Artykuł metodologiczny

Zminiaturyzowany test mikromacierzy glikanów do oceny awidności i swoistości hemaglutynin wirusa grypy A

DOI:

10.3791/53847

⸱

29 maja 2016

 ,  , 
1Department of Cell and Molecular Biology, Chemical Physiology and Microbial Science, The Scripps Research Institute, 2Department of Medicinal Chemistry and Chemical Biology, Utrecht Institute for Pharmaceutical Sciences, Utrecht University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z drukowanej strategii mikromacierzy glikanowej, konwencjonalny test na 96-dołkowej płytce został zminiaturyzowany do analizy awidności hemaglutyniny wirusa grypy A i swoistości dla receptorów zawierających kwas sjalowy.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hemaglutyniny wirusa grypy A (IAV) rozpoznają kwasy sjalowe na powierzchni komórki jako funkcjonalne receptory, które dostają się do komórek. Dzikie ptactwo wodne jest naturalnym rezerwuarem IAV, ale IAV może przekroczyć barierę gatunkową dla drobiu, trzody chlewnej, koni i ludzi. Ptasie wirusy rozpoznają kwas sjalowy przyłączony do przedostatniej galaktozy za pomocą wiązania α2-3 (receptory typu ptasiego), podczas gdy wirusy ludzkie preferencyjnie rozpoznają kwas sjalowy z wiązaniem α2-6 (receptory typu ludzkiego). Aby monitorować, czy ptasie wirusy przystosowują się do receptorów typu ludzkiego, można zastosować kilka metod. Mikromacierze glikanów z różnymi bibliotekami syntetycznych sialozydów są coraz częściej wykorzystywane do oceny swoistości receptorowej. Jednak ta technika nie jest używana do pomiaru awidności. Pomiar awidności jest zwykle osiągany poprzez ocenę wiązania seryjnie rozcieńczonej hemaglutyniny lub wirusa z glikanami zaadsorbowanymi na konwencjonalnych 96-dołkowych płytkach polipropylenowych. W tym teście glikany z kwasami sjalowymi α2-3 lub α2-6 są sprzężone z biotyną i adsorbowane na płytkach streptawidyny lub są sprzężone z poliakrylamidem (PAA), który bezpośrednio adsorbuje się na tworzywie sztucznym. Znacznie zminiaturyzowaliśmy ten test, bezpośrednio drukując sialozydy związane z PAA i ich niezwiązane z PAA odpowiedniki na szkiełkach mikrodołkowych. Ta konfiguracja, z 48 matrycami na jednym szkiełku, umożliwia jednoczesne oznaczanie 6 białek wiążących glikany w 8 rozcieńczeniach, badając 6 różnych glikanów, w tym dwie kontrole bez sjalilacji. Jest to odpowiednik 18 płytek 96-dołkowych w tradycyjnym teście płytkowym. Format macierzy glikanowej zmniejsza zużycie związków i środków biologicznych, a tym samym znacznie zwiększa wydajność.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dzikie ptactwo wodne jest naturalnym rezerwuarem dla IAV, ale IAV jest w stanie przekroczyć barierę gatunkową dla drobiu i ssaków, w tym ludzi. Ptasie wirusy inwazyjne rozpoznają kwasy sjalowe sprzężone z α2-3 (receptory typu ptasiego), podczas gdy ludzkie wirusy wiążą kwasy sjalowe sprzężone z α2-6 (receptory typu ludzkiego). Aby móc skutecznie replikować się i przenosić między ludźmi, ptasi wirus IAV musi wiązać się z receptorami typu ludzkiego 1.

IAV są podzielone na podstawie serologii, która charakteryzuje antygenowość ich otoczek hemaglutyniny (HA) i neuraminidazy (NA). HA wiąże się z kwasami sjalowymi, podczas gdy NA jest enzymem niszczącym receptory na drugim końcu cyklu życiowego wirusa i rozszczepia kwas sjalowy 2. Wszystkie wirusy zakażające ludzi, w tym H1N1, H2N2 i H3N2, mają ptasie pochodzenie 3. W ciągu ostatnich dwóch dekad doszło do kilku krzyżówek ptaków z ludźmi, z których najbardziej znane są H5N1, H7N7 i H7N9; jednak inne podtypy zakażały ludzi bardziej sporadycznie (H6N1, H7N1, H7N2, H9N2, H10N7, H10N8) 4. Na szczęście wydaje się, że żaden z tych wirusów nie był w stanie w pełni przystosować się do receptorów kwasu sjalowego 5-8 związanych z α2-6 typu ludzkiego. Adaptacja ptasich lub innych odzwierzęcych wirusów do replikacji i przenoszenia w organizmie ludzkiego gospodarza może mieć katastrofalny wpływ na zdrowie ludzi. W związku z tym wcześniejsza wiedza na temat tego, w jaki sposób wirusy te ewoluują, aby wiązać receptory typu ludzkiego, pomoże w ogólnoświatowym nadzorze nad pojawiającymi się wirusami grypy.

