Artykuł metodologiczny

Wyznaczanie czułości spektralnej komórek fotoreceptorowych w modelu owadów na podstawie nagrań wewnątrzkomórkowych in vivo

DOI:

10.3791/53829

⸱

26 lutego 2016

 ,  , 
1Department of Ecology and Evolutionary Biology, University of California, Irvine, 2School of Life Sciences, University of Sussex

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elektrofizjologiczna technika zapisu wewnątrzkomórkowego jest demonstrowana i używana do określania wrażliwości spektralnej pojedynczych komórek fotoreceptorowych w złożonym oku motyla.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zapis wewnątrzkomórkowy to potężna technika używana do określenia, jak pojedyncza komórka może zareagować na dany bodziec. W badaniach nad wzrokiem zapis wewnątrzkomórkowy był historycznie powszechną techniką stosowaną do badania wrażliwości poszczególnych komórek fotoreceptorów na różne bodźce świetlne, która jest nadal stosowana. Jednak w literaturze nadal brakuje szczegółowej metodologii dla badaczy chcących powtórzyć eksperymenty z zapisem wewnątrzkomórkowym w oku. Tutaj przedstawiamy owada jako model do badania fizjologii oka w bardziej ogólnym ujęciu. Komórki fotoreceptorów owadów znajdują się blisko powierzchni oka i dlatego są łatwo dostępne, a wiele mechanizmów związanych z widzeniem jest zachowanych w całej gromadzie zwierząt. Opisujemy podstawową procedurę wewnątrzkomórkowego zapisu in vivo komórek fotoreceptorowych w oku motyla, mając na celu uczynienie tej techniki bardziej dostępną dla badaczy z niewielkim wcześniejszym doświadczeniem w elektrofizjologii. Przedstawiamy podstawowy potrzebny sprzęt, jak przygotować żywego motyla do nagrania, jak wprowadzić szklaną mikroelektrodę do pojedynczej komórki, a na końcu samą procedurę nagrywania. Wyjaśniamy również podstawową analizę surowych danych odpowiedzi w celu określenia czułości spektralnej poszczególnych typów komórek. Chociaż nasz protokół koncentruje się na określaniu czułości spektralnej, inne bodźce (np. światło spolaryzowane) i odmiany metody mają zastosowanie do tej konfiguracji.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Właściwości elektryczne komórek, takich jak neurony, są obserwowane poprzez pomiar przepływu jonów przez błony komórkowe jako zmiany napięcia lub prądu. Opracowano szereg technik elektrofizjologicznych do pomiaru zdarzeń bioelektrycznych w komórkach. Neurony znajdujące się w oczach zwierząt są dostępne, a ich obwody są często mniej złożone niż w mózgu, co czyni te komórki dobrymi kandydatami do badań elektrofizjologicznych. Typowe zastosowania elektrofizjologii oka obejmują elektroretinografię (ERG)1,2 i wewnątrzkomórkowy zapis mikroelektrod. ERG polega na umieszczeniu elektrody w oku zwierzęcia lub na jego oku, zastosowaniu bodźca świetlnego i zmierzeniu zmiany napięcia jako sumy odpowiedzi wszystkich pobliskich komórek3-6. Jeśli ktoś jest szczególnie zainteresowany scharakteryzowaniem wrażliwości spektralnej poszczególnych komórek fotoreceptorowych, często wiele typów komórek jednocześnie reaguje z różną siłą na dany bodziec; w związku z tym określenie wrażliwości określonych typów komórek na podstawie danych ERG może być trudne, zwłaszcza jeśli w oku znajduje się kilka różnych rodzajów spektralnie podobnych komórek fotoreceptorowych. Jednym z potencjalnych rozwiązań jest stworzenie transgenicznej Drosophila z genem fotoreceptora (opsyny) ulegającym ekspresji w większości komórek R1-6 w oku, a następnie wykonanie ERG7. Potencjalne wady tej metody obejmują brak lub niską ekspresję białka fotoreceptora8 oraz długie ramy czasowe dla generacji i badań przesiewowych zwierząt transgenicznych. W przypadku oczu z mniejszą liczbą rodzajów spektralnie odrębnych fotoreceptorów, adaptacja oka za pomocą kolorowych filtrów może pomóc w obniżeniu udziału niektórych typów komórek w ERG, umożliwiając w ten sposób oszacowanie maksimów czułości spektralnej9.

Zapis wewnątrzkomórkowy to kolejna technika, w której cienka elektroda napala komórkę na pal i stosuje się bodziec. Elektroda rejestruje tylko odpowiedź pojedynczego ogniwa, dzięki czemu nagrywanie i analizowanie wielu pojedynczych komórek może dać określone czułości fizjologicznie różnych typów komórek10-14. Chociaż nasz protokół koncentruje się na analizie czułości spektralnej, podstawowe zasady zapisu wewnątrzkomórkowego za pomocą ostrych elektrod można modyfikować do innych zastosowań. Korzystając na przykład z innego przygotowania próbki i używając ostrych elektrod kwarcowych, można nagrywać z głębszej części płata wzrokowego lub innych obszarów mózgu, w zależności od zadawanego pytania. Na przykład czasy odpowiedzi poszczególnych komórek fotoreceptorów15, aktywność komórek w płatach wzrokowych16 (blaszka, rdzeń lub lobula17), mózgu18 lub innych zwojach19 mogą być również rejestrowane za pomocą podobnych technik, lub bodźce barwne można zastąpić polaryzacją20-22 lub bodźcami ruchowymi23,24.

Fototransdukcja, proces, w którym energia świetlna jest absorbowana i przekształcana w sygnał elektrochemiczny, jest starożytną cechą wspólną dla prawie wszystkich współczesnych typów zwierząt25. Barwnikiem wzrokowym znajdującym się w komórkach fotoreceptorów i odpowiedzialnym za inicjację fototransdukcji wzrokowej jest rodopsyna. Rodopsyny u wszystkich zwierząt składają się z białka opsyny, członka rodziny 7 transbłonowych receptorów sprzężonych z białkiem G, i związanego z nim chromoforu, który pochodzi z siatkówki lub podobnej cząsteczki26,27. Sekwencja aminokwasów opsyny i struktura chromoforu wpływają na absorbancję rodopsyny do różnych długości fal światła. Kiedy foton jest absorbowany przez chromofor, rodopsyna zostaje aktywowana, inicjując kaskadę białka G w komórce, która ostatecznie prowadzi do otwarcia kanałów jonowych związanych z błoną28. W przeciwieństwie do większości neuronów, komórki fotoreceptorów ulegają stopniowanym zmianom potencjału, które można zmierzyć jako względną zmianę amplitudy odpowiedzi ze zmieniającym się bodźcem świetlnym. Zazwyczaj dany typ fotoreceptora wykazuje ekspresję tylko jednego genu opsyny (choć istnieją wyjątki8,10,29-31). Wyrafinowane widzenie kolorów, podobne do tych, które można znaleźć u wielu kręgowców i stawonogów, uzyskuje się za pomocą złożonego oka składającego się z setek lub tysięcy komórek fotoreceptorów, z których każda wyraża jeden lub czasami więcej typów rodopsyny. Informacje wizualne są przechwytywane poprzez porównywanie odpowiedzi na mozaikę fotoreceptorów za pośrednictwem złożonej sygnalizacji neuronalnej w oku i mózgu, co skutkuje percepcją obrazu wraz z kolorem i ruchem.

