Wielozadaniowa chromogenna hybrydyzacja in situ w całości do porównania domen ekspresji genów w zarodkach Drosophila

Podsumowanie

Opisujemy wielozadaniową procedurę chromogenicznej hybrydyzacji in situ (MC-WISH) w nienaruszonych zarodkach Drosophila, pozwalającą na jednoczesne i specyficzne wykrywanie trzech różnych wzorców dystrybucji mRNA poprzez kontrastujące kolorowe osady.

Streszczenie

Aby przeanalizować sieci regulacyjne genów aktywne podczas rozwoju embrionalnego i organogenezy, konieczne jest precyzyjne określenie, w jaki sposób różne geny są wyrażane w stosunku przestrzennym do siebie in situ. Multi-target chromogenic whole-mount in situ hybridization (MC-WISH) znacznie ułatwia natychmiastowe porównanie wzorców ekspresji genów, ponieważ umożliwia charakterystyczną wizualizację różnych gatunków mRNA w kontrastujących kolorach w tej samej próbce próbki. Daje to możliwość topograficznego powiązania domen ekspresji genów ze sobą z dużą dokładnością oraz zdefiniowania unikalnych i nakładających się na siebie miejsc ekspresji. W prezentowanym protokole opisano procedurę MC-WISH służącą do porównywania wzorców ekspresji mRNA różnych genów w zarodkach Drosophila. Do trzech sond RNA, z których każda jest specyficzna dla innego genu i znakowana innym haptenem, jest jednocześnie hybrydyzowana z próbkami zarodków, a następnie wykrywana za pomocą immunohistochemii kolorymetrycznej opartej na fosfatazie alkalicznej. Opisana procedura jest szczegółowo opisana tutaj dla Drosophila, ale działa równie dobrze w przypadku zarodków danio pręgowanego.

Wprowadzenie

Hybrydyzacja in situ (ISH) to standardowa metoda wykrywania i lokalizacji transkryptów RNA w kontekście morfologicznym, w komórkach, tkankach i organizmach ¹. Sygnały wytwarzane przez procedurę ISH są zwykle wizualizowane przez radioaktywne, fluorescencyjne i chromogenne systemy detekcji. W ostatnich latach znaczący postęp technologiczny w dziedzinie fluorescencyjnego ISH (FISH)² zaowocował radykalną poprawą czułości i rozdzielczości, umożliwiając wykrywanie i ilościowe określanie ekspresji RNA na poziomie pojedynczych komórek i subkomórek oraz wizualizację RNA do pojedynczych cząsteczek ^3,4. Podczas gdy wyrafinowane metody jednocząsteczkowe FISH są wykorzystywane do bardziej specjalistycznych zastosowań, chromogenny ISH jest szeroko rozpowszechniony jako rutynowa metoda wykrywania RNA in situ w badaniach i diagnostyce klinicznej. Do detekcji chromogennej stosuje się enzymatyczne reakcje wytrącania, które generują widoczne produkty w kontrastowych kolorach w miejscach hybrydyzacji ⁵. Ma to tę zaletę, że wizualizację RNA można połączyć z rutynowymi barwieniami histologicznymi, a kontekst morfologiczny jest natychmiast widoczny w standardowej mikroskopii jasnego pola. Ponadto wiele z zastosowanych podłoży barwiących wytwarza osady, które są stabilne w organicznych i/lub wodnych podłożach montażowych, dzięki czemu można uzyskać trwałe preparaty próbek ⁵.

U Drosophila, początkowe protokoły ISH stosowały sondy znakowane radioizotopami do wykrywania transkryptów na podzielonym materiale ⁶. Chociaż trudno jest zrekonstruować na podstawie skrawków tkanek pełne wzorce transkryptów całych zarodków lub układów narządów, zastosowanie chromogennych procedur ISH z nieradioaktywnie znakowanymi sondami umożliwia globalne wykrycie rozkładów RNA w całych mocowaniach ⁷. Chociaż istnieje wiele odmian chromogennego ISH, w typowych protokołach hybrydyzacji in situ (WISH) zhybrydyzowane sondy znakowane haptenem są wykrywane przez przeciwciała anty-haptenowe sprzężone z enzymem reporterowym, a transkrypty mRNA są wizualizowane przez wytrącający się chromogen.

Paleta różnokolorowych osadów wytwarzanych przez enzymy reporterowe fosfatazę alkaliczną (AP), peroksydazę chrzanową (POD) i beta-galaktozydazę (GAL) pozwala na charakterystyczne wykrywanie wielu celów w jednej i tej samej próbce ^8-14. Jednak aktywność enzymatyczna POD trwa tylko przez ograniczony czas, a reakcja kolorymetryczna GAL jest nieco mniej czuła, tak więc bez dodatkowego wzmocnienia sygnału (tyramidowego) ¹⁵ wykrycie mniej obfitych transkryptów może być trudne w przypadku tych enzymów. W przeciwieństwie do tego, trwała aktywność AP pozwala na długotrwałą wymianę podłoża i wysoki stosunek sygnału do szumu. Dlatego sekwencyjna detekcja za pomocą enzymu reporterowego AP z różnokolorowymi substratami okazała się skuteczna w skutecznym i charakterystycznym wykrywaniu do trzech różnych transkryptów w pojedynczych zarodkach ^10-12,16.