Określenie preferencji receptora zostało po raz pierwszy wyjaśnione przy użyciu erytrocytów różnych gatunków i pozostaje ulubionym testem wśród badaczy grypy 9-12. Wykazanie, że ptasie wirusy rozpoznają kwas sjalowy α2-3, a ludzkie wirusy α2-6 sprzężony z kwasem sjalowym, pierwotnie opierało się na teście wykorzystującym hemaglutynację erytrocytów zmodyfikowanych enzymatycznie tak, aby zawierały każde z wiązań 13,14. Chociaż odczytem jest hemaglutynacja, standardowy test dla wirusologów, podstawowe struktury glikanów nie są zdefiniowane, a jedynie wiązanie końcowe. Dodatkowo, ograniczona dostępność sjalilotransferaz, stosowanych do re-sialyacji komórek, ograniczyła zastosowanie tego testu 15-18. Następnie wprowadzono inne metody określania preferencji wiązania receptorów przy użyciu sjalylowanych struktur glikanowych połączonych ze strukturami poliakrylamidu (PAA) lub poliglutaminianu (PGA) w testach na płytkach 19,20. Możliwe jest kilka wariantów powlekania glikanów lub wirusów na płytkach do mikromiareczkowania, z których każda daje solidny, wiarygodny i bardzo czuły test ELISA 21-23. Alternatywnie, glikany związane z biotyną mogą zastąpić PAA/PGA i mogą być sprzężone z płytkami pokrytymi streptawidyną 2,24. Chociaż niektóre specyficzne surowice mogą być wymagane, testy ELISA są standardowe, a kilka glikanów związanych z PAA jest łatwo dostępnych komercyjnie i niekomercyjnie (Consortium for Functional Glycomics (http://www.functionalglycomics.org)).

Technologie mikromacierzy glikanów okazały się nieocenionym narzędziem do określania specyficzności receptorów, ponieważ wykrywa się wiele różnych glikanów, a wiązanie z szeroką gamą różnych struktur można ocenić w ramach jednego testu 25-29. Wiązanie IAV z tymi strukturami zapewnia lepsze zrozumienie struktur glikanów, które IAV preferencyjnie rozpoznaje 30-33. Mikromacierze glikanów wymagają niewielkiej objętości próbki do przeprowadzenia testu wiązania i wykorzystują tylko niewielkie ilości glikanu na plamkę (2 nl). Jednak macierze te są zwykle używane tylko do oceny swoistości receptorów glikanów. Analiza wielu wirusów lub białek hemaglutyniny w różnych zakresach stężeń może być zaporowa ze względu na wymaganą liczbę preparatów. Co więcej, do tej pory nie opracowano testu względnej awidności przy użyciu technik macierzy glikanowej.

Aby połączyć niskie wymagania dotyczące próbek zapewniane przez techniki mikromacierzy glikanowych i czułość glikanów połączonych z PAA w testach opartych na ELISA, staraliśmy się opracować wielodołkową matrycę glikanów, która pozwoliłaby na analizę o wysokiej przepustowości z podobną lub lepszą rozdzielczością w porównaniu do tradycyjnego testu opartego na ELISA. Jednocześnie zależało nam na zminimalizowaniu ilości spożywanych środków biologicznych i reporterowych. Ostatecznym rezultatem jest zminiaturyzowany test awidności, opracowany specjalnie do monitorowania swoistości IAV i ma również zastosowanie do oceny innych białek wiążących glikany. Za pomocą szklanego szkiełka podzielonego na 48 mikrodołków za pomocą maski teflonowej, wykrywa się 6 różnych glikanów w 6 powtórzeniach na studzienkę. Platforma mikromacierzy zapewnia te same trendy w wiązaniu receptorów, co w formacie makro ELISA, z kilkoma zaletami. Obejmują one (I) drukowanie związku w 6 powtórzeniach, przy użyciu minimalnej próbki, w porównaniu z powlekaniem kilku rzędów na płytce, przy użyciu 100 μl na studzienkę; (II) wiele różnych związków analizowanych jednocześnie w jednym odwiercie, w tym kontrole; (III) ogromny spadek objętości inkubacji oraz; (IV) większy zakres dynamiki przy użyciu odczytu fluorescencyjnego. Można obliczyć, że pojedyncze szkiełko jest równoważne 18 płytkom 96-dołkowym.