Po zmierzeniu surowych reakcji komórki fotoreceptora na różne długości fal światła za pomocą zapisu wewnątrzkomórkowego, możliwe jest obliczenie jej czułości spektralnej. Obliczenia te opierają się na zasadzie jednowariancji, która mówi, że odpowiedź komórki fotoreceptorowej zależy od liczby absorbowanych przez nią fotonów, ale nie od szczególnych właściwości absorbowanych przez nią fotonów32. Każdy foton, który zostanie wchłonięty przez rodopsynę, wywoła ten sam rodzaj odpowiedzi. W praktyce oznacza to, że surowa amplituda odpowiedzi komórki wzrośnie albo z powodu wzrostu natężenia światła (więcej fotonów do pochłonięcia), albo z powodu przesunięcia długości fali w kierunku szczytowej czułości (większe prawdopodobieństwo, że rodopsyna zaabsorbuje tę długość fali). Wykorzystujemy tę zasadę, odnosząc odpowiedzi komórkowe o znanej intensywności i tej samej długości fali do odpowiedzi o różnych długościach fal i tej samej intensywności, ale nieznanej względnej czułości. Typy komórek są często identyfikowane na podstawie długości fali, przy której osiąga się ich czułość.

Tutaj pokazujemy jedną metodę wewnątrzkomórkowego zapisu i analizy wrażliwości spektralnej fotoreceptorów w oku motyla, koncentrując się na uczynieniu tej metody bardziej dostępną dla szerszej społeczności badawczej. Chociaż zapis wewnątrzkomórkowy pozostaje powszechny w literaturze, szczególnie w odniesieniu do widzenia kolorów u owadów, stwierdziliśmy, że opisy materiałów i metod są zwykle zbyt krótkie, aby umożliwić odtworzenie tej techniki. Przedstawiamy tę metodę w formacie wideo, aby umożliwić jej łatwiejszą replikację. Opisujemy również technikę przy użyciu łatwo dostępnego i niedrogiego sprzętu. Zajmujemy się typowymi zastrzeżeniami, które często nie są zgłaszane, a które spowalniają badania podczas optymalizacji nowej i złożonej techniki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie zwierzęta były traktowane tak humanitarnie, jak to tylko możliwe. Owady zostały wysłane jako poczwarki z Costa Rica Entomological Supply w Kostaryce.

1. Pielęgnacja poczwarek Heliconius

  1. Zawieś wszystkie poczwarki w odległości 2-3 cm od siebie w wilgotnej komorze za pomocą szpilek do owadów.
  2. Po ekwiwalizacji pozwól skrzydłom wyschnąć, a następnie utrzymuj motyle przy życiu przez co najmniej 1 dzień w wilgotnej komorze i codziennie podawaj rozcieńczony roztwór miodu przed nagraniem.
    1. Rozcieńczyć miód wodą do około 20% objętościowo roztworu miodu i wlać do płytkiej szalki Petriego.
    2. Przynieś pojedyncze motyle na szalkę Petriego, jeden po drugim. Po dotknięciu roztworu przednim stępem, motyle automatycznie wyprostują swoje trąbki i będą pić z szalki Petriego. Jeśli ich trąbka nie wysuwa się automatycznie, użyj kleszczy, aby wyciągnąć trąbkę i wprowadzić ją do roztworu miodu.

2. Tor optyczny, kalibracja i pomiar eksperymentalnych warunków oświetleniowych

  1. Umieść ksenonową lampę łukową o mocy 150 W z obudową i uniwersalnym zasilaczem oraz dołączonym zespołem soczewki skraplacza na jednym końcu stołu o długości co najmniej jednego metra, aby zapewnić jasne, białe światło.
    UWAGA: Ksenonowe lampy łukowe wytwarzają niezwykle jasne światło o dużym natężeniu promieniowania UV. Okulary ochronne powinny być noszone przez cały czas, a lampa powinna być używana zgodnie z zaleceniami producenta, aby zapobiec gromadzeniu się ozonu spowodowanemu oddziaływaniem światła UV z tlenem atmosferycznym.
  2. Ustawić tor optyczny o długości jednego metra, aby światło wychodzące z zespołu obudowy mogło przejść (ilustracja 1).
    1. Umieścić w następującej kolejności na torze optycznym z zachowaniem przybliżonych odległości od siebie: 1) wypukła soczewka krzemionkowa lub kwarcowa w odległości 40 cm od zespołu kondensatora, 2) koło filtrów o neutralnej gęstości (bez filtrów znajdujących się obecnie na drodze światła) 22 cm dalej wzdłuż toru, 3) przesłona z jednostką napędową w odległości 14 cm od filtrów ND, 4) wklęsła soczewka krzemionkowa lub kwarcowa przylegająca bezpośrednio po przesłonie oraz 5) sonda wiązki kolimacyjnej 6 cm dalej wzdłuż drugiego końca toru.
    2. Przymocuj światłowodowy o średnicy 600 μm do sondy wiązki kolimacyjnej.
      Uwaga: W zależności od natężenia światła, światłowodowy o średnicy 5-10 mm może być wymagany, aby dostarczyć wystarczającą ilość światła do innych preparatów i może być do tego zastąpiony.
    3. Dostosuj odległość, wysokość i kąt każdego elementu optycznego tak, aby wiązka światła wychodząca z zespołu miała jak największe natężenie.
    4. Ponieważ optyczne elementy toru mogą się nieznacznie różnić w różnych zastosowaniach, należy upewnić się, że wszystkie elementy przepuszczają światło w zakresie UVA i widzialnym (315-700 nm).
  3. Po zmontowaniu toru optycznego zmierz światło przechodzące przez zestaw za pomocą spektrometru. Najpierw skalibruj spektrometr za pomocą lampy kalibracyjnej o znanym widmie i oprogramowania producenta.
    Uwaga: Opisujemy poniższą konfigurację przy użyciu produktów Ocean Optics dla przejrzystości, ale inni producenci (np. Avantes) sprzedają porównywalne produkty.
    1. Włącz lampę kalibracyjną wolframu co najmniej 45 minut przed wykonaniem pomiarów.
    2. Aby skalibrować, podłącz spektrometr przez USB do komputera z zainstalowanym powiązanym oprogramowaniem. Następnie podłącz spektrometr do wolframowej lampy kalibracyjnej za pomocą transmisyjnego korektora cosinusowego w promieniowaniu UV.
    3. Wybierz "Nowy bezwzględny pomiar natężenia promieniowania" z zakładki "Plik" i wybierz spektrometr jako "Źródło".
    4. Postępuj zgodnie z instrukcjami, aby utworzyć nowy plik kalibracji "cal". Po wyświetleniu monitu załaduj dostarczony plik danych dla znanego widma wolframowej lampy kalibracyjnej w zakresie światła widzialnego (300-800 nm) do oprogramowania, które automatycznie oblicza skorygowane widmo na podstawie wyjścia spektrometru.
    5. Zapisz plik kalibracji. Załaduj ten plik podczas inicjalizacji oprogramowania dla wszystkich przyszłych pomiarów widm światła za pomocą spektrometru.
  4. Po skalibrowaniu spektrometru użyj go do zarejestrowania widm światła z konfiguracji eksperymentalnej. Następnie, po otwarciu oprogramowania, wybierz "Nowy bezwzględny pomiar natężenia promieniowania" i załaduj wcześniej zapisany plik kalibracyjny. Następnie weź ciemne widmo, blokując całe światło do spektrometru.
    1. Gdy spektrometr aktualnie mierzy pożądane eksperymentalne warunki oświetleniowe, dostosuj czas integracji (4 ms), skany do średniej (5) i szerokość wagonu (5), aby widmo było odpowiednio wyskalowane i wygładzone. Zachowaj te same ustawienia dla wszystkich pomiarów spektralnych, aby można było porównać natężenie światła z różnych pomiarów.
  5. Zmierz widma dla nietłumionego światła białego, dla wszystkich filtrów o neutralnej gęstości, które mają być używane podczas eksperymentów, oraz dla każdego filtra interferencyjnego pasmowoprzepustowego (rysunek 2).
    1. Zmierz widmo światła białego bez żadnych filtrów na ścieżce światła, przymocowując wolny koniec światłowodowego z kroku 2.2.2 do spektrometru. Po załadowaniu pliku kalibracyjnego z kroku 2.3 zapisz widmo światła białego za pomocą oprogramowania spektrometru jako plik tekstowy.
      Uwaga: Widma zapisane jako pliki tekstowe zawierają długość fali (współrzędne x) w jednej kolumnie i natężenie światła (współrzędne y) w drugiej kolumnie, dzięki czemu dane można załadować do arkusza kalkulacyjnego dla kroku 2.6.
    2. Korzystając z tej samej konfiguracji, co w kroku 2.5.1, zarejestruj widmo z każdej gęstości optycznej (OD) (0-3,5 OD) używanej podczas eksperymentów, obracając koło filtra o neutralnej gęstości (ND) na ścieżce optycznej i zapisz plik tekstowy dla każdej OD.
    3. Korzystając z tej samej konfiguracji, co w kroku 2.5.1, umieść kolejno filtry interferencyjne o połowie szerokości pasma 10 nm na ścieżce światła i zapisz widmo obserwowane dla każdego filtra. Powtórz tę procedurę dla każdego z 41 różnych filtrów interferencyjnych o transmitancji szczytowej rozmieszczonych co 10 nm od 300 do 700 nm. Filtry oddalone od siebie o więcej (20 nm) są dopuszczalne dla większości zastosowań (widma patrz rysunek 2).
  6. Koryguje różnice w natężeniu światła, gdy filtry interferencyjne są umieszczone na ścieżce światła. Każdy filtr interferencyjny przepuszcza inną całkowitą liczbę fotonów, a niska transmisja niektórych filtrów utrudnia dalsze tłumienie intensywności, tak aby wszystkie filtry dopuszczały równą liczbę fotonów.
    1. Aby obliczyć względne natężenie (I) dla każdego filtra interferencyjnego o szerokości pasma 10 nm, oblicz wartość I w wyrażeniu I = T/s, gdzie T jest obszarem pod krzywą widmową każdego filtra interferencyjnego 10 nm (od 2.5.3), a s jest maksymalnym bezwzględnym natężeniem promieniowania (wartość y zapisanego pliku tekstowego z 2.5.1) światła białego przy szczytowej długości fali każdego filtra (patrz rysunek 2 dla przykładu przy 520 nm).
    2. Podzielić wszystkie obliczone natężenia przez maksymalną wartość natężenia obliczoną w ppkt 2.6.1, aby znormalizować do jednego, i przyjąć odwrotność względnych wartości znormalizowanych do użycia jako współczynnik korekcyjny zastosowany do czułości surowej dla każdej długości fali (patrz krok 6.4).
  7. Kroki od 2.1 do 2.6 należy wykonać tylko raz przed serią eksperymentów. W trakcie eksperymentu należy okresowo rejestrować bezwzględne natężenie promieniowania lampy ksenonowej łukowej w jasnym świetle i filtrach o neutralnej gęstości, aby upewnić się, że intensywność bodźca świetlnego nie ulega zmianie.
  8. W trakcie eksperymentu, jeśli jakakolwiek odpowiedź komórkowa na światło przepuszczane przez filtry interferencyjne zbliża się do maksymalnej amplitudy odpowiedzi, użyj filtrów ND do tłumienia sygnału. Jeżeli filtry ND są używane podczas eksperymentu, należy uwzględnić odpowiedni spadek intensywności podczas obliczania czułości spektralnej.
  9. Skonfiguruj ścieżkę optyczną, kalibrację i filtry na kilka dni lub tygodni przed rozpoczęciem eksperymentów. Filtry należy przykryć, aby zapobiec gromadzeniu się kurzu.