Dla tej wielocelowej metody chromogenicznego WISH (MC-WISH) (Rysunek 1) ¹⁴, znakowane antysensowne sondy RNA są generowane przez transkrypcję in vitro i oznaczane jednym z dostępnych znaczników haptenowych. Zarodki są utrwalane i przepuszczalne przez formaldehyd przez obróbkę metanolem i trawienie proteinazą K. Hybrydyzacja zarodków jest przeprowadzana jednocześnie za pomocą maksymalnie trzech różnie znakowanych antysensownych sond RNA, z których każda jest specyficzna dla innego genu. Po usunięciu niezwiązanej sondy przez rygorystyczne mycie, każda etykieta haptenowa jest wizualizowana w oddzielnej rundzie wykrywania. Pojedyncza runda detekcji polega na inkubacji zarodków z przeciwciałem antyhaptenowym sprzężonym z wizualizacją AP i RNA poprzez zastosowanie substratu AP, który wytwarza miejscowy, stabilny osad o kolorze. Po wykryciu i wybarwieniu przeciwciał zastosowany koniugat przeciwciało-AP jest usuwany przez przemywanie o niskim pH. W eksperymentach wielokolorowych każda runda detekcji wykorzystuje przeciwciało skierowane przeciwko innemu znacznikowi haptenowemu, a każdy wzór transkryptu jest wizualizowany przez inny substrat kolorystyczny (Tabela 1). Zarodki są umieszczane w glicerolu i obrazowane pod mikroskopem złożonym o wysokiej rozdzielczości przy użyciu optyki z kontrastem interferencyjnym różnicowym (DIC).

Protokół

1. Znakowanie sond RNA metodą transkrypcji in vitro

1. Zebrać reakcję transkrypcji in vitro w mikroprobówce o pojemności 1,5 ml w warunkach wolnych od RNaz: 10,5 μl H₂O poddanych działaniu DEPC, 4,0 μl 5x buforu transkrypcyjnego, 1,0 μl (1 μg) zlinearyzowany, oczyszczony matrycowy DNA w H_2Opoddanym działaniu DEPC, 1,3 μl mieszaniny NTP, 0,7 μl UTP znakowanego haptenem, 0,5 μl inhibitora RNA RiboLock, 2,0 μl polimerazy RNA.
   Uwaga: Końcowa objętość reakcji wynosi 20 μl.
2. W zależności od sekwencji promotora matrycy należy użyć polimerazy RNA T7, T3 lub SP6 do transkrypcji in vitro (patrz odniesienie ¹⁷).
3. Wybierz digoksygeninę-11-UTP, biotynę-16-UTP lub fluoresceinę-12-UTP jako etykietę dla sondy RNA. Aby uzyskać więcej informacji, zobacz dyskusję na temat etykiet haptenów i stężeń sond w Dyskusji.
4. Wymieszaj reakcję transkrypcji i krótko odwiruj.
5. Pozostaw na transkrypcję przez 3 godziny w temperaturze 37 °C.
6. Dodać 1 μl DNazy I wolnej od RNaz do reakcji transkrypcji w celu usunięcia matrycy DNA, dobrze wymieszać i inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C.
7. Za pomocą H₂O poddanego działaniu DEPC wyregulować objętość próbki do 200 μl.
8. Dodać 100 μl (0,5 obj.) 7,5 M octanu amonu i 600 μl (3 obj.) etanolu, aby wytrącić znakowaną sondę RNA. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
   1. Nie używaj lodowatego etanolu, ponieważ może to prowadzić do niepożądanego wytrącania się nieinkorporowanych nukleotydów.
9. Odwirowywać transkrybowany RNA w wirówce o kontrolowanej temperaturze z maksymalną prędkością (20 800 x g) przez 30 minut w temperaturze +20 °C. Ostrożnie odsysać supernatant.
10. Otrzymany osad przepłukać 70% etanolem w temperaturze pokojowej i odwirować przy 20 800 x g przez 10 minut w temperaturze +20 °C.
11. Usunąć supernatant i uważać, aby przypadkowo nie zassać luźnego osadu. Pozostaw granulki do wyschnięcia w mikroprobówce z otwartą pokrywą na kilka minut w temperaturze pokojowej.
12. Otrzymany osad rozpuścić w 100 μl_H2O, poddanego działaniu DEPC.
13. Dodać 300 μl buforu do hybrydyzacji (50% obj./obj. dejonizowanego formamidu, 5x SSC, 50 μg/ml soli sodowej heparyny, 0,1% obj./obj. Tween-20, 5 mg/ml torula RNA) i przechowywać w temperaturze -20 °C. Sondy można przechowywać przez długi czas w temperaturze -20 °C.
    Uwaga: W pierwszym teście nowo transkrybowanej sondy należy rozcieńczyć 3 μl sondy RNA znakowanej haptenem w 100 μl buforze hybrydyzacyjnym, aby uzyskać końcowe stężenie dla eksperymentu WISH.

2. Przetwarzanie próbek zarodków za pomocą wkładek

Uwaga: Używanie mikroprobówek lub płytek wielodołkowych do przetwarzania zarodków na różnych etapach inkubacji niesie ze sobą ryzyko utraty znacznych ilości zarodków przez przypadkowe ich zassanie podczas wymiany roztworów. Aby uniknąć tej straty, pomocne może być użycie koszy (takich jak wkładki Netwella) do przenoszenia próbek zarodków przez procedurę. Są to wkładki polistyrenowe z siatką poliestrową od spodu (ryc. 2A), na której spoczywają zarodki podczas obróbki.

1. W celu przetwarzania zarodków w procedurze WISH, należy umieścić wkładki w 12-dołkowej płytce (ryc. 2B) i dodać 2 ml odpowiedniego roztworu do każdej studzienki.
2. Odpipetować zarodki do wkładek za pomocą niebieskiej końcówki. Upewnij się, że wszystkie zarodki są zanurzone w płynie.
3. Po upływie czasu inkubacji umieść wkładki zawierające zarodki na innej 12-dołkowej płytce, która jest wypełniona roztworem do następnego kroku.
   1. Za pomocą nośników i uchwytów (Rysunek 2C) można przenieść do 12 próbek jednocześnie z jednego roztworu do drugiego (Rysunek 2D).
      Uwaga: Aby zmniejszyć wymagane objętości, należy użyć mikroprobówek o pojemności 2,0 ml do etapów wstępnej hybrydyzacji/hybrydyzacji (patrz KROK 4.1) i płytek 24-dołkowych do reakcji barwienia (KROK 6.2). Reakcje hybrydyzacji i barwienia przeprowadza się w objętościach odpowiednio 100 μl i 400 μl.

