Wytwarzanie wystających domen ludzkiego norowirusa w E. coli do krystalografii rentgenowskiej

Podsumowanie

Tutaj opisujemy metodę ekspresji i oczyszczania wysokiej jakości domen wystających (P) norowirusa (P) w E. coli do wykorzystania w badaniach krystalografii rentgenowskiej. Metoda ta może być stosowana do innych domen kaliciwirusa P, a także białek niestrukturalnych, tj. białka wirusa sprzężonego z genomem (VPg), proteazy i polimerazy RNA zależnej od RNA (RdRp).

Streszczenie

Kapsyd norowirusa składa się z pojedynczego głównego białka strukturalnego, określanego jako VP1. VP1 jest podzielony na domenę powłoki (S) i domenę wystającą (P). Domena S tworzy ciągłe rusztowanie wokół wirusowego RNA, podczas gdy domena P tworzy kolce wirusa w domenie S i zawiera determinanty antygenowości i interakcji gospodarz-komórka. Domena P wiąże struktury węglowodanowe, tj. antygeny grupy histo-krwi, które uważa się za ważne w przypadku infekcji norowirusowych. W tym protokole opisujemy metodę wytwarzania wysokiej jakości domen P norowirusa o wysokiej wydajności. Białka te można następnie wykorzystać do krystalografii rentgenowskiej i testu ELISA w celu zbadania antygenowości i interakcji między komórkami gospodarza.

Domena P jest najpierw klonowana do wektora wyrażeń, a następnie wyrażana w bakteriach. Białko jest oczyszczane przy użyciu trzech etapów, które obejmują unieruchomioną chromatografię powinowactwa do jonów metali i chromatografię wykluczania wielkości. Zasadniczo możliwe jest klonowanie, ekspresja, oczyszczanie i krystalizacja białek w czasie krótszym niż cztery tygodnie, co sprawia, że protokół ten jest szybkim systemem do analizy nowo pojawiających się szczepów norowirusa.

Wprowadzenie

Ludzkie norowirusy są główną przyczyną ostrego zapalenia żołądka i jelit na całym świecie¹. Wirusy te należą do rodziny Caliciviridae, której istnieje co najmniej pięć rodzajów, w tym Norowirus, Sapowirus, Zajęczak, Vesiwirus i Nebowirus. Pomimo ich dużego wpływu na system opieki zdrowotnej i szerokiej dystrybucji, badania nad ludzkimi norowirusami są utrudnione ze względu na brak solidnego systemu hodowli komórkowych. Do tej pory nie ma zatwierdzonych szczepionek ani strategii przeciwwirusowych.

Białko głównego kapsydu norowirusa, określane jako VP1, można podzielić na domenę powłoki (S) i wystającą domenę (P)². Domena P jest połączona z domeną S za pomocą elastycznego obszaru zawiasu (H). Domena S tworzy rusztowanie wokół wirusowego RNA, podczas gdy domena P stanowi najbardziej zewnętrzną część kapsydu wirusa. Domena P łączy się w biologicznie istotne dimery, gdy ulega ekspresji w bakteriach. P dimer oddziałuje ze strukturami węglowodanowymi, zwanymi antygenami grupy krwi (HBGA), które są obecne jako rozpuszczalne antygeny w ślinie i znajdują się w niektórych komórkach gospodarza³. Uważa się, że interakcja domena P-HBGA jest ważna dla infekcji⁴. Rzeczywiście, niedawny raport ujawnił znaczenie syntetycznych HBGA lub bakterii eksprymujących HBGA dla zakażenia ludzkim norowirusem in vitro⁵.

Obecne badania dotyczące przyłączania komórek gospodarza przez norowirusy są głównie przeprowadzane z cząsteczkami wirusopodobnymi (VLP), które mogą być wyrażane w komórkach owadów lub z rekombinowanymi domenami P wyrażonymi w Escherichia coli (E. coli). Aby zrozumieć oddziaływania domena P-HBGA w rozdzielczości atomowej, złożone struktury domeny P-HBGA można rozwiązać za pomocą krystalografii rentgenowskiej. W tym miejscu opisujemy protokół ekspresji i oczyszczania domeny P, który umożliwia wytwarzanie domeny P w dużej ilości i jakości, która może być wykorzystana do krystalografii rentgenowskiej. Co więcej, metoda ta może być stosowana do innych domen kaliciwirusa P i białek niestrukturalnych.