3. Konfiguracja sprzętu nagrywającego

  1. Przeprowadź ten sam światłowodowy, który jest używany do kalibracji, przez klatkę Faradaya i zamontuj na urządzeniu goniometrycznym, takim jak obwód ramienia Cardana (patrz rysunek 3, aby zapoznać się ze schematem). będzie znajdował się w odległości około 10 cm od oka okazu.
  2. Umieść metalowy stolik na izolowanym wibracyjnie stole z uchwytem elektrody zamontowanym bezpośrednio nad stolikiem pod kontrolą mikromanipulatora (ilustracja 4). Umieść ramię kardana tak, aby głowa próbki znajdowała się w środku kuli utworzonej przez ruch obrotowy ramienia.
  3. Korzystając z wewnątrzkomórkowego systemu przedwzmacniacza, który obejmuje wzmacniacz (na zewnątrz klatki Faradaya) i przedwzmacniacz (stopień główny, w pobliżu preparacji wewnątrz klatki Faradaya) zamontuj stopień główny nad metalowym stopniem, na którym zostanie umieszczony próbka.
    1. Podłącz koncentryczny do stacji czołowej za pomocą złącza BNC. Rozłup tylko końcówkę na drugim końcu koncentrycznego i oddziel zewnętrzną metalową osłonę od przewodu wewnętrznego.
    2. zewnętrzną osłonę (utrzymywaną na potencjale uziemienia) do jednego końca izolowanego drutu miedzianego z zaciskiem krokodylkowym na drugim końcu. Ten zacisk krokodylkowy zostanie przymocowany do metalowej elektrody referencyjnej na platformie próbki (krok 5.1.4).
    3. wewnętrzny przewód koncentrycznego do cienkiego srebrnego drutu, który będzie służył jako elektroda nagrywająca. Drut ten powinien być wystarczająco cienki, aby można go było wprowadzić do szklanej elektrody wypełnionej roztworem w kroku 5.2.3.
  4. Umieść mikroskop stereoskopowy przymocowany do wahadłowego ramienia i podstawy na drewnianej ławce na zewnątrz klatki Faradaya, tak aby można go było obrócić w celu opuszczenia elektrody do oka i ponownie wysunąć, gdy elektroda znajdzie się w oku.
  5. Upewnij się, że cały metal wewnątrz klatki Faradaya jest odpowiednio uziemiony.
  6. Na zewnątrz klatki Faradaya podłącz preamplifer do wejścia reduktora szumów 50-60 Hz (opcjonalnie) i podłącz wyjście do jednego kanału oscyloskopu za pomocą adaptera BNC T.
  7. Używając drugiego końca adaptera T, podłącz sygnał przechodzący przez oscyloskop do jednego kanału sprzętu. Podłącz ten sprzęt do komputera za pomocą USB, co pozwoli na odczytanie odpowiedzi nagranych za pomocą przedwzmacniacza przez oprogramowanie w komputerze.
  8. Podłącz sterownik migawki z toru optycznego do drugiego kanału oscyloskopu za pomocą innego adaptera T i podłącz go do generatora impulsów, który będzie kontrolował częstotliwość i czas trwania błysków światła dostarczanych do oka (krok 5.5).
    Uwaga: Konfiguracja samego zestawu powinna być wykonana tylko raz. Przerwij się tutaj, aż będziesz gotowy do rozpoczęcia nagrywania.