3. Przygotowanie zarodków do hybrydyzacji

1. Pobieranie, dekorionacja, utrwalanie i dewitelinyzacja zarodków przy użyciu standardowych procedur ^14,18. Przygotowane zarodki są rutynowo przechowywane w metanolu w temperaturze -20 °C.
2. Przenieść zarodki, które mają być wykorzystane do hybrydyzacji in situ, do RT i rozprowadzić do wkładek 12-dołkowej płytki wypełnionej 2 ml metanolu na basenik.
3. Nawadniaj zarodki poprzez zmniejszającą się serię metanolu w temperaturze pokojowej. Inkubuj zarodki za każdym razem przez 3 minuty w: (i) 75% metanolu w 1x PBS (ii) 50% metanolu w 1x PBS, 0,1% Tween-20 (iii) 25% metanolu w 1x PBS, 0,1% Tween-20 (iv) 1x PBS, 0,1% Tween-20 (v) 1x PBS, 0,1% Tween-20.
4. Wstępnie utrwalić zarodki w 4% paraformaldehydzie w 1x PBS przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
5. Usuń utrwalacz przez 4 prania przez 3 minuty w 1x PBS, 0,1% Tween-20 przy RT. W międzyczasie rozmrozić i przygotować roztwory robocze proteinazy K i glicyny.
6. Permeabilizuj zarodki w świeżej proteinazie K (10 μg/ml do 50 μg/ml) w 1x PBS, 0,1% Tween-20 przez 3 min przy RT.
   Uwaga: Leczenie proteinazą K jest zrównoważone w zależności od siły utrwalenia zarodka. Na przykład, jeżeli pominięto etap wstępnego wiązania (3.4), można zastosować łagodniejsze traktowanie proteinazą K.
7. Zatrzymaj reakcję przez dwa 1-minutowe płukanie w 2 mg/ml glicyny w 1x PBS, 0,1% Tween-20 w temperaturze pokojowej.
8. Po utrwaleniu zarodków w 4% paraformaldehydzie w 1x PBS przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
9. Następnie usuń utrwalacz paraformaldehydu, myjąc czterokrotnie przez 3 minuty w 1X PBS, 0,1% Tween-20 przy RT.
10. Przenieś zarodki po utrwaleniu do buforu przed hybrydyzacją. Przechowywać zarodki w buforze przed hybrydyzacją w temperaturze -20 °C lub bezpośrednio przystąpić do hybrydyzacji sond.

4. Hybrydyzacja sond

1. Przenieść zarodki przechowywane w temperaturze -20 °C w buforze przed hybrydyzacją do RT. Rozprowadzić zarodki w buforze przed hybrydyzacją do mikroprobówek o pojemności 2,0 ml.
2. Przez co najmniej 30 minut należy wstępnie hybrydyzować próbki zarodków w temperaturze 65 °C w buforze przed hybrydyzacją.
   Uwaga: Do etapów wstępnej hybrydyzacji i hybrydyzacji stosuje się kąpiel wodną. Podczas wstępnej hybrydyzacji jest czas na przygotowanie mieszanki sondy poprzez połączenie do trzech antysensownych sond RNA, z których każda jest specyficzna dla innego transkryptu genu i znakowana innym haptenem.
3. Aby uzyskać mieszaninę sondy, dodaj odpowiednie ilości (zwykle od 1 μl do 6 μl) każdej żądanej oryginalnej sondy antysensownego RNA znakowanej haptenem w 100 μl buforu hybrydyzacyjnego (50% obj./obj. dejonizowany formamid, 5x SSC, 50 μg/ml soli sodowej heparyny, 0,1% obj./obj. Tween-20, 5 mg/ml RNA toruli, 5% wag./obj. siarczan dekstranu).
   Uwaga: Dodanie siarczanu dekstranu jest opcjonalne.
4. Denaturować antysensowną sondę RNA wymieszać w bloku grzewczym w temperaturze 80 °C przez 5 minut. Następnie przenieść zdenaturowaną mieszaninę sondy bezpośrednio do temperatury 65 °C.
5. Usuń większość buforu przed hybrydyzacją z próbek zarodków i dodaj zdenaturowaną mieszankę sondy.
6. Pozwól próbkom zarodków zhybrydyzować w celu wymieszania sondy O/N w temperaturze 65 °C.
   Uwaga: Temperatury w zakresie od 55 °C do 65 °C są rutynowo stosowane do hybrydyzacji, etapów przed i po hybrydyzacji. Hybrydyzacja w temperaturze 65 °C zapewnia najbardziej rygorystyczne warunki i jest zalecana w przypadku problemów z podłożem przy użyciu niższych temperatur. Jeśli nie ma problemów z tle, zalecana jest hybrydyzacja w temperaturze 55 °C, co zapewnia przewagę w postaci zwiększonej siły sygnału i lepszej integralności zarodka.
7. Następnego ranka należy najpierw przelać roztwory myjące do temperatury 65 °C, aby upewnić się, że zostaną podgrzane do odpowiedniej temperatury na czas.
8. Przenieść sondę do hybrydyzacji, wymieszać z zarodkami z mikroprobówek o pojemności 2,0 ml do wkładek 12-dołkowej płytki zawierającej 2 ml wstępnie podgrzanego buforu do mycia hybrydyzacji (50% formamid w 2× SSC, 0,1% Tween-20). Umieścić 12-dołkową płytkę zawierającą próbki zarodków w piecu i inkubować przez 20 minut w temperaturze 65 °C.
9. Przenieść próbki zarodków do 2 ml nowego buforu do przemywania hybrydyzacji i inkubować przez 20 minut w temperaturze 65 °C. Powtórzyć ten krok jeszcze raz.
10. Usunąć nadmiar sondy przez 20 minut prania w temperaturze 65 °C, raz na 2× SSC, 0,1% Tween-20 i trzy razy w 0,2× SSC, 0,1% Tween-20.
11. Przenieść próbki zarodków do 1x PBS, 0,1% Tween-20 w RT.
12. Inkubować zarodki w buforze blokującym (8% surowicy owczej w 1x PBS, 0,1% Tween-20) przez co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej.