Z poniższym protokołem, każde laboratorium zdolne do wytwarzania i analizowania mikrotablic powinno być w stanie wyprodukować ten zminiaturyzowany format ELISA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Wszystkie kroki są wykonywane w temperaturze pokojowej, chyba że wskazano inaczej.

1. Budowa tablicy

  1. Przygotowanie glikanów i ustawienie płytki
    1. Przygotuj zapas bufora drukowania. Najpierw przygotować 500 ml 150 mM roztworu podstawowego dwuzasadowego fosforanu sodu. Przygotować również 50 ml 150 mM roztworu podstawowego monozasadowego roztworu fosforanu sodu. W kolbie, używając mieszadła magnetycznego i pH-metru, powoli miareczkować dwuzasadowy roztwór fosforanu sodu roztworem jednozasadowym, aż do osiągnięcia pH 8,5. Dodaj Tween-20 do wartości 0,005%.
    2. Przygotuj próbki glikanów. Rozcieńczone glikany sprzężone z PAA (diLacNAc (Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA), 3SLNLN (Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA) i 6SLNLN (Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA (Rysunek 1A)) należy rozcieńczyć do 100 μg/ml w buforze drukarskim z kroku 1.1.1. Glikany jednowartościowe, diLacNAc (Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-(CH2)3NH2, 3SLNLN (Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ--(CH2)3NH2) i 6SLNLN (Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ--(CH2)3NH2)) do 100 μM w buforze drukowania od kroku 1.1.1. Na koniec przygotuj barwniki funkcjonalizowane aminami, które będą używane jako znaczniki siatki/światła do lądowania. Plamki markerów barwnikowych są drukowane z prędkością 1 μM.
      UWAGA: W naszych wydrukach używany jest barwnik Atto488-NHS. Jednak każdy barwnik funkcjonalizowany aminami, możliwy do odczytania przez skaner do slajdów, jest odpowiedni do tego celu.
    3. Przenieś 10 μl każdej próbki glikanu na 384-dołkowe płytki do mikromiareczkowania, używane przez robota drukarskiego. Niewykorzystane glikany należy przechowywać w roztworze buforowym do drukowania w temperaturze -20 °C w szczelnie zamkniętych probówkach. Tansfer 10 μl markera barwnikowego do płyty drukarskiej.  
  2. Drukowanie
    UWAGA: Wszystkie czynności związane z dotykaniem lub przesuwaniem szkiełek należy wykonywać w rękawiczkach.
    1. Umieść kołki macierzy w głowicy drukującej zgodnie z prawidłową konfiguracją układu. W tym układzie użyj jednego pinu, aby wydrukować wszystkie próbki i tablice. Wydrukuj glikany w blokach po sześć, pomijając jedną cechę (cecha jest definiowana jako pojedyncza plamka określonego związku), z każdej strony, tak aby plamki tej samej próbki nie były drukowane dokładnie obok siebie.
      UWAGA: Użytkownik końcowy musi zdecydować o konfiguracji.  
    2. Wyjmij szkiełka z worków, otwórz pudełka i usuń wszelkie cząsteczki kurzu lub małe kawałki plastiku, które mogą znajdować się na ich powierzchni, wydmuchując azot o bardzo wysokiej czystości na każde szkiełko. Umieść żądaną liczbę szkiełek, powlekaną stroną do góry, na stoliku macierzowym.
    3. Zaprogramuj matrycę, użyj parametrów 27 punktów na wizytę na płycie źródłowej, używając 3 "pre-spotów" na szkiełkach pokrytych poli-L-lizyną, aby usunąć nadmiar płynu na końcówce kołków drukujących
      1. Włącz MPU (główną jednostkę napędową) i jednostkę sterowania klimatyzacją. Otwórz oprogramowanie do analizy kafelkowej na komputerze.
      2. Wybierz układ do wydruku. Wybierz Opcje → Narzędzie Pin Tool, które ma być używane do drukowania narzędzia drukującego tablica 1 x 1 - 1 pojedynczy pin. Wybierz kartę Target (Cel) → Tool Array Definition (Definicja tablicy narzędzi) → opcji Print Pattern (Wzór drukowania) i dodaj wysokość (odległość między punktami), liczbę wierszy i kolumn, które mają pomieścić próbki do wydrukowania, oraz wzór drukowania próbek (dla tej tablicy używany jest wzór drukowania 8 x 8 o rastrze 340 μm dla łącznie 7 próbek).