4. Przygotowanie w dniu nagrania

  1. Włącz lampę ksenonową co najmniej 45 minut przed eksperymentem i włącz szklany ściągacz mikroelektrod co najmniej 30 minut przed wyciągnięciem szklanych elektrod.
  2. Włącz wszystkie urządzenia nagrywające (migawkę, wzmacniacz, eliminator szumów, generator impulsów, oscyloskop i sprzęt do akwizycji danych) i upewnij się, że migawka jest domyślnie zamknięta, aby żadne światło nie przechodziło przez światłowodowy.
  3. Wyciągnij drobne mikroelektrody ze szkła borokrzemianowego (lub glinokrzemianowego) (idealna jest rezystancja 100-250 MΩ) za pomocą ściągacza do mikroelektrod szklanych. Użyj szklanych elektrod w ciągu zaledwie kilku godzin od wyciągnięcia.
  4. Napełnij elektrody 3 M chlorkiem potasu (KCl). Należy pamiętać, że roztwór ten może być modyfikowany w zależności od potrzeb badacza, np. iniekcja barwnika.

5. Procedura przygotowania i rejestracji próbek

  1. Przygotuj próbkę
    1. Umieść pojedynczego motyla w małej plastikowej rurce z gorącym woskiem, tak aby głowa była nieruchoma i wystawała z jednego końca rurki. Nawoskuj trąbkę, czułki i skrzydła (ryc. 5).
    2. Przytrzymaj brzuch suchym kawałkiem wosku i utrzymuj rurkę nawilżoną, umieszczając mokrą chusteczkę wewnątrz rurki za brzuchem. Upewnij się, że próbka jest całkowicie nieruchoma.
    3. Zamontuj rurkę za pomocą małego kawałka wosku na małej platformie z przegubem kulowym, który jest przymocowany do podstawy magnetycznej.
    4. Pod mikroskopem preparacyjnym włóż srebrny drut o średnicy 0,125 mm do głowicy przez aparaty gębowe, które mają być używane jako elektroda odniesienia. Przed eksperymentem przymocuj drut na stałe do platformy w taki sposób, aby drut miedziany w kroku 3.3.2 mógł się do niego przypiąć po umieszczeniu platformy na stoliku w celu nagrywania.
    5. Gdy elektroda referencyjna znajdzie się w odpowiedniej pozycji, można ją utrzymać na miejscu poprzez szybkie stopienie, a następnie schłodzenie wosku wokół drutu.
    6. Używając łamliwej żyletki ze stali węglowej, chwyć część ostrza za pomocą uchwytu ostrza i oderwij mały kawałek, aby użyć go do przecięcia rogówki.
    7. Wytnij mały otwór (o średnicy ~10 ommatidia) w lewej rogówce za pomocą żyletki i uszczelnij otwór wazeliną, aby zapobiec wysuszeniu.
  2. Po przecięciu rogówki należy jak najszybciej włożyć elektrodę rejestrującą do oka, ponieważ hemolimfa w oku szybko stwardnieje i uniemożliwi wprowadzenie elektrody. Jeśli to możliwe, wykonaj sekcję na stanowisku, na którym będzie miało miejsce nagranie.
    Uwaga: Wazeliny nie należy rozmazywać na pozostałej części oka, ponieważ spowoduje to rozmycie optyki.
    1. Jeśli nie znajduje się jeszcze na scenie, umieść zamontowaną próbkę i platformę na scenie w zestawie nagraniowym. Podłącz przewód uziemiający stopnia czołowego z kroku 3.3.2 do elektrody odniesienia na platformie próbki za pomocą zacisków krokodylkowych.
      Uwaga: Jeśli to możliwe, użyj czerwonego filtra, aby oświetlić zwierzę.
    2. Użyj źródła światła z nasadkami na gęsiej szyi, aby na krótko oświetlić próbkę pod stereoskopem, jednocześnie opuszczając elektrodę rejestrującą do oka.
    3. Włóż srebrny drut podłączony do headstage z kroku 3.3.3 do roztworu KCl z tyłu szklanej mikroelektrody. Zamontuj szklaną elektrodę na uchwycie elektrody.
    4. Wyreguluj uchwyt elektrody tak, aby mikroelektroda znajdowała się bezpośrednio nad otworem wcześniej wyciętym w rogówce, około milimetra nad rogówką. Opuść mikroelektrodę do oka za pomocą mikromanipulatora, aż obwód zostanie zamknięty, jak pokazuje duża zmiana potencjału (mV) na oscyloskopie.
  3. Gdy znajdzie się w oku, wysuń stereoskop na zewnątrz klatki Faradaya i wyłącz źródło światła oświetlające próbkę. Pomieszczenie powinno być ciemne, aby oko stało się ciemne.
  4. Sprawdź rezystancję elektrody, przykładając prąd 1 nA ze wzmacniacza i odnotowując zmianę napięcia. Rezystancja powinna zwykle mieścić się w zakresie 100-250 MΩ. Wyższe rezystancje wskazują na zablokowanie lub zginanie elektrody, a niskie opory na pęknięcie elektrody.
  5. Aktywuj generator impulsów tak, aby migawka otworzyła się, umożliwiając błysk światła o czasie trwania 50 ms co 0,5 sekundy i pozwól mu nadal migać przez czas trwania eksperymentu.
    1. Dostosuj generator impulsów tak, aby umożliwiał błyski o czasie trwania do 50 ms. Ten czas trwania i 0,5-sekundowa przerwa między błyskami sprawiają, że próbka jest jak najbardziej przystosowana do ciemności podczas eksperymentu. Pięćdziesiąt ms jest bliskie najkrótszemu czasowi trwania błysku, który wywoła taką samą amplitudę w odpowiedzi, jak dłuższy czas trwania błysku.
    2. Ponownie zmierz odpowiedzi zarówno na początku, jak i na końcu eksperymentu (krok 5.16). W trakcie około dwudziestominutowego eksperymentu te ustawienia lampy błyskowej nie pogarszają reakcji w czasie. Różne przygotowania mogą wymagać dostosowania tych ustawień lampy błyskowej.
  6. Ustaw ramię Cardana tak, aby światłowodowy był skierowany w stronę oka.
  7. Sprawdź oscyloskop pod kątem zmiany napięcia przy każdym mignięciu światła. Ujemna zmiana napięcia oznacza, że elektroda nie weszła jeszcze do ogniwa.
  8. Przesuwaj ramię kardana wokół próbki, aż zostanie ustawione pod kątem do oka, przy którym występuje maksymalne napięcie reakcji.