5. Wykrywanie przeciwciał w sondach znakowanych haptenem

Uwaga: W przeciwieństwie do jednoczesnej hybrydyzacji wszystkich trzech różnie oznakowanych sond, każda sonda jest wykrywana jedna po drugiej w oddzielnych rundach inkubacji i barwienia przeciwciał. Dlatego w każdej rundzie wykrywania stosuje się tylko jedno przeciwciało (anty-digoksygeninę-AP lub anty-fluoresceinę-AP lub anty-biotynę-AP).

1. Wybierz pomiędzy KROKIEM 5.1.1 do 5.1.3 i przystąp do przygotowania odpowiedniego rozcieńczenia przeciwciała zgodnie z etykietą haptenową, która ma zostać wykryta.
   Uwaga: W celu sekwencyjnego wykrywania różnie oznakowanych sond, w każdym cyklu wykrywania stosuje się kolejne przeciwciało anty-haptenowe.
   1. Do wykrywania sondy znakowanej fluoresceiną należy rozcieńczyć koniugaty anty-fluoresceiny-AP w stosunku 1:4,000 w buforze blokującym.
   2. W celu wykrycia sondy znakowanej digoksygeniną należy rozcieńczyć koniugaty anty-digoksygeniny-AP w proporcji 1:4 000 w buforze blokującym.
   3. W celu wykrycia sondy znakowanej biotyną należy przygotować sprzężony roztwór anty-biotyny-AP w rozcieńczeniu 1:4,000 w buforze blokującym.
2. Inkubować zarodki w wybranym roztworze anty-hapten-AP przez 3 do 4 godzin w temperaturze pokojowej. Alternatywnie, inkubować O/N w temperaturze 4 °C. Nie należy stosować wszystkich trzech przeciwciał jednocześnie.
3. W celu usunięcia niezwiązanego przeciwciała należy przemyć zarodki 1x PBS, 0,1% Tween-20 przez 4 razy 15 minut w temperaturze pokojowej.
4. Aby zmienić systemy buforowe, przemyj dwa razy po 15 minut w temperaturze pokojowej w TNT (0,1 M Tris-HCl pH 8,0, 0,1 M NaCl, 0,1% Tween-20).

6. Barwienie chromogenne fosfatazy alkalicznej

1. Po wykryciu przeciwciał należy wybrać pomiędzy KROKIEM 6.1.1 a 6.1.4 i przystąpić do jednej z reakcji barwienia chromogennego fosfatazy alkalicznej, aby uzyskać pożądany sygnał barwy (patrz Tabela 1). Dla każdej rundy detekcji stosowana jest inna reakcja substratu chromogennego, aby podkreślić każdy wzór transkryptu innym kolorem.
   1. Szybkie barwienie na czerwono
      1. Umyj zarodki dwa razy przez 15 minut w TT8.2 (0,1 M Tris-HCl pH 8,2, 0,1% Tween-20).
      2. Podczas mycia zarodków przygotuj roztwór barwiący Fast Red z zestawu tabletek substratowych fosfatazy alkalicznej Fast Red TR/NAMP.
      3. Rozpuścić tabletkę buforową z zestawu tabletek w 1 ml wody destylowanej i wymieszać przez wirowanie do uzyskania 0,1 M Tris-HCl pH 8,2.
      4. Wrzuć tabletkę Fast Red TR/NAMP do przygotowanego buforu Tris i rozpuść przez wirowanie, aby uzyskać roztwór barwiący Fast Red.
      5. Przezroczysty roztwór barwiący Fast Red z nierozpuszczonych cząstek przez filtr strzykawkowy 0,2 μm.
   2. Szybkie barwienie na niebiesko
      1. Umyj zarodki dwa razy przez 15 minut w świeżym buforze barwiącym SB8.2 (0,1 M Tris-HCl pH 8,2, 0,1 M NaCl, 0,05 M MgCl₂, 0,1% Tween-20).
      2. Podczas mycia zarodków należy przygotować roztwór barwiący Fast Blue z roztworów podstawowych 50 mg/ml Fast Blue BB (w DMF) i 50 mg/ml fosforanu naftolu (w DMSO).
      3. Świeżo przygotować roztwór Fast Blue BB o stężeniu 0,5 mg/ml w SB8.2.
      4. Świeżo przygotować oddzielny roztwór fosforanu naftolu o stężeniu 0,5 mg/ml w SB8.2.
      5. Przygotowany roztwór fosforanu naftolu dodawać kroplami do roztworu Fast Blue BB pod ciągłym mieszaniem z wirem. Wynikowe końcowe stężenie robocze wynosi 0,25 mg/ml dla obu składników substratu.
         Uwaga: Różne kombinacje Fast Blue / fosforanu naftolu dają różne odcienie kolorów (patrz tabela 1).
   3. Barwienie BCIP/NBT
      1. Umyj zarodki dwa razy przez 15 minut w świeżym buforze barwiącym SB9.5 (0,1 M Tris-HCl pH 9,5, 0,1 M NaCl, 0,05 M MgCl₂, 0,1% Tween-20).
      2. Aby uzyskać fioletowo-niebieski sygnał chromogenny, należy świeżo przygotować roztwór barwiący BCIP/NBT, dodając 1 μl lewamizolu, 3,5 μl BCIP i 4,5 μl NBT na ml buforu barwiącego SB9.5 i dobrze wymieszać.
   4. Barwienie INT
      1. Umyj zarodki dwa razy przez 15 minut w świeżym buforze barwiącym SB9.5.
      2. Aby uzyskać żółtobrązowy sygnał chromogenny, świeżo przygotuj roztwór barwiący INT, dodając 1 μl lewamizolu, 5 μl Magenta-Phos i 5 μl INT na ml buforu barwiącego SB9.5 i dobrze wymieszaj.
         Uwaga: Alternatywnie można użyć 7,5 μl/ml BCIP/INT gotowego do użycia roztworu barwiącego.
2. Do reakcji barwienia należy przenieść próbki zarodków na płytkę 24-dołkową. Każdą próbkę inkubować w 400 μl wybranego roztworu barwiącego w ciemności.
3. Od czasu do czasu monitoruj rozwój sygnału pod mikroskopem stereoskopowym. Zatrzymaj reakcję barwienia po uzyskaniu żądanej siły sygnału i przed zaobserwowaniem znacznego sygnału tła.
4. Aby zatrzymać reakcję chromogenną, należy przenieść barwione zarodki do wkładek 12-dołkowej płytki zawierającej 2 ml TNT na dołek. Wypłucz barwione zarodki dwa razy w TNT.
5. Umyj zarodki dwa razy przez 10 minut w 1× PBS, 0,1% Tween-20 w temperaturze pokojowej, aby usunąć resztki substratu.

