Selektywne pobieranie leukocytów płucnych z marginesem

Podsumowanie

Marginating-pulmonary leukocyty wykazują unikalne cechy i odrębne funkcje immunologiczne w porównaniu z innymi populacjami leukocytów. Tutaj opisujemy selektywne zbieranie tej subpopulacji leukocytów płucnych poprzez wymuszoną perfuzję płuc u szczurów i myszy. Leukocyty płucne z marginesem wydają się mieć kluczowe znaczenie w określaniu podatności na choroby krwiopochodne i płucne.

Streszczenie

Leukocyty płucno-z marginesem (MP) to leukocyty, które przylegają do wewnętrznego śródbłonka naczyń włosowatych płuc. Wykazano, że leukocyty MP wykazują unikalny skład i cechy w porównaniu z leukocytami innych kompartmentów immunologicznych. Dowody wskazują na wyższą cytotoksyczność komórek NK oraz wyraźny profil pro- i przeciwzapalny populacji leukocytów MP w porównaniu z immunocytami krążącymi lub śledzionowymi. Przedstawiona w niniejszym artykule metoda umożliwia selektywne pobieranie leukocytów MP poprzez wymuszoną perfuzję płuc u myszy lub szczurów. W przeciwieństwie do innych metod stosowanych do ekstrakcji leukocytów płucnych, takich jak rozdrabnianie tkanek i degradacja biologiczna, ta metoda daje wyłącznie leukocyty z naczyń włosowatych płuc, niezanieczyszczone komórkami miąższowymi, śródmiąższowymi i oskrzelowo-pęcherzykowymi. Ponadto technika perfuzji lepiej zachowuje integralność i środowisko fizjologiczne leukocytów MP, bez wywoływania reakcji fizjologicznych spowodowanych przetwarzaniem tkankowym. Ta unikalna populacja leukocytów MP jest strategicznie zlokalizowana, aby identyfikować i reagować na nieprawidłowe krążące komórki, ponieważ wszystkie krążące komórki nowotworowe i zakażone komórki są zatrzymywane podczas przechodzenia przez naczynia włosowate płuc, fizycznie oddziałując z komórkami śródbłonka i leukocytami rezydentnymi. Tak więc selektywne zbieranie leukocytów MP i ich badanie w różnych warunkach może pogłębić naszą wiedzę na temat ich znaczenia biologicznego i klinicznego, szczególnie w odniesieniu do kontrolowania krążących nieprawidłowych komórek i chorób związanych z płucami.

Wprowadzenie

Aby zrozumieć znaczenie tej unikalnej populacji, ważne jest, aby zauważyć, że układ odpornościowy może kontrolować krążące komórki nowotworowe, mikroprzerzuty i choroby resztkowe poprzez funkcje in vivo odporności komórkowej (CMI). Zdolność ta jest oczywista pomimo wcześniejszej porażki układu odpornościowego w kontrolowaniu guza pierwotnego i poparta licznymi dowodami in vivo u pacjentów z rakiem i modelach zwierzęcych⁵. Co ważne, wyniki te są często niespójne z badaniami in vitro i ex vivo, które donoszą, że większość autologicznych komórek nowotworowych jest odporna na cytotoksyczność poprzez krążenie leukocytów w próbkach krwi od ludzi i zwierząt (mierzonych za pomocą testów cytotoksyczności) ^6,7. Rozbieżność ta może być przypisana istnieniu in vivo odrębnych populacji leukocytów, takich jak wspomniana wcześniej populacja leukocytów MP, a konkretnie jej subpopulacja aktywowanych komórek NK³. Rzeczywiście, wykazano, że syngeniczne komórki nowotworowe (MADB106), które okazały się oporne na krążące i śledzioniczne leukocyty, są lizowane przez komórki MP-NK^3,8. Tak więc rzekomo "odporne na NK" komórki MADB106, które dają przerzuty do płuc szczurów fischera344 (F344), są kontrolowane przez komórki MP-NK, ale nie przez krążące lub śledzionowe komórki NK, które są powszechnie badane ze względu na ich łatwość dostępu.