      3. Wybierz opcję Target → Slide Layout (Układ slajdów docelowych) i zaprogramuj odległość między blokami, aby umożliwić drukowanie każdej replikowanej tablicy w 48-dołkowym (4 x 12) szablonie slajdów. Wybierz opcję Source (Źródło) i dodaj liczbę przetworników źródłowych (1 dla każdej próbki w przypadku korzystania z 1 pinu) (w przypadku tego wydruku zostanie użytych 7 przetworników źródłowych, aby pomieścić 6 dołków na próbki i 1 dołek markera barwnikowego).
        UWAGA: Okno dialogowe źródła powinno zmienić kolor na ZIELONY, aby pokazać, że liczba wizyt źródła jest zgodna z próbkami, które mają zostać wydrukowane we wzorcu drukowania.
      4. Wybierz opcję Target → Adapter Plate and Slide Layout (Płyta adaptera docelowego i układ slajdów) i dostosuj numer slajdu (dla tego wydruku drukowanych jest jednocześnie 5 slajdów z 1 slajdem wstępnego punktowania).
      5. Zwolnij tacę, klikając przycisk T1, aby aktywować tacę i dodać żądaną liczbę szkiełek do tacy, zwracając szczególną uwagę na położenie szkiełka wstępnego (NIEBIESKIEGO) i "prawdziwych" slajdów.
      6. Umieść zwykłe szklane szkiełka na wszystkich pozostałych portach próżniowych, aby zablokować próżnię i kliknij OK, aby aktywować próżnię. Sprawdź, czy wszystkie szkiełka są przytrzymane na swoim miejscu, a następnie kliknij przycisk OK, aby przywrócić tacę do pozycji wyjściowej.
      7. Załaduj płytę drukarską do uchwytu płyty i upewnij się, że stojak jest prawidłowo ustawiony na miejscu. Kliknij przycisk GO (Przejdź) i poczekaj, aż proces drukowania będzie kontynuowany.
    4. Wydrukuj pozostałe 24 punkty w replikach po 6 punktów na macierz (4 tablice/wizytę źródłową).
    5. Załaduj płytki 384-dołkowe do drukarki i rozpocznij drukowanie. Utrzymuj wilgotność względną podczas drukowania w zakresie od 55 do 65%. Drukarka zatrzymuje się po wydrukowaniu 5 slajdów.
      UWAGA: Podczas gdy mikromacierz w tym teście jest drukowana w określonym wzorze 8 x 8, różne roboty drukujące mikromacierze będą wymagały programowania specyficznego dla sprzętu, aby osiągnąć pożądany układ. To od użytkownika końcowego zależy, czy określi najbardziej odpowiedni wzór, biorąc pod uwagę specyfikacje jego urządzeń.
  3. Nawilżanie/Unieruchamianie
    UWAGA: Po zakończeniu drukowania preparaty przechodzą etap tymczasowego unieruchomienia, zwany również nawilżaniem. Nawilżanie po wydrukowaniu pomaga ujednolicić mocowanie próbki poprzez ponowne zwilżenie miejsc i zapewnienie całkowitego zablokowania.
    1. Umieść szkiełka w komorze o wilgotności 100% natychmiast po wydrukowaniu na okres 30 minut. Zbuduj komorę, kładąc bardzo mokre ręczniki papierowe płasko na dnie dużego szklanego naczynia, umieszczając szkiełka na jakimś stojaku, takim jak stojak na probówki, stroną do zadrukowania do góry i uszczelniając folią, aby zatrzymać wilgoć.
    2. Szkiełka numerować za pomocą pisaka do znakowania odpornego na działanie alkoholu/rozpuszczalników i przechowywać w pudełku do wysuszania. Osuszyć przez noc.
  4. Numerowanie, blokowanie i przechowywanie
    1. Przygotować bufor blokujący – 50 mM etanoloaminy w 50 mM buforze boranowym. Najpierw rozpuścić kwas borowy w ddH2O do końcowego stężenia 50 mM w kolbie zawierającej mieszadło magnetyczne. Energicznie mieszać roztwór na płycie mieszającej, aż do rozpuszczenia całego ciała stałego. Ciągle mieszając, dodać odpowiednią ilość etanoloaminy z 16,54 M roztworu podstawowego, aby osiągnąć pożądane stężenie 50 mM. Dodać stężony wodorotlenek sodu, aby dostosować do końcowego pH 9,2.
    2. Zanurz wydrukowane slajdy w roztworze bufora blokującego na 1 godzinę.
    3. Po upływie 1 godziny przepłukać szkiełka w ddH2O, aby usunąć nadmiar śladów buforu blokującego. Bufor blokujący należy zutylizować do odpowiedniego pojemnika na odpady.
    4. Przenieś szkiełka do uchwytów do barwienia szkła i odwiruj do sucha. Wysuszyć matryce, umieszczając je w wirówce wyposażonej w wahliwe uchwyty płytek, z prędkością 10 x g przez 5 minut.
    5. Po wyschnięciu szkiełek można je natychmiast inkubować lub przechowywać. Warunki przechowywania to -20 °C w szczelnie zamkniętej plastikowej torbie.  