7. Usuwanie przeciwciał/Inaktywacja fosfatazy alkalicznej

1. Usunąć przeciwciało i dezaktywować fosfatazę alkaliczną przez inkubację w 2 ml roztworu zatrzymującego o niskim pH (0,1 M glicyna-HCl pH 2,2, 0,1% Tween-20) przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
2. Płukać przez 1 minutę 2 ml 1× PBS, 0,1% Tween-20 w temperaturze pokojowej.
3. Prać 3 razy przez 3 minuty w 1× PBS, 0,1% Tween-20 w RT.

8. Druga runda wykrywania

1. Aby wykryć wzorzec dystrybucji drugiego transkryptu, należy przystąpić do wykrywania przeciwciał w sondach znakowanych haptenem (KROK 5.1 do 5.4) przy użyciu koniugatów przeciwciało-AP skierowanych przeciwko drugiemu znacznikowi haptenu.
2. Wykonaj barwienie chromogenne fosfatazy alkalicznej (KROK 6.1 do 6.5), nakładając kombinację substratów, która daje kolor kontrastujący z kolorem użytym w pierwszej rundzie wykrywania (dostępne kolory patrz Tabela 1).
3. Usunąć drugi koniugat przeciwciało-AP zgodnie z opisem w KROKU 7.1 do 7.3.

9. Trzecia runda wykrywania

1. Aby wykryć wzorzec dystrybucji trzeciego transkryptu, należy przystąpić do wykrywania przeciwciał sond znakowanych haptenem (KROK 5.1 do 5.4) przy użyciu koniugatów przeciwciało-AP specyficznych dla trzeciego znacznika haptenu.
2. Wykonaj barwienie chromogenne fosfatazy alkalicznej (KROK 6.1 do 6.5), stosując kombinację substratów, która nie została zastosowana w poprzednich rundach wykrywania. Wybierz reakcję chromogeniczną, w wyniku której powstaje kolorowy osad łatwy do odróżnienia od tych z poprzednich dwóch rund wykrywania (wybór koloru znajduje się w Tabeli 1).

10. Montaż i obrazowanie

1. Przenieś odpowiednio wybarwione zarodki do 30% glicerolu w PBS i inkubuj, aż zarodki zostaną całkowicie zanurzone w roztworze glicerolu. Są dobrze zrównoważone, gdy opadają na dno.
2. Przenieść zarodki do 70% glicerolu w_H2Oi pozostawić do równowagi w RT. Barwione zarodki można przechowywać w 70% glicerolu w temperaturze 4 °C.
3. W celu zamontowania, pipetą wybarwić zarodki w kropli 70% glicerolu na szkiełku podstawowym i bez dotykania przekładek przyklejonych do szkiełka (ryc. 3). Nałożyć szkiełko nakrywkowe.
4. Zobacz zamontowane zarodki pod mikroskopem preparacyjnym. Przesuń nałożony szkiełko nakrywkowe, aby zarodki obróciły się do pożądanej orientacji.
5. Obserwuj prawidłowo zorientowane zarodki w wysokiej rozdzielczości (obiektywy 20X, 40X) pod mikroskopem złożonym z optyką kontrastową z interferencją różnicową.
6. Rób zdjęcia za pomocą kolorowego aparatu cyfrowego i zapisuj je na cyfrowym urządzeniu pamięci masowej.

Wyniki

Opisany protokół umożliwia jednoczesną wizualizację wielu wzorów transkrypcyjnych w różnych kolorach. MC-WISH daje korzyść w postaci możliwości bezpośredniego porównania wzorów ekspresji różnych genów w tym samym embrionie. Jako przykład, wzory ekspresji genów empty spiracles (ems) ¹⁹, fushi tarazu (ftz) ²⁰ oraz sloppy paired 1 (slp1) ²¹ są bezpośrednio porównywane w embrionach Drosophila melanogaster na etapie blastodermy i wizualizowane w różnych odcieniach kolorów (Rysunek 4).