  9. Obracaj mikromanipulatorem do przodu i do tyłu, powodując bardzo małe ruchy pionowe elektrody w obu kierunkach, jednocześnie lekko stukając w podstawę uchwytu elektrody lub korzystając z funkcji Buzz na przedwzmacniaczu. Kontynuuj dokonywanie niewielkich regulacji, aż na oscyloskopie pojawi się reakcja na światło depolaryzujące (ilustracja 6).
  10. Ponownie wyreguluj ramię kardana, aby znaleźć kąt padania, w którym błysk światła wytwarza największy sygnał depolaryzujący. Dokonaj niewielkich regulacji za pomocą mikromanipulatora i użyj funkcji Buzz na amplifier w razie potrzeby, aby upewnić się, że elektroda stabilnie rejestruje ogniwo i że pozostanie w ogniwie przez cały eksperyment (patrz krok 5.11).
  11. Gdy konfiguracja jest stabilna, rozpocznij nagrywanie. Stabilne nagranie powinno charakteryzować się niewielkimi lub żadnymi zmianami w potencjale spoczynkowym, niskim poziomem szumów tła i niezmiennie dużą charakterystyką depolaryzacyjną (stosunek sygnału do szumu wynoszący co najmniej 10:1).
    1. Uruchom oprogramowanie na komputerze i rozpocznij "nowy eksperyment", który otworzy wyskakujące okienko z czterema kanałami.
    2. Dostosuj skalę napięcia w prawym górnym rogu okna oprogramowania na 500 mV. Pierwszy kanał będzie wyświetlał odpowiedzi zarejestrowane z elektrody w czasie rzeczywistym, podczas gdy drugi kanał będzie rejestrował falę prostokątną wytwarzaną przez generator funkcyjny, jeśli sygnał jest podawany do sprzętu do akwizycji danych za pośrednictwem oscyloskopu, pokazując, kiedy migawka jest otwarta. Pozostałe dwa kanały są niepotrzebne.
    3. Kliknij "Start" w prawym dolnym rogu, aby rozpocząć nagrywanie i zezwól oprogramowaniu na działanie na czas trwania eksperymentu. Dostosuj powiększenie osi x (czas) i y (napięcie), aby odpowiedzi były wyraźne.
  12. Najpierw, przy białym świetle, nagraj do 10 indywidualnych odpowiedzi za pomocą koła filtra ND przy 3,5 OD (około 5-10 sekund).
  13. Następnie zapisz tę samą liczbę odpowiedzi przy 3,3 OD, a następnie 3,1, 3,0, 2,5, 2,3, 2,1 itd. w każdej kombinacji, aż do 0,0 OD. Te amplitudy odpowiedzi dla serii filtrów ND zapewnią krzywą intensywności logarytmu odpowiedzi w sekcji 6. Jeśli dojdzie do wybielania, używaj mniej błysków jasnych bodźców w trakcie eksperymentu.
  14. Rejestruj odpowiedź komórki na wszystkie długości fal za pomocą filtrów interferencyjnych.
    1. Najpierw znajdź szczytową długość fali. Bez filtrów ND na ścieżce światła (0,0 OD) umieść filtr przepuszczający promieniowanie UV na ścieżce światła i krótko obserwuj amplitudę odpowiedzi. Powtórz z niebieskim filtrem nadawczym, zielonym filtrem nadawczym i czerwonym filtrem nadawczym, co powinno dać pewne wyobrażenie o tym, gdzie będzie szczytowa odpowiedź.
    2. Użyj filtrów przy około 350, 450, 550, 650 nm, aby znaleźć ogólny obszar szczytowej czułości w kroku 5.14.1. Dokładna długość fali nie ma znaczenia w tej początkowej fazie wyszukiwania, ponieważ wszystkie długości fal zostaną zarejestrowane w następnym kroku. Jeśli istnieją szacunkowe czułości szczytowe lub zostały one wcześniej zarejestrowane, użyj znanych długości fal, aby szybko zidentyfikować odpowiedź szczytową.
    3. Po zidentyfikowaniu odpowiedzi szczytowej lub w jej pobliżu nagrywaj na tej długości fali przez 10 odpowiedzi (około 5 sekund).
    4. Po nagraniu na długości fali odpowiedzi szczytowej, nagrywaj z innymi filtrami interferencyjnymi, od 300-700 nm w krokach co 10 nm. Zacznij od piku i idź w kierunku krótszych i dłuższych fal, zamieniając filtry ze ścieżki światła jeden po drugim (np. jeśli szczytowa odpowiedź przypada na 520 nm, najpierw zarejestruj odpowiedzi na tej długości fali, następnie 510 nm, a następnie 530 nm, 500 nm, 540 nm, 490 nm, 550 nm i tak dalej, aż nie ma odpowiedzi).
    5. Zezwalaj na maksymalnie 10 odpowiedzi na filtr (5 sekund każda). Podczas wymiany filtrów interferencyjnych pozwól komórce zareagować na 1-2 błyski białego światła bez żadnego filtra na ścieżce światła, co jest pomocne w monitorowaniu, czy szczytowa odpowiedź pogarsza się z czasem. Zmniejsz liczbę odpowiedzi lub zwiększ OD, jeśli wystąpi wybielanie.
  15. Jeśli odpowiedź pod którymkolwiek filtrem interferencyjnym jest zbyt bliska maksymalnej odpowiedzi w świetle białym przy 0 OD, należy ją osłabić za pomocą filtrów ND. Filtry interferencyjne i rozmiar światłowodowego użytego w tym eksperymencie znacznie tłumią intensywność światła, więc filtry ND zazwyczaj nie są potrzebne.
  16. Jeśli zapis pozostaje stabilny, ponownie zapisz długości fal wokół odpowiedzi szczytowej, która służy jako pseudoreplikat do potwierdzania poprzednich amplitud odpowiedzi i pomaga zapewnić, że odpowiedź nie uległa pogorszeniu w czasie. Po zarejestrowaniu wszystkich długości fal ponownie nagraj odpowiedzi w serii ND, jak w kroku 5.12.
  17. Po zakończeniu nagrywania kliknij "Zatrzymaj" w oprogramowaniu i zapisz nagranie do analizy.
  18. Po eksperymencie złóż ofiarę przez zamrożenie lub schłodzenie przez kilka minut, a następnie szybko odetnij głowę i zmiażdż klatkę piersiową.
  19. Wyłącz wszystkie urządzenia. W razie potrzeby przerwij się w tym miejscu przed wykonaniem analizy.