Domena P jest zoptymalizowana pod kątem ekspresji E. coli i sklonowana do standardowego wektora transferu. Domena P jest następnie ponownie klonowana do wektora ekspresji, który koduje znacznik polihistydyny (His) i białko wiążące mannozę (MBP), po których następuje miejsce cięcia proteazy. Białko fuzyjne domeny MBP-His-P ulega ekspresji w E. coli, po czym następują trzy etapy oczyszczania. Białko fuzyjne domeny MBP-His-P jest oczyszczane za pomocą immobilizowanej chromatografii powinowactwa jonów metali (IMAC). Następnie białko fuzyjne jest rozszczepiane proteazą ludzkiego rinowirusa (HRV)-3C, a domena P jest oddzielana od MBP-His przez dodatkowy etap oczyszczania IMAC. Na koniec domena P jest oczyszczana za pomocą chromatografii wykluczającej rozmiar (SEC). Oczyszczona domena P może być następnie wykorzystana do krystalografii rentgenowskiej. Badania przesiewowe warunków krystalizacji białek przeprowadza się za pomocą dostępnych na rynku zestawów przesiewowych wykorzystujących różne stężenia białek w domenie P. Obserwuje się wzrost kryształów i optymalizuje się najbardziej obiecujące warunki.

Dzięki opisanym tutaj metodom, możliwe jest przejście od genu do białka do struktury w czasie krótszym niż cztery tygodnie. Dlatego nasza metoda ekspresji, oczyszczania i krystalizacji domeny P jest odpowiednia do badania interakcji norowirus-gospodarz na poziomie molekularnym i dostarczania ważnych danych, które pomogą w nowoczesnym projektowaniu szczepionek i badaniach przesiewowych leków.

Protokół

1. Klonowanie domen P

1. Określ region kodujący domenę P przez wyrównanie sekwencji szczepów norowirusa (np. szczep GII.10, GenBank: AF504671, pdb-ID: 3ONU)⁶. Ponadto usuń elastyczny obszar na końcu C-końcowym domeny P (Rysunek 2A). Optymalizuj kodon DNA pod kątem ekspresji E. coli i uwzględniaj miejsca restrykcyjne BamHI (N-końcowy) i NotI (C-końcowy) w celu subklonowania regionu kodującego domenę P do wektora ekspresji pMalc2x^6,7,
   Uwaga: Region kodowania domeny P jest optymalizowany i syntetyzowany przez usługę komercyjną. Region kodowania domeny P (wstaw) ma około 1 kb długości i jest dostarczany w standardowym wektorze transferu.
2. Trawić 2 μg wektora przenoszenia z każdym 1 μl enzymów restrykcyjnych BamHI (20 000 U/ml) i NotI (10 000 U/ml) przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C z dostarczonymi przez producenta.
3. Oddzielić strawioną wkładkę od 1% żelu agarozowego przez 20 minut pod napięciem 135 V i oczyść DNA insercji z żelu za pomocą dostępnego w handlu zestawu.
4. Przygotować wektor ekspresji pMalc2x, trawiąc 2 μg tego wektora z każdym 1 μl enzymów restrykcyjnych BamHI (20 000 U/ml) i NotI (10 000 U/ml) przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Oczyścić wektor z żelu agarozowego, jak opisano powyżej (1.3). Uwaga: Obie próbki (1.2 i 1.4) mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C.
5. Związać oczyszczoną wstawkę do strawionego wektora pMalc2x w miejscach restrykcyjnych BamHI i NotI za pomocą 1 μl ligazy T4-DNA (400 000 U / ml) przez 15 minut w temperaturze pokojowej (RT) (Figura 2B i 2C). Użyj co najmniej 20 ng wektora pMalc2x i stosunku wektor:wstawienie 1:3 (masa cząsteczkowa). Mieszanka do podwiązywania wynosi zwykle ~ 20 μl.
6. Przekształć 2 μl mieszaniny ligacyjnej w 50 μl chemicznie kompetentnych komórek bakteryjnych E. coli DH5α przy użyciu standardowego protokołu przemiany (10 min na lodzie, szok termiczny 45 s w temperaturze 42 °C) i hodować w 600 μl pożywki S.O.C. przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Odwirować przekształcone komórki przez 3 minuty przy 1 000 x g, Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 30 μl podłoża S.O.C.
   1. Umieść mieszaninę transformacyjną na płytkach LB-Agar, zawierających 100 μg/ml ampicyliny do selekcji, i hoduj przez noc w temperaturze 37 °C. Wybierz co najmniej pięć kolonii.
7. Dla każdej z pięciu kolonii należy zaszczepić 2-3 ml kultury pożywki LB uzupełnionej 50 μg/ml ampicyliny (LB-amp) i hodować przez wytrząsanie przez noc z prędkością 160 obr./min w temperaturze 37 °C.
8. Wyodrębnij plazmidy z hodowli nocnej za pomocą komercyjnego zestawu. Sprawdź obecność wstawki domeny P poprzez sekwencjonowanie za pomocą startera do przodu pMalc2x (5'-TCAGACTGTCGATGAAGC-3') i startera odwrotnego (5'-GATGTGCTGCAAGGCGAT-3').

