikatnie wymieszaj próbki, odwracając je i umieszczając je obok biochipa na zautomatyzowanym stoliku.
  4. Umieść rurkę połączoną z wlotem biochipa w probówkach zawierających odtworzone próbki krwi.
  5. Uruchom pompę przy 50 dynach/cm2 (lub innych naprężeniach ścinających, zgodnie z życzeniem) dla tych kanałów, które są połączone z probówkami zawierającymi odtworzone próbki krwi za pomocą oprogramowania pompy.
    Uwaga: Można zastosować inne naprężenia ścinające.
  6. Rejestruj obrazy co 15 sekund przez 5 minut w czasie rzeczywistym za pomocą oprogramowania do akwizycji i eksperymentowania mikroskopu.
    Uwaga: W zależności od konfiguracji eksperymentalnej można użyć innych szeregów czasowych.
    Uwaga: Zazwyczaj używamy powiększenia 100X (obiektyw 10X i obiektywy 10X), ale większe (lub mniejsze) powiększenie można z łatwością zastosować jako alternatywę.

4. Wypłukać

  1. Umyj wszystkie rurki podłączone do wylotu i podłączone do wielokanałowego kolektora lub pompy za pomocą wody destylowanej, następnie podchlorynu sodu (wybielacz) 0,5% (v/v) i na koniec 0,1 M NaOH w wodzie. Wyrzuć rurki przypięte do wlotu biochipa jako odpad niebezpieczny.

5. Analiza danych

  1. Określ kinetykę wzrostu skrzepliny za pomocą oprogramowania do analizy obrazu. Następujące polecenia są specyficzne dla ZEN2012.
    1. Otwórz wtyczkę Analiza obrazu, aby określić pokrycie powierzchni płytek krwi.
    2. Ustaw próg fluorescencji w zakładce Analizuj interaktywnie, aby zdefiniować intensywność piksela, która koreluje z sygnałem dodatnim, czyli przylegającą płytką krwi lub przylegającymi płytkami
      3. krwi.
    3. Użyj narzędzia Utwórz tabele, aby automatycznie wygenerować arkusz kalkulacyjny, który będzie zawierał oddzielne obszary powierzchni (w μm2) tych "obiektów" zawierających piksele z sygnałem między wybranymi progami. Jest to wykonywane dla każdego punktu czasowego.
      Uwaga: Po wybraniu progów fluorescencji oprogramowanie analityczne automatycznie wykrywa "obiekty" w polu widzenia, które spełniają kryteria. Obiekty te są skrzeplinami, małymi agregatami płytek krwi lub pojedynczymi płytkami krwi i pokrywają pewną liczbę pikseli. Każdy obiekt jest wymieniony w arkuszu kalkulacyjnym osobno.
    4. Zapisz te arkusze kalkulacyjne w formacie xml i otwórz je w programie arkusza kalkulacyjnego w celu dalszych obliczeń.
    5. Zsumuj pola powierzchni wybranych obiektów przez zsumowanie i podziel wynik przez całkowitą powierzchnię pola pomiarowego (μm2). Spowoduje to uzyskanie względnego pokrycia powierzchni (%). Zrób to dla każdego punktu czasowego.
    6. Wykreślić te pokrycia powierzchni w funkcji czasu perfuzji i obliczyć nachylenie za pomocą regresji liniowej, uzyskując kinetykę wzrostu skrzepliny w tym konkretnym stanie.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zademonstrować zmienność wewnątrz testu, trzy identyczne próbki krwi pełnej zostały jednocześnie przebadane na powierzchniach pokrytych kolagenem (Rysunek 1). Dało to współczynnik zmienności na poziomie 8,7%. Statystyka ta sugeruje akceptowalną zmienność wewnątrztestową i wewnątrzlaboratoryjną, co pozwala na wiarygodne porównanie między powiązanymi próbkami.