6. Analiza wrażliwości spektralnej

  1. Za pomocą oprogramowania używanego do rejestrowania surowych odpowiedzi należy obliczyć średnią amplitudę odpowiedzi 10 indywidualnych odpowiedzi dla każdego filtra z serii ND i dla każdego filtra interferencyjnego.
  2. Utwórz funkcję intensywności logarytmu odpowiedzi (VlogI) na podstawie serii filtrów ND zarejestrowanych w krokach 5.12-5.13 (Rysunek 7). W tym celu należy wykreślić logarytmiczne jednostki intensywności (OD) na osi X i odpowiedzieć na każdą intensywność na osi y.
    1. Aby wyprowadzić czułość spektralną komórki na różnych długościach fal, zazwyczaj dopasuj równanie Naka-Rushtona do danych z kroku 6.2 i użyj tego równania do odniesienia eksperymentalnie uzyskanych odpowiedzi spektralnych o różnych długościach fal do względnych fotonów wymaganych do wywołania tej odpowiedzi przy stałej długości fali (w tym przypadku światło białe).
      Uwaga: Równanie Naki-Rushtona to: V/Vmax = In/(In + Kn), gdzie I to intensywność bodźca, V to amplituda odpowiedzi, Vmax to maksymalna amplituda odpowiedzi, K to intensywność bodźca dająca 1/2 Vmax, a n to nachylenie wykładnicze. Aby dopasować to równanie do danych VlogI, można użyć różnych metod, w tym oprogramowania do dopasowywania krzywych lub pakietów statystycznych opartych na kodzie.
    2. Aby dopasować równanie Naka-Rushtona za pomocą prostych obliczeń i programu arkusza kalkulacyjnego, przekształć dane odpowiedzi VlogI dla każdej intensywności bodźca: log[(Vmax/V) - 1]. Następnie wykonaj regresję liniową na przekształconych danych, aby uzyskać równanie linii najlepszego dopasowania.
      Uwaga: Vmax musi być większe niż jakiekolwiek zmierzone odpowiedzi; Aby zachować spójność, metoda ta szacuje Vmax jako o 1% większe niż najwyższa zmierzona odpowiedź.
    3. Z równania linii regresji oszacuj wykładnik (n), biorąc ujemne nachylenie, a log(K) = punkt przecięcia z osią y/n.
  3. Po oszacowaniu parametrów dla V,max, n i K, określ względną liczbę fotonów wymaganych do wywołania odpowiedzi widmowej komórki na każdej długości fali, podłączając zmierzoną odpowiedź spektralną na danej długości fali jako (V) i rozwiązując dla I.
  4. Pomnóż obliczoną intensywność bodźca (I) z kroku 6.3 przez współczynnik korekcyjny dla każdego filtra interferencyjnego (z kroku 2.4.3) dla każdej długości fali.
  5. Aby uzyskać czułość, wszystkie intensywności muszą być powiązane z krzywą V log-I, aby można je było porównać. W tym celu należy odnieść natężenie każdej długości fali do 1/2 Vmax lub K, obliczonego w kroku 6.2.3.
    1. Odejmij każde skorygowane natężenie długości fali (krok 6.4) od K.
    2. Następnie dla każdej długości fali dodaj tę wartość "odległości od K" do K i pomnóż przez (-1).
    3. Następnie doprowadź wszystkie punkty danych do wartości dodatnich, dodając wartość bezwzględną najniższego punktu danych w serii do każdej długości fali.
  6. Znajdź czułość dla każdej długości fali, biorąc odwrotność wszystkich nowo obliczonych intensywności z kroku 6.5.1. Przekształć dane tak, aby spektrum czułości mieściło się w zakresie od 0 do 1.
  7. Po nagraniu z więcej niż jednej komórki tego samego typu uśrednij końcowe odpowiedzi i wykreśl je ze standardowymi słupkami błędów lub 95% przedziałami ufności (Rysunek 8).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dla wielu elementów konfiguracji nagrywania, pisemny opis nie dostarcza wystarczająco dużo szczegółów. Rysunek 1 przedstawia schemat komponentów wchodzących w skład kompletnej konfiguracji nagrywania. Na rysunku 2 widma są wykreślone dla światła białego i każdego filtra interferencyjnego, aby dać poczucie, dlaczego potrzebny jest współczynnik korekcyjny i co jest potrzebne do obliczenia tej korekcji. Rysunek 3 przedstawia zdjęcia i schemat ramienia Cardana, któr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nagrywanie wewnątrzkomórkowe może być trudną techniką do opanowania ze względu na wiele związanych z tym kroków technicznych. Aby eksperymenty zakończyły się sukcesem, należy wziąć pod uwagę kilka ważnych punktów. Po pierwsze, ważne jest, aby mieć odpowiednio izolowany wibracyjnie stół, na którym przeprowadzany jest eksperyment. Wielu badaczy korzysta ze stołów powietrznych, które całkowicie oddzielają blat od podstawy, zapewniając doskonałą izolację drgań. Nasz zestaw składa się z grubego marmurowego stołu z piaskownicą...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy zmarłemu Rudy'emu Limburgowi za wykonanie obwodu ramienia kardana, Kimberly Jamison, Matthew McHenry i Raju Metherate za użyczenie nam sprzętu, a także Almutowi Kelberowi i Kentaro Arikawie za zachętę. Praca ta była wspierana przez stypendium badawcze dla absolwentów National Science Foundation (NSF) dla KJM oraz grant NSF IOS-1257627 dla ADB.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Poczwarki motyliKilka dostępnych lokalnych gatunków wymaga zezwoleń USDA na wysyłkę. Carolina Bio Supply ma kilka gatunków owadów, które można zamówić na terenie USA bez konieczności uzyskania dodatkowych pozwoleń
Duży plastikowy cylinderKażda komora, która pozostaje nawilżona, będzie działać
Szpilki do owadów, rozmiar 2BioQuip1208B2
100% Desert MesquiteHoney Trader Joe'sKażdy roztwór miodu lub sacharozy będzie działał
Lampa ksenonowaWyroby Instruments66003Oriel jest teraz częścią Newport Corporation
Universal Power SupplyOriel Instruments68805Oriel jest teraz częścią Newport
Corporation Optical TrackOriel Instruments11190Oriel jest teraz częścią Newport Corporation
Rail Carrier, Large (2x)Oriel Instruments11641Oriel jest teraz częścią Newport Corporation
Przewoźnik kolejowy, mały (4x)Oriel Instruments11647Oriel jest teraz częścią Newport
Corporation Thread Adapter, 8-32 Male na 1/4-20 Męskie, zestaw 10Newport CorporationTA-8Q20-10
Optyczna stacja montażowa, 1,0 cala, 0,5 cala Średnica nierdzewna, 8-32 i 1/4-20 (5x)Newport CorporationSP-1
Uchwyt optyczny bez poślizgu, 2 cale, 0,5 cala. Średnica słupków, 1/4-20 (5x)Newport CorporationVPH-2