Dostępne są różne kombinacje substratów AP, które pozwalają na uzyskanie panelu kontrastujących ze sobą kolorowych osadów (Tabela 1). Czerwony osad powstający w wyniku reakcji z Fast Red oraz fioletowy osad powstający z BCIP/NBT można łatwo rozróżnić, dlatego są one najczęściej stosowane w eksperymentach dwukolorowych (Rysunek 4A). Jednakże barwienie BCIP/NBT może szybko przybrać bardzo ciemny kolor, co w przypadku częściowej ko-dystrybucji transkryptów może maskować kolor Fast Red. Dlatego korzystne może być zastosowanie Fast Blue, który w połączeniu z NAMP, NAGP i NABP generuje odpowiednio produkty niebieskie, zielone i fioletowe (Tabela 1). Połączenie Fast Blue z NAMP daje jasnoniebieski kolor, który jest łatwo rozróżnialny od produktu Fast Red w sąsiadujących lub nakładających się domenach ekspresji, co pokazano tutaj dla miejsc ekspresji ems i slp1 zwizualizowanych odpowiednio w kolorze czerwonym i niebieskim (Rysunek 4B). Kombinacja Fast Blue NAGP zapewnia podobny silny kontrast w stosunku do barwienia Fast Red, dzięki czemu zielona domena ems jest wyraźnie odróżnialna od czerwonego miejsca ekspresji slp1 (Rysunek 4C). Jednakże, jeśli miejsca ekspresji ems i slp1 są wykrywane odpowiednio za pomocą Fast Blue NABP i Fast Red, powstałe fioletowe i czerwone osady są trudniejsze do rozróżnienia (Rysunek 4D). Jak wspomniano powyżej, Fast Red i Fast Blue NAGP są łatwe do rozróżnienia, co pokazano na przykładzie ekspresji slp1 i ftz w kolorze odpowiednio czerwonym i zielonym (Rysunek 4D).

MagentaPhos w połączeniu z INT tworzy żółty osad, który jest wykorzystywany do ujawnienia segmentowej ekspresji ftz (Rysunek 4C, E). Żółty osad zapewnia dobry kontrast w stosunku do niebieskich substratów, co obrazuje detekcja slp1 i ftz odpowiednio za pomocą Fast Blue NAMP oraz MAG/INT (Rysunek 4E). Jednakże żółty osad jest trudniejszy do odróżnienia od produktu Fast Red. Żółto zabarwiona domena ekspresji ems jest niemal nie do odróżnienia od rostralnej ekspresji slp1 ukazanej na czerwono (Rysunek 4F). W związku z tym kombinacja substratów barwnych musi zostać starannie dobrana dla każdego eksperymentu.

Rycina 1. Schemat blokowy MC-WISH. W celu wielobarwnej wizualizacji trzech unikalnych wzorów transkryptów, w każdym cyklu detekcji należy wybrać odpowiednie kombinacje koniugatów przeciwciało-AP oraz substratów barwnych. Skróty: AP, fosfataza zasadowa; BIO, biotyna; DIG, digoksygenina; FLUO, fluoresceina. Pozostałe skróty znajdują się w opisach do Ryciny 4 oraz Tabeli 1. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 2. Inserty jako nośniki embrionów. (A) Inserty wyposażone u dołu w membrany poliestrowe o średnicy 15 mm i rozmiarze oczek 74 µm są wykorzystywane jako nośniki embrionów Drosophila. (B) Inserty są montowane w płytkach 12-dołkowych, które pełnią funkcję tacek zbiorników dla różnych roztworów. (C) Dostępne nośniki i uchwyty umożliwiają jednoczesną obróbkę (D) 12 insertów/próbek embrionów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Montowanie zabarwionych embrionów. Embriony montuje się w kropli 70% glicerolu pomiędzy dwoma stosami szkiełek nakrywkowych, które pełnią funkcję dystansów. Delikatne przesuwanie nałożonego dużego szkiełka nakrywkowego pomaga obrócić zamontowane embriony do pożądanej orientacji w celu obserwacji i fotografowania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 4. Wielokolorowa wizualizacja transkryptów mRNA w zarodkach Drosophila. Przykłady eksperymentów MC-WISH w zarodkach Drosophila przedstawione z widokiem bocznego. Wzory ekspresji mRNA dla empty spiracles (ems), fushi tarazu (ftz) oraz sloppy paired 1 (slp1) zostały zwizualizowane za pomocą różnych kombinacji substratów barwnych AP, które są wskazane na każdym panelu. Transkrypty wykryto za pomocą sond znakowanych: (A) ftz FLUO i ems DIG, (B) slp1 FLUO, ems BIO i ftz DIG, (C) ems BIO, slp1 FLUO i ftz DIG, (D) ftz BIO, slp1 FLUO i ems DIG, (E) slp1 FLUO, ems DIG i ftz BIO, (F) ftz BIO, slp1 FLUO i ems DIG. Sondy znakowane haptenami były wykrywane immunohistochemicznie jedna po drugiej w wymienionej kolejności. Skróty: FB, Fast Blue; FR, tabletka Fast Red. Pozostałe skróty znajdują się w legendach do Ryciny 1 i Tabeli 1. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Kombinacja substratów	Dodać do 1 ml buforu AP	Stężenie [µg/ml]	Bufor AP	Kolor	Czułość sygnału
BCIP NBT	3.5 µl 4.5 µl	175 337.5	SB9.5	fioletowy	+++
MAG INT	5 µl 5 µl	250 250	SB9.5	żółty	+
Roztwór zapasowy BCIP/INT	7.5 µl	250 250	SB9.5	żółty	+
Fast Blue NAMP	5 µl 5 µl	250 250	SB8.2	niebieski	++
Fast Blue NABP	20 µl 10 µl	1,000 500	SB8.2	fioletowy	++
Fast Blue NAGP	10 µl 10 µl	500 500	TT8.2	zielony	+
Fast Red NAMP	1 tabletka	1,000 400	TT8.2	czerwony	++

Tabela 1. Kombinacje substratów. Skróty: +++, silna; ++, średnia; +, słaba; NBT, chlorek 4-nitro-błękitu tetrazoliowego; BCIP, 5-bromo-4-chloro-3-indolyliofosforan; INT, chlorek 2-(4-jodofenylu)-3-(4-nitrofenylu)-5-fenylotetrazoliowy; MAG, Magenta-Phos, 5-bromo-6-chloro-3-indolyliofosforan; NAMP, fosforan naftolu-AS-MX; NABP, fosforan naftolu-AS-BI; NAGP, fosforan naftolu-AS-GR; SB9.5, bufor barwiący o pH 9.5; SB8.2, bufor barwiący o pH 8.2; TT8.2, bufor Tris-Tween o pH 8.2.