Oczyszczone i aktywne leukocyty MP są niedostępne za pomocą standardowych metod pozyskiwania leukocytów z płuc, które opierają się na mieleniu tkanki płucnej lub biologicznej degradacji⁹. Nasze podejście ma dwie główne zalety w porównaniu z metodami przetwarzania tkanek. Po pierwsze, podejście perfuzyjne selektywnie zbiera leukocyty MP, oddzielając je od innych komórek pochodzących z przedziałów miąższowych płuc, śródmiąższowych i oskrzelowo-pęcherzykowych. Po drugie, technika perfuzji lepiej zachowuje integralność i środowisko fizjologiczne leukocytów MP, w przeciwieństwie do metod mielenia i przetwarzania biologicznego, które uszkadzają komórki, zmieniają ich morfologię oraz indukują produkcję i uwalnianie różnych czynników, które modulują aktywność immunologiczną i specyficznie hamują cytotoksyczność NK¹⁰.

Płuca są głównym celem przerzutów nowotworowych i różnych chorób zakaźnych. Wszystkie krążące komórki nowotworowe i zakażone komórki przechodzą przez naczynia włosowate płuc, gdzie muszą się odkształcać i wchodzić w interakcje z komórkami śródbłonka naczyń włosowatych i leukocytami rezydentnymi. W tych warunkach krążące komórki mogą być łatwo atakowane przez rezydentne leukocyty MP. Wydaje się zatem, że biologicznie korzystne jest posiadanie aktywowanych leukocytów w tym przedziale immunologicznym i ważne jest, aby badać tę unikalną populację MP w różnych warunkach biologicznych, eksperymentalnych i klinicznych. Warto zauważyć, że wykazano, że ogólnoustrojowa aktywacja immunologiczna przez różne modyfikatory odpowiedzi biologicznej (np. kwas poliinozyno-policytydylowy (poli I:C) lub oligodeoksynukleotydy typu C CpG (CpG-C ODN)) aktywują leukocyty MP bardziej niż krążące leukocyty^3,8,11.

Protokół

Procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystywania (IACUC) na Uniwersytecie w Tel Awiwie.