Stałe mocowanie obiektywu, 50,8 mmNewport CorporationLH-2
Stałe mocowanie obiektywu, 25,4 mmNewport CorporationLH-1
Newport Corporation60006
Wypukła soczewka krzemionkowa, 50,8 mmNewport CorporationSPX055
Sześciopozycyjne koło filtrów, x2Newport CorporationFW1X6
Piasta do mocowania koła filtraNewport CorporationFWM
Wklęsła soczewka krzemionkowa, 25,4 mmNewport CorporationSPC034
Uchwyt kolimatoraNewport Corporation77612
Sonda wiązki kolimacyjnejNewport Corporation77644
Konwerter tulejowy, zakończenie SMA do standardowej tulejki 11 mmNewport Corporation77670Ten adapter umożliwia dopasowanie światłowodu do uchwytu kolimatora 
600 μ Średnica m Światłowodowy obtykalny UV-visOriel Instruments78367Oriel jest teraz częścią Newport Corporation
Migawka z jednostką napędowąUniblitz100-2B
Fused Silica Metallic ND Filter, 0,1 ODNewportFRQ-ND01
Fused Silica Metallic ND Filter, 0,3 ODNewportFRQ-ND03
Fused Silica Metallic ND Filter, 0,5 ODNewportFRQ-ND05
Metaliczny filtr ND z topionej krzemionki UV, 1,0 ODNewportFRQ-ND10
Metaliczny filtr ND z topionej krzemionki UV, 2,0 ODNewportFRQ-ND30
Metaliczny filtr ND z topionej krzemionki, 3,0 ODLampa NewportFRQ-ND50
LS-1-CalOptyka oceaniczna SpektrometrLS-1-Cal
Optyka oceanicznaUSB-2000
SpectraSuite SoftwareOcean Optics
Interference filtr pasmowo-przepustowy, 300 nm Edmund Optics67749
Filtr pasmowo-przepustowy interferencyjny, 310 nm Edmund Optics67752
Filtr pasmowo-przepustowy interferencyjny, 320 nm Edmund Optics67754
Filtr pasmowo-przepustowy interferencyjny, 330 nm Edmund Optics67756
Filtr pasmowo-przepustowy interferencyjny, 340 nm Edmund Optics65614
Filtr pasmowo-przepustowy interferencyjny, 350 nm Edmund Optics67757
Filtr pasmowo-przepustowy interferencyjny, 360 nm Edmund Optics67760
Filtr pasmowo-przepustowy interferencyjny, 370 nm Edmund Optics67761
Filtr pasmowo-przepustowy interferencyjny, 380 nm Edmund Optics67762
Filtr pasmowo-przepustowy interferencyjny, 390 nm Edmund Optics67763
Filtr pasmowo-przepustowy interferencyjny, 400 nm Edmund Optics65732
Filtr pasmowo-przepustowy interferencyjny, 410 nm Edmund Optics65619
Filtr pasmowo-przepustowy interferencyjny, 420 nm Edmund Optics65621
Filtr pasmowo-przepustowy interferencyjny, 430 nm Edmund Optics65622
Filtr pasmowo-przepustowy interferencyjny, 440 nm Edmund Optics67764
Filtr pasmowo-przepustowy interferencyjny, 450 nm Edmund Optics65625
Filtr pasmowo-przepustowy interferencyjny, 460 nm Edmund Optics67765
Filtr pasmowo-przepustowy interferencyjny, 470 nm Edmund Optics65629
Filtr pasmowo-przepustowy interferencyjny, 480 nm Edmund Optics65630
Filtr pasmowo-przepustowy interferencyjny, 492 nm Edmund Optics65633
Filtr pasmowo-przepustowy interferencyjny, 500 nm Edmund Optics65634
Filtr pasmowo-przepustowy interferencyjny, 510 nm Edmund Optics65637
Filtr pasmowo-przepustowy interferencyjny, 520 nm Edmund Optics65639
Filtr pasmowo-przepustowy interferencyjny, 532 nm Edmund Optics65640
Filtr pasmowo-przepustowy interferencyjny, 540 nm Edmund Optics65642
Filtr pasmowo-przepustowy interferencyjny, 550 nm Edmund Optics65644
Filtr pasmowo-przepustowy interferencyjny, 560 nm Edmund Optics67766
Filtr pasmowo-przepustowy interferencyjny, 570 nm Edmund Optics67767
Filtr pasmowo-przepustowy interferencyjny, 580 nm Edmund Optics65646
Filtr pasmowo-przepustowy interferencyjny, 589 nm Edmund Optics65647
Filtr pasmowo-przepustowy interferencyjny, 600 nm Edmund Optics65648
Filtr pasmowo-przepustowy interferencyjny, 610 nm Edmund Optics65649
Filtr pasmowo-przepustowy interferencyjny, 620 nm Edmund Optics65650
Filtr pasmowo-przepustowy interferencyjny, 632 nm Edmund Optics65651
Filtr pasmowo-przepustowy interferencyjny, 640 nm Edmund Optics65653
Filtr pasmowo-przepustowy interferencyjny, 650 nm Edmund Optics65655
Filtr pasmowo-przepustowy interferencyjny, 660 nm Edmund Optics67769
Filtr pasmowo-przepustowy interferencyjny, 671 nm Edmund Optics65657
Filtr pasmowo-przepustowy interferencyjny, 680 nm Edmund Optics67770
Filtr pasmowo-przepustowy interferencyjny, 690 nm Edmund Optics65659
Filtr pasmowo-przepustowy interferencyjny, 700 nm Edmund Optics67771
KlatkaSprawdzi się każda metalowa konstrukcja, którą można uziemić i która pasuje do eksperymentalnej konfiguracji.
Mikroskop stereoskopowy, powiększenie 6X, 12X, 25X, 50XWild HeerbruggWild M5Każdy mikroskop stereoskopowy zrobi to
Statyw mikroskopu z wahadłowym ramieniem i ciężką podstawąInstrumentyKażda ciężka podstawa z ramieniem zrobi
CardanaZbudowany na zamówienie, patrz Rysunek 4< / silny>
Oświetlacz o wysokiej intensywności Fiber-liteDolan-JennerMI-150Do oświetlania próbki
Światłowód na gęsiej szyi Fiber-liteDolan-JennerEEG 2823Każdy światłowód na gęsiej szyi zrobi to
Marmurowy stół
Podniesiony drewniany stółNależy wyciąć otwór w tym stole, aby piaskownica mogła spoczywać na marmurowym stole pod spodem
Drewniane pudełko wypełnione piaskiemzbudowane na zamówienie, dowolne pudełko z piaskiem
ManipulatorCarl Zeiss - Jena
Uchwyt
Stopień
Przewody z zaciskiem krokodylkowym do uziemienia
Izolowany drut
Drut srebrny o średnicy 0,125 mm
Przedwzmacniacz ze sceną czołowąDagan CorporationIX2-700
Humbug Reduktor szumówQuest ScientificHumbug
Oscyloskop, 30 MHz, 2 kanały, Dual Trace, Alt-triggering, bez sondyEZ Digitalos-5030
BNC T-adapter
Powerlab hardware 2/20ADI instrumentsML820
Oprogramowanie LabchartInstrumenty ADIWykres 5
Generator impulsów 10 MHzBK Precision4030
Ściągacz do pipet szklanychSutter InstrumentsP-87
Kapilary ze szkła borokrzemianowego z żarnikiemWorld Precision Instruments1B120F-4
Chlorek potasu, 3 M
Szczelinowa plastikowa rurka
Wosk
Lutownica Weller
Platforma z kulą i gniazdem Podstawa magnetycznaHama zdjęcia i wideo
Dwukrawędziowa stal węglowa, łamliwa żyletkaMikroskopia elektronowa Nauki72004
Wazelina
Microsoft ExcelMicrosoft
łukowa Zespół soczewki kondensatora UV UV UV UV Faradaya McBaina ramię elektrodypróbkimiedziany AGW0510 BNC World Precision Instruments o niskiej temperaturze topnienia