Dyskusja

Hybrydyzacja in situ (ISH) z radioaktywnie znakowanymi sondami kwasów nukleinowych jest często stosowana do wykrywania lokalizacji RNA na skrawkach tkanki. Radioaktywna metoda ISH jest jednak czasochłonna, mniej czuła i nie pozwala na ocenę pełnych wzorców dystrybucji transkryptów w całych wierzchołkach. W przeciwieństwie do tego, opisana tutaj metoda MC-WISH pozwala na bezpośrednie porównanie wielu domen ekspresji genów w kontrastujących kolorach w nienaruszonych zarodkach. MC-WISH ma tę zaletę, że kontekst histologiczny jest natychmiast widoczny i wizualizowany za pomocą standardowej mikroskopii jasnego pola. Daje to możliwość topograficznego powiązania domen ekspresji genów ze sobą z dużą dokładnością oraz zdefiniowania unikalnych i nakładających się miejsc ekspresji w szybki i niezawodny sposób. Z drugiej strony, multipleksowana fluorescencyjna ISH (FISH) jest silniejsza pod względem czułości i rozdzielczości i jest preferowana do stosowania, jeśli wymagana jest komórkowa lub nawet subkomórkowa rozdzielczość wykrywania mRNA.

Szerokie spektrum transkryptów, które zostało zmapowane przez MC-WISH, sugeruje, że praktycznie każdy transkrypt może być analizowany nie tylko w tkankach embrionalnych, ale także w tkankach larwalnych i dorosłych oraz u gatunków innych niż Drosophila. Rzeczywiście, opisana tutaj procedura opisana dla Drosophila działa podobnie skutecznie w przypadku zarodków danio pręgowanego ^11,16,22. Co więcej, metoda MC-WISH może być dostosowana do szerokiej gamy zarodków i próbek tkanek bezkręgowców i kręgowców.

Etykiety haptenowe i stężenia sondowe

Rutynowo używamy fluoresceiny, digoksygeniny i biotyny jako znaczników haptenów sond RNA. Ponadto można zastosować sondy znakowane dinitrofenolem, które zostały wprowadzone w eksperymentach WISH ^23-25 na danio pręgowanym. Sondy znakowane fluoresceiną wykazują mniejszą czułość w porównaniu z innymi znakami haptenowymi, dlatego fluoresceina najlepiej nadaje się do wykrywania obfitych transkryptów. Każda nowo transkrybowana sonda jest najpierw testowana w pojedynczym eksperymencie WISH, gdzie jej wydajność jest oceniana przy użyciu BCIP/NBT lub Fast Red jako substratu. Stężenie sondy jest uważane za optymalne, gdy silny sygnał bez rozwoju tła jest osiągany w ciągu kilku godzin.

Aby upewnić się, że interesujące nas domeny ekspresji zostały wykryte w pełnym zakresie przez MC-WISH, konieczne jest zobrazowanie każdego wzorca transkryptu za pomocą eksperymentów WISH z pojedynczym znacznikiem przy użyciu najbardziej czułej kombinacji substratów, BCIP/NBT. Gwarantuje to, że słabe domeny wyrażeń nie zostaną pominięte w eksperymencie z wieloma celami. Aby skompensować mniejszą czułość innych kombinacji substratów, konieczne jest stosowanie podwojonych (do potrojonych) stężeń sondy w porównaniu ze standardowym barwieniem BCIP/NBT.

Inaktywacja przy niskim pH

Etap inaktywacji przy niskim pH może prowadzić do częściowej dezintegracji hybryd mRNA sondy RNA znakowanej haptenem antysensownym, co skutkuje zmniejszoną wykrywalnością sygnału w drugiej i trzeciej rundzie barwienia. Aby zminimalizować utratę czułości, etapy inaktywacji są tak krótkie, jak to możliwe. Doświadczyliśmy, że 10-minutowy czas inkubacji przy niskim pH jest wystarczający do wyeliminowania aktywności AP. Następujące po sobie szybkie płukanie w dużych ilościach zapewnia szybkie rozcieńczenie niezwiązanych koniugatów przeciwciało-AP i zapobiega ponownemu wiązaniu się z sondami haptenizowanymi. Alternatywne procedury obejmują wiązanie paraformaldehydu i inaktywację termiczną. Jednak niektóre z kolorowych osadów nie są stabilne termicznie, a wiązanie paraformaldehydu może nie być wystarczające do całkowitej inaktywacji AP. Niepełna inaktywacja pierwszego zastosowanego koniugatu przeciwciało-AP może prowadzić do ponownej wizualizacji wzorca mRNA w następnej rundzie wykrywania, co prowadzi do fałszywie dodatniego nakładania się ekspresji z drugim gatunkiem mRNA, który ma zostać wykryty. Dlatego w eksperymencie kontrolnym zarodki są dzielone na dwie frakcje po inaktywacji pierwszego zastosowanego koniugatu przeciwciało-AP. Drugi koniugat przeciwciało-AP jest pomijany we frakcji kontrolnej i nie powinien wytwarzać sygnału w drugiej reakcji barwnej. Jeśli jednak druga reakcja barwna generuje wzór rozkładu sygnału odpowiadający pierwszemu, oznacza to, że procedura inaktywacji nie była skuteczna. W takim przypadku czas inkubacji w roztworze zatrzymującym o niskim pH powinien zostać przedłużony do następnego eksperymentu.