Wlot komercyjnej komory przepływowej, którą tutaj ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eksperymenty w komorze przepływowej mikroprzepływowej są doskonałym narzędziem do badania funkcji płytek krwi w przepływającej krwi i są wykorzystywane do oceny hemostazy in vitro w różnych kontekstach eksperymentalnych. Pomimo słabej standaryzacji międzylaboratoryjnej9 wykazaliśmy, że w naszym laboratorium zmienność doświadczalna jest akceptowalna. Pozwala to na wiarygodne porównanie (sparowanych) próbek w ramach danego badania. Zostało to potwierdzone za pomocą dobrze udokumentowanego zjawiska zmian...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych podziękowań.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Rurka próżniowa BD z EDTA Becton, Dickinson and Company368856
Rurka próżniowa BD z heparynąBecton, Dickinson and Company368480
Rurka próżniowa BD z cytrynianem soduBecton, Dickinson and Company366575
Hirudin Probówka do krwiRoche6675751 001
Odkurzacz BD EclipseBecton, Dickinson i Spółka368650Igła do pobierania krwi z fabrycznie przymocowanym uchwytem
Końcówki do pipet 100-1 000Greiner bio-one740290
Końcówki do pipet 2-200Greiner bio-one739280
Końcówki do pipet 1-10EppendorfA08928
Tubka 5 mlSimport11691380
Rurka stożkowa 15 mlGreiner bio-one1888271
Tubka stożkowa 50 mlGreiner bio-one227261
10 ml StrzykawkaBD309604
Chusteczki precyzyjneKimtech5511
Vena8 Fluoro+ BiochipsCellix188V8CF-400-100-02P10Nazwany w Rysunek S1 A jako 'Biochip'Vena8
RurkaCellixTUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100FNazwany w Rysunek S1 B jako "Jednorazowe rurki"
Igły Vena8CellixSS-P-B1IC-B1OC-PACK200Nazwane w Rysunek S1 B jako 'Pin'Złącza
do jednowejściowych biochipówCellixCONNECTORS-B1IC-PACK100
Multiflow8 connectCellixMF8-CONNECT-BIC3-N-THROMBOSISNazwany w Rysunek S1 B jako "Rurki wielokrotnego użytku" i "Splitter"
Pudełko nawilżaneCellixHUMID-BOX
Oprogramowanie pompa mikroprzepływowaCellixN/AVenaflux Assay
HormCollagen Takeda/Nycomed1130630Natywny kolagen ścięgien koni (typ I)
Uzupełnia się izotoniczny roztwór glukozy do rozcieńczania kolagenu
Sól fizjologiczna buforowana HEPES (HBS)w przygotowaniu domowym10mM sól fizjologiczna buforowana kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES) (0,9% (w/v) NaCl, pH 7,4)
Bufor blokującyw domu przygotowaniew przygotowaniu domowym1,0% (w/v) albumina surowicy bydlęcej i 0,1% (w/v) glukoza w HBS
Calcein AMSondy molekularneC1430
Wybielacz 10%w domu przygotowaniew domu
przygotowanie 0,1 M NaOHw domu przygotowaniew domu
przygotowanie Alkohol denaturowanyFiersT0011.5
Mirus Evo NanopumpCellix188-MIRUS-PUMP-EVOz Multiflow8. Nazwany w Rysunek S1 A jako "Pompa" i "Kolektor"
MikroskopZeissAxio Observer Z1wyposażony w kamerę colibri-LED i CCD o wysokiej rozdzielczości
Mikroskop programowy ZeissN/AZEN 2012
SysmexN/A
Wirówka stołowaEppendorf521-0095
Inkubator płytekkrwi HelmerPF-48i
Kąpiel wodna do inkubacjiGFL1013
Marka pipetA03429
Wałek rurowyRatekBTR5-12V
Sterylne urządzenie dokująceTerumo BCTTSCD
Zgrzewarka do rurTerumo BCTAC-155
VortexVWR58816-121
Analizator hematologiczny