2. P Wyrażenie domeny

1. Przekształć 1 μl (150 ng/μl - 400 ng/μl) wektora kodującego pMalc2x białko fuzyjne domeny MBP-His-P w 50 μl kompetentnych komórek BL21 E. coli przy użyciu standardowego protokołu transformacji (10 min na lodzie, szok termiczny 45 s w 42 °C) i hoduj w 600 μl pożywki S.O.C. przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Subkultura do 120 ml LB-amp przez noc w temperaturze 160 prędkości obrotowej i 37 °C.
2. Zaszczepić dziewięć litrów (np. 6 x 5-litrowych kolb z 1,5 l każda) LB-amp z subkulturą (1:100). Hoduj komórki, wstrząsając z prędkością 160 obr./min i 37 °C, aż OD₆₀₀ osiągnie 0,4 - 0,6. Następnie obniżyć temperaturę do 22 °C na ~ 1 godzinę, a następnie indukować ekspresję białka za pomocą 0,66 mM izopropylo-β-D-tiogalaktopiranozydu (IPTG)⁸. Hoduj komórki przez noc w temperaturze 22 °C (~ 18 h).
   Uwaga: Temperatura może się zmieniać, ale zalecamy użycie 22 °C lub niższej.
3. Zebrać komórki przez odwirowanie (10,543 x g, 15 min, 4 °C). Odrzucić supernatant i zamrozić osad komórkowy w temperaturze -20 °C.