Zamówienia na aplikację podłoża AP

Ponieważ czułość spada z każdą kolejną rundą wykrywania, zaleca się wykrywanie mniej obfitych mRNA przed bardziej obfitymi transkryptami. Ponadto kombinacje substratów Fast Red i Fast Blue są znacznie mniej wrażliwe niż purpurowoniebieskie barwienie BCIP/NBT, dlatego barwniki Fast są preferowane w pierwszej rundzie barwienia w celu wykrycia silniej wyrażonego transkryptu. Ma to również tę zaletę, że późniejsze barwienie BCIP/NBT może być monitorowane i zatrzymywane na czas, zanim fioletowo-niebieski sygnał stanie się zbyt ciemny w stosunku do jaśniejszych barwników Fast. Tak więc w standardowym eksperymencie dwukolorowym, po pierwsze, silniejsza ekspresja mRNA jest wykrywana przez Fast Red, a po drugie, słabsze przez BCIP/NBT. Jako alternatywę dla barwników Fast można zastosować żółte kombinacje substratów INT, które jednak wytwarzają osady, które po pewnym czasie stają się dyfuzyjne. Dlatego BCIP/INT stosuje się wyłącznie w ostatniej rundzie barwienia. W związku z tym w eksperymencie trójkolorowym często używamy najpierw Fast Red, następnie BCIP/NBT (lub Fast Blue), a po trzecie kombinacji substratów INT. Należy pamiętać, że zaleca się jak najszybsze sfotografowanie barwionych zarodków podczas stosowania INT.

Fluorescencyjna detekcja barwników azowych

Czasami może być trudno rozpoznać nakładające się na siebie wzorce ekspresji, gdy ciemniejszy osad koloru zacienia jaśniejszy. Na przykład silnie rozwinięty osad BCIP / NBT może maskować lżejsze sygnały szybkiego barwnika. Jednym ze sposobów obejścia tego problemu jest robienie zdjęć natychmiast po każdym barwieniu i usuwanie nałożonego osadu barwiącego przed następną rundą wykrywania. W tym przypadku rozpuszczalny w alkoholu barwnik azowy (Fast Red) i osady INT są usuwane przez płukanie etanolem odpowiednio po pierwszej i drugiej rundzie wykrywania, a barwienie BCIP/NBT jest nakładane jako ostatni substrat AP ²⁶. Inną możliwością jest wykorzystanie właściwości fluorescencyjnych barwników azowych. Fast Red można zobrazować za pomocą zestawów filtrów rodaminy ²⁷, natomiast Fast Blue można zaobserwować za pomocą filtrów dalekiej czerwieni ^28,29. Porównanie lub nałożenie na siebie obrazów chromogenicznych i fluorescencyjnych może ujawnić miejsce kodystrybucji. Stosując to podejście, rozwój sygnału BCIP/NBT musi zostać zatrzymany w czasie, aby nie stał się zbyt gęsty i nie wygasił sygnału fluorescencyjnego produktu reakcji barwnika azowego.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Dejonizowana, uzdatniona woda dietylowęglanowa (DEPC)	Thermo Scientific	R0603
T7 Polimeraza RNA	Thermo Scientific	EP0111
Polimeraza RNA T3	Thermo Scientific	EP0101
SP6 Polimeraza RNA	Thermo Scientific	EP0131
Inhibitor RNazy RiboLock	Thermo Scientific	EO0381
DNaza I, bez RNaz	Thermo Scientific	EN0521
Zestaw NTP	Thermo Scientific	R0481
Digoxigenin-11-UTP	Roche	11209256910
Fluoresceina-12-UTP	Roche	11427857910
Biotyna-16-UTP	Roche	11388908910
Octan amonu	Applichem	A2936
Etanol, Absolutny	Merck	100983
Wodorofosforan sodu	Scharlau	SO0339
Diwodorofosforan sodu	Scharlau	SO0331
Tween-20	Sigma	P1379
Paraformaldehyd	Sigma	P6148
Metanol	Sigma	32213
Proteinaza K	Thermo Scientific	EO0491
Glycine	Sigma	G7126
Kwas solny	Merck	100317
cytrynian tri-sodowy	Scharlau	SO0200
dejonizowany formamid	Applichem	A2156
RNA typu VI z drożdży torula	Sigma	R6625
Sól sodowa heparyny	Applichem	A3004
Sól sodowa siarczanu dekstranu	Sigma	D6001
Surowica owcza	Sigma	S2263
Owce anty-biotyna-AP fragmenty Fab	Roche	11426303001
Owcza fosfataza anty-digoksygeninowo-alkaliczna (AP) Fragmenty Fab		11093274910
Owce anty-fluoresceina-AP Fragmenty	Fab	11426303001
Królik przeciwciało anty-dinitrofenylo-AP	Laboratoria wektorowe	MB-3100
Tris-(hydroksymetylo)-aminometan	Scharlau	TR04241000
Chlorek magnezu	Scharlau	MA0036
Chlorek sodu	Scharlau	SO0227
Lewamizol	Sigma	L9756
N,N-dimetyloformamid	Sigma	D4551
Dimetylosulfotlenek	Applichem	A3006
Zestaw tabletek Fast Red	Sigma	F4648
Szybka niebieska sól BB	Sigma	F3378
Naftol-AS-MX-fosforan	Sigma	N5000
Naftol-AS-GR-fosforan	Sigma	N3625
Naftol-AS-BI-fosforan	Sigma	N2250
Magenta-Phos	Biosynth	B7550
INT	Sigma	I8377
NBT	Applichem	A1243
BCIP	Applichem	A1117
Roztwór INT/BCIP	Roche	11681460001
Glicerol 86-88%	Scharlau	GL0023
Inkubator uniwersalny	Memmert	BE400
Kąpiel wodna	Memmert	WB14
Blok grzewczy	Grant	QBT2
Netwell  wkładki 15 mm	Corning	3477
Zestaw nośny Netwell 15 mm	Corning	3520
12-dołkowa płytka do hodowli komórkowych	Corning	3513
24-dołkowa płytka	Sarstedt	83.3922
1,5 ml mikroprobówka	Sarstedt	72.690.001
2,0 ml mikroprobówka	Sarstedt	72 691