1. Protokół dla szczurów

1. Preparaty
   1. Ułóż 2 igły motylkowe 21 G. Opcjonalnie przygotuj 2 igły motylkowe o krawędziach 21 G, piłując ostrą krawędź igły.
   2. Sterylizuj narzędzia chirurgiczne: 2 pary nożyczek, kleszcze o stępionych krawędziach, hemostat, kleszczyki do tkanek zębów sterylizowane w autoklawie w temperaturze 121 °C przez co najmniej 30 minut w stanie grawitacyjnym (na sucho).
   3. Przygotować heparynizowany PBS (30 jednostek/ml), dodając 30 jednostek heparyny na ml roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (1x PBS). Stosować w temperaturze RT. 35 ml to minimalna objętość potrzebna na zwierzę.
   4. Przesyłaj heparynizowany PBS do przewodów pompy perystaltycznej i igieł motylkowych, aby uniknąć pęcherzyków powietrza.
2. Perfuzja płuc i pobieranie leukocytów MP
   1. Poddać zwierzę eutanazji przez przedawkowanie 8% izofluranu. Potwierdź eutanazję, monitorując ustanie oddychania.
   2. Po ustaniu oddychania należy natychmiast otworzyć jamę otrzewnej i klatkę piersiową za pomocą sterylnych nożyczek i kleszczy do tkanek zęba. Wykonaj nacięcie brzucha w linii środkowej wzdłuż brzucha aż do wyrostka mieczykowatego.
   3. Podnieś mostek za pomocą kleszczy, ostrożnie przecinając klatkę piersiową po obu stronach, nie nakłuwając żadnych narządów wewnętrznych ani dużych naczyń krwionośnych. Zaciśnij hemostat na mostku i rostralnie złóż klatkę piersiową, aby odsłonić kompleks krążeniowo-oddechowy.
   4. Wbić igłę motylkową do prawej komory serca i w ciągu około minuty zebrać maksymalną objętość krwi do strzykawki (~6 ml od zwierzęcia o wadze 250 g).
   5. Zacisnąć żyłę główną za pomocą hemostatu, aby uniknąć wstecznej perfuzji wątroby (patrz Dyskusja).
   6. Trzymać igłę motylkową w prawej komorze, jednocześnie zastępując strzykawkę zawierającą krew rurą odpływową pompy perystaltycznej.
   7. Wprowadzić drugą igłę motylkową połączoną ze strzykawką o pojemności 5 ml do pobierania do lewej komory, unikając penetracji przegrody międzykomorowej.
   8. Włączyć pompę perystaltyczną z prędkością około 5 ml/min i delikatnie zebrać do strzykawki pierwsze mililitry perfuzatu, które są zanieczyszczone krwią. Kontynuuj, aż kolor perfuzyjny zmieni się z ciemnego na bladoczerwony. (Wyrzuć zanieczyszczony krwią perfuzt).
   9. Nie przerywając pracy pompy perystaltycznej, należy szybko wymienić strzykawkę o pojemności 5 ml na strzykawkę do pobierania o pojemności 20 ml i pobrać 20 ml perfuzatu płucnego, stosując większą prędkość perfuzji (do 7 ml/min). Należy stale monitorować przepływ perfuzatu do strzykawki zbierającej, unikając przy tym powstawania podciśnienia.
   10. Zatrzymaj przepływ pompy perystaltycznej.
3. Ekstrakcja leukocytów
   1. Odwirować perfuzat przez 10 minut przy 400 × g.
   2. Odessać płyn.
   3. Dodać 10 ml PBS lub pożywki, odwirować przy 400 x g przez 10 minut i odessać płyn. Powtórz ten krok dwukrotnie. Użycie PBS lub pożywki zależy od późniejszego wykorzystania próbki.
   4. Dodać 20 ml PBS lub pożywki, odwirować przy 400 x g przez 10 minut i odessać płyn.
   5. Rozpuść komórki do pożądanego stężenia, w oparciu o użycie próbki (FACS, PCR itp.).