3. 1. etap oczyszczania i rozszczepienia proteazy

1. Przygotuj, które są używane podczas etapów oczyszczania białek z roztworów podstawowych, aby zagwarantować odtwarzalność i stabilność eksperymentów. Przygotować cztery różne do chromatografii powinowactwa do immobilizowanych jonów metali (IMAC), z których każdy zawiera inne stężenie imidazolu (10 mM, 20 mM, 50 mM i 250 mM). Na potrzeby SEC należy przygotować żelowy bufor filtracyjny (GFB) o wyższym stężeniu soli, ale bez imidazolu. Użyj wody dejonizowanej i przefiltruj wszystkie przed użyciem o wielkości porów 0,45 μm.
   Uwaga: Szczegółowy schemat przygotowania bufora znajduje się w Tabeli 1.
2. Rozmrozić osad komórkowy z dziewięciolitrowej hodowli i rozpuścić w 150 ml PBS w temperaturze 4 °C. Zawiesinę komórek poddać sonifikacji trzykrotnie przez 2 minuty (moc 130 W, amplituda 20%, częstotliwość impulsów 50%), aby rozbić komórki. Utrzymuj zawiesinę komórkową na lodzie podczas sonikacji.
3. Odwirować sonikowaną zawiesinę komórkową (43,667 x g, 30 min, 4 °C) w celu oddzielenia resztek komórkowych od supernatantu zawierającego wyrażone białko. Zebrać sklarowany osad i wyrzucić osad.
4. Przepłukać i zrównoważyć 10 ml (= objętość 1 kolumny [CV]) zawiesiny kulek agarozowych niklu (Ni)-NTA z 10 mM buforem imidazolowym w kolumnie chromatograficznej. Dodać zrównoważone kulki Ni do supernatantu z etapu 3.3 zawierającego wyrażone białko fuzyjne domeny MBP-His-P i inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C z powolną rotacją.
5. Po inkubacji nanieść całą mieszaninę białka niklu i kulek na kolumnę chromatograficzną. Powoli przemyć kolumnę każdymi 5 CV imidazolowych o pojemności 10 mM, 20 mM i 50 mM, zaczynając od 10 mM, następnie 20 mM i kończąc na 50 mM (rysunek 3A).
6. Eluować białko fuzyjne domeny MBP-His-P za pomocą 250 mM buforu imidazolu (Figura 3A). Podczas elucji sprawdź OD_280nm, aby zweryfikować elucję białka fuzyjnego (wzrost OD_280nm). Kontynuuj elucję, aż OD_280nm spadnie do ~ 0,1. Przemyć kulki nadmierną ilością 250 mM buforu imidazolowego (co najmniej 10 CV), a następnie co najmniej 10 CV 10 mM buforu imidazolowego. Zachowaj koraliki na drugi etap oczyszczania (sekcja 4).
7. Sprawdź obecność białka fuzyjnego domeny MBP-His-P za pomocą SDS-PAGE za pomocą 12% żelu poliakryloamidowego SDS (10 x 8 cm)⁹ (Figura 3A). Wykonać elektroforezę żelową przy 45 A i 200 V przez 45 minut.
8. Zagęścić (np. przy użyciu komercyjnego koncentratora) eluowane białko fuzyjne domeny MBP-His-P do końcowego stężenia ~ 3 mg / ml. Rozszczepić fuzję domeny MBP-His-P proteazą HRV-3C podczas dializy w stosunku do 2 litrów 10 mM buforu imidazolu (~ 1:100) przez noc w temperaturze 4 °C (Figura 3A). W zależności od końcowej objętości skoncentrowanego białka dializę należy wykonywać w kasecie dializacyjnej lub rurce do dializy.
   Uwaga: Ilość proteazy HRV-3C do rozszczepienia białka oblicza się na podstawie specyficznej aktywności proteazy (2 U/μl, 1 U wystarcza do rozszczepienia 100 μg białka) i ilości eluowanego białka fuzyjnego, która zmienia się w zależności od poziomu ekspresji i może być oszacowana na podstawie wyniku SDS-PAGE (3.7).

4. 2. etap oczyszczania

1. Zrównoważyć kulki niklu z kroku 3.6 w 10 mM buforze imidazolowym.
2. Inkubować dializowane białko z etapu 3.7 (zawierające rozszczepioną domenę P, białko MBP i proteazę HRV) ze zrównoważonymi kulkami niklu (4.1) przez 30 minut w temperaturze 4 °C z powolnymi obrotami.
3. Nałóż mieszaninę kulek niklu na kolumnę i zbierz przepływ (rozszczepioną domenę P) (rysunek 3B). Zmierz stężenie białka wychodzącego z kolumny, aż OD_{280 nm} osiągnie ~ 0,1,
   Uwaga: MBP-His powinien pozostać związany z koralikami Ni-koralikami (Rysunek 3B).
4. Sprawdź obecność rozszczepionej domeny P za pomocą SDS-PAGE z 12% żelem, jak opisano powyżej (Rysunek 3B). Zagęścić eluowaną domenę P do ~ 3 mg/ml i dializować przez noc w temperaturze 4 °C przeciwko GFB w celu późniejszego oczyszczenia SEC.

5. Trzeci etap oczyszczania

1. Umyć pompy i rury systemu oczyszczania HPLC i wstępnie zrównoważyć kolumnę SEC (patrz Lista materiałów) z GFB.
2. Wprowadzić domenę P do kolumny z szybkością przepływu 1 ml/min za pomocą superpętli (do 12 ml) lub pętli (do 3 ml), w zależności od objętości zagęszczonej próbki. Po zakończeniu wstrzykiwania należy zwiększyć szybkość przepływu do 2,5 ml/min.
3. W miarę wzrostu OD i schodzenia domeny P z kolumny, zbierz frakcje 1,5 ml. Sprawdź frakcje za pomocą SDS-PAGE z 12% żelem (Rysunek 4A i 4B). Zebrać tylko najczystsze frakcje i skoncentrować do ~ 3 mg/ml i ~ 8 mg/ml.
   Uwaga: Po ~110 ml (objętość pustka) większość zanieczyszczeń jest wymywana z kolumny SEC o objętości złoża 320 ml. Domena P jest zwykle eluowana jako dimer. Czas/objętość elucji dimeru domeny P zależy od stopnia przygotowania (pg) kolumny SEC.