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Beckmann, H., et al. Spectral sensitivity in Onychophora (velvet worms) revealed by electroretinograms, phototactic behaviour and opsin gene expression. J. Exp. Biol. 218, 915-922 (2015).
  2. Leboulle, G., et al. Characterisation of the RNA interference response against the long-wavelength receptor of the honeybee. Insect Biochem. Mol. Biol. 43, 959-969 (2013).
  3. Martinez-Harms, J., et al. Evidence of red sensitive photoreceptors in Pygopleurus israelitus Coleoptera) and its implications for beetle pollination in the southeast Mediterranean. J. Comp. Physiol. A. 198, 451-463 (2012).
  4. Knox, B. E., et al. Heterologous expression of Limulus rhodopsin. J. Biol. Chem. 278, 40493-40502 (2003).
  5. Salcedo, E., Zheng, L., Phistry, M., Bagg, E. E., Britt, S. G. Molecular basis for ultraviolet vision in invertebrates. J. Neurosci. 23, 10873-10878 (2003).
  6. Salcedo, E., et al. Blue- and green-absorbing visual pigments of Drosophila: ectopic expression and physiological characterization of the R8 photoreceptor cell-specific Rh5 and Rh6 rhodopsins. J. Neurosci. 19, 10716-10726 (1999).
  7. Vilinsky, I., Johnson, K. G. Electroretinograms in Drosophila: robust and genetically accessible electrophysiological system for the undergraduate laboratory. J. Undergrad. Neurosci. Educ. 11, 149-157 (2012).
  8. Hu, X., Leming, M. T., Whaley, M. A., O'Tousa, J. E. Rhodopsin coexpression in UV photoreceptors of Aedes aegypti Anopheles gambiae mosquitoes. J. Exp. Biol. 217, 1003-1008 (2014).
  9. Telles, F. J., et al. Out of the blue: the spectral sensitivity of hummingbird hawkmoths. J. Comp. Physiol. A. 200, 537-546 (2014).
  10. Arikawa, K., Mizuno, S., Kinoshita, M., Stavenga, D. G. Coexpression of two visual pigments in a photoreceptor causes an abnormally broad spectral sensitivity in the eye of the butterfly Papilio xuthus. J. Neurosci. 23, 4527-4532 (2003).
  11. Arikawa, K., et al. An ultraviolet absorbing pigment causes a narrow-band violet receptor and a single-peaked green receptor in the eye of the butterfly Papilio. Vision Res. 39, 1-8 (1999).
  12. Cronin, T. W., Jarvilehto, M., Weckstrom, M., Lall, A. B. Tuning of photoreceptor spectral sensitivity in fireflies (Coleoptera: Lampyridae). J. Comp. Physiol. A. 186, 1-12 (2000).
  13. Skorupski, P., Doring, T. F., Chittka, L. Photoreceptor spectral sensitivity in island and mainland populations of the bumblebee, Bombus terrestris. J. Comp. Physiol. A. 193, 485-494 (2007).
  14. Stalleicken, J., Labhart, T., Mouritsen, H. Physiological characterization of the compound eye in monarch butterflies with focus on the dorsal rim area. J. Comp. Physiol. A. 192, 321-331 (2006).
  15. Skorupski, P., Chittka, L. Photoreceptor processing speed and input resistance changes during light adaptation correlate with spectral class in the bumblebee, Bombus impatiens. PLoS One. 6, 25989(2011).
  16. Yang, E. -C., Osorio, D. Spectral sensitivities of photoreceptors and lamina monopolar cells in the dragonfly, Hemicordulia tau. J. Comp. Physiol. A. 169, (1991).
  17. Yang, E. C., Lin, H. C., Hung, Y. S. Patterns of chromatic information processing in the lobula of the honeybee, Apis mellifera L. J. Insect Physiol. 50, 913-925 (2004).
  18. Rosner, R., Homberg, U. Widespread sensitivity to looming stimuli and small moving objects in the central complex of an insect brain. J. Neurosci. 33, 8122-8133 (2013).
  19. Trager, U., Homberg, U. Polarization-sensitive descending neurons in the locust: connecting the brain to thoracic ganglia. J. Neurosci. 31, 2238-2247 (2011).
  20. Heinze, S., Reppert, S. M. Sun compass integration of skylight cues in migratory monarch butterflies. Neuron. 69, 345-358 (2011).
  21. Greiner, B., Cronin, T. W., Ribi, W. A., Wcislo, W. T., Warrant, E. J. Anatomical and physiological evidence for polarisation vision in the nocturnal bee Megalopta genalis. J. Comp. Physiol. A. 193, 591-600 (2007).
  22. Stowasser, A., Buschbeck, E. K. Electrophysiological evidence for polarization sensitivity in the camera-type eyes of the aquatic predacious insect larva Thermonectus marmoratus. J. Exp. Biol. 215, 3577-3586 (2012).
  23. Osorio, D. Directionally selective cells in the locust medulla. J. Comp. Physiol. A. 159, 841-847 (1986).
  24. Nordström, K., Barnett, P. D., Moyer de Miguel, I. M., Brinkworth, R. S., O'Carroll, D. C. Sexual dimorphism in the hoverfly motion vision pathway. Curr. Biol. 18, 661-667 (2008).
  25. Plachetzki, D. C., Fong, C. R., Oakley, T. H. The evolution of phototransduction from an ancestral cyclic nucleotide gated pathway. Proc. Biol. Sci. 277, 1963-1969 (2010).
  26. Feuda, R., Hamilton, S. C., McInerney, J. O., Pisani, D. Metazoan opsin evolution reveals a simple route to animal vision. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 18868-18872 (2012).
  27. Palczewski, K., et al. Crystal structure of rhodopsin: A G protein-coupled receptor. Science. 289, 739-745 (2000).
  28. Hardie, R. C., Raghu, P. Visual transduction in Drosophila. Nature. 413, 186-193 (2001).
  29. Katti, C., et al. Opsin co-expression in Limulus differential regulation by light and a circadian clock. J. Exp. Biol. 213, 2589-2601 (2010).
  30. Smith, W. C., Price, D. A., Greenberg, R. M., Battelle, B. A. Opsins from the lateral eyes and ocelli of the horseshoe crab, Limulus polyphemus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 6150-6154 (1993).
  31. Sison-Mangus, M. P., Bernard, G. D., Lampel, J., Briscoe, A. D. Beauty in the eye of the beholder: the two blue opsins of lycaenid butterflies and the opsin gene-driven evolution of sexually dimorphic eyes. J. Exp. Biol. 209, 3079-3090 (2006).
  32. Rushton, W. Review Lecture. Pigments and signals in colour vision. J. Physiol. 220, 1-31 (1972).
  33. Naka, K. I., Rushton, W. A. S-potentials from luminosity units in the retina of fish (Cyprinidae). J. Physiol. 185, 587-599 (1966).
  34. Lipetz, L. E. Handbook of Sensory Physiology. Vol. 1. Principles of Receptor Physiology. Loewenstein, W. R. 1, Springer. Berlin Heidelberg. Ch. 6 191-225 (1971).
  35. Matić, T., Laughlin, S. B. Changes in the intensity-response function of an insect's photoreceptors due to light adaptation. J. Comp. Physiol. A. 145, 169-177 (1981).
  36. Evans, L. S., Peachey, N. S., Marchese, A. L. Comparison of three methods of estimating the parameters of the Naka-Rushton equation. Documenta Ophthalmologica. 84, 19-30 (1993).
  37. Aylward, G. W. A simple method of fitting the Naka-Rushton equation. Clinical Vision Sciences. 4, 275-277 (1989).
  38. Stavenga, D. G., Smits, R. P., Hoenders, B. J. Simple exponential functions describing the absorbance bands of visual pigment spectra. Vision Res. 33, 1011-1017 (1993).
  39. Bernard, G. D. Red-absorbing visual pigment of butterflies. Science. 203, 1125-1127 (1979).
  40. Ogawa, Y., et al. Coexpression of three middle wavelength-absorbing visual pigments in sexually dimorphic photoreceptors of the butterfly Colias erate. J. Comp. Physiol. A. 198, 857-867 (2012).
  41. Briscoe, A. D., Chittka, L. The evolution of color vision in insects. Annu. Rev. Entomol. 46, 471-510 (2001).
  42. Kelber, A., Thunell, C., Arikawa, K. Polarisation-dependent colour vision in Papilio butterflies. J. Exp. Biol. 204, 2469-2480 (2001).
  43. Kelber, A., Balkenius, A., Warrant, E. J. Scotopic colour vision in nocturnal hawkmoths. Nature. 419, 922-925 (2002).
  44. Koshitaka, H., Kinoshita, M., Vorobyev, M., Arikawa, K. Tetrachromacy in a butterfly that has eight varieties of spectral receptors. Proc. Biol. Sci. 275, 947-954 (2008).
  45. Blackiston, D., Briscoe, A. D., Weiss, M. R. Color vision and learning in the monarch butterfly, Danaus plexippus (Nymphalidae). J. Exp. Biol. 214, 509-520 (2011).
  46. Sison-Mangus, M. P., Briscoe, A. D., Zaccardi, G., Knuttel, H., Kelber, A. The lycaenid butterfly Polyommatus icarus uses a duplicated blue opsin to see green. J. Exp. Biol. 211, 361-369 (2008).
  47. Schneuwly, S., et al. Drosophilia ninaA gene encodes an eye-specific cyclophilin (cyclosporine A binding protein). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (1989).
  48. Luan, Z., Reddig, K., Li, H. S. Loss of Na(+)/K(+)-ATPase in Drosophila leads to blindness and age-dependent neurodegeneration. Exp. Neurol. 261, 791-801 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Rejestracja wewn trzkom rkowakom rki fotoreceptoroweszklana mikroelektrodalampa ksenonowarezystancja elektrodystymulacja wiat emanaliza odpowiedziadaptacja do ciemno ci

Powiązane artykuły