2. Protokół myszy

1. Preparaty
   1. Ułóż 2 igły motylkowe 25 G. Opcjonalnie przygotuj 2 igły motylkowe o krawędziach 25 G, piłując ostrą krawędź igły.
   2. Sterylizuj narzędzia chirurgiczne: 2 pary nożyczek, kleszcze o stępionych krawędziach, hemostat, kleszczyki do tkanek zębów sterylizowane w autoklawie w temperaturze 121 °C przez co najmniej 30 minut w stanie grawitacyjnym (na sucho).
   3. Przygotować heparynizowany PBS (30 jednostek/ml), dodając 30 jednostek heparyny na ml 1x PBS roztworu. Stosować w temperaturze RT. 25 ml to minimalna objętość potrzebna na zwierzę.
   4. Przesyłaj heparynizowany PBS do przewodów pompy perystaltycznej i igieł motylkowych, aby uniknąć pęcherzyków powietrza.
2. Perfuzja płuc i pobieranie leukocytów MP
   1. Poddać zwierzę eutanazji przez przedawkowanie 8% izofluranu. Potwierdź eutanazję, monitorując ustanie oddychania.
   2. Po ustaniu oddychania należy natychmiast otworzyć jamę otrzewnej i klatkę piersiową za pomocą sterylnych nożyczek i kleszczy do tkanek zęba. Wykonaj nacięcie brzucha w linii środkowej wzdłuż brzucha aż do wyrostka mieczykowatego.
   3. Podnieś mostek za pomocą kleszczy, ostrożnie przecinając klatkę piersiową po obu stronach, nie nakłuwając żadnych narządów wewnętrznych ani dużych naczyń krwionośnych. Zaciśnij hemostat na mostku i rostralnie złóż klatkę piersiową, aby odsłonić kompleks krążeniowo-oddechowy.
   4. Zacisnąć żyłę główną za pomocą hemostatu, aby uniknąć wstecznej perfuzji wątroby (patrz Dyskusja).
   5. Do prawej komory serca wprowadzić igłę motylkową podłączoną do rury odpływowej pompy perystaltycznej, a drugą igłę motylkową połączoną ze strzykawką o pojemności 2 ml do lewej komory serca, unikając penetracji przegrody międzykomorowej.
   6. Włączyć pompę do prędkości około 2 ml/min i zebrać pierwsze mililitry zanieczyszczonego krwią perfuzatu do strzykawki do pobierania do momentu, aż perfulat zmieni kolor z ciemnego na bladoczerwony (wyrzucić zanieczyszczony krwią perfut).
   7. Nie przerywając pracy pompy perystaltycznej, należy szybko zastąpić strzykawkę o pojemności 2 ml strzykawką do pobierania próbek o pojemności 10 ml i pobrać 10 ml perfuzatu płucnego, stosując większą prędkość perfuzji (do 4 ml/min). Należy stale monitorować przepływ perfuzatu do strzykawki zbierającej, unikając przy tym powstawania podciśnienia.
   8. Zatrzymaj przepływ pompy perystaltycznej.
3. Ekstrakcja leukocytów
   1. Odwirować perfuzat przez 10 minut przy 400 × g.
   2. Odessać płyn.
   3. Dodać 10 ml PBS lub pożywki, odwirować przy 400 x g przez 10 minut i odessać płyn. Powtórz ten krok trzy razy. Użycie PBS lub pożywki zależy od późniejszego wykorzystania próbki.
   4. Dodać 10 ml PBS lub pożywki, odwirować przy 400 x g przez 10 minut i odessać płyn.
   5. Rozpuść komórki do pożądanego stężenia, w oparciu o użycie próbki (FACS, PCR itp.).

Wyniki

Przedział MP wykazuje inny skład podzbiorów leukocytów w porównaniu do leukocytów krążących. Za pomocą analizy cytometrii przepływowej zidentyfikowano i zmierzono subpopulacje leukocytów, aby scharakteryzować skład leukocytów zarówno krążących, jak i znajdujących się w MP. Granulocyty i limfocyty zidentyfikowano na podstawie rozproszenia światła przedniego (forward scatter) i bocznego (side scatter). Wśród limfocytów komórki NKRP-1^bright zidentyfikowano jako komórki NK, CD3

Dyskusja

Przedstawiona w artykule metoda umożliwia selektywne zbieranie i badanie unikalnej populacji leukocytów MP. W porównaniu z leukocytami krążącymi lub śledzionowymi, populacja MP charakteryzuje się odrębnym składem subpopulacji leukocytów, wyższymi poziomami aktywacji, wyższym uwalnianiem różnych cytokin oraz wyższymi poziomami mRNA cytokin pro- i przeciwzapalnych^2,3. W szczególności wykazaliśmy, że komórki MP-NK są bardziej cytotoksyczne niż krążące komórki NK w stosunku do różnych komórek docelowych^3,4

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Autoclud Pompa
Igła motylkowa	OMG		26G
Igła motylkowa	OMG		21G*3/4"
Strzykawka	roztwór		1 ml
Strzykawka	roztwór		2,5 ml
Strzykawka	roztwór		5 ml
Strzykawka	Roztwór		10 ml
Strzykawka	Roztwór		25 ml
Kleszcze
Nożyczki
hemostat
Kleszcze
Heparyna sodowa błona śluzowa świni (bez konserwantów)	Sigma Aldrich

perystaltycznao krawędziachdo tkanek