2. Analiza białek wiążących glikany

  1. Przygotuj nawilżoną komorę, w której zmieszczą się matryce, które mają być hybrydyzowane. Prosta komora składa się z naczynia z Pyrexu, wyłożonego na dnie zwilżonymi ręcznikami papierowymi i stojakiem, na którym spoczywają zjeżdżalnie.
  2. Stosować biotynylowane lektyny SNA (aglutynina Sambuca nigra) i ECA (aglutynina Erythrina cristagalli) w stężeniu 10 μg/ml + 2 μg/ml barwnika Streptawidyna-555, w buforze sondującym (PBS + 0,01% Tween-20). W przypadku HA (A/Vietnam/1203/04 H5N1 i A/KY/07 H1N1, w tym przykładzie) należy użyć początkowego stężenia 20 μg/ml wstępnie skompleksowanego, jak opisano wcześniej 34. Krótko mówiąc, przygotuj mieszaninę HA:Mouse-α-Strep:Goat-α-Mouse-Alexa647 w buforze blokującym (PBS + 3%BSA + 0,01% Tween-20), w stosunku molowym 4:2:1.
    UWAGA: Matryca jest badana lektynami w celu upewnienia się, że glikany są unieruchomione i wykrywalne (Rysunek 1B).
  3. Przenieść roztwór mieszaniny białka i przeciwciała wiążący glikany o objętości 20 μl na płytkę 384-dołkową i inkubować na lodzie przez 30 minut. Próbki lektyny i kwasu hialuronowego rozcieńczyć seryjnie w stosunku 1:1 w odpowiednim buforze 8 razy, mieszając 10 μl próbki z 10 μl buforu.
  4. Pobrać pipetą 8 μl próbki na powierzchnię mikrostudzienki i inkubować w szczelnie zamkniętej komorze nawilżania (100% wilgotności względnej) przez 90 minut.
  5. Myć szkiełka pojedynczo, trzymając za krawędzie i zanurzając je czterokrotnie w mieszaninie PBS i 0,05% Tween, następnie cztery razy w PBS, a na koniec cztery razy w dejonizowanymH2O. Stosując ten sam protokół suszenia, który opisano w kroku blokowania, wirować matryce do suszenia w wirówce przez 5 minut przy 10 x g.

3. Skanowanie i analiza danych

UWAGA: Mikromacierze glikanowe mogą być skanowane z różnymi ustawieniami, w zależności od producenta skanera mikromatrycowego. Zmieniając moc i rozdzielczość lasera, przyrząd może wytworzyć obraz z jak największą liczbą sygnałów w swoim zakresie dynamicznym (ilustracja 1C).