6. Krystalizacja domeny P

1. Użyj domeny P przy ~ 3 mg/ml i 8 mg/ml do wstępnego badania przesiewowego krystalizacji. Przygotować co najmniej 100 μl domeny P na stężenie do wstępnych badań przesiewowych z 384 dostępnymi na rynku warunkami przesiewowymi. Przeprowadzić badanie przesiewowe w temperaturze 18 °C na 96-dołkowej płytce, gdzie zbiornik zawiera 100 μl roztworu macierzystego, a kropla składa się z 0,2 μl roztworu macierzystego i 0,2 μl białka.
2. Powtórz i zoptymalizuj udane warunki krystalizacji. Dlatego używaj płytek 15-dołkowych, które zawierają 3 rzędy. Ustaw pierwszy rząd ze 100% roztworem macierzystym, drugi rząd ze 90% roztworem macierzystym i 10% wodą, a trzeci rząd z 80% roztworem macierzystym i 20% wodą. Jako objętość zbiornika należy użyć kropli o wielkości 2 μl (1 μl białka + 1 μl roztworu macierzystego) i 500 μl roztworu macierzystego.
3. Użyj zoptymalizowanych warunków krystalicznych do kokrystalizacji domeny P z ligandami. Przygotować płytki zgodnie z opisem w ppkt 6.2. Zamiast kropli o wielkości 2 μl, należy ustawić krople zawierające 1 μl roztworu macierzystego, 1 μl białka i 1 μl liganda o stężeniu 1 mg/ml.
4. Zbieranie zestawów danych monokryształów za pomocą promieniowania synchrotronowego. Przeprowadź wymianę molekularną przy użyciu opublikowanych struktur domeny P o wysokim podobieństwie sekwencji jako początkowy model wyszukiwania^6,10-13.
   Uwaga: Obecność liganda objawia się jako niemodelowana plama o gęstości elektronów.

Wyniki

Schemat opisanego protokołu przedstawiono na Rysunku 1. Protokół obejmuje 6 głównych części, w tym klonowanie genu docelowego, ekspresję, trzystopniowe oczyszczanie oraz krystalizację. Rysunek 2 ilustruje konstrukcję ekspresyjną (EC) oraz charakterystykę wektora ekspresyjnego pMalc2x. Sekwencja wieliego miejsca klonowania (MCS) wektora pMalc2x zawiera miejsca cięcia restrykcyjnego i proteolitycznego. Rysunek 3 przedstawia reprezentatywne ...

Dyskusja

W tym miejscu opisujemy protokół ekspresji i oczyszczania domen P norowirusa w wysokiej jakości i ilości. Norowirusy nie są dobrze przebadane, a dane strukturalne są stale potrzebne. O ile nam wiadomo, produkcja domen P przy użyciu innych protokołów (np. domen P oznaczonych GST) była do tej pory problematyczna i brakowało wystarczających danych strukturalnych na temat interakcji norowirus-gospodarz. Dzięki opisanej tutaj metodzie w ostatnim czasie znacząco przyczyniliśmy się do zrozumienia molekularnych szczegół...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Domena P DNA	Life Technologies		GeneArt Synteza genów
pMalc2x  wektor	Na żądanie
BamHI	New England Biolabs	R0136L
NotI	New England Biolabs	R0189L
T4 DNA Ligaza	New England Biolabs	M0202S
QIAquick Zestaw	do ekstrakcji żeluQiagen	28704
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27104
S.O.C. Medium	Life Technologies	15544-034
Ekonomiczno-kolumnowa kolumna chromatograficzna	Bio-Rad	7372512	2,5 x 10 cm, możliwość użycia w innym
rozmiarze Ni-NTA Agaroza	Qiagen	30210
Vivaspin 20	GE Healthcare	różne	odcięcie 10 kDa, 30 kDa i 50 kDa stosowane
Wydajność podklonowania DH5α Competent Cells	Life Technologies	18265-017
One Shot BL21(DE3) Chemicznie kompetentny E. coli	Life Technologies	C6000-03
HRV 3C Proteaza	Merck Millipore	71493
HiLoad 26/600 Superdex 75 PG	GE Healthcare	28-9893-34	Kolumna SEC
JCSG Podstawowe pakiety	Qiagen	różne	4 przesiewy z każdym 96 dołkami Węglowodany
	Dextra Laboratories, Wielka Brytania	różne	produkty grupy krwi