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Broos, K., Feys, H. B., De Meyer, S. F., Vanhoorelbeke, K., Deckmyn, H. Platelets at work in primary hemostasis. Blood Rev. 25, 155-167 (2011).
  2. Stalker, T. J., et al. Hierarchical organization in the hemostatic response and its relationship to the platelet-signaling network. Blood. 121, 1875-1885 (2013).
  3. Sakariassen, K. S., Bolhuis, P. A., Sixma, J. J. Human blood platelet adhesion to artery subendothelium is mediated by factor VIII-Von Willebrand factor bound to the subendothelium. Nature. 279, 636-638 (1979).
  4. Savage, B., Saldivar, E., Ruggeri, Z. M. Initiation of platelet adhesion by arrest onto fibrinogen or translocation on von Willebrand factor. Cell. 84, 289-297 (1996).
  5. Westein, E., de Witt, S., Lamers, M., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Monitoring in vitro thrombus formation with novel microfluidic devices. Platelets. 23, 501-509 (2012).
  6. Varga-Szabo, D., et al. The calcium sensor STIM1 is an essential mediator of arterial thrombosis and ischemic brain infarction. J Exp Med. 205, 1583-1591 (2008).
  7. Westein, E., et al. Atherosclerotic geometries exacerbate pathological thrombus formation poststenosis in a von Willebrand factor-dependent manner. Proc Natl Acad Sci USA. , (2013).
  8. Grabowski, E. F., Yam, K., Gerace, M. Evaluation of hemostasis in flowing blood. Am J Hematol. 87 (Suppl 1), S51-S55 (2012).
  9. Roest, M., et al. Flow chamber-based assays to measure thrombus formation in vitro: requirements for standardization. J Thromb Haemost. 9, 2322-2324 (2011).
  10. Heemskerk, J. W. M., et al. Collagen surfaces to measure thrombus formation under flow: possibilities for standardization. J Thromb Haemost. 9, 856-858 (2011).
  11. Shrivastava, M. The platelet storage lesion. Transfus Apher Sci. 41, 105-113 (2009).
  12. Miyaji, R., et al. Decreased platelet aggregation of platelet concentrate during storage recovers in the body after transfusion. Transfusion. 44, 891-899 (2004).
  13. Goodrich, R. P., et al. Correlation of in vitro platelet quality measurements with in vivo platelet viability in human subjects. Vox Sang. 90, 279-285 (2006).
  14. Van Aelst, B., et al. Riboflavin and amotosalen photochemical treatments of platelet concentrates reduce thrombus formation kinetics in vitro. Vox Sang. 108, 328-339 (2015).
  15. Van Aelst, B., Devloo, R., Vandekerckhove, P., Compernolle, V., Feys, H. B. Ultraviolet c light pathogen inactivation treatment of platelet concentrates preserves integrin activation but affects thrombus formation kinetics on collagen in vitro. Transfusion. , (2015).
  16. de Witt, S. M., et al. Identification of platelet function defects by multi-parameter assessment of thrombus formation. Nat Commun. 5, 4257(2014).
  17. Cazenave, J. P., et al. Preparation of washed platelet suspensions from human and rodent blood. Methods Mol Biol. 272, 13-28 (2004).
  18. Jackson, S. P., Nesbitt, W. S., Westein, E. Dynamics of platelet thrombus formation. J Thromb Haemost. 7 (Suppl 1), 17-20 (2009).
  19. Diedrich, B., Remberger, M., Shanwell, A., Svahn, B. M., Ringden, O. A prospective randomized trial of a prophylactic platelet transfusion trigger of 10 x 10(9) per L versus 30 x 10(9) per L in allogeneic hematopoietic progenitor cell transplant recipients. Transfusion. 45, 1064-1072 (2005).
  20. Neeves, K. B., et al. Sources of variability in platelet accumulation on type 1 fibrillar collagen in microfluidic flow assays. PloS one . 8, e54680(2013).
  21. Born, G. V. Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal. Nature. 194, 927-929 (1962).
  22. Cattaneo, M., et al. Recommendations for the Standardization of Light Transmission Aggregometry: A Consensus of the Working Party from the Platelet Physiology Subcommittee of SSC/ISTH. J Thromb Haemost. 11, 1183-1189 (2013).
  23. Deckmyn, H., Feys, H. B. Assays for quality control of platelets for transfusion. ISBT Sci Series. 8, 221-224 (2013).
  24. Andre, P., et al. Anticoagulants (thrombin inhibitors) and aspirin synergize with P2Y12 receptor antagonism in thrombosis. Circulation. 108, 2697-2703 (2003).
  25. Casari, C., et al. von Willebrand factor mutation promotes thrombocytopathy by inhibiting integrin alphaIIbbeta3. J Clin Invest. 123, 5071-5081 (2013).
  26. Gitz, E., et al. Improved platelet survival after cold storage by prevention of Glycoprotein Ibα clustering in lipid rafts. Haematologica. , (2012).
  27. Maurer-Spurej, E., Labrie, A., Brown, K. Routine Quality Testing of Blood Platelet Transfusions with Dynamic Light Scattering. Part Part Syst Char. 25, 99-104 (2008).
  28. Van Kruchten, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Measurement of whole blood thrombus formation using parallel-plate flow chambers - a practical guide. Platelets. 23, 229-242 (2012).
  29. Zwaginga, J. J., et al. Flow-based assays for global assessment of hemostasis. Part 2: current methods and considerations for the future. J Thromb Haemost. 4, 2716-2717 (2006).
  30. Zwaginga, J. J., et al. Flow-based assays for global assessment of hemostasis. Part 1: Biorheologic considerations. J Thromb Haemost. 4, 2486-2487 (2006).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microfluidic Flow ChambersPlatelet TransfusionHemostasis ModelingReconstituted BloodCollagen BindingThrombus Growth KineticsShear Rate AnalysisBlood Component PreparationPlatelet Concentrate QualityFlow Chamber Experiment

Related Articles