  1. Użyj skanera do szkiełek fluorescencyjnych i zeskanuj matryce natychmiast po inkubacji z białkami wiążącymi glikany. Zwróć uwagę, aby upewnić się, że szkiełko jest prawidłowo włożone do przyrządu skanującego.
    1. Otwórz oprogramowanie do skanowania. Kliknij start, aby otworzyć program. Połącz ze skanerem: Skaner → Połącz lub zielony przycisk w menu panelu nawigacyjnego skanera.
    2. Otwórz drzwiczki automatycznego podajnika skanera. Umieść suwaki w szczelinach w autoloaderze w określonej kolejności. Zamknij klapki automatycznej ładowarki. Kliknij "czytnik treści" w panelu nawigacyjnym Narzędzia, aby automatycznie wykryć slajdy w skanerze.
    3. Ustaw parametr skanowania: Skaner → Parametry skanowania odpowiednie dla eksperymentu (np. wysoka moc lasera 635, zysk detekcji 50%). Skanuj slajdy: Skaner → skanowanie. Wybierz ścieżkę, tworząc folder, w którym zostaną zapisane skanowane obrazy i nazwij poszczególne skany. Zrób to przed właściwym skanowaniem. Powtórz te czynności dla każdego slajdu z osobna. Kliknij przycisk OK, aby rozpocząć skanowanie.
  2. Użyj oprogramowania skanera, aby skonfigurować instrument i zeskanować slajdy. Ustaw skaner tak, aby iteracyjnie skanował przy niskiej mocy lasera (5 mW) ze zwiększającymi się ustawieniami wzmocnienia o 25%, 50% i 75%.
    UWAGA: Ustawienia można testować i optymalizować, ale należy pamiętać, że każde skanowanie może obniżyć moc fluorescencji barwników z powodu fotowybielania.
    1. Otwarte oprogramowanie do akwizycji i analizy danych, takie jak oprogramowanie Mapix. Kliknij start, aby otworzyć program. Otwórz skanowany obraz: Plik → otwórz obraz. Otwórz plik GAL: Przeanalizuj → otwórz siatkę i wybierz odpowiedni plik GAL.
    2. Wejdź w tryb bloków: Obraz → trybie bloków, aby przesunąć siatkę. Użyj znaczników siatki, aby ustawić siatkę w odpowiednim miejscu na slajdzie. W razie potrzeby dostosuj poszczególne bloki, aby dopasować je do drukowanej tablicy.
    3. Wejdź w tryb spotów: Obraz → trybie spotów, aby dostosować lokalizację i rozmiar poszczególnych punktów w bloku. Gdy wszystkie bloki i punkty zostaną wyregulowane i umieszczone na miejscu, zmierz intensywność sygnału, analizując → obliczenia fotometryczne. Zapisz plik wyjściowy.
  3. Po zakończeniu skanowania slajdów obrazy są analizowane pod kątem sygnałów wiążących za pomocą zainstalowanego programu do przetwarzania obrazów (rysunek 1D-G). W celu analizy obrazu załaduj plik GAL (Array List) na zeskanowany obraz TIFF.
    UWAGA: Plik GAL zawiera zarówno wzorzec układu punktu, jak i tożsamości każdej lokalizacji punktu. Pliki GAL dla macierzy są tworzone przez oprogramowanie drukarki przy użyciu pliku tekstowego rozdzielanego tabulatorami, który zawiera tożsamość próbek i ich lokalizację na 384-dołkowej płycie źródłowej.
  4. Użyj znacznika siatki/świateł lądowania wydrukowanych na mikrotablicach, aby prawidłowo umieścić siatkę GAL. Poszczególne miejsca mogą wymagać indywidualnego przesuwania, ale dobrze wydrukowana tablica zazwyczaj pozwala na łatwe umieszczanie bloków w siatce. Po umieszczeniu siatki zbierz intensywności plamki za pomocą oprogramowania i zapisz je jako plik tekstowy rozdzielany tabulatorami (.txt).  
    1. Za pomocą programu do obsługi arkuszy kalkulacyjnych otwórz plik wyjściowy ze skanera. Otwórz odpowiedni plik makra z lokalizacji folderu. Kliknij przycisk Wyświetl → Makro → UruchomMakro.
      UWAGA: Wstępnie napisany skopiuje surowe dane wyjściowe, usunie niepotrzebne wiersze i kolumny, posortuje dane według próbki, obliczy średni średni sygnał minus wartości tła i wykreśli wynikowe wartości w arkuszu kalkulacyjnym zawierającym wykresy dla każdej z sześciu próbek testowanych na tablicy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drukowanie, skanowanie i analizy danych

Aby zapewnić prawidłowe drukowanie, ważne jest prawidłowe wyrównanie siatki punktowej w masce teflonowej, która wyznacza każdą tablicę na slajdzie. Podczas drukowania, ze względu na charakter powłoki teflonowej, plamy nie są widoczne gołym okiem na szkiełkach MPX. Zwraca się wówczas uwagę na wygląd punktów wstępnych na szkiełkach pokrytych poli-L-lizyną. Bezpośrednio po wydrukowaniu każde ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ocena swoistości receptora IAV jest ważnym krokiem w analizie potencjału pandemicznego ptasich wirusów. Rozpoznawanie kwasu sjalowego przez wirusa jest związane z kilkoma właściwościami biologicznymi, takimi jak wiązanie się z komórką i uwalnianie z niej. Wiedza o tym, jakie mutacje aminokwasów są niezbędne, aby ptasie wirusy mogły wiązać α2-6 i przekroczyć barierę gatunkową, umożliwia przygotowanie się na pandemię. W celu określenia swoistości receptora stosuje się kilka testów; Jednak wszystkie mają swoje wady, w tym t...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prace te były częściowo wspierane przez Scripps Microarray Core Facility oraz kontrakt z Centers for Disease Control (J.C.P.). RPdV jest laureatem grantu Rubicon i VENI przyznawanego przez Holenderską Organizację Badań Naukowych (NWO). Konsorcjum na rzecz Glikemii Funkcjonalnej (http://www.functionalglycomics.org/) finansowane przez grant NIGMS GM62116 (J.C.P.) dostarczyło kilka glikanów użytych w tym badaniu. Jest to publikacja 29113 z The Scripps Research Institute.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
NEXTERION® Slajd H MPX-48 Prowadnice Schott1091525Microwell
ProScanArray Plus PerkinElmerwycofałskaner konfokalny
Skaner Innoscan 1100AL/Oprogramowanie MapixInnopsys-konfokalnyskaner mikromatrycowy
MicroGrid II Drukarka mikroprocesorowaDigilab-SNA
Vector LabsB-1305 Lektyna roślinna
ECAVector LabsB-1145 Lektyna roślinna
Przeciwciało przeciw paciorkowcaIBA2-1509-001 Korpus Anitbody do wiązania HA
Anti-Mouse Alexa-647LifeA-21235Anitbody do wiązania HA
Tween-20SigmaP2287 Detergent
dwuzasadowy fosforan soduSigma255793składnik buforowy do drukowania
monozasadowy fosforan soduSigma229903 Komponent bufora wydruku
roztwór poli-l-lizynySigmaP8920 Komponent szkiełka wstępnego
wodorotlenek soduSigma221465składnik szkiełka wstępnego
EtanolSigma493546składnik szkiełka wstępnego
buforowana fosforanem Corning46-013-CMbufor do inkubacji/mycia
szpilki SMP4B PrzypinkadrukarskaTelechemSMP4B
Sprężony azot (klasa 5)PraxairUN1066ogólne narzędzie do odkurzania/suszenia
Kwas borowySigmaB6768-500GOdczynnik blokujący szkiełko
etanoloaminaSigmaE9508-500MLOdczynnik blokujący szkiełko
Atto 488AttoTecAD 488-91Znacznik siatki na tablicy
PAA-LNLNKonsorcjum ds. Glikomiki FunkcjonalnejPA368Glikany plamiste
PAA-3SLNLNKonsorcjum ds. Glikomika FunkcjonalnaPA362Glikany Plamiste
PAA-6SLNLNKonsorcjum Glikomiki FunkcjonalnejPA343Glikany Plamiste
Konsorcjum LNLN Glikomiki FunkcjonalnejTe98Glikany Plamiste
3SLNLNKonsorcjum Glikomiki FunkcjonalnejTe175Glikany Plamiste
6SLNLNKonsorcjum Glikomiksu FunkcjonalnegoTe176Glikany plamiste
384-dołkowa płytka do mikromiareczkowaniaMatrix TechCorp4361Płyta drukarska
Marker laboratoryjny VWRVWR52877-150Numeracja slajdów
Naczynie do barwienia szkiełekWheaton SigmaZ103969-1EABlokowanie i suszenie
sól fizjologiczna

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tumpey, T. M., et al. A two-amino acid change in the hemagglutinin of the 1918 influenza virus abolishes transmission. Science. 315 (5812), 655-659 (2007).
  2. Xu, R., et al. Functional balance of the hemagglutinin and neuraminidase activities accompanies the emergence of the 2009 H1N1 influenza pandemic. J Virol. 86 (17), 9221-9232 (2012).
  3. Bouvier, N. M., Palese, P. The biology of influenza viruses. Vaccine. 26, Suppl 4. D49-D53 (2008).
  4. Freidl, G. S., et al. Influenza at the animal-human interface: a review of the literature for virological evidence of human infection with swine or avian influenza viruses other than A(H5N1). Euro Surveill. 19 (18), (2014).
  5. Xu, R., et al. Preferential recognition of avian-like receptors in human influenza A H7N9 viruses. Science. 342 (6163), 1230-1235 (2013).
  6. Paulson, J. C., de Vries, R. P. H5N1 receptor specificity as a factor in pandemic risk. Virus Res. 178 (1), 99-113 (2013).
  7. Tzarum, N., et al. Structure and receptor binding of the hemagglutinin from a human H6N1 influenza virus. Cell Host Microbe. 17 (3), 369-376 (2015).
  8. Zhang, H., et al. A Human-Infecting H10N8 Influenza Virus Retains a Strong Preference for Avian-type Receptors. Cell Host Microbe. 17 (3), 377-384 (2015).
  9. Carroll, S. M., Higa, H. H., Paulson, J. C. Different cell-surface receptor determinants of antigenically similar influenza virus hemagglutinins. J Biol Chem. 256 (16), 8357-8363 (1981).
  10. Gambaryan, A. S., et al. Specification of receptor-binding phenotypes of influenza virus isolates from different hosts using synthetic sialylglycopolymers: non-egg-adapted human H1 and H3 influenza A and influenza B viruses share a common high binding affinity for 6'-sialyl(N-acetyllactosamine). Virology. 232 (2), 345-350 (1997).
  11. Rogers, G. N., D'Souza, B. L. Receptor binding properties of human and animal H1 influenza virus isolates. Virology. 173 (1), 317-322 (1989).
  12. Rogers, G. N., et al. Single amino acid substitutions in influenza haemagglutinin change receptor binding specificity. Nature. 304 (5921), 76-78 (1983).
  13. Paulson, J. C., Rogers, G. N. Resialylated erythrocytes for assessment of the specificity of sialyloligosaccharide binding proteins. Methods Enzymol. 138, 162-168 (1987).
  14. Paulson, J. C., Sadler, J. E., Hill, R. L. Restoration of specific myxovirus receptors to asialoerythrocytes by incorporation of sialic acid with pure sialyltransferases. J Biol Chem. 254 (6), 2120-2124 (1979).
  15. Chutinimitkul, S., et al. In vitro assessment of attachment pattern and replication efficiency of H5N1 influenza A viruses with altered receptor specificity. J Virol. 84 (13), 6825-6833 (2010).
  16. Glaser, L., et al. A single amino acid substitution in 1918 influenza virus hemagglutinin changes receptor binding specificity. J Virol. 79 (17), 11533-11536 (2005).
  17. Herfst, S., et al. Airborne transmission of influenza A/H5N1 virus between ferrets. Science. 336 (6088), 1534-1541 (2012).
  18. Nobusawa, E., Ishihara, H., Morishita, T., Sato, K., Nakajima, K. Change in receptor-binding specificity of recent human influenza A viruses (H3N2): a single amino acid change in hemagglutinin altered its recognition of sialyloligosaccharides. Virology. 278 (2), 587-596 (2000).
  19. Gambaryan, A. S., Matrosovich, M. N. A solid-phase enzyme-linked assay for influenza virus receptor-binding activity. J Virol Methods. 39 (1-2), 111-123 (1992).
  20. Totani, K., et al. Chemoenzymatic synthesis and application of glycopolymers containing multivalent sialyloligosaccharides with a poly(L-glutamic acid) backbone for inhibition of infection by influenza viruses. Glycobiology. 13 (5), 315-326 (2003).
  21. Gambaryan, A., et al. Receptor specificity of influenza viruses from birds and mammals: new data on involvement of the inner fragments of the carbohydrate chain. Virology. 334 (2), 276-283 (2005).
  22. Ito, T., et al. Receptor specificity of influenza A viruses correlates with the agglutination of erythrocytes from different animal species. Virology. 227 (2), 493-499 (1997).
  23. Watanabe, Y., et al. Acquisition of human-type receptor binding specificity by new H5N1 influenza virus sublineages during their emergence in birds in Egypt. PLoS Pathog. 7 (5), e1002068(2011).
  24. Chandrasekaran, A., et al. Glycan topology determines human adaptation of avian H5N1 virus hemagglutinin. Nat Biotechnol. 26 (1), 107-113 (2008).
  25. Blixt, O., et al. Printed covalent glycan array for ligand profiling of diverse glycan binding proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (49), 17033-17038 (2004).
  26. Childs, R. A., et al. Receptor-binding specificity of pandemic influenza A (H1N1) 2009 virus determined by carbohydrate microarray. Nat Biotechnol. 27 (9), 797-799 (2009).
  27. Nycholat, C. M., et al. Recognition of Sialylated Poly-N-acetyllactosamine Chains on N- and O-Linked Glycans by Human and Avian Influenza A Virus Hemagglutinins. Angew Chem Int Ed Engl. , (2012).
  28. Rillahan, C. D., Paulson, J. C. Glycan microarrays for decoding the glycome. Annu Rev Biochem. 80, 797-823 (2011).
  29. Song, X., et al. A sialylated glycan microarray reveals novel interactions of modified sialic acids with proteins and viruses. J Biol Chem. 286 (36), 31610-31622 (2011).
  30. Gulati, S., et al. Human H3N2 Influenza Viruses Isolated from 1968 To 2012 Show Varying Preference for Receptor Substructures with No Apparent Consequences for Disease or Spread. PLoS One. 8 (6), (2013).
  31. Stevens, J., Blixt, O., Paulson, J. C., Wilson, I. A. Glycan microarray technologies: tools to survey host specificity of influenza viruses. Nat Rev Microbiol. 4 (11), 857-864 (2006).
  32. de Vries, R. P., et al. Evolution of the hemagglutinin protein of the new pandemic H1N1 influenza virus: maintaining optimal receptor binding by compensatory substitutions. J Virol. 87 (24), 13868-13877 (2013).
  33. Yang, H., et al. Structure and receptor binding preferences of recombinant human A(H3N2) virus hemagglutinins. Virology. 477, 18-31 (2015).
  34. de Vries, R. P., et al. The influenza A virus hemagglutinin glycosylation state affects receptor-binding specificity. Virology. 403 (1), 17-25 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Glycan Microarray AssayInfluenza A VirusHemagglutinin BindingAvidity MeasurementSpecificity AnalysisSialic Acid LinkagePAA Conjugated GlycansSerial DilutionFluorescent DetectionData Analysis

Powiązane artykuły